一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于
Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
肿瘤的发病率高，不易察觉，我国病例数相当庞大，对人类的健康产生极大危害。
肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞
内或宿主体液中，其在临床上对于原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤
的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预
测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。
CA724、CA242、CEA、PSA等常见的肿瘤标志物，对于癌症的诊断都能起到一定的作
用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技
术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控
制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团，使得它更容易与有机物结合。且具有大的
比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效固载抗体；金纳米粒子具有生物相容性
好、导电性强的优点，可以结合大量的抗体，多余的金纳米粒子还可以增强电极的导电性。
WO2.72/MWCNTs复合材料具有高的比表面积和导电率；将Ag@Au合金杂化到WO2.72/MWCNTs上，
大大提高了材料的热稳定性，导电性，催化性，生物相容性，可以明显的提高免疫传感器的
灵敏度。
发明内容
本发明提供了一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应
用，实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制
备方法。
本发明的目的之二是将所制备的基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器，
用于检测肿瘤标志物。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面，室
温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯
水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电
极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到
电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、2.0 ~ 4.0 mg/mL的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂
于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感
器。
所述金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
(1)金纳米粒子溶胶的制备
将3.9 ~ 4.2 mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95 mL超纯水加入250 mL的三口烧
瓶中，在油浴中加热至沸腾并回流，磁力搅拌下加入9 ~ 11 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠溶
液 ，持续搅拌并回流15 ~ 25 min，至溶液变为酒红色并不再改变， 将溶液室温下冷却，制
得金纳米粒子的溶胶；
(2)氨基化石墨烯的制备
将90 ~120 mg氧化石墨烯分散在40 mL乙二醇中，超声30 min，加入1 mL的浓氨水，待
悬浊液变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中，在180 ℃下反应10 ~ 15 h；冷却至
室温,用超纯水和乙醇各洗涤三次，放于60℃的干燥箱中干燥10 h，制得氨基化石墨烯；
(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备
将8 ~12mg氨基化石墨烯加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶胶中，搅拌3h，离
心除去上清液，制得负载金纳米粒子的石墨烯。
所述Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）WO2.72/MWCNTs的合成
将2 ~ 4 g氯化钨 WCl6 分散在100 mL的无水乙醇中，再加入0.8 ~1.6 g的MWCNTs，将
混合溶液加入聚四氟乙烯高压反应釜，密封，放入干燥箱中， 160 ℃下反应24 h，室温冷
却，用乙醇和超纯水各洗涤三次，65 ℃ ~ 75℃的干燥箱中干燥10 h，得WO2.72/MWCNTs固
体；
（2）Ag@Au溶液的制备
室温下，向100 ~120 mL上述步骤2（1）中制得的金纳米粒子溶胶中，边搅拌边依次加入
20 ~ 24 mL、 0.1 mol/L的CTAB，2.2 ~ 2.6 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸，50 ~ 60 mL、0.01
mol/L的AgNO3，以及5 ~ 6 mL、0.25 mol/L的NaOH溶液，持续搅拌20 ~30 min，制得Ag@Au溶
液；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs的合成
将20 ~ 30 mg上述步骤（1）制得的WO2.72/MWCNTs加入到上述步骤（2）所得Ag@Au溶液
中，搅拌下反应2 h，用超纯水和乙醇分别洗涤三次，65℃ ~ 75℃干燥箱中干燥12 h，得到
Ag@Au-WO2.72/MWCNTs；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 ~ 8 mg的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶
液，加入1 mL、20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化
12 h，制得Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，检测
步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为
辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 6.10 ~ 8.50磷酸盐缓冲
溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间
400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中
注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述肿瘤标志物选自下列之一： CA724、CA242、CEA、PSA。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用了金纳米粒子负载的氨基化石墨烯作为基底材料，石墨烯有大的比表
面积，可提供更多金纳米粒子的结合位点，金纳米粒子的修饰提高了石墨烯的导电性，加快
了电子的传递，同时可以固载大量的抗体，进而能够提高检测的灵敏度；
（2）采用Ag@Au-WO2.72/MWCNTs作为检测抗体标记物，MWCNTs可以分隔海胆状WO2.72，组
织或减缓它们之间的堆积，增强复合材料的比表面积和导电率；Ag对过氧化氢有很强的催
化作用，将Ag@Au合金杂化到WO2.72/MWCNTs上，大大提高了材料的热稳定性，导电性，催化
性，因此，Ag@Au-WO2.72/MWCNTs作为二抗标记物实现了信号的多重放大，从而提高了传感器
的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种Ag@Au-WO2.72/MWCNTs标记的电化学免疫传感器对肿瘤标志物CA724、CA242、
CEA、PSA的检测，其线性范围1 fg/mL～ 10 ng/mL，检测限最低0.33 fg/mL，表明一种基于
Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法，包括以
下步骤：
（1）将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.0 mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面，室温下晾
干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4
℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面
上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到
电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、2.0 mg/mL的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极
表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器。
实施例2 一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法，包括以
下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、1.5 mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面，室温下晾
干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、10.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，
4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、2.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面
上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到
电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、3.0 mg/mL的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极
表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器。
实施例3 一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法，包括以
下步骤：
（1）将直径为5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2）取6 µL、2.0 mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面，室温下晾
干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，
4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、3.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面
上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到
电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6 µL、4.0 mg/mL的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极
表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器。
实施例4 金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
(1)金纳米粒子溶胶的制备
将3.9 mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95 mL超纯水加入250 mL的三口烧瓶中，在
油浴中加热至沸腾并回流，磁力搅拌下加入9 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠溶液 ，持续搅拌
并回流15 min，至溶液变为酒红色并不再改变， 将溶液室温下冷却，制得金纳米粒子的溶
胶；
(2)氨基化石墨烯的制备
将90 mg氧化石墨烯分散在40 mL乙二醇中，超声30 min，加入1mL的浓氨水，待悬浊液
变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中，在180 ℃下反应10 h；冷却至室温,用超纯
水和乙醇各洗涤三次，放于60 ℃的干燥箱中干燥10 h，制得氨基化石墨烯；
(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备
将8 mg氨基化石墨烯加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶胶中，搅拌3 h，离心
除去上清液，制得负载金纳米粒子的石墨烯。
实施例5 金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
(1)金纳米粒子溶胶的制备
将4.1 mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95 mL超纯水加入250 mL的三口烧瓶中，在
油浴中加热至沸腾并回流，磁力搅拌下加入10 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠溶液，持续搅拌
并回流20 min，至溶液变为酒红色并不再改变， 将溶液室温下冷却，制得金纳米粒子的溶
胶；
(2)氨基化石墨烯的制备
将105 mg氧化石墨烯分散在40 mL乙二醇中，超声30 min，加入1 mL的浓氨水，待悬浊
液变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中，在180 ℃下反应13 h；冷却至室温,用超
纯水和乙醇各洗涤三次，放于60 ℃的干燥箱中干燥10 h，制得氨基化石墨烯；
(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备
将10 mg氨基化石墨烯加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶胶中，搅拌3 h，离心
除去上清液，制得负载金纳米粒子的石墨烯。
实施例6 金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
(1)金纳米粒子溶胶的制备
将4.2 mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95 mL超纯水加入250 mL的三口烧瓶中，在
油浴中加热至沸腾并回流，磁力搅拌下加入11 mL、38.8 mmol/L的柠檬酸钠溶液 ，持续搅
拌并回流25 min，至溶液变为酒红色并不再改变， 将溶液室温下冷却，制得金纳米粒子的
溶胶；
(2)氨基化石墨烯的制备
将120 mg氧化石墨烯分散在40 mL乙二醇中，超声30 min，加入1 mL的浓氨水，待悬浊
液变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中，在180 ℃下反应15 h；冷却至室温,用超
纯水和乙醇各洗涤三次，放于60 ℃的干燥箱中干燥10 h，制得氨基化石墨烯；
(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备
将12 mg氨基化石墨烯加入到上述步骤（1）所制得的金纳米粒子溶胶中，搅拌3 h，离心
除去上清液，制得负载金纳米粒子的石墨烯。
实施例7 Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）WO2.72/MWCNTs的合成
将2 g氯化钨 WCl6 分散在100 mL的无水乙醇中，再加入0.8 g的MWCNTs，将混合溶液
加入聚四氟乙烯高压反应釜，密封，放入干燥箱中， 160 ℃下反应24 h，室温冷却，用乙醇
和超纯水各洗涤三次，65 ℃的干燥箱中干燥10 h，得WO2.72/MWCNTs固体；
（2）Ag@Au溶液的制备
室温下，向100 mL上述步骤2（1）中制得的金纳米粒子溶胶中，边搅拌边依次加入20
mL、 0.1 mol/L的CTAB，2.2 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸，50 mL、0.01 mol/L的AgNO3，以及5
mL、0.25 mol/L的NaOH溶液，持续搅拌20 min，制得Ag@Au溶液；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs的合成
将20 mg上述步骤（1）制得的WO2.72/MWCNTs加入到上述步骤（2）所得Ag@Au溶液中，搅拌
下反应2 h，用超纯水和乙醇分别洗涤三次，65℃干燥箱中干燥12 h，得到Ag@Au-WO2.72/
MWCNTs；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将4 mg的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，
加入1 mL、 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12
h，制得Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例8 Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）WO2.72/MWCNTs的合成
将3 g氯化钨 WCl6 分散在100 mL的无水乙醇中，再加入1.2 g的MWCNTs，将混合溶液
加入聚四氟乙烯高压反应釜，密封，放入干燥箱中， 160 ℃下反应24 h，室温冷却，用乙醇
和超纯水各洗涤三次，70 ℃的干燥箱中干燥10 h，得WO2.72/MWCNTs固体；
（2）Ag@Au溶液的制备
室温下，向110 mL上述步骤2（1）中制得的金纳米粒子溶胶中，边搅拌边依次加入22
mL、 0.1 mol/L的CTAB，2.4 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸，55 mL、0.01 mol/L的AgNO3，以及
5.5 mL、0.25 mol/L的NaOH溶液，持续搅拌25 min，制得Ag@Au溶液；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs的合成
将25 mg上述步骤（1）制得的WO2.72/MWCNTs加入到上述步骤（2）所得Ag@Au溶液中，搅拌
下反应2 h，用超纯水和乙醇分别洗涤三次，70℃干燥箱中干燥12 h，得到Ag@Au-WO2.72/
MWCNTs；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将6 mg的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，
加入1 mL 、20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12
h，制得Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例9 Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备，步骤如下：
（1）WO2.72/MWCNTs的合成
将4g氯化钨 WCl6 分散在100 mL的无水乙醇中，再加入1.6 g的MWCNTs，将混合溶液加
入聚四氟乙烯高压反应釜，密封，放入干燥箱中， 160 ℃下反应24 h，室温冷却，用乙醇和
超纯水各洗涤三次， 75℃的干燥箱中干燥10 h，得WO2.72/MWCNTs固体；
（2）Ag@Au溶液的制备
室温下，向100 ~120 mL上述步骤2（1）中制得的金纳米粒子溶胶中，边搅拌边依次加入
24 mL、 0.1 mol/L的CTAB， 2.6 mL、0.1 mol/L的抗坏血酸，60 mL、0.01 mol/L的AgNO3，以
及6 mL、0.25 mol/L的NaOH溶液，持续搅拌30 min，制得Ag@Au溶液；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs的合成
将30 mg上述步骤（1）制得的WO2.72/MWCNTs加入到上述步骤（2）所得Ag@Au溶液中，搅拌
下反应2 h，用超纯水和乙醇分别洗涤三次，75℃干燥箱中干燥12 h，得到Ag@Au-WO2.72/
MWCNTs；
（3）Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备
将8 mg的Ag@Au-WO2.72/MWCNTs检测抗体标记物分散到1 mL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，
加入1 mL、 20 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12
h，制得Ag@Au-WO2.72/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液，4 ℃下保存备用。
实施例10 肿瘤标志物CA724的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为
辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol /L的pH 6.10 ~ 8.50磷酸盐缓
冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间
400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol /L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液
中注入10 µL、5 mol L-1的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）绘制标准曲线，测得所制备传感器对样品中CA724检测的线性范围为1 fg/mL~10
ng/mL，检测限为0.33 fg /mL。
实施例11 肿瘤标志物CA242的检测
按照实施例10的方法对样品中CA242进行检测，其线性范围为1 fg/mL~10 ng/mL，检测
限为0.33 fg /mL。
实施例12 肿瘤标志物CEA的检测
按照实施例10的方法对样品中CEA进行检测，其线性范围为1 fg /mL~10 ng /mL，检
测限为0.33 fg/ mL。
实施例13 肿瘤标志物PSA的检测
按照实施例10的方法对样品中PSA进行检测，其线性范围为1 fg /mL~10 ng /mL，检
测限为0.33 fg/ mL。