基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG免疫层析试纸条的制备方法技术领域
本发明涉及疾病检测技术领域,更具体的是涉及一种基于量子点的绒毛膜促性腺
激素HCG免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
在肿瘤检验诊断学方法中,血清肿瘤标志物的检测已经越来越引起人们的关注,
这是因为这种方法具有很多优点,如简便无创,可以重复检测,检测结果直观且可以定量,
费用相对较低等等,最重要的一点是对于血清肿瘤标志物可以动态监测,从而可以对恶性
肿瘤的诊断、病情发展与疗效等进行判断,在临床上具有很高的应用价值。肿瘤标志物可以
是在恶性肿瘤发生和增殖过程中,由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的,存在于细胞、组织
或体液中,能够用一定方法来定量且能证实肿瘤存在的物质;也可以是由于机体对肿瘤产
生反应,导致体内异常产生或升高的,可以反映肿瘤存在和生长的、能够监测肿瘤治疗和预
后的一类物质,它包括蛋白质、激素、多胺及癌基因产物等,这些物质在正常人的体内不存
在,或者在正常人体内出现的水平显著低于肿瘤患者体内的水平。
绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)是由胎盘的滋养层细
胞分泌的一种糖蛋白,它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。人绒毛膜促性腺激素(HCG)αβ,由
合体滋养细胞合成。分子量为36700的糖蛋白激素,α亚基与垂体分泌的FSH(卵泡刺激素)、
LH(黄体生成素)和TSH(促甲状腺激素)等基本相似,故相互间能发生交叉反应,而β亚基的
结构各不相似。β-HCG于β-LH结构相近,但最后24个氨基酸延长部分在β-LH中不存在。肿瘤
标志物可以对高危人群进行筛查,通过检测肿瘤患者治疗前后肿瘤标志物的浓度变化可以
判断对肿瘤的治疗是否有效。对生物体内的肿瘤标志物实现高灵敏度的检测是生命科学领
域研究的一项重要课题,发展一种新的灵敏度高的检测方法也成为研究者们努力的目标。
量子点是在把导带电子、价带空穴及激子在三个空间方向上束缚住的半导体纳米
结构。又可称为纳米晶,是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。量子点的粒径
一般介于1~10nm之间,由于电子和空穴被量子限域,连续的能带结构变成具有分子特性的
分立能级结构,受激后可以发射荧光。基于量子效应,量子点在太阳能电池,发光器件,光学
生物标记等领域具有广泛的应用前景。目前量子点因具有优异的光学性质已经被广泛应用
于示踪、成像以及标记等方面,而免疫层析试纸条检测则因为它的简单迅速、价格低廉、可
以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制绒毛膜促性腺激素
HCG量子点免疫荧光试纸条,对绒毛膜促性腺激素HCG进行检测,建立绒毛膜促性腺激素HCG
检测的新方法。
发明内容
鉴于肿瘤标志物在肿瘤检测中的重要地位、量子点这种纳米粒子独特的光学性质
以及层析技术简便和价格方面的优势。我们将结合量子点和免疫层析试纸条两种技术,利
用量子点羧基和肿瘤标志物相应抗体的氨基反应,制得量子点荧光探针。探针、肿瘤标志物
和包埋在试纸条的另一种肿瘤标志物抗体通过抗体抗原之间的作用,形成一种类似夹心的
结构。对绒毛膜促性腺激素HCG,这种由胎盘的滋养层细胞分泌糖蛋白进行定性定量的检
测,建立肿瘤标志物检测的新方法,致力于简单迅速、价格低廉、定性定量、操作简便的肿瘤
早期诊断方法。
本发明的技术方案如下:
一种基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG免疫层析试纸条的制备方法;其步骤如
下:
1)将量子点(Quantum dots,QDs)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸
盐(EDC)和PBS缓冲液加入反应器,在旋转混合架上活化量子点的羧基,离心得到免疫量子
点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合,加入PBS缓冲液,在旋转
混合架上偶联抗体2~3h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然
后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭QDs-Ab2荧光探针上未反应的
羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结合垫并烘干,然后用上述荧光
探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
所述量子点QDs:绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2质量分数比=1:10~50。
所述量子点QDs:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC质量分数比
为1:4000~10000。
所述PBS缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS缓冲液,用以保持绒毛膜促性腺激素抗体的
免疫活性。
所述结合垫处理液是含有质量体积比5%的蔗糖、质量体积比5%的牛血清白蛋白
BSA、质量体积比3%的聚乙二醇PEG、体积比2%的聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯Tween-20的
PBS溶液;样品垫处理液是体积比0.5%的Tween-20的PBS溶液。
通过EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)的活化作用,量子点的
羧基和绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2(分子量150000~200000)的氨基生成牢固的化学键,离
心纯化后分散在含牛血清白蛋白的PBS缓冲液中,得到QDs-Ab2的荧光探针。将绒毛膜促性
腺激素β抗体Ab1均匀喷在硝酸纤维素膜上作为检测线T,而将羊抗鼠抗体Ab3硝酸纤维素膜
上作为质控线C。将试纸条的四个部分样品垫、结合垫、吸水垫以及硝酸纤维素膜组装的一
起,最后得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。滴加检测样品到样品垫上,检
测样品会在吸水垫的层析作用下向前移动:如果检测样品有绒毛膜促性腺激素HCG存在,探
针QDs-Ab2、绒毛膜促性腺激素HCG和包埋在硝酸纤维素膜上的绒毛膜促性腺激素β抗体Ab1
通过抗体抗原之间的作用,在T线上形成一种类似夹心的结构QDs-Ab2-HCG-Ab1,而在C线上
形成QDs-Ab2-Ab3的结构,此时T线和C线同时亮;如果检测样品没有绒毛膜促性腺激素HCG存
在,则探针QDs-Ab2仅仅和包埋在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体,形成QDs-Ab2-Ab3的结构,
此时C线亮而T线不亮。
本发明制备的新型基于量子点的免疫层析试纸条优势在于:
1.采用量子点这种具有优异的光学性质,已经被广泛应用于示踪、成像以及标记
等方面的纳米材料作为探针荧光来源,将纳米技术应用到肿瘤检测领域。
2.采用免疫层析技术作为检测用的基材,免疫层析技术因为它的简单迅速、价格
低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。
3.采用量子点的羧基和抗体的氨基之间的反应形成的牢固的化学键,而非传统的
静电吸附作用,提高了试纸条抵抗非特异性吸附的能力,量子点荧光强度和绒毛膜促性腺
激素HCG浓度之间的关系可同时实现定性定量检测。
如图1所示,本发明制备的量子点绒毛膜促性腺激素HCG试纸条所用量子点粒径相
对较大,但颗粒分散均匀,符合试纸条制备的条件;如图2、3所示,本发明制备的量子点绒毛
膜促性腺激素HCG试纸条标准曲线为:y=-4E-07x2+0.0014x+0.2783R2=0.9966;如图4、5所
示,本发明制备的量子点绒毛膜促性腺激素HCG试纸条非特异性吸附较低。
附图说明
图1本发明制备的基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG试纸条的量子点电镜照片。
图2本发明制备的基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG试纸条的标准曲线。
图3本发明制备的基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG试纸条的标准曲线对应紫
外照片。
图4本发明制备的基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG试纸条的特异性实验。
图5本发明制备的基于量子点的绒毛膜促性腺激素HCG试纸条的特异性实验对应
紫外照片。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述,但本发明不限于此。
实施案例1:
1)将质量分数配比为1:4000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:10),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例2:
1)将质量分数配比为1:4000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:30),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例3:
1)将质量分数配比为1:4000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:50),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例4:
1)将质量分数配比为1:6000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:10),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例5:
1)将质量分数配比为1:10000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:10),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2.5h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺
激素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封
闭QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理
结合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例6:
1)将质量分数配比为1:4000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:10),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体3h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。
实施案例7:
1)将质量分数配比为1:4000的量子点(Quantum dots,QDs)和1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)加入反应器,加入PBS缓冲液,在旋转混合架上活化量子
点的羧基,离心得到免疫量子点immune QDs;
2)将绒毛膜促性腺激素α抗体Ab2和上述immune QDs混合(QDs和Ab2质量分数配比
为1:10),加入PBS缓冲液,在旋转混合架上偶联抗体2h,离心得到量子点-绒毛膜促性腺激
素α抗体荧光探针QDs-Ab2,然后用牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)封闭
QDs-Ab2荧光探针上未反应的羧基,同时用样品垫处理液处理样品垫、结合垫处理液处理结
合垫并烘干,然后用上述荧光探针溶液处理结合垫并烘干;
3)试纸条制备:将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起,每层叠
加2~3mm,得到绒毛膜促性腺激素HCG量子点免疫层析试纸条。在样品垫滴加浓度为1000、
500、250、100、50、10mIU/mL的标准绒毛膜促性腺激素HCG,拟合得出标准曲线;在样品垫分
别滴加PSA抗原、AFP抗原、CEA抗原、CA125抗原、CA153抗原、CA199抗原、FCS以及HCG,得出非
特异性曲线。