Sox2-CDP结合结构域的候选肽适配子技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Sox2-CDP结合结构域的候选肽适配子。
背景技术
双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中定位和相互作用
的技术，该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧
光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用。该技术已用于不同蛋白间相互作用
强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。肽适配子是指从随机蛋白表达文库中筛
选针对蛋白质靶标的短肽分子，这些从高容量的文库中筛选获取的短肽分子能特异地与靶
标结合，从而影响靶标的功能，可应用于靶标及其复合物功能的干预研究。
Sox2蛋白是一个强大的转录因子，在干细胞干性维持和自我更新、多个肿瘤的恶
性进程（如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭转移，肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性
等）的多个方面具有促进作用。CDP蛋白在促进肿瘤功能方面和Sox2蛋白有重叠，而且Sox2
与CDP蛋白具有共同的下游表达分子，研究表明，Sox2与CDP能形成蛋白复合物，我们也已经
证明在Sox2-CDP复合物中，位于CDP上的结合结构域CDP∆C(101-1516)。
免疫共沉淀技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于蛋白质之间相互
作用研究的经典方法。该技术基于在溶液状态下或细胞中，蛋白X如能和蛋白Y相互作用，该
复合物能被其中任一蛋白的抗体结合发生沉淀的原理，已被广泛用于蛋白质之间相互作用
的鉴定实验。
肿瘤细胞增殖实验主要包括细胞计数和克隆形成实验，其中克隆形成实验是用来
检测细胞克隆形成的能力。细胞接种后的存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁
后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必具备贴壁和增殖活力。克
隆形成率反映了细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。并且克隆形成率与接种密度有
一定关系。
肿瘤细胞侵袭实验是一个模拟体内环境，依赖肿瘤细胞分泌蛋白酶降解基质，从
而使细胞具备转移能力的能力测试，它从一定程度反映了细胞的侵袭和转移潜能。目前多
应用Transwell小室和Matrigel基质胶完成实验。
发明内容
本发明的目的是提供Sox2-CDP结合结构域的候选肽适配子，利用双分子荧光互补
和免疫共沉淀技术进行特异肽适配子的鉴定方法，通过功能分析，我们从中筛选获得了
Sox2-CDP结合结构域的有效肽适配子候选药物。
Sox2-CDP结合结构域肽适配子，序列为：LNLFTFRLKICV。利用基于双分子荧光互补
技术建立的肽适配子文库（构建方法见专利201410339641.X），以pBiFcVN173-CDP∆C(101-
1516)为靶标，筛选获得靶向结合CDP∆C(101-1516)的候选肽适配子；通过表达载体构建和
免疫共沉淀技术，从候选肽适配子中鉴定能特异高亲和结合CDP∆C(101-1516)的肽适配
子。CDP∆C(101-1516)结构域序列为：
MAANVGSMFQYWKRFDLQQLQRELDATATVLANRQDESEQSRKRLIEQSREFKKNTPEDLRKQVAPLLKSFQGEIDA
LSKRSKEAEAAFLNVYKRLIDVP。
pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)的制备方法为：利用克隆技术和载体构建技术，将
经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的CDPΔC(101-1516)开放阅读框定向插入
至pBiFc-VN173中，获得pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)表达载体。
所述的靶向结合CDP∆C(101-1516)的候选肽适配子，统称为TrxA-peptide-TrxA，
peptide指以下4个包含11个氨基酸的短肽，具体序列为TrxA-LNLFTFRLKICV-TrxA，TrxA-
LFYIYFSFWFL-TrxA，TrxA-TPVFLPPFSPM -TrxA，TrxA- YLFAIYSFSSL -TrxA，通过位于TrxA
中的半胱氨酸形成二硫键，以形成固定的构象，特异短肽位于TrxA表达框中。
Sox2-CDP结合结构域的肽适配子鉴定方法，包括以下步骤：
1）应用设计引物，对CDP∆C(101-1516)进行高保真扩增后，进行EcoRI和XbaI双酶切后
转移入pBiFcVN173表达载体，获得pBiFcVN173- CDP∆C(101-1516)表达载体；
2）通过随机挑选方法，从肽适配子文库（专利号：ZL201410339641.X）中随机挑取30个
肽适配子表达载体与pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)共转染HEK293T细胞，同时转染
pDsRED2-C1作为内参，观察荧光的出现；
3）应用设计引物，以双分子荧光互补获取的候选肽适配子pBiFcVC155-TrxA-peptide-
TrxA为模板，对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增；
4）利用酶切连接方法将候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA转移入pCMV-Tag2B表达载
体，获得pCMV-Tag2B-TrxA-peptide-TrxA表达载体；
5) 利用酶切连接方法将CDP∆C(101-1516)转移入pBiFcVC155表达载体，获得
pBiFcVC155-CDP∆C(101-1516)表达载体；
6) 利用共转染方法，以分组形式分别将pCMV-Tag2B-TrxA-peptide-TrxA和
pBiFcVC155-CDP∆C(101-1516)转染入HEK293T 细胞，利用Flag抗体进行免疫共沉淀并联
合利用CDP抗体鉴定；
利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的
CDP∆C(101-1516)开放阅读框定向插入至pBiFc-VN173中，获得pBiFcVN173-CDP∆C(101-
1516)表达载体。
根据双分子荧光互补技术，从肽适配子文库中筛选获得了4个候选肽适配子：P8：
LNLFTFRLKICV、 P32：LFYIYFSFWFL，P46TPVFLPPFSPM和P58：YLFAIYSFSSL，这些肽适配子插
入于TrxA支架中，并与VENUS蛋白C155片段融合表达。
利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末
端的TrxA-peptide-TrxA候选肽适配子核苷酸片段定向插入至pCMV-Tag2B表达载体，获得
pCMV-Tag2B-TrxA-peptide-TrxA表达载体。
利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末
端的CDP∆C(101-1516)开放阅读框定向插入至pBiFcVC155表达载体，获得pBiFcVC155-CDP
∆C(101-1516)表达载体。
利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末
端的TrxA-peptide-TrxA候选肽适配子核苷酸片段定向插入至PCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-
EF1-Puro表达载体，获得构建PCDH-CMV-TrxA-peptide- TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro表达载
体。
PCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro表达载体的制备方法为设计引物，利用高保真
克隆方法获取IRES-GFP，并将IRES-GFP定向插PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体中，获得
PCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro。
另外，ΔN、ΔC为通用指的是删除N端和C端，Δ指的是删除（delete）的意思，如
SOX2ΔN(1-167)指的是删除N端1-167氨基酸位点的截短SOX2蛋白。
将所有目的质粒抽提后送测序公司测序并确认序列的正确性和一致性。
将所有慢病毒表达载体PCDH-CMV-TrxA-peptide-TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro转染
HEK293T细胞，进行病毒包装。每隔24小时后收获病毒，收获3次，分别简写为P8，P32，P46和
P58病毒。
使用表达肽适配子的病毒P8，P32，P46和P58病毒感染食管鳞癌细胞KYSE450，并用
嘌呤霉素进行筛选获得稳定表达的细胞系，分别命名为KYSE450（P8），KYSE450（P32），
KYSE450（P46）和KYSE450（P58）；
利用构建的食管鳞癌细胞KYSE450，通过细胞增殖实验、克隆形成以及细胞侵袭实验优
选最佳的肽适配子。
本发明的有益效果在于：
（1）构建了pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)表达载体，结合结构域CDP∆C(101-1516)与
VENUS蛋白的1-172氨基酸残基进行融合表达；
（2）利用双分子荧光互补技术，从高容量的肽适配子表达文库中筛选获得了4个靶向结
合CDP∆C(101-1516)的候选肽适配子；
（3）构建了pCMV-Tag2B-TrxA-peptide-TrxA和pBiFcVC155-CDP∆C (101- 1516)表达
载体，使候选肽适配子与Flag标签蛋白进行融合表达；
（4）在测序结果正确的基础上，利用去内毒素质粒抽提试剂盒将相应的表达载体进行
抽提，将它们按组合的方式共转染HEK293T细胞，免疫共沉淀结果表明，肽适配子P8，P32，
P46和P58均能与CDP∆C(101-1516)结构域特异并高亲和结合；
（5）通过构建，获得了表达肽适配子P8，P32，P46和P58的慢病毒表达载体PCDH-CMV-
TrxA-peptide-TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro，并通过包装，获得了相应的病毒，通过感染食管
鳞癌细胞系和药物筛选，我们获得了稳定表达肽适配子P8，P32，P46和P58的食管鳞癌细胞
系：KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450（P58）；
（6）利用构建的食管鳞癌细胞KYSE450，通过细胞增殖实验、克隆形成以及细胞侵袭实
验优选获得最佳的肽适配子P8(LNLFTFRLKICV)，该适配子能显著食管鳞癌细胞的增殖和侵
袭，可以被用于制备食管鳞癌治疗的候选药物。
附图说明
图1为用于双分子荧光互补以及免疫共沉淀的相关表达载体示意图。A:泳道1代表
CDP-SOX2结合结构域CDP∆C(101-1516)；泳道2为CDP∆C(101-1516)与pBiFcVN173载体连
接后的载体构建鉴定。B：泳道1、3、5、7分别代表筛选出的靶向CDP-SOX2结合结构域的肽适
配子PEPTIDE 8、PEPTIDE 32、PEPTIDE 46、PEPTIDE 58；泳道2、4、6、8为筛选出的肽适配子
与PCMV-Tag2B载体连接后的载体构建鉴定。
图2为双分子荧光互补筛选与CDP-Sox2结合结构域特异结合的肽适配子示意图，
红色荧光为内参。
图3 为免疫共沉淀验证CDP-Sox2结合结构域与筛选的候选肽适配子之间的相互
作用示意图。
图4表达特异肽适配子的慢病毒载体构建。泳道1、2、3、4分别代表筛选出的肽适
配子PEPTIDE 8、PEPTIDE 32、PEPTIDE 46、和PEPTIDE 58与慢病毒载体PCDH-IRES-GFP连接
后的载体构建鉴定。
图5表达特异肽适配子的重组慢病毒的包装（A为荧光视野，B为白光视野）。
图6 稳定表达特异肽适配子的KYSE450细胞系建立（A为荧光视野，B为白光视野）。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生
化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验，均设置为独立的三次重复实验，结果取平均
值。
实施例1
基于双分子荧光互补技术的CDP∆C(101-1516)结构域融合表达载体构建和特异肽适
配子筛选包括以下步骤
步骤1）pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)表达载体构建：以人食管鳞癌细胞系KYSE450的
RNA反转录的cDNA为模板，设计引物对CDP∆C(101-1516)片段进行高保真PCR扩增，并使用
限制性内切酶EcoRI和XbaI对扩增产物进行酶切后，将其插入pBiFcVN173载体，以形成
pBiFcVN173-CDP∆C(101-1516)表达载体。扩增引物序列如下：正向引物：5’-
CGGAATTCAATGGCGGCCAATGTGG GAT-3’(末端为EcoRI酶切位点）；反向引物: 5’-
TGCTCTAGATGGGACGTCAA TCAATCTTTT-3’ （末端为XbaI酶切位点）。经酶切鉴定和测序结果
表明：获得了预期的表达CDP∆C(101-1516)靶标并可用于双荧光互补的载体（图1）。
PCR反应条件如下：
步骤2）使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确的pBiFcVN173-CDP∆C (101-
1516)和pDsRED2-C1载体，随机挑取30个肽适配子文库质粒，使用Lipofectamine 2000转染
试剂，将200ng 随机挑取的pBiFc-VC155-TrxA-peptide -TrxA 文库质粒，200ng
pBiFcVN173-Sox2和50ng pDsRED2-C1（pDsRed2-C1转染的红色荧光作为内参）载体分别形
成30个不同组合共转染于12孔板的HEK293T细胞中。
步骤3）将转染的HEK293T细胞放置于细胞培养箱中培养24小时后，在荧光显微镜
下观察到荧光的出现。初步结果表明其中4个肽适配子能特异与CDP∆C (101-1516)结构域
特异结合，从而快速初步筛选获得靶向特异结合CDP∆C (101-1516)结构域的肽适配子（图
2），候选肽适配子TrxA-peptide-TrxA中peptide相应的氨基酸序列见表1，列表中序列不包
含侧翼的TrxA序列。
表1为与CDP∆C(101-1516)结合结构域特异结合的候选肽适配子的
测序结果及氨基酸序列。
实施例2
靶向结合CDP∆C (101-1516)结构域的肽适配子的鉴定包括以下步骤：
1）用于表达候选肽适配子的真核表达载体构建【Peptide-FLAG，peptide指AA(11)】
设计特异引物对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增，peptide分别指P8，P32，P46，
P58。使用限制性内切酶EcoRI和BamHI对扩增产物进行酶切后，将这4个候选肽适配子的酶
切片段分别插入pCMV-Tag2B载体中，获得pCMV-Tag2B-TrxA-peptide-TrxA载体, 这些载体
可以表达与FLAG融合表达的肽适配子，分别为pCMV-Tag2B-TrxA- P8-TrxA，pCMV-Tag2B-
TrxA- P32-TrxA ，pCMV-Tag2B-TrxA- P46-TrxA，pCMV-Tag2B-TrxA- P58-TrxA（图1）。
扩增引物序列如下：正向引物：5’-CGGGATCCATGAGCGATAAA ATTATTCAC-3’（末端为
BamHI酶切位点）； 反向引物： 5’-CGGAATTCCAGGTT AGCGTCGAGGAA-3’（末端为EcoRI酶切位
点），PCR反应条件如下：
2）用于表达CDP∆C (101-1516)结构域的表达载体pBiFcVC155-CDP∆C (101- 1516)
构建。设计特异引物对CDP∆C (101-1516)进行高保真PCR扩增，使用限制性内切酶SalI和
KpnI对扩增产物进行酶切后，将酶切片段插入pBiFcVC155载体，获得了pBiFcVC155-CDP∆C
(101-1516)表达载体。引物序列如下，正向引物：5’-acgcGTCGACCATGGCGGCCAATGTGGGAT-3’
（末端为SalI酶切位点）：反向引物：5ggGGTACCTGGGACGTCAATCAATCTTTT3（末端为KpnI酶切
位点）。
3）免疫共沉淀验证肽适配子与CDP∆C (101-1516)结构域的特异结合
将融合表达载体分成四组，分别为pCMV-Tag2B-TrxA-P8-TrxA和pBiFcVC155-CDP∆C
(101-1516)，pCMV-Tag2B-TrxA-P32-TrxA和pBiFcVC155-CDP∆C(101-1516)，pCMV-Tag2B-
TrxA-P46-TrxA和pBiFcVC155-CDP∆C(101-1516)，pCMV-Tag2B-TrxA-P58-TrxA和
pBiFcVC155-CDP∆C(101-1516。分别使用转染试剂PEI将这四组载体共转入HEK293T细胞，
收获蛋白并使用Flag标签抗体做免疫共沉淀，用CDP抗体做免疫印迹实验验证，由图3可知，
CDP∆C (101-1516)与TrxA-P8-TrxA，TrxA-P32-TrxA，TrxA-P46-TrxA和TrxA-P58-TrxA均
能紧密结合。
实施例3
稳定表达靶向CDP∆C (101-1516)结构域的肽适配子的食管鳞癌细胞系建立和功能实
验包括以下步骤：
1）表达特异肽适配子的慢病毒载体构建和病毒包装
设计特异引物对TrxA-peptide-TrxA进行高保真PCR扩增，peptide分别指P8，P32，P46，
P58。使用限制性内切酶EcoRI和BamHI对扩增产物进行酶切后，将这4个候选肽适配子的酶
切片段分别插入PCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体中，获得PCDH-CMV-TrxA-peptide-
TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro表达载体,分别为PCDH-CMV-TrxA-P8-TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro，
PCDH-CMV-TrxA-P32-TrxA -IRES-GFP-EF1-Puro，PCDH-CMV-TrxA-P46-TrxA-IRES-GFP-
EF1-Puro 和PCDH-CMV-TrxA-P58-TrxA-IRES-GFP-EF1-Puro（图4）。
扩增引物序列如下：正向引物5’-CGGAATTCGCCACCATGAGCGATAA AATTATTCAC-3’
（末端为EcoRI酶切位点）； 反向引物： 5’-CGGGATCCTCAC AGGTTAGCGTCGAGGAA-3’（末端为
BamHI酶切位点），PCR反应条件如下：
2）稳定表达特异肽适配子的食管鳞癌细胞系的建立
使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确的PCDH-CMV-TrxA -peptide-TrxA-IRES-
GFP-EF1-Puro分别与PHR和VSVG按一定比例溶于HBSS，并与转染试剂PEI进行混匀，加入至
包装细胞HEK293T细胞中，每隔24小时收集病毒上清，收集3次后，离心并过滤获得表达特异
肽适配子的慢病毒（图5）。
接种食管鳞癌细胞株KYSE450，使用收获的慢病毒上清感染KYSE450细胞，并加入
Polybrene（终浓度8µg/ml），12小时后换液，感染48小时后进行嘌呤霉素药物筛选，未感染
组和感染组分别加入嘌呤霉素并最终获得稳定表达特异肽适配子的食管鳞癌细胞系：
KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450（P58）（图6）。
3）稳定表达特异肽适配子的食管鳞癌细胞系的功能分析
将相同数量的KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450（P58）分别接种细
胞6孔板，在接种后的第1天，第2天，第3天和第4天分别计数，分析细胞增殖曲线的变化，通
过统计分析后发现：与对照相比，KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450
（P58）的增殖能力均比对照降低。
将相同数量的KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450（P58）分别接
种细胞6孔板，在接种后的第7天，结晶紫染色后，拍照计数，观察形成的大克隆数，通过统计
分析后发现：与对照相比，KYSE450（P8）和KYSE450（P58）的大克隆形成能力均显著降低。
将相同数量的KYSE450（P8），KYSE450（P32），KYSE450（P46）和KYSE450（P58）分别接
种于铺好Matrigel的Transwell小室，在接种后的48小时，结晶紫染色后，拍照计数，使用结
晶紫对穿过小室的细胞就染色，并计数，通过统计分析后发现：与对照相比，KYSE450（P8）、
KYSE450（P32）和KYSE450（P46）的侵袭能力显著降低，在候选肽适配子中，KYSE450（P32）的
侵袭能力最低。但是，通过综合增殖和侵袭方面的结果，我们认为肽适配子P8：
LNLFTFRLKICV最适合用于食管鳞癌肽适配子药物的制备和后期的药理研究。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> Sox2-CDP结合结构域的候选肽适配子
<130> 21
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> P8
<400> 1
Leu Asn Leu Phe Thr Phe Arg Leu Lys Ile Cys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 100
<212> PRT
<213> CDP△C(101-1516)结构域
<400> 2
Met Ala Ala Asn Val Gly Ser Met Phe Gln Tyr Trp Lys Arg Phe Asp
1 5 10 15
Leu Gln Gln Leu Gln Arg Glu Leu Asp Ala Thr Ala Thr Val Leu Ala
20 25 30
Asn Arg Gln Asp Glu Ser Glu Gln Ser Arg Lys Arg Leu Ile Glu Gln
35 40 45
Ser Arg Glu Phe Lys Lys Asn Thr Pro Glu Asp Leu Arg Lys Gln Val
50 55 60
Ala Pro Leu Leu Lys Ser Phe Gln Gly Glu Ile Asp Ala Leu Ser Lys
65 70 75 80
Arg Ser Lys Glu Ala Glu Ala Ala Phe Leu Asn Val Tyr Lys Arg Leu
85 90 95
Ile Asp Val Pro
100
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Phe Tyr Ile Tyr Phe Ser Phe Trp Phe Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Thr Pro Val Phe Leu Pro Pro Phe Ser Pro Met
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Tyr Leu Phe Ala Ile Tyr Ser Phe Ser Ser Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttaaatctgt ttacttttag gttgaagatc tgtgtg 36
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgttttata tttatttttc tttttggttc ttg 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acacccgttt tcttacctcc tttttctcca atg 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tacctgtttg ctatttattc tttctcttct ttg 33
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgggatccat gagcgataaa attattcac 29
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggaattcca ggttagcgtc gaggaa 26
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggggtacctg ggacgtcaat caatctttt 29