一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法技术领域
本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检
测抗双链DNA抗体IgG试剂盒及其制备方法。
背景技术
双链脱氧核糖核酸（double stranded DNA,dsDNA）抗体是一种能够与天然 DNA结
合的自身抗体。在 90%以上活动的系统性红斑狼疮（SLE）病人的血清中均存在抗双链 DNA
抗体，双链DNA抗体与 SLE 的病理变化、活动性、疗效及预后有很密切的关系。
SLE是严重危害人类健康的自身免疫性疾病，好发于青年女性，可累及全身各个系
统。SLE疾病的重要免疫学特征是自身抗体的产生，自身抗体不仅对疾病的诊断具有重要价
值，在疾病发病中也有重要作用；其中，dsDNA IgG抗体是系统性红斑狼疮标志性抗体，几乎
存在于所有患者的血清中，与临床表现密切相关，它是SLE活动期的标志。有研究证明，抗
dsDNA抗体和DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或抗体直接作用于肾小球抗原
而造成SLE患者的肾损伤。
dsDNA IgG抗体测定对于SLE的诊断和鉴别诊断、监视治疗和病情追踪以及判断预
后等有重要意义。
临床检测抗双链DNA抗体IgG的常见方法有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、酶
促化学发光法，但这些方法都存在着一些不足。
临床检测抗双链DNA抗体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述
的不足之处：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反
应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份
的检测；
（2） 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使
用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注
试剂的操作也极为繁琐；
（3） 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知
悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大
的随意性；
（4） 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影
响检测结果的准确性；
（5） 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复
杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
（6） 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检
测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个
不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
发明内容
目前抗双链DNA抗体IgG检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测
线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。
本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性
范围广、重现性高、可以定量、操作简单的抗双链DNA抗体IgG试剂盒及其制备方法。本发明
首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁颗
粒、抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的吖啶酯以及抗双链DNA抗体IgG定标品；然后利用
全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际
样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对抗双链DNA抗体IgG全自动化学发光免疫分析
系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
本发明与目前技术相比，具有以下优点：
1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为
直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到2.0 IU/mL；
3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到2-300 IU/mL；
4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，
这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软
件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完
成，操作更加简便，减少了人为的误差。
附图说明
图1为实施例3得到的抗dsDNA抗体IgG标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒制备方法
（1）抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的纳米磁珠制备：
取50mg羧基化的磁微粒（粒径为0.05-1um）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5
MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5
mg 抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，用含2% BSA 的
0.1 M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁
颗粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯的制备：
取50 uL 25mg/mL的抗双链DNA抗体IgG衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的
碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取
出，用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处
理，最后加入得到的抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至
保存管得到抗双链DNA抗体IgG衍生物标记的吖啶酯，每瓶5 mL分装保存于4℃备用。
（3）抗双链DNA抗体IgG定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将抗双链DNA抗体IgG
配置成浓度为0 IU/mL、20 IU/mL、40 IU/mL、80 IU/mL、160 IU/mL、320 IU/mL，每瓶0.5 mL
分装冻干，4 ℃保存备用。
(4)化学发光预激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5
克吐温20，摇匀后避光存放。
(5)化学发光激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克Triton
X-405，摇匀后避光存放。
实施例2：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫检测方法：
本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为竞争法，即
仪器依次加入20 uL的样品、50 uL的抗双链DNA抗体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒以及50
uL的抗双链DNA抗体IgG包被的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入
暗室，依次加入50uL化学发光预激发液、50uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光
强度，从标准曲线计算出被测样品的 抗双链DNA抗体IgG含量。
实施例3：抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒性能评价
检测曲线见附图1。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫层析试剂
盒的灵敏度，求得的灵敏度为2.0 IU/mL。
线性的检测：
对浓度为0 IU/mL、20 IU/mL、40 IU/mL、80 IU/mL、160 IU/mL、320 IU/mL标准品做线
性分析，计算线性相关系数，r=0.9985，另外，该试剂盒对抗双链DNA抗体IgG样品检测的线
性范围为2-300 IU/mL。
精密度测定：
取浓度为50 IU/mL及200IU/mL两个抗双链DNA抗体IgG样品，每个样本每个浓度各做3
个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间
差均小于5%。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘
油酯，添加比例按照 1: 20 进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测
值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件
标准，可用于临床实验室抗双链DNA抗体IgG浓度的准确评估。
实施例4: 抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒的灵敏度实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0 IU/mL的校准品或样本
稀释液为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其
平均值（M）和标准差（SD），得出M-2SD，将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值小
于2.0 IU/mL。