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1、10申请公布号CN104072614A43申请公布日20141001CN104072614A21申请号201310533628322申请日20060610PTA364520010816PTA364920010816PTA389720011205PTA364820010816PTA364720010816PTA389820011205PTA390020011205PTA389920011205PTA364620010816PTA38962001120560/697,44220050708US60/773,31020060215US200680032957820060610C07K16/28200。
2、601C12N15/13200601A61K39/395200601A61P11/00200601A61P1/16200601A61P13/12200601A61P35/00200601A61P17/06200601A61P17/02200601A61P17/0020060171申请人拜奥根IDEC马萨诸塞公司地址美国马萨诸塞72发明人S维奥莉特LA库珀曼KJ西蒙PH温莱博H范维利吉曼J萨尔丹哈AA鲁格夫斯科74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人孙式洪54发明名称抗V6抗体及其用途57摘要本发明提供了识别V6整联蛋白的人源化抗体及其用途,所述抗体包含非人起源的可变。
3、区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还提供了包含所述抗体的药物组合物及其应用。本发明另外涉及用于制备此类抗体的方法。30优先权数据62分案原申请数据83生物保藏信息51INTCL权利要求书3页说明书165页序列表52页附图77页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书165页序列表52页附图77页10申请公布号CN104072614ACN104072614A1/3页21一种与V6特异性结合的人源化抗体或其抗原结合片段,其中所述人源化抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域,其中所述重链可变结构域含有SEQIDNO144、SEQIDNO145或SEQIDNO146。
4、中所示的氨基酸序列,所述轻链可变结构域含有SEQIDNO139、SEQIDNO140、SEQIDNO141、SEQIDNO142或SEQIDNO143中所示的氨基酸序列。2一种与V6特异性结合的人源化抗体或其抗原结合片段,其包含(I)重链可变结构域,其中所述重链可变结构域包含分别由SEQIDNO1的氨基酸残基3135、5065和98109限定的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3;和(II)轻链可变结构域,其中所述轻链可变结构域包含分别由SEQIDNO2的氨基酸残基2435、5157和9098限定的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。3权利要求2的抗体或其抗原结合片段,其中所述重。
5、链可变结构域包含分别由SEQIDNO1的氨基酸残基130、3649、6697和110120限定的框架区FR1、FR2、FR3和FR4。4权利要求2的抗体,其中所述轻链可变结构域包含分别由SEQIDNO2的氨基酸残基123、3650、5889和99108限定的框架区FR1、FR2、FR3和FR4。5根据权利要求14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是IGG抗体。6根据权利要求14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是IGG1或IGG4抗体。7根据权利要求14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自FAB片段、FAB片段、F(AB)2片段、FD片段、F。
6、V片段、SCFV、二硫键合的FV。8根据权利要求14中任一项所述的抗体或抗原结合片段,其中所述的抗体与细胞毒素剂缀合。9根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述细胞毒素剂选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、阿霉素、氨甲蝶呤、5氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、卡里奇霉素(CALICHEAMICIN)、美登素、TRICHOTHENE、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌(PSEUDOMONASAERUGINOSA)外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素A链、八叠球菌、油桐(ALEURITESFORDII)蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(PHYTOLACAA。
7、MERICANA)蛋白质、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、SAPAONARIAOFCINALIS抑制剂、白树毒素、MITOGELLIN、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、TRICOTHECENE、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)、放射性同位素、和前体药物活化酶。10根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述细胞毒素剂是选自211AT、131I、125I、90Y、186RE、188RE、153SM、212BI、32P和LU的放射性同位素。11根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述细胞毒素剂是选自碱性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P内酰胺。
8、酶和青霉素酰胺酶的前体药物活化酶。12一种分离核酸分子,其包含编码多肽的编码序列,其中所述多肽包含SEQIDNO139、SEQIDNO140、SEQIDNO141、SEQIDNO142、SEQIDNO143、SEQIDNO144、SEQIDNO145或SEQIDNO146。权利要求书CN104072614A2/3页313一种分离多肽,其包含SEQIDNO139、SEQIDNO140、SEQIDNO141、SEQIDNO142、SEQIDNO143、SEQIDNO144、SEQIDNO145或SEQIDNO146。14一种重组载体,其包含权利要求12的核酸分子。15一种宿主细胞,其包含权利要求1。
9、4的重组载体。16一种用于预防或治疗人受试者中纤维化的药物组合物,其包含权利要求14中任何一项的抗体或其抗原结合片段。17权利要求16的药物组合物,其中所述纤维化是肺纤维化。18权利要求17的药物组合物,其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化。19权利要求16的药物组合物,其中所述纤维化是肾纤维化或肝纤维化。20包含权利要求14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其用于治疗或预防人受试者中的急性肾损伤或急性肺损伤。21包含权利要求14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其用于治疗或预防人受试者中的癌症。22权利要求21的药物组合物,其中所述癌症是上皮癌。23权利要求21的药物。
10、组合物,其中所述癌症是口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾或结肠直肠癌。24权利要求21的药物组合物,其中所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒素剂缀合。25一种与V6特异性结合的人源化抗体,其包含SEQIDNO78的重链可变结构域和SEQIDNO75的轻链可变结构域。26一种与V6特异性结合的人源化抗体,其包含SEQIDNO79的重链可变结构域和SEQIDNO76的轻链可变结构域。27一种与V6特异性结合的人源化抗体,其包含SEQIDNO80的重链可变结构域和SEQIDNO77的轻链可变结构域。28一种用于预防或治疗哺乳动物中由V6介导的疾病的组合物,其包含权利要求2527中任何一。
11、项的抗体和药学上可接受的载体。29权利要求28的组合物在制备用于治疗具有由V6介导的疾病的受试者的药物中的用途,其中所述组合物用于减轻选自如下的疾病或减缓选自如下的疾病的发作纤维化、牛皮癣、癌症、急性肺损伤、急性肾损伤或阿尔波特氏综合征。30权利要求29的用途,其中所述受试者是人。31权利要求29的用途,其中所述疾病是纤维化。32权利要求31的用途,其中所述纤维化是硬皮病、瘢痕化、肝纤维化、肾纤维化或肺纤维化。33权利要求32的用途,其中所述纤维化是肺纤维化。34权利要求29的用途,其中所述疾病是牛皮癣。35权利要求29的用途,其中所述疾病是癌症。36权利要求35的用途,其中所述癌症是上皮癌、。
12、口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾、或结肠直肠癌。37权利要求36的用途,其中所述癌症是上皮癌38权利要求36的用途,其中所述癌症是皮肤癌。权利要求书CN104072614A3/3页439权利要求36的用途,其中所述癌症是子宫颈癌。40权利要求36的用途,其中所述癌症是卵巢癌。41权利要求36的用途,其中所述癌症是咽癌。42权利要求36的用途,其中所述癌症是喉癌。43权利要求36的用途,其中所述癌症是肺癌。44权利要求36的用途,其中所述癌症是乳腺癌。45权利要求36的用途,其中所述癌症是肾癌。46权利要求36的用途,其中所述癌症是结肠直肠癌。47权利要求29的用途,其中所述。
13、疾病是急性肺损伤。48权利要求29的用途,其中所述疾病是急性肾损伤。权利要求书CN104072614A1/165页5抗V6抗体及其用途0001本申请是申请号为2006800329578、申请日为2006年7月10日、发明名称为“抗V6抗体及其用途”的中国发明专利申请的分案申请。0002发明背景发明领域0003本发明在细胞生物学、免疫学和肿瘤学领域中。具体而言,本发明涉及识别V6整联蛋白的人源化抗体,所述抗体包含非人起源的可变区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还涉及关于其制备的过程、包含其的药物组合物,以及通过施用人源化抗V6抗体治疗各种疾病的方法。本发明还涉及在肿瘤细胞和组织表面上差异。
14、表达的整联蛋白V6的鉴定,这种差异表达在确定肿瘤细胞的转移潜能中的用途,以及使用与整联蛋白V6结合的配体特别是抗体,诊断和治疗/预防肿瘤转移以及用于清除残留转移性肿瘤细胞的方法。0004相关领域0005整联蛋白是结合细胞外基质蛋白且介导细胞细胞和细胞细胞外基质相互作用(一般称为细胞粘附事件)的细胞表面糖蛋白受体(RUOSLAHTI,E,JCLININVEST8715(1991);HYNES,RO,CELL691125(1992)。这些受体由非共价结合的ALPHA()和BETA()链构成,所述链和链组合以产生具有不同细胞和粘附特异性的各种异二聚蛋白质(ALBEDA,SM,LABINVEST684。
15、14(1993)。近期研究已暗示某些整联蛋白调节各种细胞过程,包括细胞粘附、迁移、侵袭、分化、增殖、凋亡和基因表达(ALBEDA,SM,LABINVEST68414(1993);JULIANO,R,CANCERMETREV132530(1994);RUOSLAHTI,E和REED,JC,CELL77477478(1994);以及RUOSLAHTI,E和GIANCOTTI,FG,CANCERCELLS1119126(1989);PLOW,HAAS等人2000;VANDERFLIER和SONNENBERG2001)。0006V6受体是作为细胞表面异二聚蛋白质表达的整联蛋白家族成员之一(BUSK,M。
16、等人,JBIOLCHEM267(9)57905796(1992)。尽管V亚单位可以与各种亚单位(L、3、5、6和8)形成异二聚体,但6亚单位只能与V亚单位作为异二聚体表达。V6整联蛋白已知是纤连蛋白、潜伏相关肽(LAP)和腱生蛋白C结合细胞表面受体,通过其上的RGD三肽结合位点与细胞外基质相互作用(BUSK,M等人,JBIOLCHEM26757905796(1992);WEINACKER,A等人,JBIOLCHEM26969406948(1994);PRIETO,AL等人,PROCNATLACADSCIUSA901015410158(1993)。尽管V6整联蛋白在超过10年前首次被鉴定和测序,。
17、但V6特别是在疾病中的生物学意义仍有待研究。V6的表达局限于上皮细胞,在其中它在健康组织中以相对低的水平表达,且在发育、损伤和创伤愈合期间显著上调(BREUSS,JM等人,JHISTOCHEMCYTOCHEM4115211527(1993);BREUSS,JM等人,JCELLSCI10822412251(1995);KOIVISTO,L等人,CELLADHESCOMMUNIC7245257(1999);ZAMBRUNO,G等人,JCELLBIOL129(3)853865(1995);HAKKINEN,L等人,JHISTOCHEMCYTOCHEM48(6)985998(2000)。日益增加的近期。
18、报道证实V6在上皮起源的癌症中是上调的,所述癌症包括结肠癌(NIU,J等人,INT说明书CN104072614A2/165页6JCANCER924048(2001);BATES,RC等人,JCLININVEST115339347(2005)、卵巢癌(AHMED,N等人,JCELLBIOCHEM84675686(2002);AHMED,N等人,JHISTOCHEMCYTOCHEM5013711379(2002);AHMED,N等人,CARCINOGEN23237244(2002)、鳞状细胞癌(KOIVISTO,L等人,EXPCELLRES2551017(2000);XUE,H等人,BIOCHEM。
19、BIOPHYSRESCOMM288610618(2001);THOMAS,GJ等人,JINVESTDERMATOL1176773(2001);THOMAS,GJ等人,INTJCANCER92641650(2001);RAMOS,DM等人,MATRIXBIOL21297307(2002);(AGREZ,M等人,BRJCANCER819097(1999);HAMIDI,S等人,BRJCANCER82(8)14331440(2000);KAWASHIMA,A等人,PATHOLRESPRACT99(2)5764(2003),和乳腺癌(ARIHIRO,K等人,BREASTCANCER71926(2000。
20、)。已报道V亚单位可能涉及肿瘤转移,和阻断这种亚单位从而可以预防转移(关于综述,参见IMHOF,BA等人,IN“ATTEMPTSTOUNDERSTANDMETASTASISFORMATIONI“UGNTHERT和WBIRCHMEIER,EDS,BERLINSPRINGERVERLAG,第195203页(1996)。0007V6整联蛋白在肿瘤细胞生物学中可能具有多重调节功能。近期研究已证实6亚单位的细胞外和细胞质结构域介导不同细胞活性。细胞外和跨膜结构域已显示介导TGF活化和粘附(SHEPPARD,D,CANCERANDMETASTASISREV24395402(2005);MUNGER,JS等。
21、人,CELL96319328(1999)。6亚单位的细胞质结构域包含独特的11氨基酸序列,所述氨基酸序列在介导V6调节的细胞增殖、MMP生产、迁移和前存活中是重要的(LI,X等人,JBIOLCHEM278(43)4164641653(2003);THOMAS,GJ等人,JINVESTDERM117(1)6773(2001);THOMAS,GJ等人,BRJCANCER87(8)859867(2002);JANES,SM和WATT,FM,JCELLBIOL166(3)419431(2004)。6亚单位已被克隆、表达和纯化(SHEPPARD等人,美国专利号6,787,322B2,所述专利的公开内容整。
22、体引入本文作为参考),和与V6整联蛋白选择性结合的功能阻断性抗体已被报道(WEINREB等人,JBIOLCHEM2791787517877(2004),其公开内容整体引入本文作为参考)。V6拮抗剂(包括某些单克隆抗体)已提议作为某些形式的急性肺损伤和纤维化的可能治疗(参见美国专利号6,692,741B2和WO99/07405,所述专利的公开内容整体引入本文作为参考)。0008V6可以通过与精氨酸甘氨酸天冬氨酸(“RGD”)基序的直接相互作用与几种配体结合,所述配体包括纤连蛋白、腱生蛋白、和潜伏相关肽1和3(LAPL和LAP3),潜伏前体形式的TGFL的N末端278氨基酸(BUSK,M等人,JB。
23、IOLCHEM267(9)57905796(1992);YOKOSAKI,Y等人,JBIOLCHEM271(39)2414424150(1996);HUANG,XZ等人,JCELLSCI11121892195(1998);MUNGER,JS等人,CELL96319328(1999)。TGF细胞因子作为潜伏复合物合成,所述潜伏复合物具有与成熟活性TGF细胞因子的C末端非共价结合的N末端LAP。潜伏TGF复合物不能与其同源受体结合,且因此直到转换成活性形式才是生物学活性的(BARCELLOSHOFF,MH,JMAMMGLANDBIOLL(4)353363(1996);GLEIZES,PE等人,ST。
24、EMCELLS15(3)190197(1997);MUNGER,JS等人,KIDINT5113761382(1997);KHALIL,N,MICROBESINFECT1(15)12551263(1999)。V6与LAPL或LAP3结合导致潜伏前体形式的TGFL和TGF3活化(MUNGER,JS等人,CELL96319328(1999),被提议是因为潜伏复合物中的构象变化允许TGF与其受体结合。因此,V6的表达上调可以导致TGF局部活化,这依次可以激活下游事件级联事件。说明书CN104072614A3/165页70009TGFL细胞因子是调节细胞增殖、分化和免疫应答的多效生长因子(WAHL,SM。
25、,JEXPMED18015871590(1994);MASSAGUE,J,ANNUREVBIOCHEM67753791(1998);CHEN,W和WAHL,SM,TGFRECEPTORS,SIGNALINGPATHWAYSANDAUTOIMMUNITY,BASELKARGER,第6291页(2002);THOMAS,DA和MASSAGUE,J,CANCERCELL8369380(2005)。TGFL在癌症中发挥的作用是两面的。虽然TGF被公认是肿瘤抑制物和生长抑制活性,但许多肿瘤进化出针对TGF1的生长抑制活性的抗性(YINGLING,JM等人,NATUREREVDRUGDISCOV3(12)。
26、10111022(2004);AKHURST,RJ等人,TRENDSCELLBIOL11(11)S44S51(2001);BALMAIN,A和AKHURST,RJ,NATURE428(6980)271272(2004)。在已建立的肿瘤中,TGFL表达和活性已涉及促进肿瘤存活、进展和转移(AKHURST,RJ等人,TRENDSCELLBIOL11(11)S44S51(2001);MURAOKA,RS等人,JCLININVEST109(12)155L(2002);YANG,YA等人,JCLININVEST109(12)16071615(2002)。这假定通过局部肿瘤基质环境中的自分泌和旁分泌效应介。
27、导,所述效应包括TGF对免疫监督、血管发生和增加的肿瘤组织间隙压的影响。几项研究已显示抑制TGF1的抗肿瘤和抗转移效应(AKHURST,RJ,JCLININVEST109(12)15331536(2002);MURAOKA,RS等人,JCLININVEST109(12)L55L(2002);YINGLING,JM等人,NATREVDRUGDISCOV3(12)10111022(2004);YANG,YA等人,JCLININVEST109(12)L6071615(2002);HALDER,SK等人,NEOPLASIA7(5)509521(2005);IYER,S等人,CANCERBIOLTHER。
28、4(3)26L266(2005)。0010V6在肿瘤特别是在肿瘤基质界面上的表达增加,可能反映TGF1局部激活的独特机制以及促进肿瘤存活、侵袭和转移的能力。在人转移灶中高水平的表达推断V6在建立转移灶中的潜在作用,这与V6可以介导上皮至间充质过渡、肿瘤细胞体外侵袭、和表达与小鼠模型中的转移相关的先前报道一致(BATES,RC等人,JCLININVEST115(2)339347(2005);THOMAS,GJ等人,BRJCANCER87(8)859867(2002);MORGAN,MR等人,JBIOLCHEM279(25)2653326539(2004)。0011我们先前已描述了有效和选择性抗V。
29、6单克隆抗体(MABS)的产生,所述抗V6单克隆抗体与人和鼠类形式的V6结合,且阻断V6与其配体的结合和V6介导的TGF1激活(WEINREB,PH等人,JBIOLCHEM279(17)1787517887(2004)。同样在整体引入本文作为参考的PCT公开WO03/100033中描述,开发和表征了针对V6的高亲和力抗体,包括此类抗体互补决定区(CDRS)中的关键氨基酸残基的鉴定和分析。特别地,这些高亲和力抗体(A)与V6特异性结合;(B)抑制V6与其配体例如LAP、纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白的结合,其IC50值低于10D5的那种(国际专利申请公开WO99/07405);(C)阻断TGF激活。
30、;(D)包含在CDRS中提供针对V6的结合特异性的某些氨基酸序列;(E)与6亚单位特异性结合;和/或(F)在免疫染色操作中识别V6,例如石蜡包埋组织的免疫染色。0012WO03/100033还描述了下述发现与V6结合的抗体可以分类为生物物理学不同的类别和亚类。一类抗体显示阻断配体(例如,LAP)与V6结合的能力(阻断剂)。这类抗体可以进一步分成阳离子依赖性阻断剂和阳离子非依赖性阻断剂亚类。某些阳离子依赖性阻断剂包含精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)肽序列,而阳离子非依赖性阻断剂不包含RGD序列。另一类抗体显示与V6结合的能力,但不阻断V6与配体的结合(非阻断说明书CN104072614A4/165。
31、页8剂)。0013此外,WO03/100033公开了包含重链和轻链的抗体,所述重链和轻链的互补决定区(CDR)1、2和3由某些氨基酸序列组成,所述氨基酸序列提供针对V6的结合特异性。WO03/100033还提供了与V6特异性结合但不抑制V6与潜伏相关肽(LAP)结合的抗体,以及与相同表位结合的抗体。0014WO03/100033进一步公开了杂交瘤61A8、62B10、63G9、68G6、62B1、62A1、62E5、71G10、77G5和71C5细胞,包含编码序列的分离核酸,和包含抗V6抗体的氨基酸序列的分离多肽。特别地,WO03/100033公开了作为通过杂交瘤61A8、63G9、68G6、。
32、62B1、62B10、62A1、62E5、71G10、77G5或71C5生产的抗体,包含重和轻链多肽序列的抗V6抗体。几种杂交瘤根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”;POBOX1549,MANASSAS,VA20108,USA)。特别地,杂交瘤克隆63G9和68G6于2001年8月16日保藏,且分别具有登记号ATCCPTA3649和PTA3645。由杂交瘤63G9和68G6生产的鼠类抗体在本申请中进一步探究其作为人源化抗体的潜在发展。0015鼠类单克隆抗体3G9是鼠类IGGL,从用人可溶性V6免疫的6整联蛋白/小鼠中分离的抗体(HUANG等人,JCELLBIOL13392。
33、1928(1996)。3G9抗体特异性识别在损伤、纤维化和癌症期间以上调水平表达的V6整联蛋白表位(参见,例如,THOMAS等人,JINVESTDERMATOLOGY1176773(2001);BRUNTON等人,NEOPLASIA3215226(2001);AGREZ等人,INTJCANCER819097(1999);BREUSS,JCELLSCIENCE10822412251(1995)。它不与其他V整联蛋白结合且与人和鼠类分子交叉反应。鼠类单克隆抗体3G9已描述阻断V6与LAP的结合,如通过阻断配体与纯化的人可溶性V6或6表达细胞的结合,从而抑制TGF受体活化的促纤维化活性所确定的(参见。
34、WO03/100033)。它还已显示抑制V6介导的TGF活化,其IC50值低于已知V6抗体10D5的那种(HUANG等人,JCELLSCI11121892195(1998)。0016如WO03/100033中所述,鼠类单克隆抗体8G6是鼠类IGGL,同样识别V6整联蛋白表位的抗体。鼠类单克隆抗体8G6是阳离子依赖性、高亲和力V6阻断剂,显示抑制V6介导的TGF活化的能力,其IC50值低于已知10D5的那种(参见WO03/100033)。0017如WO03/100033中所述,3G9和8G6鼠类抗体在预防肾和肺纤维化方面有效。此外,鼠类抗体3G9能够有效抑制人肿瘤异种移植模型中的肿瘤生长,暗示V。
35、6在癌症病理学中的潜在作用和使用针对V6抗体的此类阻断的效力。0018因此,需要开发在人中抗原性更少、且可以用于治疗涉及V6途径的疾病的V6抗体。随着重组DNA方法的出现,已可能在结构上改造抗体基因、和产生具有不能通过杂交瘤技术获得的特性的改良抗体分子。在治疗领域中,这种方法的一个目标是通过修饰其初级氨基酸结构减少啮齿类动物单克隆抗体在人中的免疫原性。治疗抗体免疫原性的减少是希望的,因为免疫应答的诱导可以在患者中引起一系列不利效应,从治疗抗体的加速清除,功效随之丧失,至最极端的致命性过敏反应。0019减少外源单克隆抗体的免疫原性的一种策略是用人起源的类似结构域替换单克隆抗体的轻和重链恒定结构域。
36、,而使外源抗体的可变区结构域保持完整。轻和重链的可变区结构域负责抗体和抗原之间的相互作用。具有与人恒定结构域连接的小鼠可变结构域的嵌合抗体分子,通常以与嵌合体来源于其的小鼠抗体相同的亲和常数结合抗原。此类嵌合说明书CN104072614A5/165页9抗体在人中比其完全小鼠配对物免疫原性更少。然而,保留完整鼠类可变结构域的抗体往往在大部分患者中引起免疫应答。0020可预测人将设定针对整个鼠类可变结构域的免疫应答,因此,甚至在此类标准嵌合抗体的临床试验已报道前,就已开始获得具有更多人特征的可变结构域的努力。通常称为“人源化”的一类方法旨在通过重组构建具有小鼠和人特征的抗体可变结构域,将鼠类单克隆。
37、抗体的可变结构域转变成更人的形式。人源化策略基于抗体结构数据的几个一致同意的理解。首先,可变结构域包含在种类内保守、但在进化上遥远的种类例如小鼠和人之间不同的肽序列邻接段。其次,其他邻接段在种类内不是保守的、但即使在相同个体内的抗体产生细胞之间也不同。第三,抗体和抗原之间的接触主要通过可变结构域的非保守区域发生。第四,抗体可变结构域的分子结构在种类中非常相似,使得种类之间的相应氨基酸残基位置可以无需实验数据单独基于位置来鉴定。0021人源化策略共有下述前提用人抗体相应位置中发现的残基替换鼠类序列特征的氨基酸残基,将减少所得到的抗体在人中的免疫原性。然而,种类之间的序列替换通常导致抗体与其抗原的。
38、结合减少。人源化技术因此存在下述平衡替换原始鼠类序列以减少免疫原性,和需要人源化分子以保留足够的抗原结合以在治疗上有用。这种平衡已使用2种方法达到。0022在由美国专利号NO5,869,619例示的一种方法中,特有的人残基代替鼠类可变结构域残基,所述鼠类可变结构域残基被确定或预测(I)在与抗原的相互作用中不发挥显著的化学作用、和(II)与伸出到溶剂内的侧链一起放置。因此,远离抗原结合位点的外部残基被人源化,而内部残基、抗原结合位点、和形成可变结构域之间的界面的残基保留鼠类的。这种方法的一个缺点是需要相当广泛的实验数据,以确定残基在抗原结合中不发挥显著的化学作用,还是在特定三维抗体结构中将位于溶。
39、剂中。0023在由美国专利号5,225,539例示的另一种更普遍的方法中,视为保守的鼠类可变结构域肽序列的邻接段用来自人抗体的相应段替换。在这种更普遍的方法中,所有可变结构域残基都是人源化的,除了涉及抗原结合的非保守区域外。为了确定用于替换的合适邻接段,美国专利号5,225,539利用先前已由WU和KABAT,JEXPMED132(2)211250(1970)开发的抗体可变结构域序列分类。0024WU和KABAT开创了抗体肽序列比对,并且他们在这点上的贡献是数倍首先,通过研究可变结构域之间的序列相似性,他们鉴定了在所有脊椎动物种类的所有抗体中或多或少同源的相应残基,因为它们采取类似的三维结构、。
40、发挥类似的功能作用、与邻近残基类似地相互作用、和存在于类似的化学环境中。其次,他们设计了其中同源免疫球蛋白残基被分配相同位置编号的肽序列编号系统。无需依赖除序列自身以外的任何实验数据,本领域技术人员即可明确地将现在通常称为KABAT编号分配给任何可变结构域序列。第三,对于每个KABAT编号序列位置,KABAT和WU计算出变异性,所述变异性意指当可变结构域序列比对时更少或更多可能的氨基酸的发现。他们鉴定了包埋在4个变异性较少的邻接区域内的3个高变异性的邻接区域。其他工作者先前已指出大约在这些区域(高变区)中的变异性,且断定高变区表示用于抗原结合的氨基酸残基。KABAT和WU正式区分构成这些可变段。
41、的残基,且将这些命名为“互补决定区”(CDRS),指抗体和抗原之间的化学互补性。在可变结构域三维折叠而不是抗原识别中的作用,归于现在称为“框架区”的剩余变异性较少的区域。说明书CN104072614A6/165页10第四,KABAT和WU建立了抗体肽和核酸序列的公众数据库,所述公众数据库继续被维持且是本领域技术人员众所周知的。0025由美国专利号5,225,539公开的使用KABAT分类的人源化方法,产生包含来自一种抗体的CDR和来自另一种抗体的框架区的嵌合抗体,所述第二种抗体在种类起源、特异性、亚类或其他特征方面不同。然而,没有具体序列或特性归于框架区,事实上,美国专利号5,225,539教。
42、导任何框架组可以与任何CDR组进行组合。框架序列因此已被识别为对赋予抗体可变区的三维结构是重要的,所述三维结构是保持良好的抗原结合所需的。本领域中的后续发展已在美国专利号5,225,539的范围内改进,以处理相对于相应的小鼠抗体,使用某些人源化抗体观察到的对于抗原的亲合力丧失。0026美国专利号5,693,761公开了关于美国专利号5,225,539用于抗体人源化的一种改进,且基于下述前提将亲合力丧失归于人源化框架中的结构基序问题,由于立体或其他化学不相容性,所述结构基序干扰CDRS折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决这个问题,美国专利号5,693,761教导使用在线性肽序列中与待。
43、人源化的小鼠抗体的框架序列紧密同源的人框架序列。因此,美国专利号5,693,761的方法集中于种类间的框架序列比较。一般地,所有可用的人可变结构域序列与特定小鼠序列比较,且计算出相应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人可变结构域以提供用于人源化计划的框架序列。美国专利号5,693,761还教导在人源化框架中保留来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的,所述氨基酸残基对支持能够结合的构象的CDRS是关键的。0027在其他方法中,通过使单个残基回复小鼠序列且如RIECHMANN等人,NATURE332(6162)323327(1988)所述测定抗原结合,获得低亲和力的人源化构建体后,在实。
44、验上测定特定框架氨基酸残基的关键性。用于鉴定框架序列中的氨基酸关键性的另一种示例方法由美国专利号5,821,337和美国专利号5,859,205公开。这些参考文献公开了框架中的特异性KABAT残基位置,所述残基位置在人源化抗体中可能需要用相应的小鼠氨基酸置换,以保留亲合力。因此,所得到的部分人和部分小鼠的构建框架仍经常显示人免疫原性或减少的抗原结合,从而在框架构建中需要众多反复以获得用于治疗用途的合适框架。0028本领域因此需要开发在人中抗原性更少的V6抗体。本发明为产生与V6特异性反应的人源化抗体作准备。本发明还提供了用于制备此类人源化抗体的方法,通过提供可靠鉴定合适的人框架序列以支持非人C。
45、DR区域的人源化抗体,和进一步提供保留高抗原结合、在人中具有低免疫原性的人源化抗体。本发明还提供了与V6反应的此类人源化抗体在各种疾病和病症治疗、诊断和/或预防中的用途。0029发明简述0030本发明至少部分基于针对V6的高亲和力人源化抗体的开发和表征,包括此类抗体互补决定区(CDRS)中的关键氨基酸残基的鉴定和分析,以及框架序列中的关键氨基酸残基的鉴定和分析。0031在一个实施方案中,本发明涉及具有对于V6整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体,其中所述抗体分别包含SEQIDNO1和SEQIDNO2的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类3G9抗体的人源化,在某些实施方案中,人源化抗体。
46、包含作为其互补决定区(CDR)1、2和3的分别由SEQIDNO1的氨基酸残基3135、5065和98109限定的重链。在某些实施方案中,人源化抗体包含作为其CDR1、2和3的分别由说明书CN104072614A107/165页11SEQIDNO2的氨基酸残基2435、5157和9098限定的轻链。在某些实施方案中,人源化抗体包含作为其框架区(FR)1、2、3和4的分别由SEQIDNO1的氨基酸残基130、3649、6697和110120限定的重链。在某些实施方案中,人源化抗体包含作为其框架区(FR)1、2、3和4的分别由SEQIDNO2的氨基酸残基123、3650、5889和99108限定的轻。
47、链。0032在某些实施方案中,人源化抗体包含在SEQIDNO1的重链,且在SEQIDNO1的重链包含至少一个下述氨基酸置换Q3M和N74S。在某些实施方案中,人源化抗体包含SEQIDNO2的轻链,且SEQIDNO2的轻链包含至少一个下述氨基酸置换E1Q、L47W、I58V、A60V和Y87F。0033在某些实施方案中,人源化抗体包含重链形式1(“HV1”),其中重链由具有氨基酸置换Q3M和N74S的SEQIDNO1组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含重链形式2(“HV2”),其中重链由具有氨基酸置换N74S的SEQIDNO1组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含重链形式3(“HV3”),其中。
48、重链由SEQIDNO1组成。0034在某些实施方案中,人源化抗体包含轻链形式1(“LV1”),其中轻链由具有氨基酸置换L47W、I58V、A60V和Y87F的SEQIDNO2组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含轻链形式2(“LV2”),其中轻链由具有氨基酸置换L47W和I58V的SEQIDNO2组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含轻链形式3(“LV3”),其中轻链由具有氨基酸置换L47W的SEQIDNO2组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含轻链形式4(“LV4”),其中轻链由具有氨基酸置换E1Q和L47WSEQIDNO2组成。在某些实施方案中,人源化抗体包含轻链形式5(“LV5”),其中。
49、轻链由SEQIDNO2组成。0035在某些实施方案中,人源化抗体包含具有HV3和LV5的重和轻链可变结构域,其中重链由SEQIDNO1组成,和其中轻链由SEQIDNO2组成。0036在某些实施方案中,人源化抗体具有来源于鼠类63G9抗体(ATCC登记号PTA3649)的CDR。0037在相关实施方案中,本发明还涉及具有对于V6整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体,其中所述抗体包含SEQIDNO3和SEQIDNO4的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类8G6抗体的人源化。在某些实施方案中,人源化抗体包含下述重链,作为其互补决定区(CDR)1、2和3分别由SEQIDNO3的氨基酸残基(即,除了某些保守变异外)3135、5066和99115限定。在某些实施方案中,人源化抗体包含下述轻链,作为其CDR。