抗ΑSUBV/SUBΒSUB6/SUB抗体及其用途.pdf

本发明提供了识别αvβ6整联蛋白的人源化抗体及其用途，所述抗体包含非人起源的可变区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还提供了包含所述抗体的药物组合物及其应用。本发明另外涉及用于制备此类抗体的方法。

1.  一种与α_vβ₆特异性结合的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域含有SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146中所示的氨基酸序列，所述轻链可变结构域含有SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142或SEQ ID NO：143中所示的氨基酸序列。

2.  一种与α_vβ₆特异性结合的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
（i）重链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO：1的氨基酸残基31－35、50－65和98－109限定的重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；和
（ii）轻链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO：2的氨基酸残基24－35、51－57和90－98限定的轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

3.  权利要求2的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO：1的氨基酸残基1－30、36－49、66－97和110－120限定的框架区FR1、FR2、FR3和FR4。

4.  权利要求2的抗体，其中所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO：2的氨基酸残基1－23、36－50、58－89和99－108限定的框架区FR1、FR2、FR3和FR4。

5.  根据权利要求1－4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG抗体。

6.  根据权利要求1－4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。

7.  根据权利要求1－4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自：Fab片段、Fab'片段、F（ab'）₂片段、Fd片段、Fv片段、scFv、二硫键合的Fv。

8.  根据权利要求1－4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述的抗体与细胞毒素剂缀合。

9.  根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒素剂选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、阿霉素、氨甲蝶呤、5－氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、卡里奇霉素（calicheamicin）、美登素、trichothene、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐（Aleuritesfordii）蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆（Phytolaca americana）蛋白质、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、tricothecene、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶）、放射性同位素、和前体药物活化酶。

10.  根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒素剂是选自²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素。

11.  根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒素剂是选自碱性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D－丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P－内酰胺酶和青霉素酰 胺酶的前体药物活化酶。

12.  一种分离核酸分子，其包含编码多肽的编码序列，其中所述多肽包含SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146。

13.  一种分离多肽，其包含SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146。

14.  一种重组载体，其包含权利要求12的核酸分子。

15.  一种宿主细胞，其包含权利要求14的重组载体。

16.  一种用于预防或治疗人受试者中纤维化的药物组合物，其包含权利要求1－4中任何一项的抗体或其抗原结合片段。

17.  权利要求16的药物组合物，其中所述纤维化是肺纤维化。

18.  权利要求17的药物组合物，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化。

19.  权利要求16的药物组合物，其中所述纤维化是肾纤维化或肝纤维化。

20.  包含权利要求1－4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗或预防人受试者中的急性肾损伤或急性肺损伤。

21.  包含权利要求1－4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗或预防人受试者中的癌症。

22.  权利要求21的药物组合物，其中所述癌症是上皮癌。

23.  权利要求21的药物组合物，其中所述癌症是口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾或结肠直肠癌。

24.  权利要求21的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒素剂缀合。

25.  一种与α_vβ₆特异性结合的人源化抗体，其包含SEQ ID NO：78的重链可变结构域和SEQ ID NO：75的轻链可变结构域。

26.  一种与α_vβ₆特异性结合的人源化抗体，其包含SEQ ID NO：79的重链可变结构域和SEQ ID NO：76的轻链可变结构域。

27.  一种与α_vβ₆特异性结合的人源化抗体，其包含SEQ ID NO：80的重链可变结构域和SEQ ID NO：77的轻链可变结构域。

28.  一种用于预防或治疗哺乳动物中由α_vβ₆介导的疾病的组合物，其包含权利要求25－27中任何一项的抗体和药学上可接受的载体。

29.  权利要求28的组合物在制备用于治疗具有由α_vβ₆介导的疾病的受试者的药物中的用途，其中所述组合物用于减轻选自如下的疾病或减缓选自如下的疾病的发作：纤维化、牛皮癣、癌症、急性肺损伤、急性肾损伤或阿尔波特氏综合征。

30.  权利要求29的用途，其中所述受试者是人。

31.  权利要求29的用途，其中所述疾病是纤维化。

32.  权利要求31的用途，其中所述纤维化是硬皮病、瘢痕化、肝纤维化、肾纤维化或肺纤维化。

33.  权利要求32的用途，其中所述纤维化是肺纤维化。

34.  权利要求29的用途，其中所述疾病是牛皮癣。

35.  权利要求29的用途，其中所述疾病是癌症。

36.  权利要求35的用途，其中所述癌症是上皮癌、口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾、或结肠直肠癌。

37.  权利要求36的用途，其中所述癌症是上皮癌.

38.  权利要求36的用途，其中所述癌症是皮肤癌。

39.  权利要求36的用途，其中所述癌症是子宫颈癌。

40.  权利要求36的用途，其中所述癌症是卵巢癌。

41.  权利要求36的用途，其中所述癌症是咽癌。

42.  权利要求36的用途，其中所述癌症是喉癌。

43.  权利要求36的用途，其中所述癌症是肺癌。

44.  权利要求36的用途，其中所述癌症是乳腺癌。

45.  权利要求36的用途，其中所述癌症是肾癌。

46.  权利要求36的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。

47.  权利要求29的用途，其中所述疾病是急性肺损伤。

48.  权利要求29的用途，其中所述疾病是急性肾损伤。

抗-α_vβ₆ 抗体及其用途
本申请是申请号为200680032957.8、申请日为2006年7月10日、发明名称为“抗-α_vβ₆抗体及其用途”的中国发明专利申请的分案申请。 
发明背景 
发明领域
本发明在细胞生物学、免疫学和肿瘤学领域中。具体而言，本发明涉及识别α_vβ₆整联蛋白的人源化抗体，所述抗体包含非人起源的可变区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还涉及关于其制备的过程、包含其的药物组合物，以及通过施用人源化抗α_vβ₆抗体治疗各种疾病的方法。本发明还涉及在肿瘤细胞和组织表面上差异表达的整联蛋白α_vβ₆的鉴定，这种差异表达在确定肿瘤细胞的转移潜能中的用途，以及使用与整联蛋白α_vβ₆结合的配体特别是抗体，诊断和治疗/预防肿瘤转移以及用于清除残留转移性肿瘤细胞的方法。 
相关领域 
整联蛋白是结合细胞外基质蛋白且介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用（一般称为细胞粘附事件）的细胞表面糖蛋白受体（Ruoslahti，E.，J.Clin.Invest.87：1-5（1991）；Hynes，R.O.，Cell69：11-25（1992））。这些受体由非共价结合的alpha（α）和beta（β）链构成，所述α链和β链组合以产生具有不同细胞和粘附特异性的各种异二聚蛋白质（Albeda，S.M.，Lab.Invest.68：4-14（1993））。近期研究已暗示某些整联蛋白调节各种细胞过程，包括细胞粘附、迁移、侵袭、分化、增殖、凋亡和基因表达（Albeda，S.M.，Lab.Invest.68：4-14（1993）；Juliano，R.，Cancer Met.Rev.13：25-30（1994）；Ruoslahti，E.和Reed，J.C.，Cell77：477-478（1994）；以及Ruoslahti， E.和Giancotti，F.G.，Cancer Cells1：119-126（1989）；Plow，Haas等人2000；van der Flier和Sonnenberg2001）。 
α_vβ₆受体是作为细胞表面异二聚蛋白质表达的整联蛋白家族成员之一（Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267（9）：5790-5796（1992））。尽管α_v亚单位可以与各种β亚单位（β_l、β₃、β₅、β₆和β₈）形成异二聚体，但β₆亚单位只能与α_v亚单位作为异二聚体表达。α_vβ₆整联蛋白已知是纤连蛋白、潜伏相关肽（LAP）和腱生蛋白C结合细胞表面受体，通过其上的RGD三肽结合位点与细胞外基质相互作用（Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267：5790-5796（1992）；Weinacker，A.等人，J.Biol.Chem.269：6940-6948（1994）；Prieto，A.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA90：10154-10158（1993））。尽管α_vβ₆整联蛋白在超过10年前首次被鉴定和测序，但α_vβ₆特别是在疾病中的生物学意义仍有待研究。α_vβ₆的表达局限于上皮细胞，在其中它在健康组织中以相对低的水平表达，且在发育、损伤和创伤愈合期间显著上调（Breuss，J.M.等人，J.Histochem.Cytochem.41：1521-1527（1993）；Breuss，J.M.等人，J.Cell Sci.108：2241-2251（1995）；Koivisto，L.等人，CellAdhes.Communic.7：245-257（1999）；Zambruno，G.等人，J.Cell Biol.129（3）：853-865（1995）；Hakkinen，L.等人，J.Histochem.Cytochem.48（6）：985-998（2000））。日益增加的近期报道证实α_vβ₆在上皮起源的癌症中是上调的，所述癌症包括结肠癌（Niu，J.等人，Int.J.Cancer92：40-48（2001）；Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115：339-347（2005））、卵巢癌（Ahmed，N.等人，J.Cell Biochem.84：675-686（2002）；Ahmed，N.等人，J.Histochem.Cytochem.50：1371-1379（2002）；Ahmed，N.等人，Carcinogen.23：237-244（2002））、鳞状细胞癌（Koivisto，L.等人，Exp.Cell Res.255：10-17（2000）；Xue，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.288：610-618（2001）；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Dermatol117：67-73（2001）；Thomas， G.J.等人，Int.J.Cancer92：641-650（2001）；Ramos，D.M.等人，Matrix Biol.21：297-307（2002）；（Agrez，M.等人，Br.J.Cancer81：90-97（1999）；Hamidi，S.等人，Br.J.Cancer82（8）：1433-1440（2000）；Kawashima，A.等人，Pathol.Res.Pract.99（2）：57-64（2003）），和乳腺癌（Arihiro，K.等人，Breast Cancer7：19-26（2000））。已报道α_v亚单位可能涉及肿瘤转移，和阻断这种亚单位从而可以预防转移（关于综述，参见Imhof，B.A.等人，in："Attempts to Understand Metastasis Formation I."U.Günthert和W.Birchmeier，eds.，Berlin：Springer-Verlag，第195-203页（1996））。 
α_vβ₆整联蛋白在肿瘤细胞生物学中可能具有多重调节功能。近期研究已证实β₆亚单位的细胞外和细胞质结构域介导不同细胞活性。细胞外和跨膜结构域已显示介导TGF-β活化和粘附（Sheppard，D.，Cancer and Metastasis Rev.24：395-402（2005）；Munger，J.S.等人，Cell96：319-328（1999））。β₆亚单位的细胞质结构域包含独特的11氨基酸序列，所述氨基酸序列在介导α_vβ₆调节的细胞增殖、MMP生产、迁移和前存活中是重要的（Li，X.等人，J.Biol.Chem.278（43）：41646-41653（2003）；Thomas，G.J.等人，J.Invest.Derm.117（1）：67-73（2001）；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer87（8）：859-867（2002）；Janes，S.M.和Watt，F.M.，J.Cell Biol166（3）：419-431（2004））。β₆亚单位已被克隆、表达和纯化（Sheppard等人，美国专利号6,787,322B2，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考），和与α_vβ₆整联蛋白选择性结合的功能阻断性抗体已被报道（Weinreb等人，J.Biol.Chem.279：17875-17877（2004），其公开内容整体引入本文作为参考）。α_vβ₆拮抗剂（包括某些单克隆抗体）已提议作为某些形式的急性肺损伤和纤维化的可能治疗（参见美国专利号6,692,741B2和WO99/07405，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考）。 
α_vβ₆可以通过与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（“RGD”）基序的直接 相互作用与几种配体结合，所述配体包括纤连蛋白、腱生蛋白、和潜伏相关肽1和3（LAPl和LAP3），潜伏前体形式的TGF-βl的N末端278氨基酸（Busk，M.等人，J.Biol.Chem.267（9）：5790-5796（1992）；Yokosaki，Y.等人，J.Biol.Chem.271（39）：24144-24150（1996）；Huang，X.Z.等人，J.Cell Sci.111：2189-2195（1998）；Munger，J.S.等人，Cell96：319-328（1999））。TGF-β细胞因子作为潜伏复合物合成，所述潜伏复合物具有与成熟活性TGF-β细胞因子的C末端非共价结合的N末端LAP。潜伏TGF-β复合物不能与其同源受体结合，且因此直到转换成活性形式才是生物学活性的（Barcellos-Hoff，M.H.，J Mamm.Gland Biol.l（4）：353-363（1996）；Gleizes，P.E.等人，Stem Cells15（3）：190-197（1997）；Munger，J.S.等人，Kid.Int.51：1376-1382（1997）；Khalil，N.，Microbes Infect.1（15）：1255-1263（1999））。α_vβ₆与LAPl或LAP3结合导致潜伏前体形式的TGF-βl和TGF-β3活化（Munger，J.S.等人，Cell96：319-328（1999）），被提议是因为潜伏复合物中的构象变化允许TGF-β与其受体结合。因此，α_vβ₆的表达上调可以导致TGF-β局部活化，这依次可以激活下游事件级联事件。 
TGF-βl细胞因子是调节细胞增殖、分化和免疫应答的多效生长因子（Wahl，S.M.，J.Exp.Med.180：1587-1590（1994）；Massague，J.，Annu.Rev.Biochem.67：753-791（1998）；Chen，W.和Wahl，S.M.，TGF-β：Receptors，Signaling Pathways and Autoimmunity，Basel：Karger，第62-91页（2002）；Thomas，D.A.和Massague，J.，Cancer Cell8：369-380（2005））。TGF-βl在癌症中发挥的作用是两面的。虽然TGF-β被公认是肿瘤抑制物和生长抑制活性，但许多肿瘤进化出针对TGF-β1的生长抑制活性的抗性（Yingling，J.M.等人，Nature Rev.Drug Discov.3（12）：1011-1022（2004）；Akhurst，RJ.等人，Trends Cell Biol.11（11）：S44-S51（2001）；Balmain， A.和Akhurst，R.J.，Nature428（6980）：271-272（2004））。在已建立的肿瘤中，TGF-βl表达和活性已涉及促进肿瘤存活、进展和转移（Akhurst，R.J.等人，Trends Cell Biol.11（11）：S44-S51（2001）；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109（12）：155l（2002）；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109（12）：1607-1615（2002））。这假定通过局部肿瘤-基质环境中的自分泌和旁分泌效应介导，所述效应包括TGF-β对免疫监督、血管发生和增加的肿瘤组织间隙压的影响。几项研究已显示抑制TGF-β1的抗肿瘤和抗转移效应（Akhurst，R.J.，J.Clin.Invest.109（12）：1533-1536（2002）；Muraoka，R.S.等人，J.Clin.Invest.109（12）：l55l（2002）；Yingling，J.M.等人，Nat.Rev.DrugDiscov.3（12）：1011-1022（2004）；Yang，Y.A.等人，J.Clin.Invest.109（12）：l607-1615（2002）；Halder，S.K.等人，Neoplasia7（5）：509-521（2005）；Iyer，S.等人，Cancer Biol.Ther.4（3）：26l-266（2005））。 
α_vβ₆在肿瘤特别是在肿瘤-基质界面上的表达增加，可能反映TGF-β1局部激活的独特机制以及促进肿瘤存活、侵袭和转移的能力。在人转移灶中高水平的表达推断α_vβ₆在建立转移灶中的潜在作用，这与α_vβ₆可以介导上皮至间充质过渡、肿瘤细胞体外侵袭、和表达与小鼠模型中的转移相关的先前报道一致（Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115（2）：339-347（2005）；Thomas，G.J.等人，Br.J.Cancer87（8）：859-867（2002）；Morgan，M.R.等人，J.Biol.Chem.279（25）：26533-26539（2004））。 
我们先前已描述了有效和选择性抗α_vβ₆单克隆抗体（mAbs）的产生，所述抗α_vβ₆单克隆抗体与人和鼠类形式的α_vβ₆结合，且阻断α_vβ₆与其配体的结合和α_vβ₆介导的TGF-β1激活（Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem.279（17）：17875-17887（2004））。同样在整体引入本文作为参考的PCT公开WO03/100033中描述，开发和表征了针对α_v β₆的高亲和力抗体，包括此类抗体互补决定区（CDRs）中的关键氨基酸残基的鉴定和分析。特别地，这些高亲和力抗体（a）与α_vβ₆特异性结合；（b）抑制α_vβ₆与其配体例如LAP、纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白的结合，其IC₅₀值低于10D5的那种（国际专利申请公开WO99/07405）；（c）阻断TGF-β激活；（d）包含在CDRs中提供针对α_vβ₆的结合特异性的某些氨基酸序列；（e）与β₆亚单位特异性结合；和/或（f）在免疫染色操作中识别α_vβ₆，例如石蜡包埋组织的免疫染色。 
WO03/100033还描述了下述发现：与α_vβ₆结合的抗体可以分类为生物物理学不同的类别和亚类。一类抗体显示阻断配体（例如，LAP）与α_vβ₆结合的能力（阻断剂）。这类抗体可以进一步分成阳离子依赖性阻断剂和阳离子非依赖性阻断剂亚类。某些阳离子依赖性阻断剂包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽序列，而阳离子非依赖性阻断剂不包含RGD序列。另一类抗体显示与α_vβ₆结合的能力，但不阻断α_vβ₆与配体的结合（非阻断剂）。 
此外，WO03/100033公开了包含重链和轻链的抗体，所述重链和轻链的互补决定区（CDR）1、2和3由某些氨基酸序列组成，所述氨基酸序列提供针对α_vβ₆的结合特异性。WO03/100033还提供了与α_vβ₆特异性结合但不抑制α_vβ₆与潜伏相关肽（LAP）结合的抗体，以及与相同表位结合的抗体。 
WO03/100033进一步公开了杂交瘤6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5和7.1C5细胞，包含编码序列的分离核酸，和包含抗α_vβ₆抗体的氨基酸序列的分离多肽。特别地，WO03/100033公开了作为通过杂交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5生产的抗体，包含重和轻链多肽序列的抗α_vβ₆抗体。几种杂交瘤根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心（“ATCC”；P.O.Box1549，Manassas，VA20108，USA）。特别地，杂交瘤克隆6.3G9和6.8G6于2001年8月16日保藏，且分别 具有登记号ATCC PTA-3649和PTA-3645。由杂交瘤6.3G9和6.8G6生产的鼠类抗体在本申请中进一步探究其作为人源化抗体的潜在发展。 
鼠类单克隆抗体3G9是鼠类IgGl，从用人可溶性α_vβ₆免疫的β₆整联蛋白-/-小鼠中分离的κ抗体（Huang等人，J.Cell Biol.133：921-928（1996））。3G9抗体特异性识别在损伤、纤维化和癌症期间以上调水平表达的α_vβ₆整联蛋白表位（参见，例如，Thomas等人，J.Invest.Dermatology117：67-73（2001）；Brunton等人，Neoplasia3：215-226（2001）；Agrez等人，Int.J.Cancer81：90-97（1999）；Breuss，J.Cell Science108：2241-2251（1995））。它不与其他α_v整联蛋白结合且与人和鼠类分子交叉反应。鼠类单克隆抗体3G9已描述阻断α_vβ₆与LAP的结合，如通过阻断配体与纯化的人可溶性α_vβ₆或β₆表达细胞的结合，从而抑制TGF-β受体活化的促纤维化活性所确定的（参见WO03/100033）。它还已显示抑制α_vβ₆介导的TGF-β活化，其IC₅₀值低于已知α_vβ₆抗体10D5的那种（Huang等人，J Cell Sci.111：2189-2195（1998））。 
如WO03/100033中所述，鼠类单克隆抗体8G6是鼠类IgGl，同样识别α_vβ₆整联蛋白表位的κ抗体。鼠类单克隆抗体8G6是阳离子依赖性、高亲和力α_vβ₆阻断剂，显示抑制α_vβ₆介导的TGF-β活化的能力，其IC₅₀值低于已知10D5的那种（参见WO03/100033）。 
如WO03/100033中所述，3G9和8G6鼠类抗体在预防肾和肺纤维化方面有效。此外，鼠类抗体3G9能够有效抑制人肿瘤异种移植模型中的肿瘤生长，暗示α_vβ₆在癌症病理学中的潜在作用和使用针对α_vβ₆抗体的此类阻断的效力。 
因此，需要开发在人中抗原性更少、且可以用于治疗涉及α_vβ₆途径的疾病的α_vβ₆抗体。随着重组DNA方法的出现，已可能在结构上改造抗体基因、和产生具有不能通过杂交瘤技术获得的特性的改良抗体分子。在治疗领域中，这种方法的一个目标是通过修饰其初级氨基酸结构 减少啮齿类动物单克隆抗体在人中的免疫原性。治疗抗体免疫原性的减少是希望的，因为免疫应答的诱导可以在患者中引起一系列不利效应，从治疗抗体的加速清除，功效随之丧失，至最极端的致命性过敏反应。 
减少外源单克隆抗体的免疫原性的一种策略是用人起源的类似结构域替换单克隆抗体的轻和重链恒定结构域，而使外源抗体的可变区结构域保持完整。轻和重链的可变区结构域负责抗体和抗原之间的相互作用。具有与人恒定结构域连接的小鼠可变结构域的嵌合抗体分子，通常以与嵌合体来源于其的小鼠抗体相同的亲和常数结合抗原。此类嵌合抗体在人中比其完全小鼠配对物免疫原性更少。然而，保留完整鼠类可变结构域的抗体往往在大部分患者中引起免疫应答。 
可预测人将设定针对整个鼠类可变结构域的免疫应答，因此，甚至在此类标准嵌合抗体的临床试验已报道前，就已开始获得具有更多人特征的可变结构域的努力。通常称为“人源化”的一类方法旨在通过重组构建具有小鼠和人特征的抗体可变结构域，将鼠类单克隆抗体的可变结构域转变成更人的形式。人源化策略基于抗体结构数据的几个一致同意的理解。首先，可变结构域包含在种类内保守、但在进化上遥远的种类例如小鼠和人之间不同的肽序列邻接段。其次，其他邻接段在种类内不是保守的、但即使在相同个体内的抗体产生细胞之间也不同。第三，抗体和抗原之间的接触主要通过可变结构域的非保守区域发生。第四，抗体可变结构域的分子结构在种类中非常相似，使得种类之间的相应氨基酸残基位置可以无需实验数据单独基于位置来鉴定。 
人源化策略共有下述前提：用人抗体相应位置中发现的残基替换鼠类序列特征的氨基酸残基，将减少所得到的抗体在人中的免疫原性。然而，种类之间的序列替换通常导致抗体与其抗原的结合减少。人源化技术因此存在下述平衡：替换原始鼠类序列以减少免疫原性，和需要人源化分子以保留足够的抗原结合以在治疗上有用。这种平衡已使用2种方法达到。 
在由美国专利号No.5,869,619例示的一种方法中，特有的人残基代替鼠类可变结构域残基，所述鼠类可变结构域残基被确定或预测（i）在与抗原的相互作用中不发挥显著的化学作用、和（ii）与伸出到溶剂内的侧链一起放置。因此，远离抗原结合位点的外部残基被人源化，而内部残基、抗原结合位点、和形成可变结构域之间的界面的残基保留鼠类的。这种方法的一个缺点是需要相当广泛的实验数据，以确定残基在抗原结合中不发挥显著的化学作用，还是在特定三维抗体结构中将位于溶剂中。 
在由美国专利号5,225,539例示的另一种更普遍的方法中，视为保守的鼠类可变结构域肽序列的邻接段用来自人抗体的相应段替换。在这种更普遍的方法中，所有可变结构域残基都是人源化的，除了涉及抗原结合的非保守区域外。为了确定用于替换的合适邻接段，美国专利号5,225,539利用先前已由Wu和Kabat，J Exp Med.132（2）：211-250（1970）开发的抗体可变结构域序列分类。 
Wu和Kabat开创了抗体肽序列比对，并且他们在这点上的贡献是数倍：首先，通过研究可变结构域之间的序列相似性，他们鉴定了在所有脊椎动物种类的所有抗体中或多或少同源的相应残基，因为它们采取类似的三维结构、发挥类似的功能作用、与邻近残基类似地相互作用、和存在于类似的化学环境中。其次，他们设计了其中同源免疫球蛋白残基被分配相同位置编号的肽序列编号系统。无需依赖除序列自身以外的任何实验数据，本领域技术人员即可明确地将现在通常称为Kabat编号分配给任何可变结构域序列。第三，对于每个Kabat编号序列位置，Kabat和Wu计算出变异性，所述变异性意指当可变结构域序列比对时更少或更多可能的氨基酸的发现。他们鉴定了包埋在4个变异性较少的邻接区域内的3个高变异性的邻接区域。其他工作者先前已指出大约在这些区域（高变区）中的变异性，且断定高变区表示用于抗原结合的氨基酸残基。Kabat和Wu正式区分构成这些可变段的残基，且将这些命名为“互补决 定区”（CDRs），指抗体和抗原之间的化学互补性。在可变结构域三维折叠而不是抗原识别中的作用，归于现在称为“框架区”的剩余变异性较少的区域。第四，Kabat和Wu建立了抗体肽和核酸序列的公众数据库，所述公众数据库继续被维持且是本领域技术人员众所周知的。 
由美国专利号5,225,539公开的使用Kabat分类的人源化方法，产生包含来自一种抗体的CDR和来自另一种抗体的框架区的嵌合抗体，所述第二种抗体在种类起源、特异性、亚类或其他特征方面不同。然而，没有具体序列或特性归于框架区，事实上，美国专利号5,225,539教导任何框架组可以与任何CDR组进行组合。框架序列因此已被识别为对赋予抗体可变区的三维结构是重要的，所述三维结构是保持良好的抗原结合所需的。本领域中的后续发展已在美国专利号5,225,539的范围内改进，以处理相对于相应的小鼠抗体，使用某些人源化抗体观察到的对于抗原的亲合力丧失。 
美国专利号5,693,761公开了关于美国专利号5,225,539用于抗体人源化的一种改进，且基于下述前提：将亲合力丧失归于人源化框架中的结构基序问题，由于立体或其他化学不相容性，所述结构基序干扰CDRs折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决这个问题，美国专利号5,693,761教导使用在线性肽序列中与待人源化的小鼠抗体的框架序列紧密同源的人框架序列。因此，美国专利号5,693,761的方法集中于种类间的框架序列比较。一般地，所有可用的人可变结构域序列与特定小鼠序列比较，且计算出相应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人可变结构域以提供用于人源化计划的框架序列。美国专利号5,693,761还教导在人源化框架中保留来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的，所述氨基酸残基对支持能够结合的构象的CDRs是关键的。 
在其他方法中，通过使单个残基回复小鼠序列且如Riechmann等人，Nature332（6162）：323-327（1988）所述测定抗原结合，获得低亲和 力的人源化构建体后，在实验上测定特定框架氨基酸残基的关键性。用于鉴定框架序列中的氨基酸关键性的另一种示例方法由美国专利号5,821,337和美国专利号5,859,205公开。这些参考文献公开了框架中的特异性Kabat残基位置，所述残基位置在人源化抗体中可能需要用相应的小鼠氨基酸置换，以保留亲合力。因此，所得到的部分人和部分小鼠的构建框架仍经常显示人免疫原性或减少的抗原结合，从而在框架构建中需要众多反复以获得用于治疗用途的合适框架。 
本领域因此需要开发在人中抗原性更少的α_vβ₆抗体。本发明为产生与α_vβ₆特异性反应的人源化抗体作准备。本发明还提供了用于制备此类人源化抗体的方法，通过提供可靠鉴定合适的人框架序列以支持非人CDR区域的人源化抗体，和进一步提供保留高抗原结合、在人中具有低免疫原性的人源化抗体。本发明还提供了与α_vβ₆反应的此类人源化抗体在各种疾病和病症治疗、诊断和/或预防中的用途。 
发明简述 
本发明至少部分基于针对α_vβ₆的高亲和力人源化抗体的开发和表征，包括此类抗体互补决定区（CDRs）中的关键氨基酸残基的鉴定和分析，以及框架序列中的关键氨基酸残基的鉴定和分析。 
在一个实施方案中，本发明涉及具有对于α_vβ₆整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体，其中所述抗体分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类3G9抗体的人源化，在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其互补决定区（CDR）1、2和3的分别由SEQ ID NO：1的氨基酸残基31－35、50－65和98－109限定的重链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其CDR1、2和3的分别由SEQ ID NO：2的氨基酸残基24-35、51-57和90-98限定的轻链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其框架区（FR）1、2、3和4的分别由SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-30、36-49、66-97和110-120限定的重链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其框架 区（FR）1、2、3和4的分别由SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-23、36-50、58-89和99-108限定的轻链。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含在SEQ ID NO：1的重链，且在SEQ ID NO：1的重链包含至少一个下述氨基酸置换：Q3M和N74S。在某些实施方案中，人源化抗体包含SEQ ID NO：2的轻链，且SEQ ID NO：2的轻链包含至少一个下述氨基酸置换：E1Q、L47W、I58V、A60V和Y87F。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式1（“HV1”），其中重链由具有氨基酸置换Q3M和N74S的SEQ ID NO：1组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式2（“HV2”），其中重链由具有氨基酸置换N74S的SEQ ID NO：1组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式3（“HV3”），其中重链由SEQ ID NO：1组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式1（“LV1”），其中轻链由具有氨基酸置换L47W、I58V、A60V和Y87F的SEQ ID NO：2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式2（“LV2”），其中轻链由具有氨基酸置换L47W和I58V的SEQ ID NO：2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式3（“LV3”），其中轻链由具有氨基酸置换L47W的SEQ ID NO：2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式4（“LV4”），其中轻链由具有氨基酸置换E1Q和L47WSEQ ID NO：2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式5（“LV5”），其中轻链由SEQ ID NO：2组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含具有HV3和LV5的重和轻链可变结构域，其中重链由SEQ ID NO：1组成，和其中轻链由SEQ ID NO：2组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体具有来源于鼠类6.3G9抗体（ATCC登记号PTA-3649）的CDR。 
在相关实施方案中，本发明还涉及具有对于α_vβ₆整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：3和SEQ ID  NO：4的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类8G6抗体的人源化。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，作为其互补决定区（CDR）1、2和3分别由SEQ ID NO：3的氨基酸残基（即，除了某些保守变异外）31－35、50－66和99－115限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，作为其CDR1、2和3分别由SEQ ID NO：4的氨基酸残基24-38、54-60和93-101限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，作为其框架区（FR）1、2、3和4分别由SEQ ID NO：3的氨基酸残基1-30、36-49、67-98和116-126限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，作为其FR1、2、3和4分别由SEQ ID NO：4的氨基酸残基1-23、39-53、61-92和102-111限定。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，所述重链由具有至少一个下述氨基酸置换：A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO：3组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，所述轻链由具有至少一个下述氨基酸置换：E1D、L46F和Y49K的SEQ ID NO：4组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含其中重链由SEQ ID NO：3的氨基酸置换A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K组成的重链形式1（“HV1”）。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式2（“HV2”），其中所述重链由具有氨基酸置换M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO：3组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式3（“HV3”），其中所述重链由具有氨基酸置换V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO：3组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式1（light version1,“LV1”），其中所述轻链由具有氨基酸置换：E1D、L46F和Y49K的SEQ ID NO：4组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式2（“LV2”），其中所述轻链由具有氨基酸置换L46F和Y49K的SEQ ID NO：4组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式3（“LV3”），其中所 述轻链由具有氨基酸置换Y49K的SEQ ID NO：4组成。 
在某些实施方案中，人源化抗体具有来源于鼠类6.8G6抗体的CDR。在某些实施方案中，人源化抗体可以与鼠类8G6抗体竞争结合α_vβ₆。 
本发明还包含结合与任何上述抗体相同的表位的人源化抗体。 
本发明还包含通过重组载体产生的人源化抗体，所述重组载体包含编码所述抗体的核酸。在某些实施方案中，重组载体是选自pKJS195（SEQ ID NO：5）、pKJS189（SEQ ID NO：6）和pKJS196（SEQ ID NO：7）的质粒。 
本发明还包含包括关于SEQ ID NO：1－7中任何一个的编码序列的分离核酸，和包含SEQ ID NO：1－7中任何一个的氨基酸序列的分离多肽。 
本发明还包含包括任何上述人源化抗体的核酸的重组载体。 
本发明还包含包括重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含任何上述人源化抗体的核酸。 
本发明还包含组合物，所述组合物包含本发明的一种或多种人源化抗体和药学可接受的载体。在这些组合物的一些中，人源化抗体与细胞毒素剂（即损害细胞存活力和/或功能的试剂）例如毒素或放射性核素缀合。组合物可以施用于具有由α_vβ₆介导的疾病、或处于具有由α_vβ₆介导的疾病危险中的受试者（例如哺乳动物，例如人），以便治疗（例如，减轻、缓和、减低、预防、延缓发作）疾病。此类疾病的例子包括但不限于：纤维化（例如，硬皮病、瘢痕化、肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化）；牛皮癣；癌症（如本文其他地方所述，例如上皮癌；口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾、胰腺、前列腺或结肠直肠癌）；阿尔波特氏综合征；肺、肝、肾及其他内脏器官的急性和慢性损伤；以及肺、肝、肾及其他内脏器官的硬化症。具有此类疾病的危险可以起因于遗传倾向；某些生活方式例如吸烟和酗酒；暴露于环境污染物例如石棉；生理条件例如糖尿病、肝炎病毒感染（丙型肝炎病毒感染）、 自身免疫性疾病；和医学处理例如放射疗法。 
本发明还包含通过在适合于人源化抗体表达的条件下培养任何上述宿主细胞，制备任何上述人源化抗体的方法，其中使人源化抗体链表达和产生人源化抗体。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离人源化抗体的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。 
杂交瘤克隆6.3G9和6.8G6根据布达佩斯条约于2001年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心（“ATCC”；P.O.Box1549，Manassas，VA20108，USA），且分别具有登记号ATCC PTA-3649和-3645。 
本发明的人源化抗体指完整抗体，例如包含2条重链和2条轻链的抗体，或完整抗体的抗原结合片段，例如Fab片段、Fab'片段、F（ab'） ₂片段或F（v）片段。本发明的人源化抗体可以是任何同种型和亚型，例如IgA（例如，IgAl和IgA2）、IgG（例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4）、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。 
在某些实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含在重链的一个或多个（例如，2、3、4、5或6）特定位置上的突变（例如，缺失、置换或添加），从而使得抗体的效应子作用（例如，抗体与Fc受体或补体因子结合的能力）被改变，而不影响抗体的抗原结合能力。 
在其他实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含在糖基化位点的氨基酸残基上的突变，从而使得糖基化位点被消除。此类人源化抗体可以具有临床利益，减少效应子作用或其他不希望有的功能，同时保留其抗原结合亲和力。糖基化位点的突变还可以有利于方法开发（例如，蛋白质表达和纯化）。 
在本发明的某些实施方案中，人源化抗体包含其CDRs来源于鼠类3G9抗体的去糖基轻链。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含轻链可变结构域，其中CDR1区包含在SEQ ID NO：2氨基酸残基26上的天冬酰胺（N）至丝氨酸（S）的置换。鼠类3G9CDR1区包含在这个氨基酸位置上的天冬酰胺。然而，在3G9抗体的人源化形式中，所有5种轻链形 式（LV1、LV2、LV3、LV4和LV5）包含在3G9CDR1区内的这个位置上的丝氨酸。在人源化3G9抗体的所有轻链形式中这个位点的去糖基化（aglycosyl）已显示有利于蛋白质表达和轻链纯化。在某些其他实施方案中，人源化3G9抗体包含在通常是正常Fc受体结合所需的糖基化位点上的突变。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含天冬酰胺（N）至谷氨酰胺（Q）的氨基酸置换。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含在重链形式3（HV3）中N至Q的氨基酸置换，所述HV3由包含质粒pKJS196（SEQ ID NO：7）的重组载体产生。在某些实施方案中，N至Q的氨基酸置换在SEQ ID NO：7的氨基酸残基319上发生。人源化3G9抗体的重链形式3（HV3）中这个位点的去糖基化已显示去除糖基化信号，而不影响人源化抗体的抗原结合亲和力，所述糖基化信号是正常Fc受体结合所需的。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含由包含质粒pKJS189（SEQ ID NO：6）的重组载体产生的重链形式3（HV3），和由包含质粒pKJS195（SEQ ID NO：5）的重组载体产生的轻链形式5（LV5）。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含由包含质粒pKJS196（SEQ ID NO：7）的重组载体产生的去糖基重链形式3（a-HV3），和由包含质粒pKJS195（SEQ ID NO：5）的重组载体产生的轻链形式5（LV5）。 
在再其他的实施方案中，重或轻链可以包含增加亲和力或效力的突变。 
本发明的人源化抗体对于治疗任何临床上不希望有的病状或疾病（如本文所述）有用，所述病状或疾病由α_vβ₆与其配体例如LAP和纤连蛋白结合来介导。这些人源化抗体经由更高的亲和力或亲合力、以及与配体的阳离子依赖性或非依赖性结合，可以比先前已知的α_vβ₆抗体更有效。与鼠类单克隆抗体形成对比，本发明的人源化抗体在受试者特别是人体内将不引起抗小鼠免疫球蛋白抗体产生，而是显示延长的血液半衰期，不利反应的频率减少，从而使得可以预期它在治疗由α_vβ₆介导的疾病功效方面优于小鼠单克隆抗体。 
在另外的方面，本发明涉及使用α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体，诊断、治疗和预防癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于减少或预防患者中的原发性肿瘤转移至次级部位的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与原发性肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致肿瘤细胞死亡、化学敏感性或侵袭力减少。在相关实施方案中，本发明提供了减少或预防患者中的转移前肿瘤进展至转移性肿瘤的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与转移前肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致减少或预防转移前癌症细胞侵入原发性肿瘤周围的组织区域内。在本发明的某些此类实施方案中，肿瘤细胞是癌，例如腺癌。在更具体的实施方案中，癌是乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、头与颈癌、胃癌或脾脏癌。更具体而言，癌是乳腺癌（包括但不限于原位乳腺癌，例如原位导管癌（DCIS）和原位小叶癌（LCIS））、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌或肺癌。 
根据本发明的这个方面的合适实施方案使用α_vβ₆整联蛋白结合配体，所述结合配体是α_vβ₆结合抗体或其α_vβ₆表位结合片段。根据某些此类实施方案，抗体是单克隆抗体（它可以是嵌合、灵长类化或人源化的），包括美国专利申请公开号US2005/0255102Al中公开的那些，所述专利的公开内容整体引入本文。合适的此类抗体包括但不限于，命名为1A8、3G9、8G6、2B1、2B10、2A1、2E5、1Gl0、7G5、1C5、10D5（ATCC保藏号HB12382）和CSβ6的α_vβ₆结合单克隆抗体，及其片段、嵌合体和杂交物。特别适合于在本发明的此类实施方案中使用的是单克隆抗体3G9和8G6。同样特别适合于在本发明的此类实施方案中使用的是人源化单克隆抗体，例如命名为hu3G9（BG0001l）的人源化3G9抗体和命名为 hu8G6的人源化8G6抗体。 
在本发明的某些此类治疗实施方案中，α_vβ₆结合配体（例如，α_vβ₆结合抗体）与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合或结合，在α_vβ₆结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。在本发明另外的治疗实施方案中，α_vβ₆结合配体（例如，α_vβ₆结合抗体）结合一种或多种此类细胞毒素化合物或试剂施用于患者。可以根据本发明的这些方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，细胞毒素剂（例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、阿霉素、氨甲蝶呤、5－氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、卡里奇霉素（calicheamicin）、美登素、单端孢霉烯族毒素（trichothene）、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐（Aleuritesfordii）蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆（Phytolaca americana）蛋白质、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、司盘奥那（sapaonaria officinalis）抑制剂、白树毒素、丝裂素（mitogellin）、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、单端孢霉烯族毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶），放射性同位素（例如 ²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素），和前体药物活化酶（例如碱性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D－丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P－内酰胺酶和青霉素酰胺酶）。在某些实施方案中，一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合配体以药物组合物的形式施用于患者，所述药物组合物包含有效量的一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合配体和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。一种或多种α _vβ₆整联蛋白结合配体和/或包含一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合配体的一种或多种药物组合物，可以通过施用药物组合物的任何合适方式施用于患者，包括但不限于，口部施用、肠胃外施用（包括例如，经由肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下途径注射）、颅内施用、经皮施用、 肺内施用和鼻内施用。 
在另外的实施方案中，本发明提供了诊断或鉴定更可能进展至侵袭癌的癌例如腺癌，和/或更可能响应使用配体的治疗的癌，所述配体与一种或多种整联蛋白α_vβ₆亚单位结合。合适的此类方法可以包括例如，（a）从患者获得包含肿瘤或其部分的癌性上皮组织样品，和非癌性上皮组织样品；（b）使组织样品与一种或多种配体接触，所述配体与一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合；和（c）测定组织样品中的整联蛋白α _vβ₆表达水平，其中相对于非癌性组织样品中的整联蛋白α_vβ₆表达水平，癌性组织样品中的整联蛋白α_vβ₆表达水平增加指示在患者中存在癌，所述癌：（a）从原位或非侵袭形式进展至侵袭、转移形式的可能性增加；和/或（b）更可能响应使用一种或多种上述治疗方法的治疗，所述治疗方法依赖于α_vβ₆结合配体的结合，特别是与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合的α_vβ₆结合配体，或与一种或多种细胞毒素化合物或试剂结合施用的α_vβ₆结合配体，所述细胞毒素化合物或试剂例如上文描述的那些。此类方法适合于诊断或鉴定各种癌，包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。在某些此类实施方案中，与一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合的配体是α_vβ₆整联蛋白结合抗体（它可以是单克隆抗体，例如上文描述的那些）或其α_vβ₆表位结合片段。特别适合于在本发明的此类诊断方法中使用的是可检测标记的α_vβ₆结合配体（例如，抗体），即包含至少一种可检测标记、与至少一种可检测标记缀合或结合的α_vβ₆结合配体，所述可检测标记例如生色标记（例如，二氨基联苯胺或4－羟基偶氮苯－2－羧酸），酶标记（例如，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ－5－类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α－甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β－半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶或乙酰胆碱酯酶），放射性同位素标记（例如，³H、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、 ⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc或¹⁰⁹Pd），非放射性同位素标记（例如，¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr、⁵⁶Fe、^99mTc或¹¹²In），荧光标记（例如，¹⁵²Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白（GFP）标记、邻苯二醛标记或荧光胺标记），毒素标记（例如，白喉毒素标记、蓖麻毒素标记或霍乱毒素标记），化学发光标记（例如，鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记或水母素标记），X放射照相标记（例如，钡或铯），自旋标记（例如，氘），和核磁共振对比剂标记（例如，Gd、Mn和铁）。 
在另外的实施方案中，本发明提供了清除患者中的α_vβ₆阳性转移性肿瘤细胞的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与一种或多种α_vβ₆阳性转移性肿瘤细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致转移性肿瘤细胞死亡、化学敏化或侵袭力减少。此类方法适合于清除患者中的各种转移性肿瘤细胞，例如起因于转移癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。根据本发明的这个方面的合适实施方案使用α_vβ₆整联蛋白结合配体，所述结合配体是α_vβ₆结合抗体或其α_vβ₆表位结合片段，特别是上文所述的单克隆抗体、或其变体或片段。在本发明的某些此类治疗实施方案中，α_vβ₆结合配体（例如，α_vβ₆结合抗体）与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合或结合，在α_vβ₆结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。在本发明另外的治疗实施方案中，α_vβ₆结合配体（例如，α_vβ₆结合抗体）结合一种或多种此类细胞毒素化合物或试剂施用于患者。可以根据本发明的这些方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，上文描述的细胞毒素剂、放射性同位素和前体药物活化酶。根据本发明的这个方 面，α_vβ₆整联蛋白结合配体，或包含配体和一种或多种药学载体或赋形剂的药物组合物，可以根据上述施用方式施用于患者。 
在另外的实施方案中，本发明提供了手术摘除来自患者组织或器官的肿瘤后清除来自患者的残留α_vβ₆阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与组织或器官中的一种或多种残留肿瘤细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与所述整联蛋白的结合导致肿瘤细胞死亡、化学敏感性或侵袭力减少。此类方法适合于清除各种患者组织中的各种转移性肿瘤细胞，例如起因于癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。根据本发明的这个方面的合适实施方案使用α_vβ₆整联蛋白结合配体，所述结合配体是α_vβ₆结合抗体或其α_vβ₆表位结合片段，特别是上文所述的单克隆抗体、或其变体或片段。在本发明的某些此类治疗实施方案中，α_vβ₆结合配体（例如，α_vβ₆结合抗体）与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合或结合，在α_vβ₆结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种α_vβ₆整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。可以根据本发明的这个方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，上文描述的细胞毒素剂、放射性同位素和前体药物活化酶。 
根据本发明的下述附图和描述以及权利要求，本发明的其他优选实施方案对于普通技术人员将是显而易见的。 
附图简述 
图1是纯化的、嵌合化3G9变体与α_vβ₆的结合ELISA测定法。用可溶性α_vβ₆包被的板与下述抗体一起温育：纯化的杂交瘤来源的鼠类3G9抗体（m3G9）、纯化的嵌合3G9抗体（ch3G9）、或在轻链第1个CDR中的N联糖基化位点内包含N至S置换的纯化的嵌合3G9抗体（ch3G9S）。用洗涤缓冲液洗涤后，板与过氧化物缀合的抗小鼠IgG（对于杂交瘤来源的材料）或抗人IgG（对于嵌合抗体）一起温育，随后用洗涤缓冲液 洗涤。板用TMB溶液显色，反应用硫酸中止且用板阅读仪在A₄₅₀处测定。在2种形式的嵌合3G9抗体之间没有可检测的显著差异。 
图2所示结果显示使用Easy Titer Assay（Pierce）来自转染的293E细胞的3G9人源化变体表达。通过Easy Titer方法根据制造商的方案（Pierce）测定来自瞬时转染的293E细胞的上清液的抗体滴度。分析人源化3G9抗体的不同变体的表达。包含轻链形式1的3G9变体表达很差，而包含轻链形式2的变体以较高水平表达。随着渐增的人源化存在朝向更高表达的趋势。 
图3显示如通过流式细胞术测定法确定的，hu-3G9抗体变体与α_vβ₆整联蛋白表达SW480细胞结合的FACS分析结果。SW480细胞通过胰酶消化进行收获、洗涤且重悬浮于FACS缓冲液中。2xl0⁵细胞随后在冰上、在包含指示转染上清液的FACS缓冲液中温育1小时，所述上清液的滴度通过Easy Titer方法根据制造商的方案（Pierce）来测定。温育后，细胞用FACS缓冲液洗涤，且重悬浮于包含藻红蛋白缀合的抗人IgG（Jackson ImmunoResearch）的FACS缓冲液中，且在冰上温育30分钟。细胞随后进行洗涤且重悬浮于200μl FACS缓冲液中，标记的次级抗体的结合通过流式细胞术来监控。测试的所有人源化形式与SW480细胞的结合至少与嵌合3G9一样好。包含轻链形式2的变体显著超过嵌合3G9的活性。抗淋巴毒素β受体抗体Hu-BHAl0充当阴性对照。 
图4显示hu-3G9抗体形式2－5与FDCPl-β6细胞结合的FACS分析。FACS分析如图3中所述进行，除了使用FDCPl-β6细胞代替SW480细胞外。完全人源化的变体形式5（H3/L5）与FDCPl-β6的结合明显比所有其他人源化形式更好。 
图5显示纯化的hu-3G9抗体形式2－5与FDCPl-β6细胞结合的FACS分析。FACS分析使用纯化的3G9人源化形式如图4中所述进行。完全人源化的变体形式5（H3/L5）与FDCPl-β6的结合明显比所有其他人源化形式更好。 
图6是纯化的hu-3G9抗体形式2－5与α_vβ₆结合的结合ELISA测定法。结合ELISA如图1中所述进行。人源化3G9形式5（H3/L5）显得比其他抗体衍生物略微更好地与α_vβ₆结合。 
图7是纯化的hu-3G9抗体形式2－5与α_vβ₆结合的阻断ELISA。板用0.3μg/ml LAP或2.5μg/ml LAP-Fc融合蛋白包被，且于4℃温育过夜。去除包被溶液并且将板阻断、洗涤、且在钙和镁的存在下如图例中标明的与生物素化的α_vβ₆和3G9衍生物混合物一起温育。板再次进行洗涤、且与超抗生物素蛋白（extravidin）-辣根过氧化物酶缀合物（Sigma）一起温育。结合蛋白使用TMB底物进行检测随后在板阅读仪中在A₄₅₀处检测。人源化3G9形式5（H3/L5）显得比其他抗体衍生物略微更好地阻断α_vβ₆与LAP的结合。 
图8显示来自纯化的hu-3G9抗体形式2－5的细胞粘附测定法结果。微量滴定板用50μl/孔的0.5μg/ml LAP于4℃包被过夜。板随后进行洗涤和阻断。使FDCP1-β6细胞（5x10⁶细胞/ml）与培养瓶分离，用荧光染料（Calcein-AM，Molecular Probes，Eugene，OR）标记且重悬浮于测定缓冲液中。在钙和镁的存在下，板与上文所述的纯化抗体以及标记FDCPl-β6细胞一起温育。将板洗涤且记录由于板上捕获细胞的荧光。结合百分比通过比较总细胞的荧光与结合细胞的那种进行测定。人源化3G9形式5（H3/L5）显得比其他抗体衍生物略微更好地阻断α_vβ₆表达细胞与LAP的结合。 
图9是pKJS195的质粒图和3G9形式5轻链序列的图示。这种质粒包含3G9形式5轻链（LV5）和新霉素抗性基因。轻链表达盒包含人CMV立即早期启动子和第1个内含子（包含小缺失）以及人生长激素多腺苷酸化序列。 
图10是pKJS189的质粒图和3G9形式3重链序列的图示。这种质粒包含3G9形式3重链（HV3）和二氢叶酸还原酶（dhfr）基因。重链表达盒包含人CMV立即早期启动子和第1个内含子（包含小缺失）以及人生 长激素多腺苷酸化序列。dhfr表达盒包含SV40早期启动子和SV40多腺苷酸化序列。 
图11是pKJS196的质粒图和去糖基3G9形式3重链序列的图示。这种质粒包含去糖基-3G9形式3重链（a-HV3）和dhfr基因。这种构建体等同于pKJS189，除了消除重链恒定区中的N联糖基化位点的N319Q置换外。 
图12显示使用Easy Titer Assay（Pierce）瞬时转染到CHO细胞内的hu-3G9CHO表达载体的装配和表达结果。Easy Titer测定法如图2中所述根据制造商的方案（Pierce）进行。将野生型（H3/L5）和去糖基（a-H3/L5）人源化3G9形式5载体瞬时转染到CHO细胞内，以证实来自这些细胞的人源化3G9的有效装配和分泌。2种形式的hu3G9抗体在CHO细胞中同样装配和表达。 
图13的复合显微照片描述了某些人癌中的α_vβ₆表达（暗区）水平，所述癌已从所示原发性肿瘤位点转移至淋巴结（图13A－13D）或肺（图13E－13F）。 
图14的复合显微照片描述了某些人癌中的α_vβ₆表达（暗区）水平，所述癌已从所示原发性肿瘤位点转移至所示转移性肿瘤位点。 
图15的复合显微照片描述了在原发性子宫内膜癌肿瘤（图15A，15C）和匹配的淋巴结转移灶（图15B，15D）中观察到的α_vβ₆表达（暗区）水平。 
图16的复合显微照片描述了在人乳腺肿瘤样品中观察到的α_vβ₆表达（暗区）水平。图16A：来自具有原位管瘤（DCIS）患者的原发性肿瘤样品中的表达。图16B：来自具有侵袭乳腺癌患者的原发性肿瘤样品中的表达。 
图17的复合显微照片描述了来自3个不同患者的原发性和转移性胰腺管腺癌肿瘤的匹配样品中观察到的α_vβ₆表达（暗区）水平。图17A－17C：来自3个不同患者的原发性肿瘤样品中的表达。图17D－17F： 来自这3个相同患者的匹配淋巴结转移灶中的表达。图17G－17H：从3个患者中的2个获得的正常胰腺组织中的表达。 
图18的复合显微照片描述了来自5个不同患者的原发性和转移性胰腺腺癌肿瘤的匹配样品中观察到的α_vβ₆表达（暗区）水平。图18A－18E：来自5个不同患者的原发性肿瘤样品中的表达，3个具有表征为腺鳞状的肿瘤（图18A－18C），和2个具有表征为低分化的肿瘤（图18D－18E）。图18F－18J：来自这5个相同患者的匹配淋巴结转移灶中的表达。图18K－18L：从5个患者中的2个获得的正常胰腺组织中的表达。 
图19表示抗α_vβ₆单克隆抗体（3G9）在人胰腺癌的BxPC-3小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长的能力。图19A：经由免疫组织化学用抗α_vβ₆单克隆抗体（3G9）染色的异种移植肿瘤切片的显微照片。图19B：在用α_vβ₆mAb3G9（▲）、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白（▼　）、或媒介物PBS（■）处理期间，BxPC-3异种移植肿瘤的生长曲线。图19C：在研究结束时（第66天）单个肿瘤大小的散布图。 
图20的一系列条形图表示抗α_vβ₆单克隆抗体（3G9）、和可溶性TGF-β受体-抗体片段缀合物（sTGF-βRII-Fc），对表达β₆（用β₆转染）的VB6细胞和模拟转染细胞的跨基质迁移、侵袭和基质金属蛋白酶9（MMP9）生产的影响。图20A和20B：细胞经过细胞外基质的迁移（图20A）或侵袭（图20B）。“Unt”：未处理的细胞；“3G9”：用10μ g/ml3G9抗α_vβ₆单克隆抗体处理的细胞；“sTGFbR-Fc”：用10μg/ml可溶性TGF-βRII-Fc缀合物处理的细胞。空心条：用β₆整联蛋白转染且表达β₆整联蛋白的细胞（VB6细胞）；实心条：不表达β₆整联蛋白的模拟转染细胞（C1细胞）。图20C：通过未处理（空心条）、用10μ g/ml3G9处理（阴影条）、或用10μg/ml sTGF-βRII-Fc缀合物处理（实心条）的C1或VB6细胞生产的MMP9（ng/ml）。 
图21是免疫组织化学切片的显微照片，表示在侵袭到LIMl863异种移植模型基质内的肿瘤细胞上的α_vβ₆表达（暗区）。关于连续切片的 抗人角蛋白染色（未显示）确定这些细胞是人上皮（即，LIMl863）肿瘤衍生的。 
图22A－22F描述了α_vβ₆mAb3G9和重组可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白在LIM1863异种移植肿瘤模型中对肿瘤生长和基质侵袭的影响。图22A：在用α_vβ₆mAb3G9（▲）、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白（▼）、或媒介物PBS（■）处理期间，LIMl863异种移植肿瘤的生长曲线。图22B：在研究结束时（第52天）单个肿瘤大小的散布图。图22C：在整个肿瘤切片上α_vβ₆阳性区的定量。图22D－22F：描述从每个所示处理组收获的肿瘤中的代表性α_vβ₆染色的显微照片。 
图23A－23D是来自各种细胞系的荧光激活细胞分选仪（FACS）分析的直方图，所述细胞系用鼠类3G9mAb或对照mAb处理，且表示m3G9与NHPα_vβ₆表达细胞系的结合水平（A，Vero；B，LLC-MK2；C，12MBr6；D，4MBr5）。 
图24A－24B的滴定曲线表示鼠类3G9与NHPα_vβ₆表达细胞系的结合水平（A，12MBr6；B，4MBr5）。 
图25的条形图表示NHPα_vβ₆表达细胞系与LAP的粘附（A，12MBr6；B，4MBr5）。 
图26A－26B的滴定曲线表示经由m3G9抑制NHPα_vβ₆表达细胞系与LAP的粘附（A，12MBr6；B，4MBr5）。 
图27的条形图表示经由人和灵长类α_vβ₆表达细胞系的潜伏TGFβ活化。 
图28的滴定曲线表示在SW480β6和4MBr5细胞系上经由m3G9抑制TGFβ活化。 
图29的一系列显微照片表示人肾脏疾病中的α_vβ₆免疫染色。（A）用α_vβ₆mAb（红色）和泛细胞角蛋白mAb（绿色）免疫染色的冷冻人肾切片。（B）用α_vβ₆mAb免疫染色的石蜡包埋的人肾切片。 
图30表示Col4A3+/-和Col4A3-/-小鼠肾中的α_vβ₆免疫染色。 图30A：来自7周大的Col4A3+/-小鼠和Col4A3-/-小鼠的冷冻肾切片的显微照片，所述小鼠用α_vβ₆mAb（红色）和泛细胞角蛋白mAb（绿色）免疫染色。图30B：来自用α_vβ₆mAb免疫染色的、4和8周大的Col4A3+/-小鼠和Col4A3-/-小鼠的石蜡包埋的肾切片。图30C：表示在来自4、7和8周大的Col4A3+/-小鼠和Col4A3-/-小鼠（n=3）肾中α_vβ₆免疫染色定量的条形图。 
图31表示α_vβ₆mAb结合的特异性。图31A：α_vβ₆mAbs（3G9、8G6、8B3）、抗αv mAb（RMV-7）、阴性对照mAbs（1E6和MOPC21）、和同位素对照（大鼠IgGl）与NIH3T3细胞和NIH3T3b6细胞结合的流式细胞术分析。图31B：用抗α_vβ₆mAb（人/小鼠嵌合3G9）免疫染色的Col4A3-/-、和Col4A3-/-；β6-/-肾切片。图31C：用抗αv多克隆抗体免疫染色的Col4A3-/-、和Col4A3-/-；β6-/-肾切片。 
图32表示使用各种处理的Col4A3-/-肾中的SMA免疫染色。图32A：显示关于3周－8.5周大的处理的Col4A3-/-小鼠、和年龄相一致的未处理的Col4A3+/-小鼠肾中免疫染色的SMA（红色）和层粘连蛋白（绿色）。显示了关于每个处理组的代表性切片的免疫染色（皮质和髓质）（n=8/组）。图32B和32C：3－7周大或3周－8.5周大的未处理的Col4A3+/-小鼠、和用各种试剂处理的Col4A3-/-小鼠肾中的SMA定量。显示相对于全图像大小，关于皮质（32B）和髓质（32C）的阳性免疫染色百分比。关于每个处理组的N值在散布图中指定。（*=p<0.01，**=p<0.05，***=p<0.001比较处理组与阴性对照mAb，1E6，处理的）。 
图33A和33B的散布图表示mRNA水平的胶原1α1（图33A）、和胶原1α2（图33B）的Taqman分析。RNA从7周大的未处理或处理的Col4A3-/-小鼠和7周大的未处理的Col4A3+/+小鼠肾中分离。 
图34的一对散布图表示用延迟mAb处理的SMA免疫染色的Col4A3-/-肾。未处理的8.5周Col4A3+/-；未处理的6周Col4A3-/-；未处理的8.5周Col4A3-/-；和用1E6和3G9处理6周－8.5周的8.5 周Col4A3-/-小鼠。N值在散布图中指定。*=p<0.0005，比较处理与阴性对照1E6，处理的Col4A3-/-小鼠。**=p<0.02比较处理与未处理的6周Col4A3-/-小鼠。 
图35描述了7周大的Col4A3-/-小鼠肾中的基因表达和调节模式。显示的是对于在p<0.01时野生型（WT）和未处理的Alport（UN）组之间2倍或更多的差异选择的395个GeneChip探针组。热柱图显示关于单个实验组的相对基因表达水平模式。每个柱表示对于5只小鼠的单个实验组395个标准化的平均探针组信号强度值。如色带所示，在实验条件中基因表达的变化反映在颜色变化中。进行二维分级聚类以探究实验组中的关系（由树状图显示）。 
图36A－36D的条形图显示与Col4A3-/-肾中的肾脏疾病相关的α_vβ₆依赖基因的功能注释。分别对探针组列表进行Ingenuity Pathways Analysis（IPA），所述列表对应与野生型比较Alport肾中过量表达或表达不足的基因。对于IPA使用的列表是最初对于Alport和野生型组之间的显著（>2倍，p<0.01）差异选择的395个探针组的子集。显示的是与基因相关的生物学功能（A，C）和正规途径（B，D）的等级次序列表，所述基因在7周大的Alport小鼠肾中过量表达（A，B）和下调（C，D）。 
图37A－37C是基因的子集和网络分析图示，所述基因在Col4A3-/-肾中差异表达且由阻断性α_vβ₆mAb处理来调节。图37A：探针组列表的Venn图。Venn圆圈、其并集、和交集面积与相应列表中的探针组数目成比例。图37B，37C：最高评分的调节网络推断显著（处理和天然Alport肾之间的差异>2倍，p<0.05）受α_vβ₆阻断性mAbs3G9（图37B）和8G6（图37C）影响的探针组列表。网络边缘显示基因中的相互作用方向，所述基因描述为节点且根据其细胞定位来排列。 
图38描述了TGF-β1表达的免疫组织化学和Taqman分析。图38A：来自对于TGF-βl表达进行免疫染色、用所示试剂处理的Col4A3+/-和Col4A3-/-小鼠的肾切片。显示关于来自每个处理组的代表性切片的染 色。图38B：在处理组中TGF-βl mRNA水平的Taqman分析。 
图39描述了关于肾中胶原表达的三色染色法。对于10周大的Col4A3+/+；β6+/+，Col4A3-/-；β6+/+，和Col4A3-/-；β6-/-小鼠进行染色。显示关于肾皮质（图39A）和髓质（图39B）区域的代表性组织切片。 
图40A和40B的散布图描述使用剂量逐渐增加的3G9处理的SMA免疫染色。显示关于用指定剂量的mu3G9、或10mg/kg mulE6（IgG对照）处理后，肾小球（皮质）（图40A）、和间质（髓质）（图40B）区域的SMA免疫染色的定量分析，所述处理为每周3次，从3到7周大。关于皮质的ED₅₀=0.4mg/kg；关于髓质的ED₅₀=0.3mg/kg。水平线表示平均值。 
图41的一系列显微照片表示正常肾和UUO后的肾中α_vβ₆表达的免疫组织化学分析。图41A：正常未损伤的肾；图41B：UUO后7天；图41C：UUO后10天；图41D：UUO后14天。 
图42的一系列显微照片表示α_vβ₆上调在照射后18周时发生。用14Gy照射的C57BL/6小鼠在所示时间点时被处死，且肺切片用抗β₆抗体染色。 
图43的一对显微照片表示α_vβ₆表达上调在纤维化区域中持续。肺切片如图1中对于β₆表达进行染色。切片来自14-Gy照射后24周（左）或27周（右）时被处死的小鼠。两种切片都显示具有表达高水平α_vβ₆的许多上皮细胞的纤维化损伤。在邻近的非纤维化上皮中，α_vβ₆表达在24周时仍然很高但到27周时明显少得多。 
图44的一系列显微照片表示Itgb6-/-小鼠被保护不受辐射诱导的肺纤维化。Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠（C57BL/6背景）暴露于14-Gy胸部辐射。27周后，小鼠被处死且左肺用Masson's三色进行染色。显示代表性肺；总之，21/23只Itgb6+/+小鼠具有明显的纤维化，而17只Itgb6-/-小鼠中没有一只具有纤维化。 
图45的条形图表示如通过羟脯氨酸测量的，Itgb6-/-小鼠被保护不受辐射诱导的肺纤维化。照射的Itgb6+/+肺的胶原含量显著大于未照射的Itgb6+/+肺以及照射和未照射的Itgb6-/-肺的那种（对照射的Itgb6+/+p<0.03，对于每个组N=5－6）。 
图46的线条图表示在α_vβ₆整联蛋白缺乏不影响在肺照射后的存活。Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠组用14Gy照射。关于2个组的存活曲线没有显著不同（WT=Itgb6+/+，KO=Itgb6-/-）。 
图47的散布图描述了在照射后26周时被处死，接受3G9、可溶性TGFβR或对照Ab IP的小鼠中的肺纤维化测量。肺纤维化在接受l mg/kg/周3G9的小鼠中被预防。每个点表示单个小鼠，条表示平均值。在0.3-mg/kg组和对照组之间在纤维化中没有差异。1-mg/kg组的纤维化明显少于对照。10-mg/kg和可溶性TGFβ受体组具有更少的纤维化，但与对照的差异没有达到显著性。 
图48的散布图描述了在接受3G9、可溶性TGFβR或对照Ab IP的所有小鼠（从照射后20到26周被处死的小鼠、垂死小鼠、和被发现死亡的小鼠）中的肺纤维化测量。数据如图47中呈现。在0.3-mg/kg组和对照组之间在纤维化中没有差异。1-mg/kg、10-mg/kg和可溶性TGFβ受体组的纤维化明显少于对照。 
图49的条形图描述了来自在照射后26周时被处死，接受3G9、可溶性TGFβR或对照Ab IP的小鼠的BAL细胞分类计数。 
图50的线条图表示接受IP3G9抗体注射的14-Gy照射小鼠具有与对照类似的存活。对所有组进行存活分析作为复合分析（p=0.088，C=对照，0.3=0.3mg/kg，1=lmg/kg，SolR=可溶性TGFβ受体，10=10mg/kg）。 
图51的条形图描述了用3G9（1、3、6或10mg/kg）每周1次SC处理的小鼠中的肺纤维化测量。显示了关于所有小鼠（被发现死亡/垂死小鼠和被处死的小鼠）、在28或32周时被处死的小鼠、和被发现死亡/ 垂死小鼠的分别结果。与所有抗体组比较，在对照中存在显著增加的纤维化（对于所有剂量对对照p<0.05）。 
图52的条形图描述了来自在照射后28或32周时被处死，接受3G9或对照Ab SC的小鼠的BAL细胞分类计数。3、6和10mg/kg的3G9剂量导致嗜中性粒细胞和淋巴细胞的百分比明显增加（对于所有比较p<0.05）。 
图53的一系列显微照片描述了在对照对3G9处理小鼠中的BAL细胞外观。在对照细胞离心涂片器（cytospin）中可见正常肺泡巨噬细胞。来自用1mg/kg3G9处理的小鼠的BAL细胞类似于对照。在3mg/kg剂量时，许多大的泡沫状巨噬细胞变得明显。（类似巨噬细胞在Itgb6-/-小鼠中可见。）在更高剂量时（本文显示的6mg/kg和10mg/kg），增加数目的嗜中性粒细胞（箭头）和淋巴细胞以及某些细胞碎片是显而易见的。 
图54的线条图描述了在照射后28周时被处死的小鼠股的卡普兰-迈耶存活曲线。 
图55的线条图描述了在照射后32周时被处死的小鼠股的卡普兰-迈耶存活曲线。 
图56的条形图表示与照射后存活32周的小鼠比较，RV/LV质量比在照射后29－32周之间死亡的小鼠中增加。将小鼠心脏固定在福尔马林中。解剖不含左心室加隔膜（LV）的右心室（RV），且对组织进行称重。相同品系的7只未照射小鼠用作对照。条表示平均值+/-SD。显示关于所有小鼠（用1E6对照抗体或任何剂量的3G9处理的小鼠）、用对照抗体1E6处理的小鼠、和用任何剂量的3G9处理的小鼠的照射小鼠数据。小鼠数目如下：未照射小鼠，N=7；lE6处理的小鼠：存活的N=10，死亡的N=5；3G9处理的小鼠：存活的，N=8，死亡的N=9。RV/LV比在存活的小鼠中与未照射对照没有显著不同。相比之下，与未照射小鼠比较，RV/LV比在死亡的小鼠（所有小鼠以及1E6和3G9子集）中显著增加（P<0.02）。 同样，与存活的等价小鼠组比较，RV/LV比在死亡的小鼠（所有小鼠以及1E6和3G9子集）中显著增加（P<0.0007）。 
图57的一对显微照片描述了来自被发现死亡的小鼠的肺，所述小鼠已用对照抗体（1E6），左，或用抗α_vβ₆抗体（3G9，1mg/kg/周），右处理。指出在肺泡壁中缺乏红细胞的周围区域。这种表现与灌注丧失一致。 
图58的一系列显微照片描述了人肺病中的α_vβ₆表达，表明α_vβ₆表达在人肺病中显著上调。人和小鼠肺的石蜡组织切片用α_vβ₆特异性抗体进行免疫染色，以显示正常（图58A）以及患病肺：特发性肺纤维化（图58B）、弥漫性间质性肺病（图58C）和弥漫性间质性肺病（图58D）中的相对表达水平。染色代表在下文表16-1（实施例16）中概述的41个不同患者样品中可见的上调水平。 
图59的一系列显微照片描述了博来霉素肺纤维化模型中的α_vβ₆表达，表明α_vβ₆表达在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中显著上调。小鼠肺的石蜡组织切片用α_vβ₆特异性抗体进行免疫染色，以显示博来霉素滴注肺中的相对表达水平。 
图60的一系列条形图描述了mu3G9处理对博来霉素处理的SV129小鼠中肺羟脯氨酸含量的影响。在对于列出的各种治疗期所示的前3次实验中，小鼠各自接受4mg/kg mu3G9（阻断性α_vβ₆mAb）、1E6（对照IgGl）。在第4次实验中，小鼠各自接受PBS、4mg/kg mu3G9（阻断性α_vβ₆mAb）、4B4（非阻断性α_vβ₆mAb）、或8G6（第二种阻断性α _vβ₆mAb），每周3次，博来霉素处理后15到60天。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录A中提供。 
图61的一系列条形图描述了mu3G9处理对博来霉素处理的C57B16小鼠中胶原含量（组织形态测定术）的影响。小鼠接受每周3次剂量的mu3G9（阻断性α_vβ₆mAb）、8G6（第二种阻断性α_vβ₆mAb）、8B3（非阻断性α_vβ₆mAb）、1E6（对照IgGl mAb）、或sTGFbR（可溶性TGF- β受体－关于TGF-β抑制的阳性对照）。在所示的前3次实验中（图61A、61B和61C），小鼠在博来霉素攻击前1天开始处理、且在第14天时实施安乐死。在前2次实验中（图61A和61B），每种试剂的剂量是4mg/kg，而在第3次实验（图61C）中，mu3G9的剂量如所示的改变。在最后一次实验中（图61D），小鼠在博来霉素攻击后14天开始处理、且在第28天时实施安乐死。组织学切片用三色染色、成像、且使用Metamorph软件计算蓝染（含胶原）组织的面积作为组织总面积百分比。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录B中提供。*=通过ANOVA与PBS处理组显著不同。 
图62的条形图描述了使用胶原报道小鼠在博来霉素肺纤维化中的mu3G9。将博来霉素气管内滴注到胶原-萤光素酶报道小鼠内。小鼠在博来霉素损伤前当天用PBS，5mg/kg可溶性TGF-bRII-Ig，或剂量为0.1、0.3、1.0、3和10mg/kg的mu3G9开始处理，每周1次，共2周。还包括用4mg/kg mu3G9每周处理3次的另外小鼠组（3X4mg/kg）。假小鼠用气管内盐水滴注且用PBS处理。肺萤光素酶含量在第14天时测定。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。*=通过ANOVA与PBS处理组显著不同。 
图63的一系列线条图描述了时程，以评估在博来霉素攻击小鼠中低有效剂量的mu3G9对主要BAL细胞群体的影响。小鼠在第0天时用博来霉素滴注到肺内。在第-1和+6天时，小鼠用PBS，剂量为0.3、1.0和3.0mg/kg的mu3G9，或剂量为1.0mg/kg的对照IgGl（1E6）处理。细胞在第2、5、8和11天时被处死，且收集肺并评估总BAL细胞计数。巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞群体通过细胞涂片离心器区分染色进行分析。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。 
图64的一系列条形图描述了在第5天时在博来霉素攻击小鼠中，高剂量的mu3G9对主要BAL细胞群体的影响。小鼠在第0天时用博来霉素滴注到肺内。在第-1、+1和+3天时，小鼠用PBS，剂量为4、20和40mg/kg 的mu3G9，或剂量为20和40mg/kg的对照IgGl mAb（1E6）处理。小鼠在第5天时被处死，且收集肺并评估总BAL细胞计数。巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞群体通过细胞涂片离心器区分染色进行分析。组平均值和标准差在实施例16的附录D中提供。*=p<0.05相对于博来霉素攻击的用PBS处理的对照，而不是相对于用1E6IgGl mAb处理的对照。 
图65描述了mu3G9在仓鼠的多剂量博来霉素模型中缺乏功效。在第0、7和14天时，用博来霉素（BL）或盐水（SA）滴注到仓鼠肺内。仓鼠在第0天时用PBS、mu3G9（Ab1）、或对照IgGl（1E6）开始处理。另外的组在第7天（Ab2）或第14天（Ab3）时用mu3G9处理。所有抗体以5mg/kg的剂量每周施用3次。存活的仓鼠在第28天时被处死，且收集肺并评估羟脯氨酸含量（图65AA）和脂质过氧化（图65B）。误差条表示标准误。在多剂量博来霉素研究自始至终的仓鼠存活（图65C）。当与PBS或IgG处理的对照组比较时，在用mu3G9处理的仓鼠存活中没有看到显著差异。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。 
图66描述了关于鉴定为显著受实验处理影响的基因的标准化信号强度曲线图。在第1、8、15和22天时，小鼠用5mg/kg sTGFbRII-Ig（sR）、或用PBS、或用剂量指定为0.3－30mg/kg的mu3G9处理，且在第29天时（无恢复期）或在第78天时（7周的恢复期）实施安乐死。由处理小鼠的肺制备RNA并分析转录物。 
图67描述了在3mg/kg3G9处理组中显示向上趋势的基因的基因表达曲线图。在第1、8、15和22天时，小鼠用5mg/kg sTGFbRII-Ig（sR）、或用PBS、或用剂量指定为0.3－30mg/kg的mu3G9处理，且在第29天时（无恢复期）或在第78天时（7周的恢复期）实施安乐死。由处理小鼠的肺制备RNA并分析转录物。 
图68的一对条形图描述了显著受mu3G9影响的基因的IPA注释。 
图69A和69B的网状图示意性描述了在小鼠肺中受mu3G9影响的调节网络。 
图70的条形图描述了MMP-12转录物对mu3G9处理的剂量响应。 
图71是正常和照射小鼠中BAL流体蛋白水平的一系列散布图。 
图72的一系列散布图描述了由辐射诱导的纤维化上调、和在28周时由mu3G9处理下调的蛋白质。 
图73是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:80的序列说明。 
发明详述 
除非本文另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然下文描述了优选方法和材料，但类似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用。虽然下文描述了示例性方法和材料，但类似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本发明的实践中使用。本文提及的所有出版物和其他参考文献整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。材料、方法和实施例仅是举例说明性的且不希望是限制性的。本说明书自始至终，单词“包含”应当理解为指包含所述整数或整数群、但不排除任何其他整数或整数群。 
定义 
约：如本文使用的，当涉及任何数值时，术语“约”意指所述值±10％的值（例如，“约50℃”包含45℃－55℃的温度范围，包括45℃和55℃；类似地，“约100mM”包含90mM－110mM的浓度范围，包括90mM和110mM）。 
拮抗剂：如本文使用的，术语“拮抗剂”指减少、基本上减少或完全抑制α_vβ₆整联蛋白在细胞、组织或生物中的生物和/或生理效应的化合物、分子、部分或复合物。可以是对于α_vβ₆的配体的拮抗剂，可以以各种方式进行此类效应，包括但不限于，与另一种配体竞争结合细胞表面上的α_vβ₆；以这样的方式与α_vβ₆相互作用以便减少、基本上减少或抑制整联蛋白结合其他配体的能力；与细胞表面α_vβ₆结合且诱导α_vβ₆中的构象变化，从而使得整联蛋白呈现其他配体不能再与之结合的结 构（或只能以减少或基本上减少的亲和力和/或功效结合）；诱导细胞、组织或生物中的生理学变化（例如，细胞内信号复合物增加；转录抑制剂增加；细胞表面α_vβ₆表达减少；等），从而使得在与细胞上的α_vβ₆结合后，其他配体的结合，或通过此类配体诱导的生理学信号被减少、基本上减少或完全抑制；以及通过其拮抗剂可以实现其活性的其他机制，所述机制将是普通技术人员熟悉的。如普通技术人员应当理解的，拮抗剂可以具有与它拮抗的另一种α_vβ₆结合部分（例如，α_vβ₆结合配体）类似的结构（例如，拮抗剂可以是激动剂的突变型蛋白、变体、片段或衍生物），或可以具有完全无关的结构。 
结合：如本文使用的，术语“结合”指可以是共价例如通过化学偶联，或非共价例如离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等的结合或附着。共价键可以是例如，酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、乌拉坦、酰胺、胺、肽、酰亚胺、腙、酰肼、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语例如“偶联”、“缀合”和“附着”更广泛，且包括“偶联”、“缀合”和“附着”。 
缀合物/缀合：如本文使用的，“缀合物”指部分例如化学药品或放射性同位素与配体的共价附着产物，所述配体与α_vβ₆例如α_vβ₆结合抗体或其片段结合。“缀合”指如前句中限定的缀合物的形成。使化学药品或放射性同位素与生物学活性材料例如蛋白质或多肽（包括抗体）缀合、由本领域技术人员通常使用的任何方法都可以在本发明中使用。 
疾病、病症、病状：如本文使用的，术语“疾病”或“病症”指人或动物的任何不利条件，包括肿瘤、癌症、变态反应、成瘾、自身免疫性、感染、最佳精神或躯体功能中毒或损害。如本文使用的，“病状”包括疾病和病症但还指生理学状态。例如，生育力是生理学状态但不是疾病或病症。因此适合于通过降低生育力预防妊娠的本发明组合物将被描述为病状（生育力）治疗，而不是病症或疾病治疗。其他病状将是本领域普通技术人员理解的。 
有效量：如本文使用的，术语“有效量”指实现所需生物学效应所需或足够的给定化合物、缀合物或组合物量。依照本发明方法给定化合物、缀合物或组合物的有效量将是达到这个选择结果的量，且此类量可以由本领域技术人员按常规进行测定，使用本领域已知和/或本文描述的测定法，无需过度实验。例如，用于治疗或预防癌症转移的有效量可以是在体内预防肿瘤细胞经过基底膜或经过内皮层移动和侵袭所需的量。该术语还与“足够量”同义。关于任何具体应用的有效量可以依此类因素而变，如待治疗的疾病、病症或病状，待施用的具体组合物，施用途径，受试者大小，和/或疾病或病状的严重度。依照本文提供的指导，无需过度实验，本领域普通技术人员即可以经验为主地确定本发明的具体化合物、缀合物或组合物的有效量。 
一个（种）、a或an：当术语“一个（种）”、“a”或“an”在本公开内容中使用时，除非另有说明，它们意指“至少一个（种）”或“一个（种）或多个（种）”。像这样，术语“a”（或“an”）、“一个（种）或多个（种）”和“至少一个（种）”在本文中可以互换使用。 
肽、多肽、蛋白质：如本文使用的，术语“多肽”意欲包含单数“多肽”以及复数“多肽”，且指通过酰胺键（也称为肽键）线性连接的单体（氨基酸）构成的分子。术语“多肽”指2个或更多氨基酸的任何一条或多条链，且不涉及产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或用于指2个或更多氨基酸的任何一条或多条链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义内，和术语“多肽”可以代替任何这些术语使用，或可与任何这些术语互换使用。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基衍生化、蛋白酶剪切、或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以来源于天然生物源或通过重组技术产生，但不必由指定核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。依照这个定义，本发明中使用的多肽大小可以为约3 个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1,000个或更多、或2000个或更多氨基酸。多肽可以具有限定三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定三维结构的多肽称为折叠的，和没有限定三维结构、而是可以采取大量不同构象的多肽称为未折叠的。如本文使用的，术语糖蛋白指与至少一种碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分经由氨基酸残基的含氧或含氮侧链与蛋白质附着，所述氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基。依照本发明使用的优选多肽包括是配体或与细胞表面上的α_vβ₆整联蛋白结合的多肽，包括但不限于，识别且与α_vβ₆上的一个或多个表位结合的抗体（特别是单克隆抗体）。 
“分离”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境中的多肽。不要求具体纯化水平。例如，分离多肽可以取自其天然或自然环境。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白质被视为分离的，与已通过任何合适技术分离、分馏、或部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样。 
作为本发明多肽还包括的是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，或其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当指抗α_vβ₆抗体或抗体多肽时，包括保留相应天然抗体或多肽的至少某些抗原结合特性的任何多肽，即保留与α_vβ₆整联蛋白上的一个或多个表位结合能力的那些多肽。本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，除了本文其他地方讨论的具体抗体片段。依照本发明有用的抗α_vβ₆抗体和抗体多肽变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸置换、删除、或插入具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然发生或非天然发生。非天然发生的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸置换、删除或添加。依照本发明有用的抗α_vβ₆抗体和抗体多肽衍生物是已被改变以便显示天然多肽上 未发现的另外特征的多肽。例子包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文使用的，抗α_vβ₆多肽或多肽片段“衍生物”指具有通过功能侧基反应化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。作为“衍生物”还包括的是包含20种标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可以代替脯氨酸；5-羟赖氨酸可以代替赖氨酸；3-甲基组氨酸可以代替组氨酸；高丝氨酸可以代替丝氨酸；和鸟氨酸可以代替赖氨酸。 
基本上，基本：如本文使用的，如果缀合蛋白质与受体的结合比率和/或量不小于未缀合的相应细胞因子、趋化因子、生长因子或多肽激素的结合比率和/或量的约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％或更多，那么蛋白质缀合被说成“基本上”不干扰蛋白质与其一种或多种受体结合的能力。 
处理：如本文使用的，术语“处理”指特别是其中目的是预防或减缓（减少）不希望有的生理学变化或紊乱的预防和/或治疗，所述生理学变化或紊乱例如多发性硬化症的进展。有利或希望的临床结果包括但不限于，无论是可检测的还是不可检测的症状减轻、病变范围减少、疾病状态稳定（即不恶化）、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻、和好转（无论是部分还是全部）。“处理”还可以指与未接受处理时的预期存活比较延长的存活。需要处理的那些包括已具有病状或病症的那些，以及易于具有病状或病症的那些，或其中病状或病症待预防的那些。“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人和其他灵长类、家畜、农场动物、和动物园、运动、或宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。 
概括 
本发明的特征在于对整联蛋白α_vβ₆特异的人源化抗体。本文描述了制备本发明抗体的各种方法。本领域已知但本文未具体描述的方法也在本发明的范围内。 
本发明还至少部分基于下述发现：整联蛋白α_vβ₆在肿瘤细胞表面上差异表达，其中相对于在非转移性或具有较低转移潜能的肿瘤细胞上观察到的表达水平，它在转移性或具有较高转移潜能肿瘤细胞上以增加的量表达。为了分析这种差异表达，本发明使用与整联蛋白α_vβ₆结合的配体，特别是抗体（和更具体而言由本发明提供的人源化抗体）。在其他实施方案中，本发明还提供了在确定肿瘤细胞的侵袭和/或转移潜能中、以及在更可能进展至侵袭或转移癌的那些癌的鉴定中使用这种差异表达鉴定的方法，所述癌例如某些腺癌和原位癌（包括DCIS和LCIS）。本发明还提供了鉴定其中构成肿瘤的细胞更可能响应治疗的那些肿瘤的方法，所述治疗使用与整联蛋白α_vβ₆结合的一种或多种配体。本发明还提供了诊断和治疗/预防肿瘤转移，以及用于在肿瘤手术摘除后清除残留转移性肿瘤细胞的方法。 
人源化抗体
在一个实施方案中，由本发明提供的抗体是单克隆抗体，在优选实施方案中，所述单克隆抗体是来源于其他种类的同类抗α_vβ₆抗体的人源化形式。人源化抗体是由重组DNA技术生产的抗体，其中并非抗原结合所需的人免疫球蛋白轻或重链的某些或所有氨基酸（例如，可变结构域的恒定区和框架区），用于代替来自同类非人抗体的轻或重链的相应氨基酸。例如，针对给定抗原的人源化形式的鼠类抗体在其重和轻链上具有（1）人抗体的恒定区；（2）来自人抗体的可变结构域的框架区；和（3）来自鼠类抗体的CDRs。必要时，人框架区中的一个或多个残基可以变成鼠类抗体相应位置上的残基，以便保留人源化抗体对抗原的结合亲和力。这种变化有时称为“回复突变”。与嵌合人抗体比较，人源化抗体在人中一般更不可能引发免疫应答，因为人源化抗体包含明显更 少的非人组分。 
用于制备本发明的人源化抗体的合适方法在下述参考文献中描述：例如Winter EP0239400；Jones等人，Nature321：522-525（1986）；Riechmann等人，Nature332：323-327（1988）；Verhoeyen等人，Science239：1534-1536（1988）；Queen等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：10029（1989）；美国专利6,180,370；以及Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：3833（1989），所述参考文献的公开内容全部整体引入本文作为参考。一般地，鼠类（或其他非人）CDRs到人抗体上的移植如下完成。编码重和轻链可变结构域的cDNAs从杂交瘤中分离。可变结构域包括CDRs的DNA序列通过测序来确定。通过定点诱变将编码CDRs的DNAs转移至人抗体重或轻链可变结构域编码序列的相应区域。随后添加所需同种型（例如γl对于C_H和κ对于C_L）的人恒定区基因区段。人源化重和轻链基因在哺乳动物宿主细胞（例如，CHO或NSO细胞）中共表达，以产生可溶性人源化抗体。为了促进抗体的大规模生产，通常希望在包含抗体表达细胞的生物反应器中生产此类人源化抗体，或产生在乳中表达抗体的转基因哺乳动物（例如，山羊、奶牛或绵羊）（参见，例如，美国专利5,827,690）。 
有时候，CDRs至人框架的直接转移导致所得到的抗体的抗原结合亲和力丧失。这是因为在某些同类抗体中，在框架区内的某些氨基酸与CDRs相互作用，且因此影响抗体的总体抗原结合亲和力。在此类情况下，在受体抗体的框架区中引入“回复突变”（同上）以便保留同类抗体的抗原结合活性将是关键的。 
进行回复突变的一般方法是本领域已知的。例如，Queen等人（同上），Co等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA88：2869-2873（1991），和WO90/07861（Protein Design Labs Inc.）描述了涉及2个关键步骤的方法。首先，通过计算机分析对于与同类鼠类抗体的可变区框架的最佳蛋白质序列同源性选择人可变框架区。随后，通过计算机模拟鼠类 可变区的三级结构，以便显示可能与鼠类CDRs相互作用的框架氨基酸残基，且随后将这些鼠类氨基酸残基叠加在同源人框架上。 
根据这种2步方法，存在关于设计人源化抗体的几个标准。第一个标准是使用来自特定人免疫球蛋白的框架作为人受体，所述人免疫球蛋白通常与非人供体免疫球蛋白同源，或使用来自许多人抗体的共有框架。第二个标准是：如果人受体残基是罕见的、和供体残基在框架的特定残基上对于人序列是一般的，那么使用供体而不是受体氨基酸。第三个标准是在紧邻CDRs的位置上使用供体而不是受体框架氨基酸残基。 
还可以使用如例如Tempest，Biotechnology9：266-271（1991）中所述的不同方法。根据这种方法，来源于NEWM和REI重和轻链的可变区框架分别用于CDR移植，而不是自由引入小鼠残基。使用这种方法的优点是NEWM和REI可变区的三维结构由于X射线晶体学是已知的，且因此可以容易地模拟CDRs和可变区框架残基之间的特异性相互作用。 
如WO03/100033中所述，本发明人由从杂交瘤6.3G9和6.8G6分离的mRNAs制备抗体重链可变区cDNA和轻链可变区cDNAs。这些杂交瘤生产与α_vβ₆整联蛋白结合的IgGl类小鼠单克隆抗体。嵌合人抗体表达载体通过将cDNA插入表达载体内来构建，所述表达载体包含人抗体重链恒定区或人抗体轻链恒定区编码序列。随后将此类载体引入动物细胞内以实现抗α_vβ₆嵌合人抗体的生产。在生产的嵌合抗体中，发现抗α_vβ₆嵌合人抗体3G9和8G6与α_vβ₆整联蛋白反应，且显示阻断活性。 
使用上述方法，产生人源化形式的嵌合抗体3G9和8G6。如本文实施例中所述，对于3G9抗体，这包括克隆鼠类3G9可变重和轻链区域。如本文实施例中所述，编码鼠类3G9轻和重链可变区的cDNA随后用于构建用于表达鼠类-人嵌合体的载体，其中鼠类3G9可变区与人IgGl（对于重链）和人κ（对于轻链）恒定区连接。转染到293-EBNA细胞内后轻链和重链3G9表达载体的表达表明，嵌合3G9转染细胞、合成且有效装配重和轻链且分泌抗体（参见实施例2）。此外，还制备了去糖基突变 型嵌合3G9抗体。在3G9轻链第1个CDR的N联糖基化位点内天冬酰胺（N）至丝氨酸（S）的氨基酸置换显示极大地改善蛋白质表达和纯化，而不改变结合亲和力（图1）。 
为了生产人源化3G9抗体，通过与人种系序列相配的同源性选择人受体框架结构域。如实施例3中所述，对于轻链，发现人L6受体框架是最同源的，和对于重链，发现人3－7受体框架是最同源的。使用这些选择的人受体框架，设计轻和重链可变结构域，且产生和表达每一种的许多变体/形式（实施例4）。 
本发明描述了作为包含SEQ ID NO：1的重链可变结构域和SEQ ID NO：2的轻链可变结构域的人源化3G9抗体。 
SEQ ID NO：1 
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYVMSWVRQAPGKGLE 
WVASISSGGRMYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV 
YYCARGSIYDGYYVFPYWGQGTLVTVSS 
SEQ ID NO：2 
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY 
STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSTYPPTFG 
GGTKVEIK 
产生具有不同程度回复突变的3G9重和轻链的不同变体/形式，以确定哪个组合产生具有对于α_vβ₆的较好结合亲和力和阻断活性的最佳人源化抗体。在产生的5种不同形式的轻链和3种不同形式的重链中，3G9重链形式3（HV3）与3G9轻链形式5（LV5）的配对产生最佳的人源化抗体（实施例4）。这种人源化3G9形式5（H3/L5）抗体通过下述产生：表达关于重链形式3（H3）包含质粒pKJS189（SEQ ID NO：6）的重组载体，与关于轻链形式5（LV5）包含质粒pKJS195（SEQ ID NO：5）的重组载体组合。 





449Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
在人源化8G6抗体的设计中使用类似方法（实施例7）。设计3种形式的8G6可变轻链和可变重链，其中第一种形式包含最多的回复突变和第三种形式包含最少的回复突变（最“人源化”）（实施例5）。 
SEQ ID NO：75（hu8G6形式1轻链） 
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 
SEQ ID NO：76（hu8G6形式2轻链） 
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 
SEQ ID NO：77（hu8G6形式3轻链） 
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEK 
SEQ ID NO：78（hu8G6形式1重链） 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFTDYAMHWVRLAPGQGLE 
WIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAV 
YYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
SEQ ID NO：79（hu8G6形式2重链） 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL 
EWIGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA 
VYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
SEQ ID NO：80（hu8G6形式3重链） 
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGL 
EWMGVISTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTA 
VYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
其他部分
如下文进一步详细描述的，本发明的人源化单克隆抗体可以进一步包含其他部分以实现所需功能。例如，人源化抗体可以包括毒素部分（例如，破伤风类毒素或蓖麻毒素）或放射性核素（例如，¹¹¹In或⁹⁰Y）用于杀死由抗体靶向的细胞（参见，例如，美国专利6,307,026）。人源化抗体可以包含用于容易分离或检测的部分（例如，生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸标记或其他肽标记）。人源化抗体还可以包含可以延长其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇（PEG）部分。 
各种化学治疗剂可以与靶向人源化抗体偶联。优选地，结合后内在化的人源化抗体将是最佳的，然而，不预先排除非内在化人源化抗体的使用。例如，取决于使用的药物，抗体-药物缀合物的使用可以提供抗肿瘤活性,所述抗体-药物组合物与肿瘤细胞表面结合，在肿瘤内或肿瘤细胞附近释放药物，且扩散或运输到细胞内。可以用于制备缀合物的药物名单是广泛的，且本领域技术人员将知道如何对所需化合物进行化学修饰，以便进行反应使得那种化合物更方便地用于制备本发明缀合物目的。例如，药物可以经由“可释放的连接体”偶联，所述可释放的连接体在血清中明显更稳定，而在肿瘤细胞内释放活性药物。取决于具体药物，可以使用几种释放机制。这些释放机制的例子包括使用酸敏感性腙、氧还反应敏感性连接体例如二硫化物、和蛋白酶切割的肽连接体。下述是来自几个不同种类的某些代表性药物： 
（A）烷化剂。这些药物的某些具体例子是环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑和亚硝基脲。 
（B）抗代谢物和抗增殖剂例如蒽环类抗生素、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、核苷、蝶啶、一烯二炔（endiynes）。例子是亚德里亚霉素、道诺红霉素、阿霉素、氨蝶呤、氨甲喋呤、丝裂霉素C、放线菌素D、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、红豆杉醇、紫杉烷、细胞松弛素B、秋水仙碱、和嘌呤霉素依托泊苷、美法仑、长春碱、长春新碱、卡里奇霉素、美登素衍生物、和dolistatin衍生物。 
（C）激素和激素拮抗剂例如皮质类固醇、孕酮和雌激素 
前体药物定义为当与抗体附着时以“较不有效”的化学形式存在，而内在化后被酶促切割以产生更有效的药物形式的药物。这种相同应用可以对不内在化的抗体缀合物进行，例如，酶促切割在肿瘤细胞表面上发生，且药物被释放到紧靠肿瘤的环境内且被肿瘤细胞同化。这个的某些例子是包含磷酸盐、硫酸盐和肽的药物。 
生物学活性蛋白质毒素例如蓖麻毒素A链、白喉毒素、志贺毒素、破伤风，或有毒酶的附着是本发明考虑的另一种形式的抗体-缀合物。此类缀合物可以使用化学缀合方法或使用遗传工程技术来制备，所述遗传工程技术允许直接表达抗体-毒素构建体，是本领域技术人员已知的。 
本发明的人源化单克隆抗体还可包含其他部分例如放射性核素。为了放射免疫疗法的目的，本发明考虑了人源化α_vβ₆抗体的使用，以特异性靶向治疗性放射同位素用于治疗癌症。相关同位素的名单可以包括但不限于，⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、 ¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。还考虑了α发射体同位素例如²¹¹At、²¹²Bi。同位素附着的方法是不同的且取决于使用的具体同位素。本领域技术人员将熟悉且能够确定用于任何具体同位素附着的缀合化学方法。 
对于放射免疫诊断的目的，人源化α_vβ₆抗体可以提供对靶向癌症和/或任何特定疾病的患病器官/组织成像和进行放射量测定的机会。这对于证实已知肿瘤位点的定位以及使得能够优化定量治疗施用将是有用的。特别地，除了纯γ同位素^99MTc外，正电子放射性同位素（例如，⁸⁶Y） 可以在治疗施用期间给予。 
上述放射免疫疗法/放射免疫诊断应用不限于非内在化抗体的使用。存在有效使用内在化抗体用于靶向放射性同位素的例子，特别是对于分解代谢后作为螯合物保留在细胞中的同位素。例如，⁹⁰Y标记的抗体使用高亲和力螯合剂例如MX-DTPA或CHX-DTPA制备。 
任何上述抗体缀合物还包括片段Fab、F（ab'）2、scFvs、微型抗体、CH2结构域缺失的抗体构建体、和FcRn突变体的使用。这些Ab片段或种属修饰的构建体具有不同于完整IgG的药代动力学、肿瘤穿透、和肿瘤定位特性，这可以在具体应用中提供优点。例如，更快清除的Fab可以用于关于放射免疫诊断应用的诊断应用。另一方面，对于免疫放射疗法或药物靶向，选择具有更长血清t_1/2的靶向媒介物可能更有效。 
患病条件和动物模型
本发明的人源化抗体在α_vβ₆介导的疾病的诊断和治疗，包括预防中有用。例如，这些人源化抗体可以通过阻断TGF-β活化或阻断α_vβ₆与任何其他配体的结合，所述配体例如纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白，用于治疗纤维化（例如，肺纤维化、急性肺损伤、肾纤维化、肝纤维化、阿尔波特氏综合征和硬皮病），以及本文其他地方描述的其他疾病和病症。特别地，本发明的人源化抗体可以用于治疗与损伤/纤维化相关的肺病，例如但不限于，特发性肺纤维化、辐射诱导的纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、硬皮病、博来霉素诱导的纤维化、慢性哮喘、硅肺病、石棉诱导的纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫、（包括细菌性肺炎诱导、创伤诱导、病毒性肺炎诱导、空调机诱导、非肺脓毒诱导和抽吸诱导的）。本发明的人源化抗体可以用于治疗与损伤/纤维化相关的慢性肾病，例如但不限于，狼疮、糖尿病、硬皮病、肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、IgA肾病、高血压、同种异体移植和阿尔波特氏病。人源化抗体还可以用于治疗肠纤维化、硬皮病、辐射诱导的纤维化。本发明的人源化抗体还可以用于治疗肝纤维化，例如但不限于，胆管损伤诱导 的纤维化。本发明的人源化抗体可以用于治疗的其他适应症还包括头与颈纤维化、辐射诱导的纤维化、角膜瘢痕形成、LASIX、角膜移植、小梁切除术、肥厚性瘢痕、烧伤诱导的纤维化、手术纤维化、肉状瘤病、牛皮癣和脊髓损伤/纤维化。 
如下文详细描述的，除了纤维化疾病或病状外，本发明的人源化抗体在癌症或癌症转移（包括肿瘤生长和侵袭），特别是上皮癌治疗中有用。上皮癌的子集是鳞状细胞癌，例如头与颈（包括口腔、喉、咽、食道），乳腺、肺，前列腺，子宫颈，结肠，胰腺，皮肤（基底细胞癌）和卵巢癌。使用新α_vβ₆单克隆抗体的研究证实α_vβ₆在许多上皮癌中，特别是在肿瘤前缘上高度表达。新抗体还可以用于由α_vβ₆介导的任何其他疾病，包括牛皮癣。 
本发明抗体的功效可以在各种动物模型中进行测试，其中一些在下文的非限制性例子中描述。关于肺纤维化的小鼠模型包括博来霉素（Pittet等人，J.Clin.Invest.107（12）：1537-1544（2001）；和Munger等人，同上）和辐射诱导的肺纤维化（Franko等人，Rad.Res.140：347-355（1994））。在博来霉素处理的小鼠中，α_vβ₆表达在肺的肺泡上皮细胞中增加。但β₆敲除小鼠被保护不受博来霉素诱导的损伤和纤维化。 
关于肾纤维化的小鼠模型包括COL4A3-/-小鼠（参见，例如，Cosgrove等人，Amer.J.Path.157：1649-1659（2000）），具有亚德里亚霉素诱导的损伤的小鼠（Wang等人，Kidney International58：1797-1804（2000）；Deman等人，Nephrol Dial Transplant16：147-150（2001）），db/db小鼠（Ziyadeh等人，PNAS USA97：8015-8020（2000）），和具有单侧输尿管梗阻的小鼠（Fogo等人，Lab Investigation81：189A（2001）；和Fogo等人，Journal of the American Society of Nephrology12：819A（2001））。在所有这些模型中，小鼠发展可以进展至肾衰竭的肾损伤和纤维化。α_vβ₆在COL4A3-/-小鼠、亚德里亚霉素处理小鼠、 和经历单侧输尿管梗阻的小鼠的肾小管升支和降支的上皮层中是上调的。可能α_vβ₆表达在各种肾损伤模型中也增加。 
同样在下文详细描述的是，还可以在此类动物模型如标准的体内肿瘤生长和转移模型中测试抗α_vβ₆单克隆抗体抑制肿瘤生长、进展、和转移的能力。参见，例如，Rockwell等人，J.Natl.Cancer Inst.49：735（1972）；Guy等人，Mol.Cell Biol.12：954（1992）；Wyckoff等人，Cancer Res.60：2504（2000）；和Oft等人，Curr.Biol.8：1243（1998）。在癌症中重要的α_vβ₆配体可以包括TGF-β、纤连蛋白和玻连蛋白，所述TGF-β涉及转移（关于综述参见Akhurst等人，Trends in Cell Biology11：S44-S51（2001））。 
本发明的治疗功效可以通过许多可用的诊断工具来测量，包括体格检查、血试验、蛋白尿测量、肌酸酐水平和肌酸酐清除率、肺功能测试、血浆尿素氮（BUN）水平、瘢痕化或纤维化损害的观察和评分、细胞外基质例如胶原沉积、平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白、肾功能测试、超声、磁共振成像（MRI）、和CT扫描。 
药物组合物
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的一种或多种人源化抗体，或其药学可接受的衍生物，任选具有任何药学可接受的载体。如本文使用的，术语“载体”包括已知可接受的佐剂和媒介物。 
根据本发明，药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水或油悬浮液。这种悬浮液可以根据本领域已知技术使用任何合适的分散、湿润或悬浮剂来配制。 
本发明的药物组合物可以根据需要经口、局部、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、关节内、滑膜内、干内（intrasternally）、鞘内、肝内、或颅内给予，或仅局部性地在炎症或肿瘤生长位点上给予。本发明的药物组合物还可以通过吸入经由使用例如喷雾器、干粉吸入器或定量吸入器来施用。 
有效产生预期效应的本发明抗体的剂量和剂量率将取决于各种因素，例如待治疗的疾病的性质、受试者大小、治疗目标、使用的具体药物组合物、和治疗医生的判断。约0.001－约100mg/kg体重/天的剂量水平，例如约0.1－约50mg/kg体重/天的活性成分化合物是有用的。例如，本发明的抗体将以约0.01mg/kg体重/天－约20mg/kg体重/天的剂量，例如约0.1mg/kg体重/天－约10mg/kg体重/天，和每1－14天的间隔施用。在另一个实施方案中，当腹膜内施用时，抗体以约0.3－1mg/kg体重的剂量施用。在另外一个实施方案中，当静脉内施用时，抗体以约5－12.5mg/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，抗体组合物以有效提供至少1mg/ml抗体血浆水平的量施用。 
其他合适的剂量以及施用方案和方式将是本领域普通技术人员熟悉的；再其他的在下文进一步详细描述。 
与整联蛋白a_vβ₆结合的配体 
在另外的实施方案中，本发明还指向通过测定细胞的整联蛋白α_vβ₆表达水平，用于鉴定转移癌细胞，或用于预测肿瘤中的细胞转移潜能（即，肿瘤中的细胞将从原发性肿瘤位点转移至体内的次级，或转移位点的可能性）的方法，其中α_vβ₆的细胞表面表达增加表明癌细胞更可能是转移性的。在相关实施方案中，本发明指向在去除肿瘤的医学干预后（例如，手术摘除肿瘤，或化学治疗或放射治疗性减少或切除肿瘤），用于清除表达α_vβ₆的残留肿瘤细胞，特别是转移性肿瘤细胞的方法。在另外相关的实施方案中，本发明提供了鉴定非侵袭形式的癌，特别是腺癌或原位癌（例如乳腺原位导管癌（DCIS）或原位小叶癌（LCIS））的方法，所述癌更可能进展至侵袭或转移形式。某些此类实施方案包含测定癌细胞中、或癌周围的肌上皮中、从患有此类癌的患者获得的组织切片中的整联蛋白α_vβ₆表达水平，其中相对于非肿瘤组织样品（理想地，来自同一患者的同一器官）整联蛋白α_vβ₆的表达水平增加，表明癌在不久将来的某时更可能进展至侵袭或转移形式的癌。在每个此类实 施方案中，本发明依赖肿瘤细胞中α_vβ₆表达增加的鉴定或利用，所述鉴定通过使组织、肿瘤或肿瘤细胞与一种或多种配体接触来完成，所述配体与组织、肿瘤或肿瘤细胞中的整联蛋白α_vβ₆结合。在某些实施方案中，组织、肿瘤或肿瘤细胞是癌组织、肿瘤或肿瘤细胞，包括来自癌例如腺癌的那些。在更具体的实施方案中，癌是乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、头与颈癌、胃癌或脾脏癌。更具体而言，癌是乳腺癌（包括但不限于原位乳腺癌，例如原位导管癌（DCIS）或原位小叶癌（LCIS））、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、或肺癌。 
在本发明的某些实施方案中，与α_vβ₆结合的配体是α_vβ₆拮抗剂。此类拮抗剂包括但不限于，与α_vβ₆特异性结合的抗体；与β₆特异性结合的抗体；与α_v特异性结合的抗体；与对于α_vβ₆的配体结合的抗体；对于α_vβ₆的配体；反义核酸；以及肽、非肽、和此类配体的拟肽类似物。 
在本发明的某些此类实施方案中，与整联蛋白α_vβ₆结合的配体是与整联蛋白α_vβ₆结合的抗体，或其整联蛋白α_vβ₆结合片段、变体、或衍生物。此类抗体可以与整联蛋白的1个亚单位（例如，与位于α_v亚单位上的表位或位于β₆亚单位上的表位结合的抗体），或2个亚单位（例如，与位于桥接α_v和β₆亚单位的整联蛋白异二聚体区域中的表位结合的抗体）结合。除非具体提及全长抗体例如天然存在的抗体，术语“α_vβ₆抗体”包含全长抗体以及此类抗体的α_vβ₆结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子、或以类似于抗体分子的方式结合抗原的改造抗体分子或片段。抗体可以是合成、单克隆或多克隆的，且可以通过本领域众所周知的技术来制备。对于治疗应用，具有人恒定区和可变区的“人”单克隆抗体通常是优选的，以便使患者针对抗体的免疫应答降到最低。此类抗体可以通过免疫包含人免疫球蛋白基因的转基因动物来产生（参见，例如，Jakobovits等人，Ann.N.Y. Acad.Sci.764：525-535（1995））。关于合成和半合成抗体，此类术语意欲包含但不限于抗体片段、同种型转换抗体、人源化抗体（例如，小鼠-人、人-小鼠等）、杂交物、具有多重特异性的抗体、全合成的抗体样分子等。 
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白包含至少重链的可变结构域，且通常包含至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对充分了解的。参见，例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988）。如普通技术人员应当理解的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”包含可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员应当理解重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon（γ、μ、α、δ或ε），其中具有某些亚类（例如，γ1－γ4）。这种链的性质确定抗体“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类（同种型）例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁等是充分表征的且已知赋予功能特化。由于本公开内容，这些种类和同种型中每一种的修饰形式对于技术人员是容易辨别的，且因此在本发明的范围内。 
适合于在本发明中使用的与α_vβ₆结合的抗体，或其α_vβ₆结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类化、或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F（ab'）₂、Fd、Fvs、单链Fvs（scFv）、单链抗体、二硫键合的Fvs（sdFv）、包含V_L或V_H结构域的片段、通过Fab表达文库产生的片段、和抗独特型（抗Id）抗体（包括，例如针对本文公开的抗α_vβ₆抗体的抗Id抗体）。ScFv分子是本领域已知的且在例如美国专利5,892,019中描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2）或亚类。 
抗体片段包括单链抗体可以包含单独或与下述全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、C_H1、C_H2和C_H3结构域。本发明中还包括的是抗原结合片段，所述抗原结合片段还包含一个或多个可变区与铰链区、C_H1、C_H2和C_H3结构域的任何组合。用于在本文公开的诊断和治疗方法中使用的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠科动物、大鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、牛科动物或鸡抗体。最优选地，抗体是人、人源化或灵长类化抗体，或嵌合抗体，特别是单克隆抗体。如本文使用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，如下文和例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所述，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的且不表达内源性免疫球蛋白。如本文使用的，术语“嵌合抗体”将意指其中免疫反应区域或位点从第一个种类获得或衍生，和恒定区（依照本发明这可以是完整、部分或修饰的）从第二个种类获得的任何抗体。在优选实施方案中，靶结合区域或位点将来自非人来源（例如，小鼠或灵长类），和恒定区是人的。 
用于依照本发明使用的特别优选的抗体是抗α_vβ₆单克隆抗体，例如Weinreb等人，J.Biol.Chem.279（17）：17875-17877（2004）（所述参考文献的公开内容整体引入本文作为参考）中公开的那些，包括其中公开的单克隆抗体6.8G6（“8G6”）和6.3G9（“3G9”）。与α_vβ₆结合且因此适合于依照本发明使用的另外抗体包括与整联蛋白α_vβ₆的β₆亚单位结合（且因此视为“抗β₆抗体”）的抗体（或其片段、变体或衍生物），例如整体引入本文作为参考的Weinacker等人，J.Cell Biol.269：1-9（1994）；和整体引入本文作为参考的美国专利号6,692,741B2，特别是在第2－3和7－8栏中公开的那些，包括命名为10D5（ATCC保藏号HB12382，1997年8月6日保藏于美国典型培养物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA20108）（参见美国专利号6,692,741，在第3栏， 7－13行，和第7－8栏）和CSβ6（参见美国专利号6,692,741，在第7－8栏）的单克隆抗体。根据本发明这个方面的合适实施方案使用α_vβ₆整联蛋白结合配体，所述α_vβ₆整联蛋白结合配体是α_vβ₆结合抗体或其α_vβ₆表位结合片段。适合于依照本发明这个方面使用的另外抗体包括但不限于，美国专利申请公开号US2005/0255102Al中公开的α_vβ₆结合单克隆抗体，所述专利的公开内容整体引入本文，包括其中命名为3G9、8G6、1A8、2B1、2B10、2A1、2E5、1Gl0、7G5、1C5的那些，及其片段、嵌合体和杂交物。用于依照本发明使用的特别合适的抗体是单克隆抗体2B1、3G9和8G6。 
在某些实施方案中，抗体包含与由杂交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5生产的抗体相同的重和轻链多肽序列。用于依照本发明使用的特别合适的抗体是包含与下述抗体相同的重和轻链多肽序列的单克隆抗体：由杂交瘤6.2B1（ATCC保藏号PTA-3646，2001年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA20108）生产的2B1抗体，由杂交瘤6.8G6（ATCC保藏号PTA-3645，2001年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA20108）生产的8G6抗体，和由杂交瘤6.3G9（ATCC保藏号PTA-3649，2001年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA20108）生产的3G9抗体（参见公开的美国申请号US2005/0255102Al，所述专利整体引入本文作为参考，特别是在第1页，第0008段；在第2页，第0032和0036段；和在第6－14页的实施例中），和命名为10D5的抗体（分泌所述抗体的杂交瘤于1997年8月6日作为ATCC保藏号HB12382保藏于美国典型培养物保藏中心，P.O.Box1549，Manassas，VA20108）（参见美国专利号6,692,741，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考，特别是在第3栏，7－13行，和第7－8栏）。 
在某些实施方案中，抗体包含其互补决定区（CDR）1、2和3与下 表1中所示序列基本上一致（即，除了某些保守变异外）的重链。在某些此类实施方案中，抗体包含其CDR1与SEQ ID NO：101－105中任何一个基本上一致；其CDR2与SEQ ID NO：106－111中任何一个基本上一致；和其CDR3与SEQ ID NO：112－117中任何一个基本上一致的重链；和/或其CDRs1、2和3分别与序列SEQ ID NO：118－123、124－127和128－133中任何一个基本上一致的轻链。 
表1 


在其他相关实施方案中，依照本发明使用的单克隆抗体是嵌合抗体，即，其中来自一个种类（例如，鼠科动物、大鼠或兔）的同类抗体通过重组DNA技术改变，从而使得重和/或轻链的部分或全部铰链和/或恒定区用来自另一个种类（例如，人）的抗体的相应组分替换的那些。一般 地，改造抗体的可变结构域保留等同于或基本上等同于同类抗体的可变结构域。此类改造抗体被称为嵌合抗体，且在给铰链和/或恒定区来源于其的种类（例如，人）个体施用时，比同类抗体的抗原性更少。制备嵌合抗体的方法是本领域众所周知的。 
在其他相关实施方案中，依照本发明使用的单克隆抗体是全人抗体。用于生产此类全人单克隆抗体的方法是本领域众所周知的（参见，例如，US2005/0255102Al，在第4页，第0069－0070段，所述专利引入本文作为参考）。 
在其他相关实施方案中，依照本发明使用的单克隆抗体是来源于其他种类的人源化形式的同类抗α_vβ₆抗体。人源化抗体是由重组DNA技术生产的抗体，其中并非抗原结合所需的人免疫球蛋白轻或重链的某些或所有氨基酸（例如，可变结构域的恒定区和框架区），用于代替来自同类非人抗体的轻或重链的相应氨基酸。例如，针对给定抗原的人源化形式的鼠类抗体在其重和轻链上具有：（a）人抗体的恒定区；（b）来自人抗体的可变结构域的框架区；和（c）来自鼠类抗体的CDRs。必要时，人框架区中的一个或多个残基可以变成鼠类抗体相应位置上的残基，以便保留人源化抗体对抗原的结合亲和力。这种变化有时称为“回复突变”。与嵌合人抗体比较，人源化抗体在人中一般更不可能引发免疫应答，因为人源化抗体包含明显更少的非人组分。用于生产此类人源化单克隆抗体的方法是本领域众所周知的（参见，例如，引入本文作为参考的US2005/0255102Al，在第4－5页，第0072－0077段）。 
在另外的此类实施方案中，人源化抗体在重和/或轻链中包含的一个或多个CDRs来源于不同抗体的重和/或轻链中的相应CDRs。此类抗体的一个合适的非限制性例子是人源化3G9抗体，所述人源化3G9抗体包含的轻链CDR1具有来源于2B1抗体（SEQ ID NO：120）的轻链CDR1序列、而不是关于保藏的3G9抗体（SEQ ID NO：121）的轻链CDR1序列。具有SEQ ID NO：120中所示轻链CDR1序列的此类人源化3G9抗体在本文中命 名为hu3G9（或BG0001l）。此类抗体的另一个合适的非限制性例子是人源化8G6抗体，所述人源化8G6抗体包含的轻链CDR1具有来源于2B1抗体（SEQ ID NO：120）的轻链CDR1序列、而不是关于保藏的8G6抗体（SEQ ID NO：118）的轻链CDR1序列。具有SEQ ID NO：120中所示轻链CDR1序列的此类人源化8G6抗体在本文中命名为hu3G96。其中一个或多个重链和/或轻链CDRs已用来自另一种抗体的一个或多个相应重链和/或轻链CDRs替换，且适合于依照本发明使用的此类衍生抗体的另外例子，由于表1中所示序列和本文提供的指导，对于本领域普通技术人员将是显而易见的。用于制备此类人源化抗体，包括此类衍生人源化抗体的合适方法是普通技术人员熟悉的，且在例如美国公开申请号2005/0255102Al中阐述，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。 
α_vβ₆结合配体的缀合和其他修饰 
在某些实施方案中，与α_vβ₆结合的配体例如抗体可以以未缀合形式使用。在其他实施方案中，与α_vβ₆结合的配体例如抗体可以与例如可检测标记、药物、前体药物或同位素缀合。 
在下文更详细描述的本发明的某些方法中，例如检测细胞或组织中的α_vβ₆表达的方法，作为肿瘤细胞转移潜能的测量，或作为鉴定组织中的原位癌（例如DCIS或LCIS）的方式，α_vβ₆结合配体（例如，抗体）与一种或多种可检测标记缀合。对于此类用途，α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体，可以通过生色、酶、放射性同位素、同位素、荧光、毒素、化学发光、核磁共振对比剂或其他标记的共价或非共价附着进行可检测标记。 
合适的生色标记的例子包括二氨基联苯胺和4－羟基偶氮－苯－2－羧酸。 
合适的酶标记的例子包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ－5－类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α－甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β－半 乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。 
合适的放射性同位素标记的例子包括³H、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、 ¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、 ¹⁰⁹Pd等。当使用体内成像时¹¹¹In是优选同位素，因为它避免了¹²⁵I或¹³¹I-标记的α_vβ₆结合配体被肝脱卤化的问题。此外，这种放射性核苷酸具有用于成像的更有利的γ发射能量（Perkins等人，Eur.J.Nucl.Med.10：296-301（1985）；Carasquillo等人，J.Nucl.Med.28：281-287（1987））。例如，与具有l-（P-异硫氰酸酯基苄基）-DPTA的单克隆抗体偶联的¹¹¹In已显示在非肿瘤性组织特别是肝中很少摄取，且因此增强肿瘤定位的特异性（Esteban等人，J.Nucl.Med.28：861-870（1987））。 
合适的非放射性同位素标记的例子包括¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr和⁵⁶Fe。 
合适的荧光标记的例子包括¹⁵²Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白（GFP）标记、邻苯二醛标记和荧光胺标记。 
合适的毒素标记的例子包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。 
发光标记的例子包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母素标记。 
核磁共振对比剂标记的例子重金属核例如Gd、Mn和铁。 
用于使上述标记与α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体结合的一般技术由Kennedy等人，Clin.Chim.Acta70：1-31（1976），和Schurs等人，Clin.Chim.Acta81：1-40（1977）提供。后一篇参考文献中提及的偶联技术是戊二醛法，高碘酸盐法、二马来酰亚胺法、间马来酰亚胺苄基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯法，所有这些方法引入本文作为参考。 
对于在本发明的某些治疗方法，例如在手术后除去残留肿瘤细胞或预防转移中的用途，α_vβ₆结合配体可以与一种或多种药物、前体药物 或同位素缀合。优选的此类缀合物包含与α_vβ₆结合、与一种或多种细胞毒素剂缀合的一种或多种配体，例如一种或多种抗体，或其片段、衍生物或变体；此类缀合物可用于由本发明提供的治疗和预防肿瘤转移的方法中。根据本发明的某些此类实施方案，α_vβ₆结合配体例如抗体与细胞毒素剂缀合。在产生α_vβ₆结合配体-细胞毒素剂缀合物中有用的细胞毒素例如化学治疗剂是本领域众所周知的，且包括但不限于，顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、阿霉素、氨甲蝶呤、5－氟尿嘧啶、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺和博来霉素。适合于依照本发明这个方面使用的其他化学治疗剂是众所周知的且是普通技术人员熟悉的。 
一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体，和一种或多种小分子毒素例如卡里奇霉素、美登素（美国专利号5,208,020）、trichothene和CC1065的缀合物的使用也是本文考虑的。在本发明的一个实施方案中，α_vβ₆结合配体与一个或多个美登素分子缀合（例如约1－约10个美登素分子/α_vβ₆结合配体）。美登素可以例如转变成May-SS-Me，所述May-SS-Me可以还原成May-SH3且与修饰的α_vβ₆结合配体反应（Chari等人Cancer Research52：127-131（1992）），以产生美登醇-α_vβ₆结合配体缀合物。 
可替代地，α_vβ₆结合配体可以与一种或多种卡里奇霉素分子缀合。卡里奇霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度上产生双链DNA断裂。可以使用的卡里奇霉素结构类似物包括但不限于，γ₁^I、α₂^I、α₃^I、N-乙酰基-γ1^I、PSAG和Φ₁^I（Hinman等人Cancer Research53：3336-3342（1993）和Lode等人Cancer Research58：2925-2928（1998））。 
可以用于与一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体，生产缀合物的酶促活性毒素及其片段，包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌）、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆蛋白质（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜抑制剂、泻果素、 巴豆毒素、司盘奥那抑制剂、白树毒素、丝裂素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、单端孢霉烯族毒素。参见，例如，于1993年10月28日以英文公开的WO93/21232，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。美登醇也可以与一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体缀合。 
本发明进一步考虑了与具有核溶解活性的化合物缀合的α_vβ₆结合配体（例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）。 
各种放射性同位素也可用于生产用于在本发明的治疗方法中使用的放射缀合的α_vβ₆结合配体。例子包括²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、 ¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素。 
α_vβ₆结合配体和细胞毒素剂的缀合物可以使用各种双功能蛋白质偶联剂来制备，所述偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-（2-硫代吡啶）丙酸酯（SPDP）、琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-I-羧酸酯、硫醇亚胺（IT）、亚氨酸酯的双功能衍生物（例如，二甲基己二亚氨HCl）、活性酯（例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯）、醛（例如戊二醛）、his-叠氮化合物（例如二（对叠氮基苯甲酰）己二酸酯）、二重氮基衍生物（例如二（对重氮基苯甲酰）-乙二胺）、二异氰酸酯（例如亚苄基2,6-二异氰酸酯），和双活性氟化合物（例如l,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可以如Vitetta等人，Science238：1098（1987）中所述进行制备。¹⁴碳标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸（MX-DTPA）是用于使放射性核苷酸与α_vβ₆结合配体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。连接体可以是促进胞毒药物释放到细胞中的“可切割连接体”。例如，可以使用酸敏感性连接体、肽酶敏感性连接体、二甲基连接体或含二硫化物连接体（Chari等人Cancer Research52：127-131（1992））。 
可替代地，包含α_vβ₆结合配体和细胞毒素剂的融合蛋白可以例如 通过重组技术或肽合成来制备。 
在另外一个实施方案中，α_vβ₆结合配体可以与“受体”（例如链霉亲和素）缀合用于在“预靶向”中使用，其中给患者施用α_vβ₆结合配体-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，和随后施用与细胞毒素剂（例如，放射性核苷酸）缀合的“配体”（例如抗生物素蛋白）。 
本发明的α_vβ₆结合配体也可以与前体药物活化酶缀合，所述前体药物活化酶使前体药物（例如肽基化学治疗剂，参见WO81/01145）转变成活性药物。参见，例如，WO88/07378和美国专利号4,975,278。此类缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前体药物的任何酶，以便使其转变成其更有活性的细胞毒素形式。 
在本发明方法中有用的酶包括但不限于，用于使含磷酸盐前体药物转变成游离药物的碱性磷酸酶；用于使含硫酸盐前体药物转变成游离药物的芳香基硫酸酯酶；用于使无毒的5-氟胞嘧啶转变成抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于使含肽前体药物转变成游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌（Serratia）蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶（例如组织蛋白酶B和L）；用于转变含D氨基酸取代基前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于使糖基化前体药物转变成游离药物的碳水化合物切割酶，例如O-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于使由P-内酰胺衍生的药物转变成游离药物的P-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如用于分别使在其胺氮上由苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。 
酶可以通过本领域众所周知的技术与α_vβ₆结合配体共价结合，例如使用异双功能交联剂。可替代地，可以使用本领域众所周知的重组DNA技术构建融合蛋白，所述融合蛋白包含与酶的至少功能活性部分连接的本发明α_vβ₆结合配体的至少抗原结合区域（参见，例如，Neuberger等人，Nature312：604-608（1984））。 
疾病诊断和预后 
目前已发现当与转移性较少或无转移性的细胞比较时，来自某些转移性肿瘤的细胞表达显著增强水平的整联蛋白α_vβ₆。此外，本发明人已发现相对于癌的肿瘤细胞和相对于正常乳腺组织，在某些形式的原位癌例如乳腺原位导管癌（DCIS）或原位小叶癌（LCIS）中，肿瘤周围的肌上皮表达显著增强水平的整联蛋白α_vβ₆。因此，本发明提供了可用于诊断肿瘤细胞转移潜能的方法，包括来自癌例如腺癌的肿瘤。在更具体的实施方案中，癌是乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、头与颈癌、胃癌或脾脏癌。更具体而言，癌是乳腺癌（包括但不限于原位乳腺癌，例如原位导管癌（DCIS）和原位小叶癌（LCIS））、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌或肺癌。 
根据本发明这个方面的方法包括测定肿瘤细胞中或组织样品的肌上皮中的α_vβ₆表达水平，且比较这些表达水平与标准α_vβ₆表达水平（例如，优选从同一动物例如人患者获得的正常细胞、非转移性细胞、或正常组织中），其中肿瘤或其细胞中的α_vβ₆表达增加指示那种肿瘤或其细胞的侵袭和/或转移潜能更高，或其中肿瘤周围肌上皮或组织切片的上皮细胞群中的α_vβ₆表达增加，指示存在更可能变得侵袭性且可能形成转移灶的原位癌例如DCIS或LCIS。 
当癌症诊断已根据常规方法进行时，本发明可用作预后指示剂，由此显示α_vβ₆表达水平增加的肿瘤细胞将预示更可能变得侵袭性、且从原发性肿瘤位点转移到远侧的转移位点。类似地，当原位癌的可疑诊断已根据常规方法（例如，乳房中钙化性结节的乳房造影检测）进行时，本发明可用作证实指示剂，由此来自钙化区域的活检组织显示肌上皮中的α_vβ₆表达水平增加，指示存在将变得侵袭性且可能响应α_vβ₆mAb治疗的原位癌，例如DCIS或LCIS。基于此类预后和诊断结果，治疗医生随后可以相应地调整治疗方案，从而提供转移前或癌前期病状的尽早检 测、且因此为患者提供更有利的临床结果。 
“测定α_vβ₆表达水平”意指直接（例如，通过测定或估计样品中的α_vβ₆绝对量）或相对地（例如，通过比较第一种生物样品中的α_vβ₆表达水平与第二种生物样品中的那种）定性或定量测量或估计第一种生物样品（例如，肿瘤样品，组织活检或抽吸物等）中的α_vβ₆水平。优选地，测量或估计第一种生物样品中的α_vβ₆水平，且与从第二种生物样品获取的标准的那种比较，所述第二种生物样品从没有癌症或癌前期损害的个体获得。如本领域普通技术人员应当理解的，已知关于给定非癌性组织的标准α_vβ₆表达水平后，它可以重复用作关于比较的标准。 
“生物样品”意指从个体（例如患者）、细胞系、组织培养、或可能包含细胞或细胞产物的其他来源例如细胞外基质获得的任何生物样品。此类生物样品包括哺乳动物身体组织和细胞，包括可能表达α_vβ₆的白细胞、卵巢、前列腺、心脏、胎盘、胰腺、肝、脾脏、肺、乳房、头与颈组织（例如，口腔、咽、舌和喉组织）、子宫内膜、结肠（或结肠直肠）、子宫颈、胃和脐带组织。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域众所周知的。优选哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、奶牛、猪、马、兔和人。特别优选的是人。 
生物样品中的α_vβ₆表达水平测定可以使用人本领域已知方法来完成。对于生物样品中的α_vβ₆表达水平测定优选的是免疫技术。例如，组织中的α_vβ₆表达可以用常规免疫组织学方法来研究。在这些中，特异性识别由与α_vβ₆结合的初级配体提供，例如抗体（多克隆或单克隆）。这种初级配体可以例如用荧光、化学发光、发磷光、酶或放射性同位素标记进行标记。可替代地，本发明的这些方法可以使用次级检测系统，其中识别且与α_vβ₆结合配体结合的第二种配体，例如，识别且与第一种α_vβ₆结合抗体结合的所谓的“次级”抗体，是如上所述可检测标记的。因此，获得用于病理学检查的免疫组织学染色的组织切片。可替代地，组织和细胞样品也可以用尿素和中性清洁剂提取，以释放α_vβ₆蛋 白质用于蛋白质印迹或斑点/狭缝测定法（Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.101：976-985（1985）；Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096（1987）），用于相对于已知具有较低α_vβ₆表达水平的标准组织或细胞样品直接定量。 
如上所述，本发明的方法可用于检测哺乳动物中的转移癌，用于测定肿瘤细胞的转移潜能（即，预测给定肿瘤细胞将从原发性肿瘤位点转移到远侧转移位点的可能性），和用于测定非侵袭性或原位癌将进展至侵袭或转移癌的可能性。特别地，本发明的方法可用于检测上皮组织的侵袭和/或转移癌（即，侵袭和/或转移癌），包括乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、胰腺、结肠（或结肠直肠）、头与颈组织（例如，口腔、咽、舌和喉组织）、子宫内膜、子宫颈、胃和脾脏。特别适合于通过本发明的方法检测的是进展至侵袭和/或转移表型的可能性增加的侵袭和/或转移腺癌，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、肺癌、和原位癌，例如某些乳腺原位导管癌（DCIS）或原位小叶癌（LCIS）。此类癌的早期鉴定和治疗与对于患者更佳的长期预后相关。例如，已报道如果未处理，那么显著比例的DCIS肿瘤变得侵袭性、且可以导致预后差得多的转移癌（参见Sakorafas，G.H.和Tsiotou，A.G.H.，Cancer Treatment Rev.26：103-125（2000））。 
因此，本发明考虑了通过下述治疗或预防转移癌的方法：鉴定患者中的侵袭前损害或癌，且治疗患者以在其有机会进化成侵袭形式之前消除侵袭前损害。此类方法包括例如，（a）获得怀疑包含癌或侵袭前损害的组织样品，和不包含癌或侵袭前损害的组织样品（优选来自与怀疑含有癌或侵袭前损害的那种相同的组织或器官）；（b）在支持一种或多种α_vβ₆结合配体与无论哪里存在的组织中的α_vβ₆整联蛋白结合的条件下，使组织样品与一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体或其片段接触；和（c）检测一种或多种α_vβ₆结合配体与组织的结合水平或模式，其中相对于增生自身（或其细胞）的结合，增生（例 如肿瘤）周围的肌上皮中α_vβ₆结合配体的局部结合增加，或相对于非癌性组织样品（或其细胞）中的结合，包含癌或侵袭前损害的组织样品中的α_vβ₆结合配体结合水平增加，指示更可能变得侵袭性和可能转移的癌。在其他相关实施方案中，本发明考虑了减少或预防患者中的转移前或侵袭前肿瘤进展至转移性或侵袭性肿瘤的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与转移前或侵袭前肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致减少或预防转移前或侵袭前癌症细胞侵入原发性肿瘤周围的组织区域内。 
样品可以由其获得用于依照本发明的这些方法使用的合适组织和器官包括但不限于，本文其他地方描述的上皮组织。可以根据本发明的此类方法有利地治疗或预防的癌症和肿瘤包括但不限于，癌，特别是腺癌，包括本文其他地方详细描述的癌和腺癌。此类癌已根据本发明的方法检测后，它随后可以经由手术、化学疗法、放射学、或本领域众所周知且因此是普通技术人员熟悉的其他癌症治疗方法从患者中清除。可替代地，此类癌可以通过给患者或患者器官或组织施用一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体或其片段，使用本发明的治疗方法清除。在此类实施方案的某些非限制性例子中，一种或多种α_vβ₆结合配体已与如上文详细描述的一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合。在此类实施方案的另外非限制性例子中，给受试者例如患者施用一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体或其片段，结合如上文详细描述的一种或多种细胞毒素化合物或试剂。 
在相关实施方案中，本发明考虑了通过测量由肿瘤或癌细胞表达的α_vβ₆来确定肿瘤或癌细胞的转移潜能。在此类实施方案中，肿瘤或细胞样品如上所述从患者获得，且根据本文描述的方法测定肿瘤或癌细胞上的α_vβ₆表达水平。优选的此类方法包括免疫组织化学，使用α_vβ₆结合抗体（或其片段、变体或衍生物），例如本文描述的那些。根据本发 明的这些方法，肿瘤或癌细胞的α_vβ₆表达水平和肿瘤或癌细胞的转移潜能之间存在直接关联：由肿瘤或癌细胞表达的α_vβ₆增加指示那种肿瘤或癌细胞更可能从原发性肿瘤位点转移到次级部位。因此，肿瘤或癌细胞的α_vβ₆表达水平可以用作肿瘤或癌细胞的转移潜能的预后指示剂，这可以帮助癌症患者及其医生基于癌症的目前或预测的未来侵占性或侵袭力做出合适的治疗决定。 
除了测定从个体获得的生物样品例如组织或肿瘤细胞样品中的α_vβ₆表达水平，α_vβ₆的表达水平和模式也可以通过成像在体内进行检测。在本发明的此类方法中，一种或多种α_vβ₆结合配体，例如一种或多种α_vβ₆结合抗体，用适合于体内成像的一种或多种标记可检测地标记。对于体内成像合适的标签或标记包括可通过X放射照相术、NMR或ESR检测的那些。对于X放射照相术，合适的标记包括放射性同位素例如钡或铯，所述放射性同位素发出可检测的辐射但对受试者没有明显伤害。对于NMR和ESR合适的标记包括具有可检测特性自旋的那些，例如氘。 
已用合适的可检测成像部分标记的与α_vβ₆结合的配体，例如α_vβ₆结合抗体或抗体片段，被引入（例如，肠胃外、皮下或腹膜内）哺乳动物内以检查癌或原位癌，所述可检测成像部分例如放射性同位素（例如， ¹³¹I、¹¹²In、^99mTc）、不透射线的物质、或可通过核磁共振检测的材料，本领域应当理解的是，受试者的大小和使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者，注入的放射性量通常为约5－20毫居里^99mTc。标记的α_vβ₆配体，例如α_vβ₆结合抗体或抗体片段，随后将优先积聚在包含或表达α_vβ₆整联蛋白的细胞或组织部位。体内肿瘤成像随后如S.W.Burchiel等人，"Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments"（第13章in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.（1982））中所述完成。 
α_vβ₆结合配体的治疗用途 
在本发明另外的实施方案中，α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体或其片段，可以在用于治疗患有某些疾病特别是具有某些癌的哺乳动物的治疗方案中使用，所述癌例如本文其他地方描述的那些。本发明的此类方法可用于治疗癌症和相关事件，包括肿瘤生长、转移和血管发生。特别顺应此类方法的是下述疾病或癌症：特征在于患有该病的哺乳动物组织或细胞中的α_vβ₆表达水平增加，以及响应靶向表达增加水平的α_vβ₆的组织或细胞且清除那些组织或细胞的治疗。可通过这些方法特别治疗的疾病包括上皮组织的转移癌（即，转移癌和/或腺癌），包括乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、胰腺、结肠、头与颈组织（例如，口腔、咽、舌和喉组织）、子宫内膜、子宫颈、胃和脾脏。特别适合于通过本发明的这些方法治疗的是子宫内膜、胰腺、结肠（例如，结肠直肠癌）、子宫颈、肺和乳腺癌（包括乳腺原位导管癌（DCIS）和原位小叶癌（LCIS））。对于治疗优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、奶牛、猪、马、兔和人。特别优选的是人。 
在某些此类治疗方案中，本发明的方法适合于通过不同方法去除、治疗或根除肿瘤后清除残留肿瘤细胞，例如残留转移细胞。例如，本发明的此类方法可以用于清除残留肿瘤细胞或转移细胞，所述残留肿瘤细胞或转移细胞在手术摘除肿瘤，或通过例如照射、化学疗法等方法根除肿瘤后可能残留在患者中。在此类治疗方案中，本发明的方法可以包括在手术、放射学和/或化学治疗除去肿瘤之前、之时和/或之后，给患者施用α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体或其片段。 
在相关实施方案中，如上所述，本发明提供了减少或预防患者中的转移前肿瘤进展至转移性肿瘤的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与转移前肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白α_vβ₆亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致减少或预防转移前癌症细胞侵入原发性肿瘤周围的组织区域内。 
在本发明的这些治疗方法的执行中，α_vβ₆结合配体例如α_vβ₆结合抗体或其片段可以以治疗制剂（这在本文中也可互换地称为药物组合物，且等价于药物组合物）的形式施用于患者。通过使具有所需纯度的α_vβ₆结合配体与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.（1980））混合，制备依照本发明使用的α_vβ₆结合配体的治疗制剂，用于例如以冻干制剂或水溶液的形式贮藏。除了药理学活性化合物例如α_vβ₆结合配体，本发明的治疗方法中使用的组合物可以包含一种或多种合适的药学可接受的载体，所述载体包含促进活性化合物加工成可以药学使用的制剂的赋形剂和助剂。本发明的药物制剂以其自身已知的方式制备，所述方式例如通过常规混合、颗粒化、锭剂制备、溶解或冻干方法。因此，用于口部使用的药物制剂可以通过下述方法获得：使活性化合物与固体赋形剂组合，任选研磨所得到的混合物，且在需要或必要时加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或锭剂核。 
合适的赋形剂特别是充填剂例如糖类，例如，乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨糖醇、纤维素制剂和/或磷酸钙，例如，磷酸三钙或磷酸氢钙，以及结合剂，例如淀粉糊，使用例如玉米淀粉、小米淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮。需要时，可以加入崩解剂，例如上述淀粉以及羧甲基-淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或褐藻酸或其盐，例如褐藻酸钠。助剂尤其是流动调节剂和润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸及其盐，例如硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇。锭剂核与合适的涂层一起提供，需要时所述涂层对胃液有抵抗力。为了这个目的，可以使用浓缩糖溶液，所述糖溶液可以任选包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了生产对胃液有抵抗力的涂层，使用合适的纤维素制剂溶液，例如邻苯二酸乙酰纤维素或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。染料材料或色素 可以加入片剂或锭剂涂层中，例如用于鉴定或为了表征活性化合物剂量组合。 
可以口部使用的其他药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和可塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以包含颗粒形式的活性化合物，所述活性化合物可以与充填剂例如乳糖、结合剂例如淀粉、和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁、和任选地稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物优选溶解或悬浮于合适的液体例如脂肪油或液体石蜡中。另外，可以加入稳定剂。 
用于肠胃外施用的合适制剂包括水溶性形式的活性化合物水溶液，例如水溶性盐和碱性溶液。碱性盐可以包括例如用Tris、胆碱氢氧化物、二-Tris丙烷、N-甲基葡糖胺、或精氨酸制备的铵盐。此外，可以施用活性化合物悬浮液如合适的油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯或聚乙二醇400（该化合物溶于PEG-400）。水注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、和/或葡聚糖。任选地，悬浮液可以包含稳定剂。 
本发明的化合物可以作为滴剂，或在软膏、凝胶、脂质体、或生物相容性聚合体圆盘、丸内或携带在隐形眼镜内施用于动物和人的眼睛。眼内组合物还可以包含如本领域技术人员可以使用常规标准选择的生理学相容性眼媒介物。媒介物可以选自已知的眼媒介物，所述眼媒介物包括但不限于，水，聚醚例如聚乙二醇400，聚乙烯例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，纤维素衍生物例如羧甲基纤维素、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物例如矿物油和白凡士林，动物脂例如羊毛脂，植物油例如花生油，丙烯酸聚合体例如羧基聚亚甲基凝胶，多糖例如葡聚糖和氨基葡聚糖例如氯化钠和氯化钾、氯化锌和缓冲剂例如碳酸氢钠或乳酸钠。还可以使用高分子量分子。不会灭活组合物中的本发明化合物的生理学相容性防腐剂包括醇例如氯代丁醇，氯苄烷铵和EDTA，或本领 域技术人员已知的任何其他合适的防腐剂。 
适合于皮下施用的抗体冻干制剂在美国专利号6,267,958中描述，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考。此类冻干制剂可以用合适的稀释剂重建成高蛋白浓缩物，且重建制剂可以皮下施用于本文待治疗的患者。 
α_vβ₆结合配体还可以诱陷在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备，例如羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚（甲基丙烯酸甲酯）微胶囊，分别在胶体药物递送系统（例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）或粗乳剂中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.（1980）中。 
可以制备α_vβ₆结合配体的缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括包含α_vβ₆结合配体的固体疏水性聚合体的半透性基质，所述基质为成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）、或聚（乙烯醇））、聚乳酸（美国专利号3,773,919）、L谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体），和聚-D-（-）-3-羟基丁酸。 
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这经由无菌过滤膜通过过滤容易地完成。 
α_vβ₆结合配体可以通过任何合适的方法施用于受试者或患者，所述方法包括肠胃外、肺内、颅内、经皮和鼻内。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，α_vβ₆结合配体可以通过脉冲输注适当地施用，例如使用剂量减少的α_vβ₆结合配体。优选地剂量通过注射给予，最优选静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。 
在本发明的某些示例性实施方案中，α_vβ₆结合配体以约1mg/m²－约500mg/m²的剂量施用于患者（例如静脉内）。例如，α_vβ₆结合配体可以以下述剂量施用：约1mg/m²、2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、10mg/m²、15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²、45mg/m²、50mg/m²、55mg/m²、60mg/m²、65mg/m²、70mg/m²、75mg/m²、80mg/m²、85mg/m²、90mg/m²、95mg/m²、100mg/m²、105mg/m²、110mg/m²、115mg/m²、120mg/m²、125mg/m²、130mg/m²、135mg/m²、140mg/m²、145mg/m²、150mg/m²、155mg/m²、160mg/m²、165mg/m²、170mg/m²、175mg/m²、180mg/m²、185mg/m²、190mg/m²、195mg/m²、200mg/m²、205mg/m²、210mg/m²、215mg/m²、220mg/m²、225mg/m²、230mg/m²、235mg/m²、240mg/m²、245mg/m²、250mg/m²、255mg/m²、260mg/m²、265mg/m²、270mg/m²、275mg/m²、280mg/m²、285mg/m²、290mg/m²、295mg/m²、300mg/m²、305mg/m²、310mg/m²、315mg/m²、320mg/m²、325mg/m²、330mg/m²、335mg/m²、340mg/m²、345mg/m²、350mg/m²、355mg/m²、360mg/m²、365mg/m²、370mg/m²、375mg/m²、380mg/m²、385mg/m²、390mg/m²、395mg/m²或400mg/m²。 
α_vβ₆结合配体可以根据广泛多样的给药方案施用。例如α_vβ₆结合配体可以每天1次施用预定时间量（例如，4－8周，或更多），或根据每周时间表（例如，每周1天、每周2天、每周3天、每周4天、每周5天、每周6天或每周7天）施用预定时间量（例如，4－8周，或更多）。“每周1次”给药方案的具体例子是在治疗期的第1、8、15和22天时施用α_vβ₆结合配体。在可替代的实施方案中，α_vβ₆结合配体可以经过数月的时间段间歇地施用。例如，α_vβ₆结合配体可以每周施用，每半年连续三周（即，每6个月重复每周给药方案）。应当理解此类施用方案可以继续延长的时间段（约数年）以维持由最初治疗提供的有利疗效。在再其他的实施方案中，此类维持疗法可以在急性给药方案后实现，所述急性给药方案设计为减少癌性、转移或原位癌病状的立即症状。 
治疗期自始至终每次施用的α_vβ₆结合配体量可以是相同的；可替代地，在治疗期间每次施用的量可以不同（例如，给定时间点施用的量可以多于或少于先前施用的量）。例如，在维持疗法期间给予的剂量可以少于治疗急性期间施用的那些。取决于具体环境的合适给药方案对于本领域普通技术人员将是显而易见的。 
在本发明的某些实施方案中，多种类型或种类的α_vβ₆结合配体互相组合，且施用于患者以治疗一种或多种癌性、转移或原位癌病状。例如，本发明考虑了给患者施用2种或更多不同的α_vβ₆结合抗体，例如本文公开的那些。当多种α_vβ₆结合配体施用于患者时，不同的α_vβ₆结合配体可以在单个药物组合物中一起施用，或更优选地，可以在分开剂量中顺次施用。此类其他试剂的有效量取决于制剂中存在的α_vβ₆结合配体量，疾病或病症或治疗类型，及其他因素。 
本发明还包括用于治疗癌性、转移或原位癌病状的方法，所述方法包括给患者施用第一种试剂连同第二种试剂，其中第一种试剂是α_vβ₆结合配体，和第二种试剂是可用于治疗一种或多种癌性、转移或原位癌病状但不必是α_vβ₆结合配体的试剂。施用第一种试剂“连同”第二种试剂意指第一种试剂可以在给患者施用第二种试剂之前、之时、或之后施用于患者，从而使得2种试剂在治疗方案期间施用于患者。例如，根据本发明的某些此类实施方案，给患者施用α_vβ₆结合配体，连同（即，之前、之时、或之后）给患者施用一种或多种其他整联蛋白受体（例如，α₁β₁、α₄β_l、α_vβ₈、α_vβ₅、α₅β_l等）拮抗剂，包括本领域已知的对一种或多种整联蛋白受体（例如，α₁β₁、α₄β_l、α_vβ₈、α_vβ₅、α₅β_l等）特异的抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂。 
在本发明这个方面的某些实施方案中，连同α_vβ₆结合配体施用的第二种试剂是例如，类固醇、细胞毒素化合物（包括本文其他地方描述的那些）、放射性同位素（包括本文其他地方描述的那些）、前体药物活化酶（包括本文其他地方描述的那些）、秋水仙碱、氧、抗氧化剂（例 如，N-乙酰半胱氨酸）、金属螯合剂（例如，四硫钼酸盐），IFN-β、IFN-γ、α-抗胰蛋白酶等。为了根据本发明这个方面的治疗用途，可以连同一种或多种第一种试剂例如一种或多种α_vβ₆结合配体施用于患者的另外的第二种试剂或化合物，将是本领域普通技术人员熟悉的；此类另外的第二种试剂或化合物的使用因此被视为由本发明包含。 
对于相关领域的普通技术人员显而易见的是，本文所述方法和应用的其他合适的修改和适应是明显的，且无需背离本发明范围或其任何实施方案即可进行。现在已详细描述本发明，通过参考下述实施例将更易于理解，所述实施例仅为了举例说明的目的随同包括且不希望限制本发明。 
实施例
实施例1：mu3G9可变区的克隆
来自3G9鼠类杂交瘤细胞的总细胞RNA使用Qiagen RNeasy mini试剂盒根据制造商的推荐方案来制备。编码重和轻链可变区的互补DNA通过RT-PCR从总细胞RNA克隆，使用Amersham/Pharmacia第一链cDNA合成试剂盒根据制造商的推荐方案使用随机六聚物用于启动。 
用于PCR扩增鼠类3G9免疫球蛋白重链可变结构域的引物是： 
5'AGGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC3'（SEQ ID NO：8）； 
5'GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT3'（SEQ ID NO：9）；（S=C/G、M=A/C、R=A/G、K=G/T、W=A/T和Y=CT）。 
反应由下述组成：于95℃最初解链2.5分钟，随后为于94℃解链30秒，于60℃退火45秒、每个循环减1℃，和于68℃延伸1分钟的10个循环，使用Clontech's Advantage Taq DNA聚合酶。反应继续进行另外10个循环：于94℃解链30秒，于55℃退火45秒，于68℃延伸1分钟和于68℃最后延伸9分钟。反应使用Qiagen Qiaquick PCR纯化试剂盒根据制造商的方案进行纯化。在过量dNTP's的存在下，Advantage Taq扩增DNA的末端用T7DNA聚合酶磨光以产生平端。使用Invitrogen的 TOPO克隆试剂盒根据制造商的推荐方案，将纯化且变钝的3G9重链可变区基因PCR产物亚克隆到Invitrogen's pCR4Blunt-TOPO克隆载体内。重链RT-PCR亚克隆命名为pKJS062。 
3G9轻链可变结构域基因使用下述引物扩增： 
5'GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAGATGGA3'（SEQ ID NO：10）； 
5'GGGGATATCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG S'（SEQ ID NO：11）。 
反应由下述组成：于95℃最初解链2.5分钟，随后为于94℃解链30秒，于60℃退火45秒、每个循环减1℃，和于68℃延伸2分钟的6个循环，使用Clontech's Advantage Taq DNA聚合酶。反应继续进行另外24个循环：于94℃解链30秒，于54℃退火45秒，于68℃延伸2分钟和于68℃最后延伸10分钟。将该反应的十分之一用作使用Pfu DNA聚合酶（Stratagene）的第二轮扩增的模板。那种反应由下述组成：于95℃最初解链2.5分钟，随后为于94℃解链30秒，于55℃退火45秒，和于72℃延伸1分钟的20个循环。反应产物使用Qiagen Qiaquick凝胶提取试剂盒根据制造商的推荐方案进行凝胶纯化。使用Invitrogen的TOPO克隆试剂盒，将纯化的3G9轻链可变区基因PCR产物亚克隆到Invitrogen's pCR4Blunt-TOPO克隆载体内。轻链RT-PCR亚克隆命名为pKJS054。 
测序来自pKJS054和pKJS062的多个独立亚克隆的插入片段。在2种情况下，多个独立亚克隆的插入片段序列是相同的。可变结构域序列的Blast分析证实其免疫球蛋白同一性。3G9重链可变结构域是鼠类亚群IIID成员。3G9轻链可变区是鼠类κ亚群IV成员。 
实施例2：ch3G9的构建和表达
使用编码鼠类3G9重和轻链可变区的cDNAs构建用于表达鼠类-人嵌合体（ch3G9）的载体，在所述ch3G9中mu3G9可变区与人IgGl和κ恒定区连接。 
为了构建重链嵌合体，将来自3G9重链可变结构域质粒pKJS062的 508bp EcoRI片段，亚克隆到线性化去磷酸化的pUC衍生克隆载体pNN09的EcoRI位点内。这个步骤将侧翼NotI位点加到所得到的质粒pKJS093中。质粒pKJS093中的重链序列通过DNA测序来证实。使用Stratagene'sQuickchange诱变试剂盒根据制造商的推荐方案，通过定点诱变使用下述诱变寡核苷酸，将紧接着HindIII限制位点的剪接供体位点加到质粒pKJS093的可变区编码序列紧下游： 
5'CTGTCTCTGCAGGTAAGCTTACACCCCCATCTG3'（SEQ ID NO：12）， 
5'CAGATGGGGGTGTAAGCTTACCTGCAGAGACAG3'（SEQ ID NO：13） 
这个步骤产生质粒pKJS116。将来自pKJS116的0.48kbNotI-HindIII重链可变结构域片段，和包含人IgGl恒定区、来自质粒pEAG964的1.22kb HindIII-NotI片段，亚克隆到pCEP4（Invitrogen）EBV表达载体衍生质粒pCH269的NotI位点内，产生质粒pKJS136。 
为了构建轻链嵌合体，将来自3G9轻链可变结构域质粒pKJS054的474碱基对EcoRI片段，亚克隆到线性化去磷酸化的克隆载体pNN09的EcoRI位点内，在所得到的质粒pKJS112中添加侧翼NotI位点。质粒pKJS112中的轻链序列通过DNA测序来证实。使用Stratagene'sQuickchange诱变试剂盒，通过定点诱变使用下述诱变寡核苷酸，将BgIII限制位点加到质粒pKJS112的可变区编码序列紧下游： 
5'GGCACCAAGCTGGAGATCTAACGGGCTGATGCTGC3'（SEQ ID NO：14）， 
5'GCAGCATCAGCCCGTTAGATCTCCAGCTTGGTGCC3'（SEQ ID NO：15） 
产生质粒pKJS132。将来自pKJS132的453bp NotI-BgIII轻链可变结构域片段，和包含人κ轻链恒定结构域、来自质粒pEAG963的678bpBgIII-NotI片段，亚克隆到pCEP4（Invitrogen）EBV表达载体衍生质粒pCH269的NotI位点内，产生质粒pKJS141。应当指出在mu3G9克隆期间，轻链的第1个CDR包含糖基化信号序列（NXTlS）。使用下述寡核苷酸的单轮Quickchange定点诱变： 
5'GGAACTTACACTTGAGCTGGCACTGCATGTCAAGG3'（SEQ ID NO：16）， 
5'CCTTGACATGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCC3'（SEQ ID NO：17）， 
将NSS基序转变成SSS且产生表达载体pKJS157，去除了这个糖基化信号序列。质粒pKJS157的轻链可变区序列通过DNA测序来证实。 
将表达载体（轻链pKJS141或pKJS157和重链pKJS136）共转染到293-EBNA细胞内，且测试转染细胞的抗体分泌和特异性。空载体转染细胞和用关于chM92（分子克隆的CD154特异性mAb）的EBV表达载体共转染细胞充当对照。使用Pierce Easy Titer试剂盒根据制造商的推荐方案的抗体滴度分析，和来自条件培养基的蛋白质印迹分析（用抗人重和轻链抗体显色），指出ch3G9转染细胞合成且有效装配重和轻链且分泌抗体。针对α_vβ₆的ELISA测定法显示ch3G9与α_vβ₆的结合类似于mu3G9，而chM92则不是。 
如图1中所示，由大规模瞬时转染生产的嵌合3G9（ch3G9；由三角形符号指示）、和在轻链第1个CDR的N联糖基化位点内包含N至S置换的去糖基突变型嵌合3G9（ch3G9S；由正方形符号指示），进行纯化且在ELISA测定法中显示与α_vβ₆类似的结合。轻链可变结构域CDR1内的糖基化位点的去除已显示改善蛋白质表达和纯化，而不改变或影响抗体的结合亲和力。 
实施例3：hu3G9形式1、2和3的构建
改造可变结构域以产生人源化3G9（hu3G9）的设计如下进行。3G9轻链可变结构域对应人κ3，和重链可变结构域对应人重亚群3。人受体框架的选择使用程序IgBLAST通过与人种系序列匹配的同源性：人L6（具有来源于人JK4的J区）用于轻链，和人3－7（具有来源于人JH4的J区）用于重链。如表1中所示，设计可变改造轻和重链中每一个的3种形式（鼠类重链=SEQ ID NO：81；3G9HV1=SEQ ID NO：82；3G9HV2=SEQ ID NO：83；3G9HV3=SEQ ID NO：84；VH3-7=SEQ ID NO：85；鼠类轻链=SEQ ID NO：86；3G9LV1=SEQ ID NO：87；3G9LV2=SEQ ID NO：88；3G9LV3=SEQ ID NO：89；3G9LV4=SEQ ID NO：90；3G9LV5=SEQ ID NO：91；且L6=SEQ ID NO：92）。第1种形式包含关于鼠类供体序列最多的回复突变，而第3种形式包含最少的回复突变（即，最“人源化”）。如表1中所示的重和轻链可变结构域的CDR区域通过常规Kabat编号分类系统来限定。然而，下文呈现的序列编号基于不同序列就彼此而言的相对线性定位。 
表1　关于hu3G9的重和轻链序列 
表1a　重链序列

表1b-轻链序列


hu3G9重链形式1和2以及轻链形式1、2和3通过下述合成制备：使用Taq DNA连接酶（New England Biolabs），连接磷酸化顶端链寡核苷酸与并列放置的短底部链寡核苷酸组合。反应进行温育经过于94℃1分钟、于55℃1分钟每个循环-1℃和65℃4分钟的15个循环，产生单链模板DNA's，包括5'限制位点（NotI和BamHI）、信号序列、可变区，且延伸直至（轻链）或进入（重链）恒定结构域内至第一个可能独特的限制位点（BsiWI对于轻链和AgeI对于重链）。关于合成基因的引物如下所述。基因模板通过PCR使用Pfu DNA聚合酶（Stratagene）使用下述寡聚物来扩增： 
用于重链的： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC3'（SEQ ID NO：18），和 
5'GCTCACGGTCACCGGTTCGGGG3'（SEQ ID NO：19）以及 
用于轻链的： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCAC3'（SEQ ID NO：20）和 
5'GGAAGATGAACACACTGGGTGCGG3'（SEQ ID NO：21） 
以产生双链DNA's。反应由下述组成：于95℃最初解链2.5分钟，随后为于94℃解链30秒，于64℃退火30秒，和于72℃延伸1分钟的16个循环。反应产物使用Qiagen Qiaquick凝胶提取试剂盒根据制造商的推荐方案进行凝胶纯化。 
重链形式1由下述顶端链5'磷酸化寡核苷酸合成制备： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAGCTGGGTGTTCCTGGTGCTGGTGCTGAAGGGCG TGCAGTGCGAGGTGATGCTGGTGGAGAGCGGCGGC3'（SEQ ID NO：22）， 
5'GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCCGCTACGTGAT GAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAG3'（SEQ ID NO：23）， 
5'CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAGCGCCA AGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGAC3'（SEQ ID NO：24）， 
5'ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCAC CCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACC3'（SEQ ID NO：25）， 
5'AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCT GGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGAGC3'（SEQ ID NO：26）。 
这些寡聚物与下述底部链非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部链寡核苷酸与并列的顶端链寡核苷酸重叠约15bp。底部链寡核苷酸是： 
5'GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC3"（SEQ ID NO：27）， 
5'CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC3"（SEQ ID NO：28）， 
5'GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG3"（SEQ ID NO：29）， 
5'GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG3"（SEQ ID NO：30）。 
重链形式2由下述顶端链5'磷酸化寡核苷酸合成制备： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCGGCCTGAGCTGGGTGTTCCTGGTGCTGGTG CTGAAGGGCGTGCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGC3'（SEQ ID NO：31） 
5'GGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCC GCTACGTGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAG3'（SEQ ID NO：32）， 
5'CATCAGCAGCGGAGGCCGCATGTACTACCCCGACACCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGC GACAGCGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGAC3'（SEQ ID NO：33）， 
5'ACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGGCAGCATCTACGACGGCTACTACGTGTTCCCCTACTGGG GCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACC3'（SEQ ID NO：34）， 
5'AAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCC TGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGAGC3'（SEQ ID NO：35）。 
这些寡聚物与下述底部链非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部链寡核苷酸与并列的顶端链寡核苷酸重叠约15bp。底部链寡核苷酸是： 
5'GCTGCACCAGGCCGCCGCCGCTCTCC3"（SEQ ID NO：36）， 
5'CCGCTGCTGATGCTGGCCACCCAC3"（SEQ ID NO：37）， 
5’GCAGTAGTACACGGCGGTGTCCTCGGCGCG3"（SEQ ID NO：38）， 
5'GCTGGGGCCCTTGGTGCTGGCGG3"（SEQ ID NO：39）。 
关于hu3G9重链形式1和2的表达载体通过下述制备：将来自合成产生的人源化变体、包括人IgGl恒定区第1个105bp的538bp NotI-AgeI重链可变结构域片段，和来自质粒pKJS160的919bp AgeI/BamHI片段，亚克隆到NotI/BamHI消化的pKJS160（等同于pCEP4（Invitrogen）衍生EBV表达载体pCH269）内，产生重链表达载体pKJS166（形式1）和pKJS167（形式2）。 
重链形式3通过在pKJS167质粒上用下述寡核苷酸执行单轮Quickchange定点诱变来制备： 
5'CCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTG3'（SEQ ID NO：40），和 
5'CAGGCTGTTCTTGGCGTTGTCGCGGCTGATGG3'（SEQ ID NO：41）. 
所得到的形式3重链质粒命名为pKJS168。所得到的质粒中的可变区cDNA序列通过DNA测序来证实。 
轻链形式1由下述顶端链5'磷酸化寡核苷酸合成制备： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATC AGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC3'（SEQ ID NO：42）， 
5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCA GCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC3'（SEQ ID NO：43）， 
5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGCGCTTCAGCGGCA GCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC3'（SEQ ID NO：44）， 
5'TTCGCCGTGTACTTCTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGG TGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC3'（SEQ ID NO：45）。 
这些寡聚物与下述底部链非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部链寡核苷酸与并列的顶端链寡核苷酸重叠约15bp。底部链寡核苷酸是： 
5'GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC3"（SEQ ID NO：46）， 
5’CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG3"（SEQ ID NO：47）， 
5'GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC3"（SEQ ID NO：48）。 
轻链形式2由下述顶端链5'磷酸化寡核苷酸合成制备： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATC AGCGTGAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC3'（SEQ ID NO：49）， 
5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCA GCAGCGTGAGCAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC3'（SEQ ID NO：50）， 
5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCCGCTTCAGCGGCA GCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC3'（SEQ ID NO：51）， 
5'TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGG TGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC3'（SEQ ID NO：52）。 
这些寡聚物与下述底部链非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部链寡核苷酸与并列的顶端链寡核苷酸重叠约15bp。底部链寡核苷酸是： 
5'GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC3"（SEQ ID NO：53）， 
5'CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG3"（SEQ ID NO：54）， 
5'GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC3"（SEQ ID NO：55）。 
轻链形式3由下述顶端链5'磷酸化寡核苷酸合成制备： 
5'GCTGACAGCGGCCGCGGGATCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGTGAGCG TGATCATGAGCCGCGGCGAGATCGTGCTGACC3'（SEQ ID NO：56）， 
5'CAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAG  CAGCAGCTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCC3'（SEQ ID NO：57）， 
5'CCCAGGCTGTGGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGG CACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGAC3'（SEQ ID NO：58）， 
5'TTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTGGAGCACCTACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAA GCGTACGGTGGCCGCACCCAGTGTGTTCATCTTCC3'（SEQ ID NO：59）。 
这些寡聚物与下述底部链非磷酸化寡核苷酸并列放置，所述底部链寡核苷酸与并列的顶端链寡核苷酸重叠约15bp。底部链寡核苷酸是： 
5'GCGGGGCTCTGGGTCAGCACGATC3"（SEQ ID NO：60）， 
5'CCACAGCCTGGGGGCCTGGCCG3"（SEQ ID NO：61）， 
5'GTACACGGCGAAGTCCTCGGGCTC3"（SEQ ID NO：62）。 
关于hu3G9轻链形式1、2和3的表达载体通过下述制备：将来自合成产生的人源化变体的400bp NotI/BsiWI轻链可变结构域片段，和包含人免疫球蛋白κ恒定区、来自质粒pKJS162的324bp BsiWI/BamHI片段，亚克隆到NotI/BamHI消化的pKJS161（同样等同于pCEP4（Invitrogen）衍生EBV表达载体pCH269）内。所得到的质粒命名为pKJS172（形式1）、pKJS173（形式2）和pKJS174（形式3）。 
实施例4：hu3G9形式1、2和3的表达以及形式4和5的构建
将人源化以及嵌合重和轻链表达载体的所有组合共转染到293-EBNA细胞内（16个组合）。测试转染细胞的抗体分泌和特异性。蛋白质印迹分析（用抗人重和轻链抗体检测）和条件培养基的Easy Titer（Pierce）分析，指出hu3G9转染细胞合成且有效分泌重和轻链，和表达水平看起来伴随抗体人源化的增加而增加。如图2中所示，包含轻链形式1的变体表达很差，而包含轻链形式2的变体以较高的水平表达，暗示人源化增加趋向导致更高的表达。 
用来自转染细胞的条件培养基染色的α_vβ₆表达SW480细胞的FACS分析指出，3G9重链的人源化对抗体与α_vβ₆表达细胞结合的能力没有负面影响，其中与形式1和2比较，重链形式3（CDR移植形式）具有增加 的结合活性（图3）。FACS分析还显示包含轻链形式3的hu3G9mAb变体的结合比包含hu3G9轻链形式2的变体略微差些，尽管2种形式看起来至少与嵌合3G9一样好地结合（图3）。在轻链形式2和3与CDR移植3G9之间分别只有2和1个氨基酸差异。因为这些轻链形式具有与嵌合3G9类似的α_vβ₆结合活性，所以制备2种另外形式，以确定结合活性是否能被改善，或CDR移植形式是否将是功能性的。 
形式4探究在轻链第1位上的谷氨酰胺至谷氨酸置换的影响，和形式5是完全CDR移植3G9轻链（表1）。为了检测这些变化各自的分别影响，构建新轻链表达载体。质粒pKJS186－轻链形式3的E1Q变体－使用Stratagene's Quickchange诱变试剂盒，通过质粒pKJS174的定点诱变使用下述寡核苷酸来制备： 
5'GTCAGCACGATCTGGCCGCGGCTCATGATC3'（SEQ ID NO：63）和 
5'GATCATGAGCCGCGGCCAGATCGTGCTGAC3'（SEQ ID NO：64） 
且命名为轻链形式4。质粒pKJS188－CDR移植3G9轻链－通过质粒pKJS174的定点诱变使用下述寡核苷酸来制备： 
5'CCCAGGCTGCTGATCTACAGCACC3'（SEQ ID NO：65）和 
5'GGTGCTGTAGATCAGCAGCCTGGG3'（SEQ ID NO：66） 
且命名为轻链形式5。这些轻链形式进行序列证实，且随后与重链形式2或3一起共转染到293-EBNA细胞内。FACS分析指出重链形式3和轻链形式5－完全CDR移植对－与α_vβ₆表达细胞的结合至少等于或优于任何其他人源化变体对（图4）。pKJS168和pKJS188配对命名为hu3G9形式5（H3/L5）。 
用ch3G9和hu3G9形式2－5共转染293-EBNA细胞进行按比例扩大，且收获条件培养基。抗体在A蛋白-Sepharose上进行纯化，且测定纯化mAbs的活性。与α_vβ₆的结合通过对细胞系FDCPl-β6的FACS分析（图5）、ELISA（图6）、以及生物素化α_vβ₆与LAP的阻断（图7）来确定。结合活性的等级次序是形式5（H3/L5）>形式3（H3/L3）=ch3G9=形式 2（H2/L2）。阻断性α_vβ₆介导的对于LAP的FDCPl-β6细胞粘附显示于图8中。生物活性的等级次序是ch3G9=形式5（H3/L5）=形式2（H2/L2）>形式3（H3/L3）。因为形式5比形式2更人源化，所以选择它用于产生稳定的CHO细胞系。 
不同形式的hu3G9重（形式1、2、3和5）和轻（形式1－5）可变结构域的DNA和相应的蛋白质序列显示于表2中。对于重链可变结构域，序列包含： 
（a）来源于VH3－7的FR1的人FR1； 
（b）鼠类3G9CDR1重链序列； 
（c）来源于VH3－7的FR2的人FR2； 
（d）鼠类3G9CDR2重链序列； 
（e）来源于VH3－7的FR3的人FR3； 
（f）鼠类3G9CDR3重链序列；和 
（g）来源于存在于大多数人抗体中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4： 
WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO：151）。 
对于轻链可变结构域，序列包含： 
（a）来源于L6的FR1的人FR1； 
（b）具有天冬酰胺（N）至丝氨酸（S）的氨基酸置换的鼠类3G9CDR1轻链序列； 
（c）来源于L6的FR2的人FR2； 
（d）鼠类3G9CDR2轻链序列； 
（e）来源于L6的FR3的人FR3； 
（f）鼠类3G9CDR3轻链序列；和 
（g）来源于存在于大多数人抗体中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4：FGGGTKVEIK（SEQ ID NO：152）。 
表2　hu3G9可变结构域的重和轻链序列
hu3G9形式1轻链（SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:139代表氨基酸序列）

hu3G9形式2轻链（SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：140代表氨基酸序列）

hu3G9形式3轻链（SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：141代表氨基酸序列）

hu3G9形式4轻链（SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：142代表氨基酸序列）

hu3G9形式5轻链（SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：143代表氨基酸序列）

hu3G9形式1重链（SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：144代表氨基酸序列）

hu3G9形式2重链（SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：145代表氨基酸序列）

hu3G9形式3和5重链（SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:146代表氨基酸序列）

实施例5：关于野生型和去糖基hu3G9形式5的稳定CHO表达载体的构建
上文描述的EBV载体包含不希望有的外来5'和3'UTRs。制备稳定的CHO表达载体用于hu-3G9重链形式3和轻链形式5（H3/L5），统称为形式5，其中外来序列被去除。此外，制备去糖基重链载体以去除表达的3G9抗体和Fcγ受体之间可能的相互作用。 
如图9中所示，轻链稳定CHO表达载体通过下述构建：将pKJS188的723碱基对BamHl片段连接到pKJS077（PDM-64-02-13）的6188碱基对、含neo BamHl消化的载体片段内，产生质粒pKJS195。 
重链稳定CHO表达载体通过下述构建：最初将来自pKJS168的1449碱基对BamHl片段连接到pKJS078（PDM-64-02-13）的6051碱基对、BamHl消化的载体片段内，以去除重链编码序列侧翼的NotI限制位点且产生质粒pKJS171。为了从由pKJS171编码的重链中遗传去除C末端赖氨酸残基，pKJS171的2190碱基对BsrGl－Xbal片段用pKJS078（PDM-64-02-13）的2187碱基对BsrGl－Xbal片段替换，产生pKJS189。如图10中所示，质粒pKJS189表示含dhfr野生型hu-3G9稳定CHO表达载体。为了产生去糖基形式的重链，pKJS189的587碱基对Agel/BsrGl片段用来自pCR076的587碱基对Agel/BsrGl片段替换，产生pKJS196。如图11中所示，这种载体表示含dhfr去糖基hu-3G9稳定CHO表达载体，包含去除正常Fc受体结合所需的糖基化信号的N319Q置换。 
证实pKJS189、pKJS196和pKJS195中的BamHI cDNA插入片段的DNA序列。将表达载体共转染到CHO细胞内，且测试转染细胞的抗体分泌。如图12中所示，条件培养基的Easy-Titer（Pierce）人抗体检测测定法指出，转染细胞合成且有效分泌来自CHO表达载体的重和轻链。 
因此，存在可以在hu-3G9抗体中进行修饰而不影响抗体结合亲和力的2个可能的糖基化位点：（1）在hu-3G9轻链可变结构域CDR1区域内SEQ ID NO：2的氨基酸残基26上，其中天冬酰胺（N）至丝氨酸（S）的置换去除改善蛋白质表达和纯化的糖基化位点（这个位点在轻链可变 结构域序列的所有5种形式中进行修饰）；和（2）在hu-3G9重链形式3恒定区中，其中天冬酰胺（N）至谷氨酰胺（Q）的置换去除Fc受体结合所需的糖基化位点。 
实施例6：表达hu3G9形式5的CHO细胞系
将关于hu3G9形式5的表达质粒pKJS189、pKJS196和pKJS195转染到CHO细胞内。从具有显示对于α_vβ₆的结合特异性的抗体分泌的转染细胞观察到hu3G9形式5（H3/L5）和去糖基hu3G9形式5（a-H3/L5）表达。 
实施例7：8G6抗α_vβ₆抗体的人源化设计
在人源化抗体的设计中，互补决定区（CDRs）包含最可能结合抗原且必须保留在改造抗体中的残基。根据Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第5版，U.S. Dept. Health and Human Services，U.S. Govt. Printing Office（1991），CDRs由序列确定。CDRs包含在规范种类内（Chothia 等人，Nature，342：877-883（1989）），其中关键残基在很大程度上决定CDR环的结构构象。这些残基几乎一直保留在改造抗体中。重和轻链CDRs如下分类成规范种类： 

对于这些种类重要的规范残基在表3中指出。所有规范残基如由规则所述。不存在关于环H3的规范种类。 
表3 


使用程序FASTA比较可变轻和重链与关于小鼠和人亚群的共有序列（Kabat等人，1991）。 
8G6可变轻链是小鼠亚群κ3成员，在112个氨基酸重叠中具有81.250％的同一性，和8G6可变重链是小鼠亚群2a成员，在129个氨基酸重叠中具有71.318％的同一性。8G6可变轻链对应人亚群κ4，在113个氨基酸重叠中具有65.487％的同一性。8G6可变重链对应人亚群1，在134个氨基酸重叠中具有58.955％的同一性。VH/VL包装界面残基是保守的，除了轻链（SEQ ID NO：4）中氨基酸位置50上的罕见F，和重链（SEQ ID NO：3）中氨基酸位置39上的罕见L。 
可变区结构建模如下进行。轻和重链针对最近PDB数据库的局部拷贝进行比对，以确定用于构建轻和重链三维模型的结构框。使用FASTA，发现8G6轻链在111个氨基酸重叠中与鼠类Nl0 Fab（INSN；分辨率）具有90.991％的序列同一性。发现8G6重链在126个氨基酸重叠中与鼠类JEL42 Fab（2JEL；分辨率）具有80.952％的序列同一性。全结构模板通过将2JEL重链和1NSN轻链组合来获得。使用分子建模包Modeler 5.0（Accelrys Inc.），使用模板结构建立轻和重链的三维结构。制备同源性模型，且选择就Modeler能量而言最佳的一个。Procheck分析显示在phi/psi帽的不接受区域中没有残基。 
在改造可变区的设计中，尝试找到最相似的人表达抗体序列用作抗体框架。为了找到最接近的表达序列，在NCBI NR数据库、TrEMBL数据库和Kabat数据库中进行最同源表达的人框架搜索。对于重和轻链序列，进行2种搜索（CDR遮蔽和暴露的）。最合适的表达序列的选择包括检查规范和界面残基的序列同一性，以及检查CDR环长度中的相似性。抗体来源也是决定因素。排除先前的人源化抗体。对于NCBI NR和TrEMBL数据库搜索，使用BLAST，和对于Kabat数据库搜索，使用FASTA。 
最相似的表达轻链在Kabat数据库中找到（kabat标识026520AC21B'CL；Ohlin等人，Mol.Immunol.，33：47-56（1996））。这是来自噬菌体展示的PCR扩增scFv，但它在框架区中100％等同于L6种系。对于重链，选择在NCBI上来自NR数据库的人框架gi|392715。它在框架区中100％等同于种系VH1－2。针对种系序列数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）搜索2种序列，且这导致下述选择的种系：L6对于轻链，和1－2对于重链。 
单克隆抗体人源化中的最重要程序是鉴定从人框架残基到小鼠的回复突变。经验已显示保留规范残基、界面包装残基、和接近于结合位点的罕见鼠类残基是特别重要的。此外，位于任何CDR残基内的残基需要严密分析对CDRs构象的潜在影响。 
已设计了3种形式的8G6可变改造轻链和3种形式的8G6可变改造重链。第一种形式包含最多的回复突变和第三种形式包含最少的回复突变（即，最“人源化”）。表4显示关于人源化8G6（hu8G6）抗体的重和轻链可变结构域序列（鼠类重链=SEQ ID NO：93；8G6HV1=SEQ ID NO：94；8G6HV2=SEQ ID NO：95；8G6HV3=SEQ ID NO：96；HV1-2=SEQ ID NO：97；鼠类轻链=SEQ ID NO：98；8G6LV1=SEQ ID NO：99；8G6HV2=SEQ ID NO：100；8G6LV3=SEQ ID NO：134；且L6=SEQ ID NO：135）。 
表4－关于hu8G6的重和轻链序列 
表4a－重链序列


表4b－轻链序列

不同形式的hu8G6重（形式1、2和3）和轻（形式1、2和3）可变结构域的蛋白质序列显示于表5中。对于重链可变结构域，序列包含： 
（a）来源于VH1-2的FR1的人FR1； 
（b）鼠类8G6CDR1重链序列； 
（c）来源于VH1－2的FR2的人FR2； 
（d）鼠类8G6CDR2重链序列； 
（e）来源于VH1－2的FR3的人FR3； 
（f）鼠类8G6CDR3重链序列；和 
（g）来源于共有框架序列的人FR4，所述共有框架序列100％等同于来自NR数据库的人框架gi|392715，且存在于大多数人抗体中、具有下述序列：WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO：151）。 
对于轻链可变结构域，序列包含： 
（a）来源于L6的FR1的人FR1； 
（b）鼠类8G6CDR1轻链序列； 
（c）来源于L6的FR2的人FR2； 
（d）鼠类8G6CDR2轻链序列； 
（e）来源于L6的FR3的人FR3； 
（f）鼠类8G6CDR3轻链序列；和 
（g）来源于存在于大多数人抗体中、具有下述序列的共有框架序列的人FR4：FGGGTKVEIK（SEQ ID NO：152）。 
表5－hu8G6可变结构域的重和轻链序列
hu8G6形式1重链（SEQ ID NO：78）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSSYTFTDYAMHWVRLAPGQGLEWIGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
hu8G6形式2重链（SEQ ID NO：79）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
hu8G6形式3重链（SEQ ID NO：80）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGVISTYYGNTNYNQKF KGRATMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLRYAMDYWGQGTLVTVSS 
hu8G6形式1轻链（SEQ ID NO：75）
DIVLTQSPLATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRFLIKYASNLESGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 
hu8G6形式2轻链（SEQ ID NO：76）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 
hu8G6形式3轻链（SEQ ID NO：77）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTSSYSYMYWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHNWEIPFTFGGGTKVEIK 
下文描述了改造可变轻链中的回复突变： 
E1D－这已显示影响CDR构象/抗原结合（Kolbinger 等人，Protein Eng.，8：971-980（1993））。在模型中，它可能与CDRs Ll和L3中的S26、Q27和/或E93的主链或侧链相互作用。它在形式2和3中被去除，因为该置换是保守的。 
L46F－这是VH/VL包装界面残基。它看起来还正好在CDR-L2残基E55的下面。它在形式3中被去除。 
Y49K－这邻近于CDR-L2且看起来在模型中与残基E55相互作用。这可能是非常重要的回复突变，且因此未被去除。 
下文描述了改造可变重链中的回复突变： 
A24G－这是关于CDR-Hl的规范残基。保守突变。在形式2中被去除。 
G26S－这是关于CDR-Hl的规范残基。保守突变。在形式2中被去除。 
Q39L－这是包装界面残基。它与轻链的相互作用非常有限，且因此在形式2中被去除。M48I－这是常见的回复突变。在模型中它可以与CDR-H2中的Y59和F63相互作用。它在形式3中被消除。V68A－这种残基位于CDR-H2的下面，可能与Y59和F63相互作用。 
R72V－这是关于CDR-H2的规范残基。T74K－这种残基位于CDR-H2的下面，可能与Y53相互作用或直接接触抗原。 
实施例 8：α_vβ₆抗体内在化
由细胞内在化的抗体提供用于某些临床适应症例如癌症的优点，因 为抗体随后可以与毒素、放射性化合物或其他抗癌剂缀合，以选择性靶向和抑制癌细胞生长。被内在化的抗α_vβ₆抗体的能力先前在WO03/100033中描述，所述专利整体引入本文作为参考。WO03/100033公开了对于阳离子依赖性单克隆抗体（含RGD的配体模拟物）例如6.8G6和6.1A8观察到内在化。然而，对于阳离子非依赖性mAbs例如6.3G9、7.1C5和6.4B4没有观察到内在化。抗体例如8G6被细胞内在化的能力提供了使内在化抗体与治疗部分/试剂偶联的优点，以允许将部分/试剂递送到细胞内。例如药物或毒素部分可以与8G6内在化抗体缀合。然而，这种相同的应用可以应用于非内在化抗体，例如3G9，其中化学部分可以与此类抗体缀合，以允许递送至靶细胞表面（例如，肿瘤细胞表面）。 
实施例9：相对于原发性肿瘤α_vβ₆在转移灶中是高度表达的 
在本实验中，着手研究α_vβ₆在各种上皮起源的癌症中和在转移病灶上的表达，且确定功能阻断性α_vβ₆mAbs是否能够抑制α_vβ₆表达肿瘤在体内的生长。评估了抗人α_vβ₆mAbs对人咽癌Detroit62的体内抗肿瘤活性，且比较这个与TβRII：Fc的体内抗肿瘤活性。数据支持α_vβ₆在人癌症中的作用和使用功能阻断性α_vβ₆mAb的治疗干预潜能。 
A.材料和方法： 
对于免疫组织化学，将组织切片在二甲苯和乙醇中去石蜡化、在蒸馏水中再水合、且随后浸入包含0.45％H₂O的甲醇中。组织与胃蛋白酶（00-3009，Zymed，San Francisco，CA）一起温育，且用抗生物素蛋白和生物素（SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA）封闭。初级抗体在包含0.1％牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释，且使组织于4℃温育过夜。为了免疫染色小鼠异种移植物组织上的β₆，切片与人/小鼠嵌合型抗α_vβ₆mAb，2A1（Weinreb，P.H.等人，J.Biol，Chem.279（17）：17875-17887（2004）），和抗人生物素化次级抗体（PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起温育。为了免疫染色人组织上的β₆，切片与鼠类2A1和抗小鼠-生物 素化次级抗体（PK-6102，Vector Laboratories）一起温育。将抗生物素蛋白-生物素复合物-辣根过氧化物酶（PK-6102，Vector Kit）应用于切片、在室温下温育30分钟，且如示的（SK-4100，Vector Laboratories）制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物，且于室温应用于切片5分钟。组织切片用Mayer's Hematoxylin染色1分钟且在水和PBS中漂洗。 
B.结果： 
1.α_vβ₆在转移灶中的表达 
α_vβ₆免疫染色对各种肿瘤转移灶进行评估。78％的转移灶（43/55）是阳性免疫染色的，显示在大多数转移灶上的强烈染色（图13A－F；图14A－I）。发现这种结果是阳性免疫染色百分比中的增加，其中只发现头与颈、子宫颈和胰腺肿瘤具有相等的表达水平（表1）： 
表1：α_vβ₆在人肿瘤中的表达（免疫组织化学） 

2.α_vβ₆在子宫内膜肿瘤和患者匹配的转移灶中的表达 
如上表1中所述，α_vβ₆免疫染色在检查的53％子宫内膜肿瘤上是阳性的。除少数例外，染色在更高分级肿瘤的更侵袭性区域中更显著。3种原发性肿瘤样品具有匹配的淋巴结转移灶。在3种情况的2种中，相 对于匹配的原发性肿瘤，免疫染色在淋巴结转移灶上明显更高（比较图15A与图15B，和图15C与图15D）。在第3种情况下，免疫染色在淋巴结转移灶和匹配的原发性肿瘤上都很高（数据未显示）。α_vβ₆阳性肿瘤上皮染色百分比在3种原发性肿瘤中分别为10％、20％和90％，而匹配的转移淋巴结中的α_vβ₆阳性肿瘤上皮百分比分别为80％、100％和100％。在正常子宫内膜中，染色局限于表面层上的偶然细胞以及囊。 
3.α_vβ₆在侵袭性人乳腺肿瘤样品中的表达 
使用免疫组织化学根据上文材料和方法中所述操作，评估超过100个人乳腺癌样品的α_vβ₆表达水平。在原位导管癌（DCIS）的几种情况下，α_vβ₆表达限制于肿瘤周围的肌上皮，且在肿瘤自身上未观察到（参见，例如，BrCal9；图16A）。然而，在侵袭性乳腺癌的几种情况下，α_vβ₆同样在肿瘤上表达（参见，例如，BrCa23；图16B）。 
比较正常乳腺组织与包含非侵袭性肿瘤例如DCIS的乳腺组织、包含侵袭性乳腺癌的乳腺组织，存在乳腺组织细胞（上皮细胞、肌上皮细胞和成纤维细胞）中的特异性基因表达改变的证据（Alinen，M.等人，Cancer Cell6：17-32（2004）；Burstein，H.J.等人，N.Engl.J.Med.350：1430-1441（2004））。许多这些基因表达变化已在肌上皮细胞中检测到。肌上皮（正常组织和DCIS中）上的α_vβ₆整联蛋白表达可能导致支持肿瘤存活力、且促进侵袭性肿瘤进展的微环境，可能经由局部TGF-β活化。可以进展至侵袭性癌的DCIS体内模型，例如MCF10DCIS.com（Miller，F.R.等人，J.Natl.Canc.Inst.92：1185-1186（2000）），将提供评估进展乳腺肿瘤背景中的α_vβ₆表达。可以评估在肿瘤早期非侵袭阶段的肌上皮中的α_vβ₆表达，和当肿瘤进展至体内侵袭表型时的α_vβ₆表达。这种模型还允许使用阻断性α_vβ₆mAbs测试α_vβ₆的功能作用，以及测试缀合的抗α_vβ₆mAbs的功效。 
4.α_vβ₆在人胰腺肿瘤样品、患者匹配的转移灶和侵袭性胰腺肿瘤的小鼠异种移植模型中的表达 
如上文表1中所示，α_vβ₆免疫染色在80％检查的胰腺肿瘤上是阳性的。当通过免疫组织化学检查来自8个不同患者的原发性胰腺肿瘤样品时，染色在高分级肿瘤的侵袭性区域中显著（图17A－17C；18A－18E）。原发性肿瘤样品还具有匹配的淋巴结转移灶（图17D－17F；18F－18J），所述淋巴结转移灶也显示强烈的α_vβ₆染色，支持α_vβ₆阳性细胞已从原发性肿瘤位点散布的观点。在正常胰腺（图17G－17H；18K－18L）中，染色局限于表面层上的偶然细胞。 
为了进一步检查α_vβ₆表达对肿瘤细胞侵袭的影响，使用BxPC-3小鼠肿瘤异种移植物作为侵袭性人胰腺腺癌模型。动物在胁腹用5x10⁶细胞/小鼠进行皮下植入（第0天），所述细胞悬浮于无菌盐水中，使用0.1ml/小鼠的注射。在第30天时，具有已建立的肿瘤（～60－100mm³）的小鼠互相配对成3个处理组（PBS；mAb3G9；可溶性TGF-β受体H-Ig融合蛋白（solTGFβRII-Fc））用于所有研究。测试试剂以每周3次的处理时间表腹膜内施用于小鼠。小鼠用l0mg/kg的3G9、2mg/kg的solTGFβRII-Fc、或PBS（阴性对照）进行注射。肿瘤生长每周测量2次，且肿瘤体积根据下式评估：[（宽度）²x长度]/2。来自处理组的肿瘤被切除，固定在10％多聚甲醛中，进行石蜡包埋且切片，用于使用非阻断性v6嵌合mAb6.2A1的免疫组织化学分析。 
使用抗α_vβ₆mAb3G9的处理对肿瘤生长具有直接影响（图19B，19C），其中在用抗体处理约48天后观察到肿瘤生长显著减少。使用solTGFβRII-Fc观察到的生长抑制水平略微低于对于3G9观察到的那种。这些结果指出抗α_vβ₆mAb3G9在人胰腺癌异种移植模型中抑制肿瘤生长，且暗示此类阻断性抗体可以用于在原发性人胰腺腺癌中抑制肿瘤生长，且延伸至抑制肿瘤侵袭。 
实施例10：α_vβ₆功能阻断性mAbs抑制α_vβ₆表达肿瘤细胞的肿瘤细胞迁移、侵袭、和MMP生产 
评估α_vβ₆阻断性单克隆抗体（mAb）3G9（Weinreb，P.H.等人， J.Biol.Chem.279（17）：17875-17887（2004））和可溶性重组TGF-βRII-Ig（Cosgrove，D.等人，Am.J.Pathol.157（5）：1649-1659（2000）），在体外阻断β₆转染细胞侵袭、迁移和基质金属蛋白酶9（MMP-9）生产的能力。监控这些活性是因为所述活性各自已与肿瘤细胞侵袭和迁移相关。3G9和TGF-βRII-Ig的效应使用未转染母细胞（C1）和β₆转染C1细胞衍生物（VB6）进行评估。 
迁移和侵袭测定法。C1和VB6人口腔鳞状癌细胞如先前所述在KGM培养基中生长（Thomas，G.J.等人，J.Invest.Derm.117（l）：67-73（2001）。为了测量迁移，根据制造商的说明书使用FLUOROBLOK^TM板和内眼板（BD Biosciences；Bedford，MA）。简言之，使空孔充满KGM培养基或作为阴性对照的无血清KGM。细胞被收获且在无血清培养基中与抗体一起预温育。将50,000个细胞加入内眼板中，所述内眼板随后置于孔内且于37℃在组织培养箱中温育24小时。温育后，从内眼板顶端取出细胞和培养基。迁移至过滤器下侧的细胞通过下述定量：用2μg/mL钙黄绿素（Invitrogen Corpn.，Carlsbad，CA）标记1小时，且以底部阅读模式测量荧光。抑制百分比计算为与单独的培养基比较，在抗体存在下迁移细胞数目的减少。侵袭以类似方式使用包被的FLUROBLOK内眼板且温育48小时进行测量。 
MMP生产的定量。在包含1％FBS培养基中的细胞在MATRIGEL包被孔（BD Biosciences）中培养所示时间。收获上清液，离心以去除细胞碎片，且冷冻直至测试时。MMP水平通过ELISA（R&D Systems，Minneapolis，MN）进行定量。 
结果： 
如图20A－20C中所示，α_vβ₆阻断性mAb3G9在体外显著抑制VB6细胞迁移、侵袭和MMP-9生产。使用重组可溶性TGF-βRII-Ig阻断TGF-β活性也抑制VB6细胞侵袭和MMP-9生产（图20B和20C），但不影响其迁移（图21A）。这些数据显示比较α_vβ₆功能阻断对TGF-β活性阻 断的不同功能差异。这个结论与α_vβ₆通过与纤连蛋白结合介导细胞粘附和迁移，以及活化潜伏前体TGF-β的能力一致（Sheppard，D.，Cancer Metast.Rev.24：395-402（2005））。 
实施例11：a_vβ₆mAb在人结肠直肠癌异种移植模型（LIM1863）中抑制基质侵袭 
1.背景 
新型结肠癌模型LIM1863近期被表征（Bates，R.C.和Mercurio，A.M.，Mol.Biol.Cell14：1790-1800（2003）；Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115（2）339-347（2005））。在体外，LIM1863细胞在悬浮培养中以分化良好的3D球状体（类器官）生长。然而，暴露于TGF-β和TGFα后，这种细胞系转变成迁移单层表型，具有由E-钙粘蛋白丧失代表的上皮至间充质过渡（EMT）的特有形态学变化。这种过渡伴随α_vβ₆表达的显著增加。在体内，当在裸小鼠胁腹中皮下注射时，LIMl863细胞是致瘤的（Bates，R.C.等人，J.Clin.Invest.115（2）：339-347（2005））。如图6中所示，LIMl863细胞显示惊人的α_vβ₆表达模式（同前）。具体地，α_vβ₆表达在看起来已从原发性肿瘤团块侵袭到肿瘤基质内的细胞上特别显著。这种发现与先前已描述的这些细胞已经历上皮-间充质过渡（EMT）的观点一致（参见同前）。 
因此，选择使用LIMl863细胞作为人结肠直肠癌的异种移植模型，以检查α_vβ₆在这种模型的基质侵袭中的可能牵涉。 
2.材料和方法 
LIMl863细胞在补充5％胎牛血清（FCS）的RPMI-1640（GIBCO；Invitrogen Corp.，La Jolla，CA）中作为类器官生长。LIMl863类器官（约8xl0⁶细胞）皮下接种到雌性裸小鼠胁腹内。所有动物研究都得到Biogen Idec实验动物管理使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）（IACUC）的支持。小鼠通过腹膜内注射用10mg/kg抗α_vβ₆特异性鼠类单克隆抗体3G9（Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem. 279（17）：17875-17887（2004））、2mg/kg重组可溶性TGF-βRII-Ig融合蛋白（Cosgrove，D.等人，Am.J.Pathol.157（5）：1649-1659（2000））、或媒介物对照（PBS）1周处理3次。肿瘤体积在相应时间点上使用测径器进行测量，且肿瘤体积使用式（L x W²）/2进行计算。7周后收获异种移植物且进行福尔马林固定，石蜡包埋切片用于免疫组织化学，所述免疫组织化学如上文实施例9中所述进行（图21）。 
结果 
抗α_vβ₆mAb3G9和/或重组可溶性TGF-βRII-Ig对肿瘤生长没有直接影响（图22A，22B）。然而，如通过定量基质内的α_vβ₆阳性肿瘤细胞面积评估的（图22D－22F），这些配体显著抑制LIMl863细胞的基质侵袭至约80％（图22C），所述评估由对处理不知情的病理学家来进行。 
实施例12：鼠类6.3G9（m3G9）对非人灵长类细胞上表达的α_vβ₆整联蛋白的亲和力和生物活性 
概述。抗α_vβ₆阻断性单克隆抗体6.3G9（m3G9）对非人灵长类（NHP）α_vβ₆整联蛋白的亲和力和生物活性通过各种体外方法来测定。使用荧光激活细胞分类术（FACS），从2个不同种类（来自非洲绿猴的12MBr6，和来自猕猴的4MBr5）中鉴定表达高水平α_vβ₆的NHP细胞系。m3G9分别以0.30μg/mL和0.38μg/mL的ED₅₀值与12MBr6和4MBr5上表达的α_vβ₆结合。m3G9还分别以0.22μg/mL和0.29μg/mL的IC₅₀值抑制12MBr6和4MBr5与TGFβ1潜伏相关肽（LAP）的结合。最后，如使用与TGFβ应答性貂肺上皮受体细胞的共同培养测定法测定的，m3G9以0.31μg/mL的IC₅₀值阻断4MBr5细胞系激活潜伏TGFβ的能力，所述貂肺上皮受体细胞稳定表达部分纤溶酶原激活物抑制剂1启动子（TMLC）。 
引言。这项研究的目的是测定抗α_vβ₆阻断性单克隆抗体6.3G9（m3G9）对非人灵长类（NHP）细胞上表达的α_vβ₆整联蛋白的亲和力和生物活性。m3G9是人源化单克隆抗体hu3G9（BG0001l）的鼠类前体。这 种鼠类抗体是高亲和力、特异性α_vβ₆整联蛋白靶向试剂。¹m3G9以高亲和力（K_D=16pM）与其靶α_vβ₆整联蛋白结合，抑制细胞表达的α_vβ₆与配体（TGFβl潜伏相关肽（LAP）和纤连蛋白）的结合，且阻断α _vβ₆激活潜伏TGFβl的能力。¹该抗体需要α_v和β₆亚单位的存在用于结合，且没有观察到与其他相关整联蛋白（α_vβ₃、α_vβ₃、α_vβ₅、α_vβ₃和α_IIbβ₃）的交叉反应性，指出m3G9对于α_vβ₆是高特异性的。¹
鼠类和人β₆整联蛋白具有高度序列相似性（89.5％的同一性）²，如鼠类和人α_v整联蛋白一样（92.8％的同一性）³。来自NHP的α_vβ₆序列仍未被测定，但也预期共有高水平的序列同一性。 
为了测定m3G9对NHPα_vβ₆的亲和力，结合通过FACS进行测量。m3G9阻断与人TGFβl LAP细胞粘附的能力在细胞粘附测定法中进行评估。最后，m3G9阻断NHPα_vβ₆介导的潜伏TGFβ活化的能力使用共同培养测定法进行测定。 
材料和方法： 
试剂。小鼠单克隆抗体6.3G9（m3G9）和6.4B4如参考1和上文所述来产生和纯化。重组人LAP（LAP）购自R&D Systems（目录#246-LP）。人β₆转染SW480（人结肠直肠腺癌）细胞系（SW480β6）由Dean Sheppard（UCSF）提供。 
NHP细胞系。下述细胞系从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得： 

荧光激活细胞分类术（FACS）。细胞通过胰酶消化来收获，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤1次，且随后重悬浮于FC缓冲液（PBS、2％FBS、0.1％ NaN₃、1mM CaCl₂和1mM MgCl₂）中。1x10⁶细胞随后在冰上在总共50μL FC缓冲液中，与10μg/mL m3G9一起温育0.5小时。温育后细胞用冰冷的FACS缓冲液（PBS，2％FBS，0.1％NaN₃）洗涤2次，且重悬浮于包含1：200稀释的Alexa488-缀合的山羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）的100μL FC缓冲液中，且在冰上温育30分钟。细胞随后用冰冷的FC缓冲液洗涤2次，且重悬浮于100μL FC缓冲液和50μL4％多聚甲醛中。标记的次级抗体的结合通过流式细胞术（Biogen Idec Research core facility）来监控。 
细胞粘附测定法。96孔微量滴定板于4℃用50μL/孔0.5μg/mL LAP包被过夜，所述LAP在50mM碳酸氢钠，pH9.2中稀释。板用PBS（100μL/孔）洗涤2次，用溶于PBS的1％BSA（100μL/孔）于25℃阻断1小时，且用100μL/孔测定缓冲液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂）洗涤2次。12MBr6或4MBr5细胞（4－12x10⁶细胞/mL）与2μM荧光染料（BCECF-AM，Molecular Probes）一起在测定缓冲液中，伴随轻柔振荡在37℃水浴中温育15分钟，通过离心收集，且重悬浮于测定缓冲液中至4－12x10⁶细胞/mL。向洗涤板的个别孔中加入25μL2x浓缩m3G9和25μL标记细胞，且使板于25℃温育0.5小时。板用测定缓冲液（100μL/孔）洗涤4－6次，且在96孔荧光板阅读仪（CytoFluor Series4000，Perseptive Biosystems）上记录由于板上捕获细胞的荧光。结合百分比通过比较最终洗涤步骤前的荧光（即加入的总细胞）与洗涤后的那种（即结合细胞）来测定。 
共同培养测定法。TMLC（用部分纤溶酶原激活物抑制剂1蛋白质稳定转染的貂肺上皮细胞系Mv1Lu）⁴在DMEM+10％胎牛血清中用2mML-谷酰胺、盘尼西林-链霉素和200μg/mL G418培养。细胞用PBS+5mM EDTA从烧瓶中取出，在PBS+0.1％BSA中洗涤，通过血球计来计数且在96孔板中铺板。α_vβ₆表达细胞贮藏于冰上2小时，而TMLC在DMEM+0.1％FBS中以10⁴细胞/孔在96孔板中铺板，且允许于37℃粘附，这 之后结合TMLC用DMEM+0.1％BSA洗涤1次。单克隆抗体在DMEM+0.1％BSA中稀释，加入α_vβ₆表达细胞中，且于室温预温育20分钟。α_vβ₆表达细胞随后在DMEM+0.1％BSA中以4X10⁴细胞/孔加入TMLC中（100uL/孔）。板于37℃在增湿、富含CO₂的温箱中温育20小时。弃去上清液且替换为100μL PBS+1mM Ca⁺²和1mM Mg⁺²。细胞进行裂解，且萤光素酶用LucLite试剂盒（Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA）使用微板光度计（Tropix TR717microplate luminometer，Perkin Elmer Life Sciences）进行检测。 
结果： 
1.小鼠6.3G9（m3G9）对于灵长类α_vβ₆整联蛋白的结合亲和力和阻断潜力。为了研究m3G9对于非人灵长类（NHP）α_vβ₆整联蛋白的亲和力，从ATCC获得4种NHP细胞系。最初筛选（图23）指出α_vβ₆表达在12MBr6和4MBr5细胞系上是最高的，因此使用这2种细胞系表征m3G9。α_vβ₆非阻断性抗体6.4B4也与12MBr6和4MBr5结合，其平均荧光强度与对于m3G9观察到的类似。 
1.1与细胞表达的整联蛋白的结合（FACS）。m3G9与12MBr6和4MBr5的结合使用荧光激活细胞分类术（FACS）如材料和方法中所述进行测量。对每种细胞系进行m3G9完全滴定，且使用非线性回归测定ED₅₀（产生半数最大信号的抗体浓度）。关于12MBr6和4MBr5的ED₅₀值分别为0.30μg/mL（图24A）和0.38μg/mL（图24B）。 
1.2与LAP的细胞粘附。12MBr6和4MBr5与LAP结合的能力使用细胞粘附测定法来证实。这种粘附被m3G9阻断，但不被对照蛋白质（BSA）或α_vβ₆非阻断性抗体（6.4B4）阻断（图25）。m3G9阻断这种相互作用的潜能通过测量在每种细胞系上的抑制浓度依赖性（图26）。根据这些实验测定IC₅₀（产生半数最大抑制的抗体浓度）。关于12MBr6和4MBr5的IC₅₀值分别为0.22μg/mL和0.29μg/mL。 
1.3TGFβ活化（共同培养测定法）。12MBr6和4MBr5激活潜伏TGF β的能力使用共同培养测定法来确定，在所述共同培养测定法中细胞与TGFβ应答性貂肺上皮受体细胞一起温育，所述貂肺上皮受体细胞稳定表达部分纤溶酶原激活物抑制剂1启动子（TMLC）（图27）。α_vβ₆表达不足以促进TGFβ活化，因为细胞内信号和/或潜伏TGFβ产生方面的差异在这个测定法中也对活性产生影响。在这2种细胞系中，只有4MBr5有效激活潜伏TGFβ，而12MBr5没有显示效应。使用阳性对照细胞系SW480β6同样观察到活化，所述SW480β6是稳定表达人α_vβ₆的β₆转染人结肠癌细胞系。如预期的，未转染亲本对照细胞系（SW480）没有显示活化。 
m3G9阻断TGFβ经由4MBr5活化的能力在相同实验中进行测量。TGFβ活化被1μg/mL或10μg/mL的m3G9添加阻断，但不被非阻断性抗α_vβ₆抗体6.4B4的添加阻断。m3G9在这些浓度时对4MBr5细胞的抑制影响类似于使用SW480β6细胞系观察到的那种。在分开实验中，测定m3G9抑制4MBr5介导的TGFβ活化的剂量依赖性（图28）。关于4MBr5和SW480β6的IC₅₀值分别为0.31μg/mL和0.37μg/mL。 
2.m3G9亲和力在种类中的比较。m3G9对小鼠、NHP和人α_vβ₆的结合和活性产生的数据概括于下表中。表中的第1列显示通过FACS测定的结合ED₅₀s。在每种情况下测量的ED₅₀≤0.38μg/mL（2.5nM）。表中的第2列显示通过m3G9抑制细胞粘附的IC₅₀。在每种情况下m3G9阻断细胞粘附的IC₅₀≤0.29μg/mL（1.9nM）。表中的第3列显示如使用共同培养测定法测定的，α_vβ₆介导的TGFβ活化的抑制IC₅₀。NHP细胞系4MBr5显示与人细胞系SW480β6类似的活性（IC₅₀值分别为0.40和0.24μg/mL）。 
使用小鼠、NHP和人细胞系的m3G9活性比较 

^a参考1 
^b n.d.，未测定。 
3.参考文献。 
1.Weinreb，P.H.等人，J.Biol.Chem，2004，279，17875-87. 
2.Arend，L.J.等人，J Am.Soc.Nephrol.2000，11，2297-305. 
3.Wada，J.等人，J.Cell Biol.，1996，132，1161-76. 
4.Abe，M.等人，Anal.Biochem.，1994，216，276-84. 
实施例13：鼠类抗α_vβ₆mAbs在Alport（Col4A3-/-）小鼠中的作用 
概述：α_vβ₆是TGF-β诱导型整联蛋白，在上皮重塑位点处优先表达且已显示结合和激活潜伏前体TGF-β。在本文中显示α_vβ₆在人肾上皮中在膜性肾小球肾炎、糖尿病、IgA肾病、Goodpasture和Alport肾上皮中过量表达。为了评估α_vβ₆在肾脏疾病中的潜在调节作用，已研究功能阻断性α_vβ₆mAbs和β₆亚单位遗传除去在Col4A3-/-小鼠中对肾纤维化的影响，所述Col4A3-/-小鼠是阿尔波特综合征的小鼠模型。观察到Alport小鼠肾中的α_vβ₆表达主要在皮质小管上皮细胞中且与纤维化进展相关。用α_vβ₆阻断性mAbs处理抑制活化成纤维细胞积聚和间质胶原基质沉积。在β₆缺陷Alport小鼠中观察到类似的肾纤维化抑制。 肾组织的转录特征显示α_vβ₆阻断性mAbs显著抑制在纤维化和炎症介质表达中的疾病相关变化。使用重组可溶性TGF-βRII处理产生了类似的转录调节模式，暗示共有的α_vβ₆和TGF-β调节功能。这些发现证实α_vβ₆可以促成肾纤维化调节，且暗示这种整联蛋白是潜在的治疗靶。 
引言： 
进行性纤维化是导致肾终末期疾病发展的共同过程，且通过上皮重塑、成纤维细胞活化、炎症和与细胞外基质（ECM）的细胞相互作用的再组织得到促进。促成这些事件的分子机制是复杂的，且包括TGF-β轴误调节、异常ECM重塑、和整联蛋白超家族细胞粘附受体的表达和功能改变^l-5。近期研究已显示几种整联蛋白和相关分子在肾上皮和间充质细胞中的重要调节功能^3,6-8。 
表达在肾脏疾病中强烈增加的整联蛋白中有TGF-β诱导型整联蛋白α_vβ₆^5,9,10。α_vβ₆表达一般限制于上皮细胞，在其中它在正常成人组织中以低水平表达且在发育、损伤和瘤形成期间升高^9,11-13。尽管α_vβ₆在健康成人肾中以相当低水平表达，但它的表达在发展中的小鼠肾中是显著的，特别是在近端小管、亨利氏袢和收集管中^11,12,14。近期，已报道了关于各种形式的人肾病理学的α_vβ₆表达升高¹⁰。 
与α_vβ₆在体内组织重塑期间表达增加一致，α_vβ₆整联蛋白在培养上皮细胞中的表达可以由细胞因子诱导，所述细胞因子调节上皮重塑，包括EGF和TGF-β^5,9。此外，在转基因小鼠皮肤中过量表达的β₆已显示激发形成自发性长期创伤¹⁵，暗示α_vβ₆可能在上皮组织重塑调节中起重要作用。 
关于α_vβ₆的已知配体包括纤连蛋白、腱生蛋白、以及潜伏相关肽1和3（LAP1和LAP3），潜伏前体形式的TGF-β1和-β3的N末端片段^16－19。作为与这些配体结合的结果，α_vβ₆可以介导细胞粘附、扩展、迁移、和潜伏TGF-β活化。TGF-β合成为被切割的潜伏蛋白质，且与N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP与鼠类活性C末端TGF-β细胞因子非 共价结合。潜伏TGF-β复合物不能与其同类受体结合且因此保持生物学无活性，直至通过几种可替代机制之一转变成活性形式，所述可替代机制包括通过蛋白酶切割、暴露于低pH或电离辐射、和潜伏复合物中的构象变化允许其与其同类受体结合^20－22。激活构象变化可以由α_vβ₆诱导，包括整联蛋白与包含在LAP1和LAP3内的RGD基序直接结合。这种结合使TGF-β前体转变成受体结合感受状态^17,19。这些发现暗示上皮细胞表面上的α_vβ₆表达上调可以导致局部TGF-β活化，随后为旁观者细胞中的TGF-β依赖性事件的旁分泌活化。这将包括对TGF-β活性的间接下游影响的可能性，所述TGF-β活性可以通过改变最初在α_vβ₆表达位点处的炎症和纤维化来介导。 
因为TGF-β已暗示为肾纤维化的关键调节物，所以假设它由α_vβ₆局部活化可能是肾脏疾病发作和进展中的重要过程，且α_vβ₆功能阻断可以抑制肾纤维化发展。在本文所述研究中，显示α_vβ₆在肾纤维化小鼠模型和具有纤维化病理状态的人肾样品中是高度上调的。使用Col4A3-/-小鼠，类似于在人阿尔波特综合征中观察到的那种的进行性肾脏疾病模型，显示阻断配体结合和α_vβ₆的TGF-β活化功能的mAbs²³，以及β₆的遗传除去，可能抑制肾小球和小管间质性纤维化且延迟肾组织结构的破坏。显示尽管α_vβ₆整联蛋白在肾中的表达已局限于小管上皮细胞，但它可以提供在组织远端部位处的保护效应。这些发现增加了除了小管上皮细胞上的α_vβ₆阻断的直接效应，抗纤维化效应还可以经由间接肾外效应介导的可能性。延迟处理研究指出α_vβ₆的治疗阻断不仅抑制肾纤维化进展，还具有允许现有纤维化损害消退的潜能。与肾脏疾病进展相关且受α_vβ₆抑制影响的分子标记分析指出，α_vβ₆阻断性抗体的治疗影响类似于系统TGF-β阻断的那种，且在机制上与TGF-β活性减少相关。这些数据暗示α_vβ₆涉及肾纤维化调节且可以提供关于其治疗调节的新型分子靶。 
材料和方法： 
1.试剂。α_vβ₆mAbs如本文所述和先前所述²³产生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分别的亲本杂交瘤总RNAs产生，其中恒定区引物CDL-739用于重链和CDL-738用于轻链，使用First Strand cDNA合成试剂盒（Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ）。重和轻链可变区基因通过聚合酶链式反应进行扩增，使用用于cDNA合成的相同3'引物、和对大多数鼠类抗体基因信号序列（在检索后可获得的序列）特异的简并引物库、以及Pfu DNA聚合酶（Stratagene，La Jolla CA）。将克隆的重和轻链可变区连接到具有人IgGl恒定区的哺乳动物表达载体内。重组可溶性鼠类TGF-β受体II型-Ig融合蛋白（rsTGF-βRII-Ig）如先前所述⁷产生，且购自R&D Systems（532-R2，Minneapolis，MN）。抗体如所述的购买。FITC缀合的泛抗细胞角蛋白mAb（C-1l），Sigma-Aldrich（F3418，St.Louis，MO）；抗层粘连蛋白B1链mAb（LT3），Chemicon（MAB1928，Temecula，CA）；藻红蛋白（PE）缀合的抗α_v mAb（RMV7），Chemicon（CBLl346P）；兔抗α_v，Chemicon（AB1930）；PE-大鼠IgGl，BD Biosciences（553925，San Jose，CA）；和抗平滑肌肌动蛋白（SMA）-Cy3，Sigma-Aldrich（C-6198）。与表达潜伏TGF-β的293细胞异种移植物切片比较，鉴定兔多克隆抗TGF-β，Santa Cruz Biotechnology（sc-146，Santa Cruz，CA）作为优先结合表达组成活性形式TGF-β的293细胞异种移植物切片的抗体²⁴。 
2.动物。129Sv/J背景中的Col4A3+/-小鼠从Dr.Dominique Cosgrove（Boy's Town National Research Hospital，Omaha，NE）获得，且进行繁殖以产生用于注射研究的Col4A3-/-小鼠。129SV背景中的Beta6-/-小鼠从Dr.Dean Sheppard（University of California San Francisco，CA）获得，且与Col4A3+/-小鼠进行杂交。所有动物都饲养在Biogen Idec，且所有动物研究得到批准且依照实验动物管理使用委员会来进行。 
3.流式细胞术。鼠类β₆稳定转染的NIH3T3细胞（NIH3T3b6）如先 前所述产生²³。细胞通过胰酶消化来收获，在PBS中洗涤，且随后重悬浮于FC缓冲液（1X PBS、2％FBS、0.1％NaN₃、1mM CaCl₂和1mM MgCl₂）中。随后使0.2Xl0⁵细胞在冰上、在总体积100μl包含纯化初级抗体的FC缓冲液中温育1小时。温育后，细胞用冰冷的FC缓冲液洗涤2次，且重悬浮于包含5μg/ml PE-缀合的驴抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）的100μL FC缓冲液中，且在冰上温育30分钟。为了监控α_v表达，细胞与PE-缀合的大鼠抗小鼠α_v mAb（RMV-7）和PE-缀合的大鼠IgG1对照一起温育。细胞用冰冷的FC缓冲液洗涤2次，且通过流式细胞术监控标记的次级抗体的结合。 
4.免疫组织化学。将组织切片在二甲苯和乙醇中去石蜡化、在蒸馏水中再水合、且随后浸入包含0.45％H₂O的甲醇中。组织与胃蛋白酶（00-3009，Zymed，San Francisco，CA）一起温育，且用抗生物素蛋白和生物素（SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA）封闭。初级抗体在包含0.1％BSA的PBS中稀释，且使组织于4℃温育过夜。为了免疫染色小鼠组织上的β₆，切片与人/小鼠嵌合型抗α_vβ₆mAb－2A1²³，和抗人生物素化次级抗体（PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起温育。为了免疫染色人组织上的β₆，切片与鼠类2A1²³和抗小鼠-生物素化次级抗体（PK-6102，Vector Laboratories）一起温育。将抗生物素蛋白-生物素复合物-辣根过氧化物酶（PK-6102，Vector Kit）应用于切片、在室温下温育30分钟，且如示的（SK-4100，Vector Laboratories）制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物，且于室温应用于切片5分钟。组织切片用Mayer's Hematoxylin染色1分钟且在水和PBS中漂洗。 
包埋在O.C.T.Compound（目录#4583，Sakura Tokyo，Japan）中的冷冻组织切片在丙酮中进行固定，且用溶于PBS的0.5％酪蛋白/0.05％硫柳汞阻断。为了免疫染色人组织上的β₆，切片与鼠类2A1²³和抗小鼠Alexa fluor594次级抗体（A-11032，Molecular Probes Eugene， Oregon）一起温育。为了免疫染色小鼠组织上的β₆，切片与人/小鼠嵌合型2A1和抗人Alexa fluo594缀合的次级抗体（A-11014，Molecular Probes）一起温育。对于层粘连蛋白和α_v的免疫染色，使用抗大鼠Alexafluor488缀合的次级抗体（A-11006，Molecular Probes）。所有其他抗体如先前所述直接缀合。所有图像在20X时获取，除了图2A在40X时获取外。所有人组织样品在地方检查机构同意和患者同意下获得。 
5.免疫组织化学定量。SMA免疫染色使用MetaMorph v5.0（Universal Imaging Corporation，Sunnyvale，CA）进行定量，且表示为相对于总图像大小的阳性百分比。对于每个动物，分析来自至少5个皮质和1－2个髓质切片的20X图像。处理组的统计分析使用ANOVA进行。 
6.用mAbs和rsTGF-βRII-Ig处理Col4A3-/-小鼠。129Sv/J背景中的Col4A3+/-小鼠进行繁殖以产生Col4A3-/-小鼠。如所示的，小鼠用蛋白质进行腹膜内注射，每周3次，从3周大－7或8.5周大。mAbs以4mg/kg进行腹膜内注射和rsTGF-βRII-Ig以2mg/kg进行注射。对小鼠实施安乐死，且收集肾用于RNA和免疫染色。所有动物研究得到批准且依照实验动物管理使用委员会来进行。 
7.总RNA纯化和cDNA合成。将肾直接均质化到TRIzol（155-96-018，Invitrogen，Carlsbad，CA）内，且RNA根据制造商的方案进行提取，使用另外1ml酸性苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1pH6.6提取。将纯化的总RNA重悬浮于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的H₂0（Ambion Inc，Austin，TX）中，且记录260和280（Spectra max Plus，Molecular devices，Sunnyvale，CA）。残留DNA使用5单位DNA酶I扩增等级（目录#18068-015，Invitrogen）于20℃去除15分钟。cDNA使用高容量cDNA存档试剂盒根据制造商的方案（目录#4322171，Applied Biosystems Inc，Foster City，CA）来产生。 
8.关于Taqman的引物、探针和寡核苷酸标准模板设计。寡核苷酸 引物和Taqman MGB探针使用Primer Express版本2.0.0（Applied Biosystems Inc.）由Affymetrix共有序列设计。设计具有5'共价连接的荧光报道染料（FAM）和与3'端共价连接的小沟结合剂/非荧光猝灭物（MGBNF）的Taqman MGB探针。通过给扩增子的5'和3'末端添加10bp基因特异性序列来设计寡核苷酸标准模板。反相HPLC纯化引物和寡核苷酸标准模板购自Biosearch technologies Inc.，Novato，CA。关于鼠类甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的HPLC纯化引物和探针在Biogen Idec合成[CATGGCCTTCCGTGTTCCTA（SEQ ID NO：147），GCGGCACGTCAGATCC（SEQ ID NO：148），6FAM-CCCCAATGTGTCCGTC（SEQ ID NO：149）]。 
9.Taqman热循环。关于样品和标准的一式四份PCR反应在7900HT（Applied Biosystems Inc.）热循环仪中在下述条件下循环：50℃2分钟（尿嘧啶N-去糖基化酶消化），95℃10分钟（Taq耐热聚合酶活化），以及95℃15秒和60℃60秒的40个循环。对于每个反应孔运行长度每7秒收集荧光发射。使用Sequence Detection Software（Applied Biosystems Inc.）通过与寡核苷酸标准曲线比较，测定关于每种样品的相对转录物量。 
10.探针标记、杂交和关于转录特征的扫描。样品标记、杂交和染色根据Eukaryotic Target Preparation方案进行，所述方案在关于 Expression Analysis（Affymetrix，Santa Clara，CA）的Affymetrix Technical Manual（701021rev1）中。总之，在20μL第1条链反应中使用5μg纯化的总RNA，与200U SuperScript II（目录#，18064-022，Invitrogen）和0.5ug（dT）-T7引物（SEQ ID NO：150）[5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG（T）₂₄]于42℃1小时。第2条链合成通过下述进行：添加40U大肠杆菌DNA Polymerase（目录#18010-025，Invitrogen）、2U大肠杆菌RNase H（目录#18021-071，Invitrogen）和10U大肠杆菌DNA Ligase（目录#18052-019，Invitrogen），随后于16℃温育2小时。第2条链合成反应使用 Sample Cleanup Module根据制造商的方案（目录#900371，Affymetrix,Santa Clara,CA）来纯化。纯化的cDNA使用Bio Array高产量RNA转录标记试剂盒（目录#42655-40，Enzo Life Sciences，Inc.，Parmingdale，NY）根据制造商的方案进行扩增，以产生70－120μg生物素标记的cRNA（互补RNA）。小鼠MgU74Av2、MgU74Bv2和MgU74Cv2 探针阵列在Hybridization Oven640（Affymetrix，Santa Clara，CA）中根据制造商的方案进行预杂交。将片段化的标记cRNA重悬浮于300μL1X杂交缓冲液中，所述杂交缓冲液包含100mM2-吗啉乙磺酸，1M[Na+]，20mM EDTA，0.01％Tween20，0.5mg/mL乙酰化BSA，0.1mg/mL鲱鱼精DNA，对照oligo B2，和对照bioB1.5pM、bioC5pM、bioD25pM以及cre100pM，且根据制造商的方案（Affymetrix，Santa Clara，CA）与探针阵列杂交。杂交的探针阵列进行洗涤，且使用链霉亲和素-藻红蛋白（目录#S866，Molecular Probes，Eugene，OR）进行染色，且使用Fluidics Station400（Affymetrix，Santa Clara，CA）与生物素化的抗链霉亲和素（BA-0500，Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起扩增。探针阵列使用Gene Array Scanner（Hewlett Packard，Corvallis，OR）进行扫描。 
11.转录特征数据分析。将阵列扫描转换成Affymetrix.CEL文件，且所得到的数据集（.CEL文件组表示完全实验）使用Robust Microarray Average（RMA）法进行标准化。统计和聚类分析使用GeneSpring（Agilent）和Spotfire（Spotfire）数据采集工具来完成。使用2步ANOVA和倍数变化过滤，以鉴定与未处理的Col4a3-/-组比较，其信号强度通过实验处理改变为p<0.05和至少2倍的探针集合。类似地，使用统计截止p<0.01和信号倍数变化截止2，对于未处理Col4a3-无效和首次用于实验的野生型组之间的差异表达选择疾病相关转录物。所得到的基因组和实验条件分组的特征通过层级聚类进行分析和显示。虚拟途径分 析使用Ingenuity Pathway Analysis数据库（Ingenuity Systems）来进行。 
结果： 
1.α_vβ₆在具有纤维化病理状态的人肾样品中的表达。与炎症/纤维化病理状态相关的几种不同类型的人肾脏疾病，已显示TGF-β在肾组织中相应增加的表达^25-27。使用免疫组织化学分析，检查在与慢性炎症和纤维化相关的人肾活检样品中的α_vβ₆表达，作为导致TGF-β活化增加的潜在机制（图29A和29B）。来自膜性肾小球肾炎、糖尿病、IgA肾病、Goodpasture、Alport和狼疮的组织样品都显示在扩张和损伤小管上皮层中显著的α_vβ₆染色。相比之下，形态学正常的肾（肾癌和正常组织）样品显示小管中最低限度的偶然免疫染色。在分析的所有肾样品中不存在肾小球染色。这个发现与下述先前报道一致，α_vβ₆在正常成人上皮中以低水平表达但在组织损伤和修复期间上调^{10,11,13,15,17}。 
2.α_vβ₆在与肾纤维化进展相关的Col4A3-/-小鼠肾中的表达。Col4A3-/-小鼠，人Alport疾病小鼠模型，发展进行性肾小球肾炎，导致在肾小球和脉间区中的ECM积聚，伴随许多纤维化标准标记的表达增加^28，29。先前已报道用rsTGF-βRII-Ig处理Col4A3-/-小鼠导致肾纤维化抑制⁷。来自Col4A3-/-小鼠的肾在约5－6周大时开始显示纤维化的组织学征兆。疾病随着年龄快速进展，且小鼠在约11周时死于肾衰竭。杂合Col4A3+/-小鼠不发展肾小球肾炎，且其肾在组织学上与野生型同窝产生者的那些不能区别。为了检查在年龄渐增的Col4A3+/-、和Col4A3-/-（Alport）小鼠肾中的α_vβ₆表达动力学，进行在从4、7和8周大的小鼠分离的肾中的α_vβ₆表达的免疫组织化学分析（图30A－C）。在4周大时，在Col4A3+/-和Col4A3-/-小鼠的肾小管中存在α_vβ₆的偶然表达。到7周时，α_vβ₆表达在Col4A3-/-小鼠小管上皮细胞中显著增加，但在Col4A3+/-肾中则不是。α_vβ₆的这种增加表达在超过8周大的Col4A3-/-小鼠中持续。在6周大后的Col4A3-/-（Alport）小鼠的扩张 和损伤小管上皮细胞中同样观察到α_vβ₆染色强度增加，这伴随显示强烈α_vβ₆表达的肾组织面积的显著增加。在7－8周大的时间段期间的表达增加与Col4A3-/-小鼠中肾纤维化的快速进展一致。相比之下，时程自始至终在Col4A3+/-小鼠肾中只检测到最低限度的α_vβ₆表达，和其免疫染色强度轻度可检测的年龄依赖性增加。因为Col4A3-/-小鼠肾中的α_vβ₆表达与纤维化进展相关，所以希望确定α_vβ₆功能阻断是否能够抑制纤维化损害起始和进展。 
3.在Col4A3-/-小鼠肾中mAbs与α_vβ₆结合的特异性。先前已报道有效和选择性抗α_vβ₆mAbs的产生²³，包括与α_vβ₆结合而不影响其结合配体能力的mAbs（非阻断性mAbs），和阻断配体结合和α_vβ₆介导的TGF-β活化的mAbs（阻断性mAbs）。为了证实用于体内研究的α_vβ₆阻断性mAbs与α_vβ₆整联蛋白的结合是选择性的，进行比较α_vβ₆mAbs与未转染亲本NIH3T3细胞和用β₆cDNA鼠类转染的NIH3T3细胞（NIH3T3b6）的结合的FACS分析（图31A）。尽管对照抗α_v mAb－RMV7染色未转染和α_vβ₆表达NIH3T3细胞，但抗α_vβ₆mAbs只选择性结合NIH3T3b6细胞。为了证实在肾中结合α_vβ₆的选择性，产生人/小鼠嵌合型阻断性α_vβ₆mAbs之一3G9，且比较用兔抗α_v多克隆抗体产生的免疫染色模式（图31B和31C）。如通过FACS和ELISA测定的，嵌合和原始鼠类形式的3G9具有可比较的靶结合亲和力（数据未显示）。嵌合型3G9特异性免疫染色在Col4A3-/-小鼠肾中的小管上皮细胞，且来自与β6-/-小鼠杂交的Col4A3-/-（Col4A3-/-；β6-/-）肾切片没有显示免疫染色。用抗α_v抗体免疫染色肾没有显示Col4A3-/-小鼠或Col4A3-/-；β6-/-小鼠之间的显著差异。 
4.用抗α_vβ₆mAbs处理Col4A3-/-（Alport）小鼠抑制肾纤维化。为了确定α_vβ₆在肾纤维化调节中的潜在功能牵涉，已测试阻断性α_vβ₆mAbs影响晚期纤维化损害起始和进展的能力。为了评估α_vβ₆阻断的预防效应，Co/4A3-/-小鼠从3周到7周大或从3周到8.5周大用下述抗体 处理：2种不同阻断性α_vβ₆mAbs，3G9或8G6；非阻断性α_vβ₆mAbs，6.8B3；或同种型匹配的阴性对照mAb，1E6。为了表型参考和监控系统性TGF-β抑制效应，这些研究还包括用rsTGFβRII-Ig处理的Col4A3-/-小鼠。收集肾用于组织学评估和RNA分离。与来自年龄相一致的Col4A3+/-小鼠的肾比较，纤维化组织学标记以及SMA表达在7和8.5周时在Col4A3-/-肾中急剧增加。来自阴性对照mAb处理的Col4A3-/-小鼠的肾呈现扩张和纤维化肾小球膜以及鲍曼囊中的半月体形成（图32A，1E6）。这些肾还显示伴随小管上皮损伤和扩张的显著成肌纤维细胞活化和间质纤维化。用阻断性α_vβ₆mAbs－6.3G9或8G6处理Col4A3-/-小鼠，显著减少小球和间质损伤和纤维化，导致肾结构相当大的总体保存（图32A，3G9和8G6）。阻断性α_vβ₆mAbs的这些效应伴随SMA表达在肾小球中减少>65％和在脉间区中减少>90％（图32B和32C）。阻断性α_vβ₆mAbs对肾小球中SMA表达的影响暗示，尽管α_vβ₆整联蛋白表达限制于小管上皮细胞，但其功能阻断可以在组织更远端部位处具有效应。这可以至少部分由阻断性α_vβ₆mAbs的间接系统效应介导。在用非阻断性α_vβ₆mAbs－8B3注射的Col4A3-/-小鼠肾中看不到对纤维化进展的影响。与经由TGF-β阻断抑制肾纤维化的先前报道一致^7，30-33，如通过组织学外观和肾组织中的SMA含量变化判断的，用rsTGFβRII-Ig处理Col4A3-/-小鼠产生的肾纤维化抑制类似于通过阻断性α_vβ₆mAbs产生的那种。α_vβ₆阻断性mAbs对SMA表达的影响与胶原1α1和胶原1α2mRNA的肾组织总水平减少平行（图33A和33B）。用3G9、8G6或rsTGF-βRII-Ig处理Col4A3-/-小鼠导致胶原1α1和胶原1α2mRNA丰度的显著减少，而非阻断性α_vβ₆mAb和同种型对照mAb对这些转录物水平没有显著影响。 
为了测试α_vβ₆阻断对晚期肾纤维化的影响，已研究α_vβ₆阻断性mAbs在6周大的Col4A3-/-小鼠中对肾纤维化的影响，在这时肾病理学表现为可测量的损伤和SMA阳性活化成纤维细胞积聚。小鼠用α_vβ₆阻 断性mAbs－3G9，或用同种型对照mAb－1E6处理2.5周，且随后在8.5周大时处死。SMA免疫染色定量显示，与同种型对照mAb处理的小鼠比较，在来自用3G9处理的Col4A3-/-小鼠肾中存在的SMA阳性成纤维细胞减少（图34A）。同样重要的是，与在处理开始时（6周）观察到的SMA水平比较，用延迟3G9处理的SMA免疫染色的强度和面积减少。与从用1E6处理的Col4A3-/-小鼠中分离的肾比较，用3G9延迟处理Col4A3-/-小鼠诱导病理学中的显著回复，包括损害小管和间质中纤维化的显著减少。 
这些结果暗示α_vβ₆的治疗阻断不仅抑制肾纤维化进展，还可以允许现有的纤维化损害消退。 
5.通过抗α_vβ₆mAbs调节肾基因表达。为了进一步了解与α_vβ₆功能相关的疾病机制，已在来自野生型和Alport小鼠的肾组织中进行基因表达的Affymetrix GeneChip分析。在Col4a3-/-肾中表达改变的基因组鉴定为395GeneChip探针组，显示在p<0.01时7周大Col4a3-/-年龄相一致的野生型肾之间标准化信号强度中至少2倍的平均差异（图35）。差异表达基因的功能注释使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具来进行，且已指出在Col4a3-/-肾中过量表达的基因与炎症和白细胞功能调节的显著相关，而表达减少的基因主要与代谢调节相关（图36）。 
用α_vβ₆阻断性mAbs处理动物减少了Col4A3-/-肾中基因子集的差异表达。已使用变量分析（Welch ANOVA）鉴定在p<0.05时受实验处理影响的转录物，且进一步过滤所得到的探针组，以选择在响应处理的信号强度中显示至少2倍差异的那些。这种操作产生分别受3G9、8G6和TGFβRII-Fc显著影响的56、42和28个探针组。这些探针组群体显示相当大的重叠，且群体各自表示对应Col4a3-/-肾中差异表达的转录物的完全包括子集395（图37A）。观察到经由α_vβ₆阻断性mAbs3G9和8G6的类似基因表达调节（图35，图37A），所述3G9和8G6先前显示 属于2个不同生物化学种类²³。非阻断性α_vβ₆mAbs8B3和同种型对照mAb1E6对基因表达都没有显著影响。因此，α_vβ₆mAbs对肾基因表达的影响可能是由于α_vβ₆功能阻断而不是整联蛋白信号活化或非特异性事件。没有发现阻断性α_vβ₆mAbs3G9对正常野生型肾组织中的基因表达的影响。这种观察暗示在实验中观察到的α_vβ₆阻断性mAbs效应反映α_vβ₆的主要疾病特异性调节功能。 
为了探究由α_vβ₆-mAbs调节的基因与主要调节途径的潜在关联，使用IPA软件对分别的基因列表实施虚拟调节网络分析（图37）。IPA比较作为输入提供的基因列表与基因和蛋白质中已知物理和调节相互作用的curated数据库。这种分析产生了排序表和最可能由给定调节基因列表反映的调节途径的个别构型。尽管由3G9和8G6调节的基因列表并非完全相同，但IPA已显示TGFβ依赖性网络为受3G9（37A）以及8G6（图37B）影响的最高得分调节网络。与这个发现一致，实验组平均基因表达特征的层级聚类已显示经由α_vβ₆mAbs和rsTGFβRII-Ig的基因调节模式之间的相似性（图35）。 
6.α_vβ₆阻断减少Col4A3-/-肾中的TGFβ表达。为了确定用3G9和8G6mAb处理检测到的肾纤维化减少是否与TGF-β表达减少相关，肾切片用抗TGF-βl mAb进行免疫染色（图38A）。用于免疫染色的mAb是与潜伏TGF-β比较，与表达组成活性TGF-β的组织切片优先结合的mAb（数据未显示）²⁴。用3G9或8G6处理小鼠导致在肾脉间区和小球区域中的TGF-β1免疫染色显著减少。TGF-β表达中的这些变化伴随TGF-βmRNA肾组织总水平的类似变化（图38B）。TGF-β1免疫染色模式指出尽管α_vβ₆表达限制于肾小管上皮层，但α_vβ₆功能抑制可以导致在远端部位例如小球区域处的TGF-β表达减少，所述小球区域不紧邻α_vβ₆表达区域。这可能暗示尽管α_vβ₆可以充当局部TGF-β活化的起始触发物，但它还可以对TGF-β产生远程调节影响。此类远程影响的一种可能机制可能基于TGF-β以自分泌或旁分泌方式激活其自身表达的能力，导 致TGF-β表达组织区域扩大。它还包括通过α_vβ₆阻断起始局部抑制TGF-β活化干扰炎症和纤维化过程的可能性，这随后可以进一步间接下调TGF-β活性。 
7.在Col4A3-/-小鼠中遗传除去β₆基因。为了验证来自mAb实验的发现，产生Col4A3和β₆双重敲除小鼠（Col4A3-/-；β6-/-）。年龄相一致的Col4A3-/-；β6+/-和Col4A3-/-；β6-/-小鼠肾的组织学检查证实使用α_vβ₆阻断性mAbs的研究中获得的结果。与年龄相一致的Col4A3-/-；β6+/-小鼠比较，在来自7－10周大的Col4A3-/-；β6-/-小鼠的肾中存在SMA免疫染色的显著减少（数据未显示）。这伴随肾小球和脉间区中纤维化的急剧减少（图39）。与来自Col4A3-/-；β6+/-小鼠的年龄相一致的肾比较，如在三色masson染色的来自10周大的Col4A3-/-；β6-/-肾中观察到的，这通过胶原表达减少和良好保存的肾结构得到证实。与β₆功能遗传除去比较，使用阻断性α_vβ₆mAbs处理观察到的抗纤维化效应的一致性指出，mAb处理是阻断体内α_vβ₆功能的有效方法。 
7.3G9抑制Col4A3-/-小鼠中的肾纤维化的剂量响应。Col4A3-/-小鼠用浓度渐增的3G9每周处理3次。小鼠从3周大处理到7周且随后被处死。SMA的免疫组织化学分析在肾皮质和髓质区中进行分析。剂量逐步增加显示3G9在Col4A3-/-小鼠中以0.3－0.4mg/kg的ED₅₀抑制SMA表达（图40）。 
讨论： 
肾脏疾病的进展伴随强烈的组织重塑、炎症和纤维化损害形成，最终导致肾组织结构破坏和肾功能丧失。纤维化对于这个过程是关键的，且包括成纤维细胞活化和扩充、患病组织新血管形成、和细胞外基质大量沉积。作为这些事件的主要驱动物牵涉的分子机制包括TGF-β轴误调节，伴随在位于纤维化损害的细胞中的ECM蛋白质及其受体表达改变 ^34-36。TGF-β表达升高是人组织纤维化的标记^25－27，和TGF-β在促进组织 纤维化中的功能重要性已在体外和动物疾病模型中得到文件证明。TGF-β过量表达足以在体内诱导成纤维细胞活化和血管发生，且在器官型和细胞培养中激活ECM过量产生^34，37，38。相反，TGF-β信号的遗传或药理学破坏在肺、皮肤、和肾纤维化模型中提供了不受纤维化的足够保护^{30，32，33，39-41}。 
指向系统抑制TGF-β功能（阻断性mAbs、rsTGF-βRII-Ig、TGF-β受体激酶抑制剂）的几项研究已显示减少动物疾病模型中的纤维化。然而，所有这些方法已针对阻断活化形式的TGF-β，而可以阻断TGF-β活化的试剂的治疗潜能仍研究甚少。TGF-β作为潜伏前体表达，且可以通过许多机制转变成生物学活性细胞因子，所述机制包括活性氧簇、pH、凝血酶敏感素-1、细胞外蛋白水解酶、和整联蛋白^21，42-44。在整联蛋白中特别感兴趣的是α_vβ₆，在上皮重塑位点处表达且显示充当潜伏TGF-β受体和激活物的TGF-β诱导型整联蛋白^11，17，45。β₆亚单位在几种形式的肾脏疾病是上调的¹⁰，且其遗传除去显示在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型中提供不受损伤诱导的肾纤维化的显著保护⁴⁶。β₆缺陷小鼠不受纤维化的类似保护已在博来霉素肺纤维化模型中观察到，暗示α_vβ₆可以在各种组织中介导纤维化^17，47。有趣的是，UUO诱导的SMAD2磷酸化，TGF-β信号的关键介质在β₆缺陷肾中显著减少，暗示α_vβ₆可能的确在体内作为TGF-β调节线路部分起作用⁴⁶。 
使用β₆敲除小鼠的先前研究已提供α_vβ₆可以在纤维化起始中起作用的证据，暗示这种整联蛋白是潜在的新型治疗靶。尝试确定用阻断性mAbs药理学抑制α_vβ₆功能是否能够减少Col4A3-/-小鼠中的肾纤维化，所述Col4A3-/-小鼠是常染色体隐形遗传阿尔波特综合征的动物模型²⁸， ²⁹。阿尔波特综合征是由Col4A3、Col4A4或Col4A5基因中的突变引起的遗传疾病⁴⁸。这些基因中的缺陷导致胶原IV网络的异常装配和小球和血管基底膜的异常形成。Alport患者发展导致肾终末期疾病的进行性肾小球肾炎。在人Alport以及小鼠Col4A3-/-肾组织中观察到α_vβ₆的显著 上调。在Col4A3-/-小鼠肾中，α_vβ₆的表达增加在小管上皮中特别显著，在其中它在SMA阳性细胞广泛扩充和胶原沉积之前，且与之伴随。基于这种表达模式，假设α_vβ₆在响应损伤的上皮周期早期变得上调，且可能是持续性上皮损害背景中的纤维化起始和维持中的重要介质。研究结果显示抗体介导的α_vβ₆阻断可以抑制肾纤维化起始以及早期进展，且抑制其维持。与来自β₆缺陷UUO小鼠模型的先前发现一致⁴⁶，在实验中观察到的α_vβ₆阻断性mAbs的抗纤维化效应与TGF-β活性和表达减少相关。有趣的是，在α_vβ₆mAbs处理后TGF-β和SMA表达的明显减少不仅紧在α_vβ₆阳性细胞附近发生，也可在相对远侧的组织区域中检测。尽管这个发现可能暗示α_vβ₆可以直接或以间接方式促成TGF-β轴活化，所述间接方式例如经由TGF-β表达的旁分泌自体活化，但它不排除α_vβ₆阻断可以经由肾外效应提供保护的可能性，所述肾外效应包括改变全身免疫功能。已评估在α_vβ₆mAb处理4周后小鼠中的许多趋化因子和细胞因子的血清水平以及外周血群体，和没有发现显著变化。此外，使用α_vβ₆mAb处理或β₆基因遗传敲除，通过免疫组织化学只检测到Col4A3-/-肾（小鼠）肾中最低限度的单核细胞变化。评估使用α_vβ₆mAb处理或移植研究的免疫系统功能状态的进一步研究可以更完全地解决这点。 
TGF-β途径误调节和过兴奋已暗示为涉及Col4A3-/-小鼠中肾脏疾病进展的占优势机制⁶。TGF-β线路的一个有趣特征是TGF-β诱导其自身表达的能力，所述特征可以帮助解释这种细胞因子在纤维化区域中的明显优势作用。这增加了α_vβ₆阻断的抗纤维化效应可以至少部分由间接机制介导的可能性。这可以包括通过改变局部炎症和纤维化且干扰后续增加的TGF-β活性对TGF-β表达的下游影响。因为α_vβ₆可以由TGF-β诱导，且促进潜伏TGF-β活化，所以探究在介导Col4A3-/-肾病理学中TGF-β和α_vβ₆之间的功能关联。比较α_vβ₆mAbs和rsTGF-βRII-Ig在Col4A3-/-小鼠肾中对疾病相关转录物表达的影响。这种比较已显示 α_vβ₆依赖性基因与TGF-β的不同功能关联，以及经由α_vβ₆mAbs和rsTGF-βRII-Ig的基因调节模式的紧密相似性。此外，用α_vβ₆阻断性mAbs处理Col4A3-/-小鼠抑制TGF-β的肾表达。这些发现显示抑制性α _vβ₆mAbs的疾病调节效应可以起因于TGF-β功能抑制，可能经由抑制患病组织中α_vβ₆介导的潜伏TGF-β活化。上述数据的一个吸引人的方面是经由α_vβ₆或TGF-β阻断来抑制促炎基因表达。TGF-β具有充分确定的消炎和免疫抑制功能，然而，实验中经由rsTGF-βRII-Ig和抗α_vβ₆mAbs的基因调节模式指示TGF-β在Alport疾病模型中的促炎作用。尽管这种明显促炎效应的实际机制需要进一步研究，但它可以基于TGF-β诱导生长停滞和上皮细胞死亡的已知能力^31，49-51。因为上皮损害提供用于激活针对组织损伤的早期先天免疫应答的重要机制，所以由数据暗示的TGF-β明显促炎作用可以是间接的，且由TGF-β促进的对肾上皮的损伤来介导。根据这种模型，α_vβ₆可以充当TGF-β依赖性上皮重塑机制的重要组分，且其功能在疾病中的误调节可以进一步促进疾病相关组织损伤和炎症。 
研究结果表明α_vβ₆在人肾脏疾病中是高度上调的，且用功能阻断性抗体靶向α_vβ₆可以提供肾纤维化治疗调节的有效新型方法。因为α_vβ₆表达在很大程度上限制于患病组织中的上皮细胞，所以这种方法允许选择性局部抑制TGFβ功能。因为TGFβ在各种细胞和组织类型中表达，且在许多不同内环境稳定过程调节中起重要作用，所以α_vβ₆功能阻断提供在其中α_vβ₆整联蛋白上调的那些疾病中系统抑制TGF-β的可能较安全的可替代方法。 
结论 
α_vβ₆在与炎症和纤维化病理状态相关的人肾脏疾病中是过量表达的。 
α_vβ₆阻断性mAbs在Col4A3-/-（Alport）肾纤维化模型中抑制纤维化。 
延迟处理研究指出α_vβ₆的治疗阻断不仅抑制肾纤维化进展，还可以允许现有的纤维化损害消退。 
β₆遗传敲除在Col4A3-/-小鼠中导致保护。 
肾组织转录特征显示α_vβ₆阻断性mAbs显著抑制在纤维化和炎症介质表达中的疾病相关变化。 
使用重组可溶性TGF-βRII处理产生类似的转录调节模式，暗示共有的α_vβ₆和TGF-β调节功能。 
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实施例14：鼠类3G9（mu3G9）在肾纤维化小鼠单侧输尿管梗阻模型中的功效 
概述 
单侧输尿管梗阻（UUO）是良好建立的肾损伤动物模型，导致加速的肾小管间质性纤维化。尿路梗阻在输尿管和肾小管中产生增加的管腔内压力，这导致肾实质损害。UUO的特征在于肾积水、小管扩张、肾小管凋亡、进行性肾萎缩、间质细胞浸润、肾TGF-β和肾间质性纤维化增加。 ¹整联蛋白α_vβ₆功能可以参与TGF-β活化和上皮至间充质转化的过程。因为这些过程促成疾病进展，所以UUO模型用于评估抗α_vβ₆单克隆抗体mu3G9和重组可溶性鼠类TGF-β受体II型Ig融合蛋白（rsTGF-βRII-Ig）针对快速进行性肾纤维化的功效。对于10天的实验过程用mu3G9以4mg/kg腹膜内每周给药3次，平滑肌肌动蛋白染色的平均抑制百分比为32％。 
引言 
进行性纤维化是导致肾终末期疾病发展的共同过程，且通过上皮重塑、成纤维细胞活化、炎症和与细胞外基质（ECM）的细胞相互作用的再组织得到促进。促成这些事件的分子机制是复杂的，且包括TGF-β轴误调节、异常ECM重塑、和整联蛋白超家族细胞粘附受体的表达和功能改变^2-9。近期研究已显示几种整联蛋白和相关分子在肾上皮和间充质细胞中的重要调节功能^8，10-13。 
表达在肾脏疾病中强烈增加的整联蛋白中有TGF-β诱导型整联蛋白α_vβ₆^3,14,15。α_vβ₆表达一般限制于上皮细胞，在其中它在正常成人组织中以低水平表达且在发育、损伤和瘤形成期间升高^14,16-18。尽管α_vβ₆在健康成人肾中以相当低水平表达，但它的表达在发展中的小鼠肾中是显著的，特别是在近端小管、亨利氏袢和收集管中^16，17,19。近期，已报道了关于各种形式的人肾病理学的α_vβ₆表达升高¹⁵。 
与α_vβ₆在体内组织重塑期间表达增加一致，α_vβ₆整联蛋白在培养上皮细胞中的表达可以由细胞因子诱导，所述细胞因子调节上皮重塑，包括EGF和TGF-β^3，14。此外，在转基因小鼠皮肤中过量表达的β₆已显示激发形成自发性长期创伤²⁰，暗示α_vβ₆可能在上皮组织重塑调节中起 重要作用。 
关于α_vβ₆的已知配体包括纤连蛋白、腱生蛋白、以及潜伏相关肽1和3（LAP1和LAP3），潜伏前体形式的TGF-β1和-β3的N末端片段^21－25。作为与这些配体结合的结果，α_vβ₆可以介导细胞粘附、扩展、迁移、和潜伏TGF-β活化。TGF-β合成为被切割的潜伏蛋白质，且与N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP与鼠类活性C末端TGF-β细胞因子非共价结合。潜伏TGF-β复合物不能与其同类受体结合且因此保持生物学无活性，直至通过几种可替代机制之一转变成活性形式，所述可替代机制包括通过蛋白酶切割、暴露于低pH或电离辐射、和潜伏复合物中的构象变化允许其与其同类受体结合^26－29。激活构象变化可以由α_vβ₆诱导，包括整联蛋白与包含在LAP1和LAP3内的RGD基序直接结合。这种结合使TGF-β前体转变成受体结合感受状态^22,25。这些发现暗示上皮细胞表面上的α_vβ₆表达上调可以导致局部TGF-β活化，随后为旁观者细胞中的TGF-β依赖性事件的旁分泌活化。 
因为TGF-β已暗示为肾纤维化的关键调节物，所以假设它由α_vβ₆局部活化可能是肾脏疾病发作和进展中的重要过程，且α_vβ₆功能阻断可以抑制肾纤维化发展。在本文所述研究中，显示α_vβ₆在肾纤维化小鼠单侧输尿管梗阻模型中是显著上调的。显示阻断配体结合和α_vβ₆的TGF-β活化功能的mAbs³⁰抑制这种模型中的纤维化。 
材料和方法 
1.动物。在该研究中使用雄性8－12周大的25.5±0.2g无病毒抗原的C57BL小鼠（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）。动物饲养在Biogen Idec无病毒实验动物实验室的通风隔离笼架中，且允许在研究开始前适应7天。适应和实验期间自始至终小鼠随意使用被照射的标准小鼠食物（LabDiet5P75RMH3000）和无菌水。每隔一段时间测量体重作为动物健康监控的一部分。 
2.抗体和试剂。α_vβ₆mAbs如本文所述和先前所述³⁰产生。人/小 鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分别的亲本杂交瘤总RNAs产生，其中恒定区引物CDL-739用于重链和CDL-738用于轻链，使用First Strand cDNA合成试剂盒（Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ）。重和轻链可变区基因通过聚合酶链式反应进行扩增，使用用于cDNA合成的相同3'引物、和对大多数鼠类抗体基因信号序列（在检索后可获得的序列）特异的简并引物库、以及Pfu DNA聚合酶（Stratagene，La Jolla CA）。将克隆的重和轻链可变区连接到具有人IgGl恒定区的哺乳动物表达载体内。重组可溶性鼠类TGF-β受体II型-Ig融合蛋白（rsTGF-βRII-Ig）如先前所述¹¹产生，且购自R&D Systems（532-R2，Minneapolis，MN）。 
3.免疫组织化学。将组织切片在二甲苯和乙醇中去石蜡化、在蒸馏水中再水合、且随后浸入包含0.45％H₂O的甲醇中。组织与胃蛋白酶（00-3009，Zymed，San Francisco，CA）一起温育，且用抗生物素蛋白和生物素（SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA）封闭。初级抗体在包含0.1％BSA的PBS中稀释，且使组织于4℃温育过夜。为了免疫染色小鼠组织上的β₆，切片与人/小鼠嵌合型抗α_vβ₆mAb－2A1³⁰，和抗人生物素化次级抗体（PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起温育。为了免疫染色鼠类组织上的β₆，2A1³⁰和抗小鼠-生物素化次级抗体（PK-6102，Vector Laboratories）一起温育。将抗生物素蛋白-生物素复合物-辣根过氧化物酶（PK-6102，Vector Kit））应用于切片、在室温下温育30分钟，且如示的（SK-4100，Vector Laboratories）制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物，且于室温应用于切片5分钟。组织切片用Mayer's Hematoxylin染色1分钟且在水和PBS中漂洗。 
4.单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化。关于该研究的手术经过2天的时间段进行，且关于小鼠的给药方案相对于输尿管结扎当天安排时间。左输尿管在氯胺酮：甲苯噻嗪（1000：10mg/kg皮下）麻醉下经由左中线（left-of-midline）剖腹术无菌分离。将2条紧密的咬合6-0结扎丝线置于输尿管的肾较低极水平上，且在结扎线之间切割输尿管。腹壁用 4-0Vicryl缝线缝合，且皮肤用4-0尼龙缝合。允许动物在热垫上恢复，且在第0和1天皮下给予0.05mg/kg丁丙诺啡，一天2次。从手术前当天开始，动物用mu3G9每周给药3次或用sTGF-βRII-Ig每周给药2次。该操作由先前描述的报道修改³¹。 
5.组织样品收集和关于疾病指示剂的组织学分析。动物在结扎后第10天时用二氧化碳实施安乐死。取出2个肾（左侧结扎，右侧未结扎）且穿过肾盂中心横切平分。将每个肾的一半加入10％中性缓冲的福尔马林中用于固定组织染色。将每个肾的另一半置于15％蔗糖中，随后为30％蔗糖用于免疫组织化学染色平滑肌肌动蛋白。 
福尔马林固定的肾切片对于胶原含量用Masson's三色染色法进行染色，和对于结构解剖学用H&E进行染色。三色染色的切片使用leica Qwin图像分析系统在通过亮视野显微术捕获的图像中进行形态测量定量。图像使用标准化照明条件和数码相机曝光设定进行捕获，对于背景进行校正，和对距离标准进行校准。 
设定阈值以检测关于Masson's三色染色载玻片中的胶原染色的深蓝色。胶原面积在200X时获取的图像中进行分析。从每个动物获取覆盖整个左肾切片的邻接视野的图像用于定量。 
6.统计分析。每个测量视野中的胶原含量表示为200X视野内的组织总面积百分比（排除任何空白），即蓝色面积％。测量来自每个肾的16－35个个别视野。这些包括来自切片的所有皮质和髓质组织且排除肾乳头。对于每个动物计算从左侧结扎肾的所有视野中获取的平均蓝色面积％，且充当动物的纤维化得分用于统计检验。几个处理组中蓝色面积％的处理相关差异的统计学显著性通过单因素方差分析来测定，随后为Student-Newman-Keuls方法用于配对多重比较。当p<0.05时认为差异是统计上显著的。 
结果 
1.α_vβ₆在UUO后的肾中的表达。α_vβ₆整联蛋白在UUO后的肾中 的表达通过免疫组织化学分析来检查。在未损害（正常）肾中检测到最低限度的α_vβ₆表达，而在UUO后第7、10和14天时显示显著上调的表达（图41）。在UUO后早至3天时测量到可检测的表达。 
2.使用mu3G9处理在UUO肾中抑制平滑肌肌动蛋白的免疫染色。鼠类UUO模型中的纤维化程度通过组织形态测定术分析免疫组织化学α平滑肌肌动蛋白染色（褐色染色）或Masson's三色胶原基质染色（蓝色染色）来测量。在每个研究中，在接受媒介物或同种型对照mAb（阴性对照组）的UUO小鼠中、在接受测试处理处理的组中、和未结扎的正常小鼠中测定由纤维化占据的组织面积比例。通过计算阴性对照和测试处理之间的染色面积差异超过阴性对照和未结扎正常小鼠之间差异的比率，疗效表示为Masson's三色胶原基质（蓝色）染色或平滑肌肌动蛋白（褐色）染色抑制百分比。 
为了使多项研究中的结果关联的目的，疗效表示为α平滑肌肌动蛋白染色抑制百分比。对于10天的实验过程在4mg/kg mu3G9腹膜内每周给药3次时，平滑肌肌动蛋白染色的平均抑制百分比为32.8％。而rsTGF-βRII-Ig显示在2mg/kg时平均抑制13.2％（表14.1）。 
表14.1.来自多项研究关于mu3G9和rsTGF-βRII-Ig组合数据的α平滑肌肌动蛋白染色的平均抑制百分比。 

腹膜内给药3次/周，共10天 
关于每个剂量时的个别小鼠参见表14.8 
表14.2.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-4平均抑制百分比。 

表14.3.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-6平均抑制百分比 

表14.4A.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-7平均抑制百分比 

表14.4B.Masson三色染色的UUO-7平均抑制百分比 

表14.5.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-8平均抑制百分比 

表14.6.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-9平均抑制百分比 

表14.7.平滑肌肌动蛋白染色的UUO-14平均抑制百分比 

表14.8.在用mu3G9或rsTGF-βRII-Ig处理的个别动物中平滑肌肌动蛋白免疫染色的抑制百分比 



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实施例15：抑制性抗α_vβ₆在辐射诱导的肺纤维化鼠类模型中的用途 
引言 
当紊乱的基质重塑因肺损伤而起时发生肺纤维化（Chapman2004）。在肺纤维化失调的许多信号因子中，细胞因子TGFβ其特别重要的作用。在动物模型中，TGFβ信号抑制预防了肺、肾、肝和皮肤中的纤维化。 
细胞内处理后，TGFβ及其前结构域作为非共价结合的复合物分泌（Annes，Munger等人2003）。与其前结构域结合的TGFβ是潜伏的，即它不能与TGFβ受体结合；因此前结构域被称为潜伏相关肽（LAP）。除了充当TGFβ抑制剂，LAP经由二硫键与潜伏TGFβ结合蛋白（LTBP）家族的蛋白质相互作用。LTBPs是基质蛋白且使潜伏TGFβ固定在ECM中。从LAP中释放TGFβ，称为潜伏TGFβ活化的过程，是TGFβ信号途径中的必需步骤。活化步骤是关于减少TGFβ信号策略的潜在靶。 
整联蛋白α_vβ₆和α_vβ₈通过与RGD氨基酸序列相互作用来激活潜伏TGFβl和TGFβ3，所述RGD氨基酸位于分别的LAPs的C末端附近（Munger，Huang等人1999；Annes，Rifkin等人2002；Mu，Cambier等人2002）。（TGFβ2－最终的TGFβ同种型，没有RGD序列且不能被这些整联蛋白活化）。在肺内，TGFβ经由整联蛋白α_vβ₆活化在内环境稳定中起非多余作用且响应损伤。α_vβ₆在正常肺上皮中以少量表达但在损伤后快速上调。作为TGFβ信号减少的结果，缺乏β₆基因（Itgb6-/-）的小鼠发展肺炎症和肺气肿。小鼠肺暴露于博来霉素引起急性肺损伤，伴随α_vβ₆表达大量增加，随后为TGFβ依赖性肺纤维化；Itgb6-/-小鼠在博来霉素处理后不发展肺纤维化。 
电离辐射引起肺纤维化（Franko和Sharplin1994；Movsas，Raffin等人1997；Martin，Lefaix等人2000；Abratt，Morgan等人2004）。与其中纤维化在肺损伤后数天内开始的博来霉素肺纤维化模型形成对照，辐射诱导的肺纤维化（RILF）在损伤后数月开始。鼠类RILF是品系依赖性的；在这些实验中使用的C57BL/6品系是敏感性的。在鼠类RILF模型中，还存在大约在纤维化发展时发生的大量晚期死亡率；这种死亡率很可能是由于肺灌注丧失（Franko，Nguyen等人1996；Haston，Zhou等人2002）。抑制性抗α_vβ₆mAb（3G9）已被开发（Weinreb，Simon等人2004）。这些研究的目标是：（1）通过比较Itgb6+/+和Itgb6-/-对胸部辐射的应答，在敏感性小鼠品系中建立α_vβ₆依赖性RILF，（2）通 过用TGFβ拮抗剂（可溶性TGFβ受体）处理辐射小鼠证实TGFβ依赖性鼠类RILF模型，和（3）评估给予的各种剂量3G9对辐射小鼠的效应。 
材料和方法 
1.动物。使用的所有小鼠都是雌性的。Itgb6-/-小鼠是来自Dean Sheppard，UCSF的赠予，且在C57BL/6背景上饲养在我们实验室。野生型小鼠是购自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）的C57BL/6，在到达时7－9周大，且在辐射之前允许在我们的动物实验室中适应一周。所有动物处理操作和实验得到纽约大学医学动物管理委员会（New York University School of Medicine animal care committee）的支持，且符合NIH关于实验动物管理和使用指南。笼限制于最多5只小鼠/笼/动物实验室方案。每天监控小鼠的发病率和死亡率。垂死小鼠被处死。 
2.抗体。2种抗体从Biogen Idec（Cambridge，MA）获得，且如本文其他地方所述进行制备。测试的初级抗体3G9是阻断α_vβ₆介导的TGFβ活化的抗α_vβ₆mAb。它是IgGl亚型且以阳离子非依赖性方式结合α_vβ₆。对照Ab（1E6）是不与小鼠LFA-3相互作用的小鼠抗人LFA-3IgGl单克隆Ab。在正常小鼠中高达200mg/kg/周的这种对照Ab剂量4周已显示没有毒性（数据来自Biogen Idec）。抗体等分试样在无菌PBS中制备为稀释物，以在200微升的总体积中达到0.3、1、3、6和10mg/kg的剂量。取决于实验，在右胁腹中的皮下注射或腹膜内注射在照射后15周时开始。 
3.辐射方案。小鼠在8－10周大时被照射。在照射前，使用阿佛丁（2，2，2-三溴乙醇；Acros Organics，NJ）用腹膜内递送的15μl/g2.5％溶液实现麻醉。小鼠随后仰卧放置以胶带粘紧在树脂玻璃表面上。合适放置铅遮板使辐射限制于胸部。从肺顶水平到剑突的领域是1.8cm。使用⁶⁰Co来源递送14-Gy辐射。源皮间距是65cm。使用这种来源的照射时间是～11分钟。射线照射后，将小鼠送回笼中且面向上放置且在恢复期间进行监控。 
4.来自被处死小鼠的样品收集。照射后存活预定时间点（对于抗体研究为26、28或32周）的小鼠被处死，且以下述方式进行加工。用阿佛丁获得深度麻醉后，在胸部和腹部皮肤上喷射70％的乙醇。通过横膈膜打开胸腔。从心室中直接抽吸400－500μl血液。气管被暴露且插入22-计量血管导管。肺用700-μl等分试样的PBS灌洗2次。右主支气管干在门处进行结扎，且取出每个叶并置于分开管中，在液氮中快速冷冻，且贮藏于－80℃。用400μl10％福尔马林使左肺膨胀，置于10％福尔马林中过夜，且包埋在石蜡中。在被处死时获得的支气管肺泡灌洗（BAL）流体分成2个等分试样：200μl和剩余部分。2个管在2000RPM下离心3分钟。合并来自2个管的上清液，在液氮中冷冻且贮藏于-80℃。来自较大管的细胞团块进行速冻（snap-frozen）且以相同方式贮藏。200-μl等分试样的细胞团块用200μl RBC裂解缓冲液重悬浮且充分混合。50μl用于血球计中的细胞计数。剩余150μl用于细胞离心涂片制备。通过心脏穿刺获得的血液用于如下制备血清或血浆。在Capiject管或肝素化1.5cc微量离心管中最初混合后，样品在14,000RPM下离心20分钟。取出上清液且立即冷冻至-80℃。 
5.来自被发现死亡或垂死小鼠的样品收集。在达到处死日期前被发现死亡或垂死的小鼠被解剖以获得肺样品。垂死小鼠在解剖前用阿佛丁实施安乐死。通过横膈膜打开胸腔。使用完全暴露进行直至气管的解剖。用22-计量血管导管插入气管。用800－1000μl10％福尔马林使肺膨胀。胸腔内容物被全部取出且在肺分离和石蜡包埋之前置于10％福尔马林中至少24小时。 
6.细胞分化。细胞离心涂片制剂通过DiffQuik方法（15秒顺次浸入固定剂、1％曙红Y、1％天蓝A、和去离子水中）进行染色。载玻片随后进行脱水和固定。在2个分开高倍（400x）视野中人工计数嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目。 
7.免疫组织化学。某些福尔马林固定样品用于β₆的免疫组织化学 检测。内源性过氧化物酶活性用3％过氧化氢在甲醇中猝灭15分钟，且抗原恢复通过应用Digest-All3Pepsin（Zymed，South San Francisco）5－7分钟来完成。根据制造商的说明书使用抗生物素蛋白/生物素阻断溶液（Vector Laboratories，Burlingame，CA）。用0.5％酪蛋白溶液阻断15分钟。由克隆到人IgG内的小鼠抗β₆mAb可变区组成的抗β₆单克隆抗体ch2A1（Biogen Idec），以在0.1％BSA中1：500的稀释度于室温使用1小时。检测使用Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories），根据制造商的指导用抗人次级抗体来完成。色原体产生使用DAB试剂盒（Sigma，St.Louis，MO）来完成，随后为苏木精复染。操作特异性通过在常规进行的平行处理切片中省略初级抗体，和通过在来自Itgb6-/-小鼠的肺切片上、产生阴性结果的预测试来证实。 
5.肺切片、三色染色、和纤维化百分比测定。福尔马林固定、石蜡包埋的肺横断切开至5微米厚度。肺切片通过视觉估计在门处或附近获得。载玻片进行去石蜡化至去离子水（二甲苯浴x2，各3分钟，100％乙醇x2，各3分钟，95％乙醇x2，各3分钟，70％乙醇x3，各3分钟，去离子水x3分钟）。切片用Masson's三色染色法（Bouin's溶液过夜至媒染剂，Weigert's铁苏木精5分钟，Biebrich's猩红酸Fucshin5分钟，磷钨酸/磷钼酸溶液5分钟，苯胺蓝溶液5分钟，在中间去离子水漂洗，和1％乙酸2分钟）进行染色。玻片随后进行脱水（70％乙醇，95％乙醇，100％乙醇，和二甲苯），且使用Permount进行固定。 
使用由Haston等人（Cancer Res2002，62：372-8）描述的纤维化百分比技术。获得三色染色肺切片的低倍（2-3X）图像且以数字形式保存。通过光显微术进行肺切片的高倍（100-200X）人工检查，以鉴定纤维化区域（由胶原沉积增加和结构丧失来定义）。使用NIH Image1.62软件在数码图像上描绘肺切片的纤维化横断面积连同横断总面积轮廓。纤维化面积总和除以肺总面积以确定纤维化百分比。当与10个随机切片比较时，肺的1个随机横切面已显示反映整个肺中的纤维化百分比 （Haston，Amos等人1996）。 
9.羟脯氨酸测定法。羟脯氨酸含量测量由Reddy和Enwememka的方法修改。取出右肺并进行称重。肺组织（约20mg净重）在400μl2N NaOH溶液中温育12小时（室温），随后均质化。组织匀浆和标准羟脯氨酸溶液通过加热至120℃30分钟进行水解。将氯胺T溶液（0.056M，450μl）加入50μl水解产物中，且允许氧化进行25分钟。加入Ehrlich's试剂（1M，500μl）且允许颜色于65℃发展20分钟。随后测量550nm处的吸光度。终浓度表示为μg羟脯氨酸/mg净肺组织。 
10.RV/LV质量比测量。用于这个实验的小鼠在辐射后32周时被处死的股中；另外7只未受照射的C57BL/6小鼠用作对照。来自被照射小鼠的心脏来自在28－32周之间死亡的小鼠或存活至32周时被处死的小鼠。将心脏固定在福尔马林中。在解剖显微镜下，取出心房，且解剖不含左心室和隔膜（LV）的右心室游离壁（RV）。对每片心室组织进行称重，且计算比率。7只未受照射的C57BL/6小鼠用作对照。 
11.统计学。对于非参数数据使用曼-怀二氏检验进行组之间的纤维化百分比差异的统计学显著性。记录死亡日期且用于产生卡普兰-迈耶曲线。个别组比较以及卡普兰-迈耶曲线总比较使用时序（Mantel-Cox）检验来进行。报道测量平均值与相应平均值的标准误或标准差。为了比较RV/LV质量比测量的平均值，使用斯氏t检验（未配对，2尾）。使用弗氏精确检验比较Itgb6-/-和Itgb6+/+小鼠中纤维化的存在或不存在。统计学显著性定义为p<0.05。 
结果 
1.鼠类RILF需要α_vβ₆表达：在胸部辐射后比较Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠。这个实验设计为比较基线时和辐射后的α_vβ₆表达，且测定α_vβ₆缺乏是否预防纤维化。在28周之前的各个时间点上和在28周时照射Itgb6-/-和Itgb6+/+小鼠且将其处死。 
（a）β₆在照射后18－20周时上调。如通过免疫组织化学测量的， 在照射后18周前被处死的小鼠具有正常、低α_vβ₆表达。然而，在18周时，可见遍及肺泡上皮广泛增加表达的β₆（图42）。 
（b）高α_vβ₆表达在纤维化区域中持续。与照射后的时间无关，在纤维化损害内的上皮细胞中一贯地观察到高水平的α_vβ₆表达（图43）。 
然而，在18周时注意到的广泛增加表达的α_vβ₆在稍后时间点上通常更不明显（图43，比较24周和27周）。 
（c）缺乏α_vβ₆的小鼠不发展RILF。在对照小鼠中，纤维化区域可以辨别的最早时间点是照射后20－22周（未显示）。纤维化区域一般是良好区分和胸膜下的。在来自照射后27周被处死的Itgb6-/-小鼠的肺切片中没有发现任何纤维化区域（N=17）。相比之下，在来自21/23Itgb6+/+小鼠的切片中发现纤维化区域，这是统计上显著的差异（p<0.001，双尾费氏精确检验）（图44）。来自Itgb6+/+小鼠（照射后27周）切片的纤维化区域的平均百分比是17％+/-3％。通过测量来自照射后27周Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠的肺的羟脯氨酸含量证实组织学发现（图45）。 
（d）α_vβ₆缺乏不影响肺照射后的存活。14Gy胸部辐射后，死亡率直至照射后18周时是可以忽略的，且在照射后约25周时达到50％。在Itgb6+/+和Itgb6-/-小鼠的存活曲线之间没有显著差异（图46）。 
2.3G9（0.3、1和1,10mg/kg/周腹膜内给药）和可溶性TGFβR在鼠类RILF模型中的效应。先前研究指出RILF依赖于α_vβ₆整联蛋白的表达，和缺乏α_vβ₆不会使照射后的死亡率恶化。对于α_vβ₆的需求与其作为潜伏TGFβl激活物的已知功能一致。这些结果还暗示α_vβ₆抑制作为抗纤维化策略的可行性。为了测试这个想法，和证实RILF鼠类模型是TGFβ依赖性的，用对照Ab－可溶性TGFβ受体，或3种3G9剂量之一处理被照射的小鼠（N=27/组）。较少数目的小鼠（N=15）单独用PBS注射（200μl）进行处理。3G9以0.3、1和10mg/kg的剂量使用，对照Ab以10mg/kg使用和可溶性TGFβ受体以5mg/kg使用。处理在照 射后15周时（α_vβ₆上调前约3周）开始，且每周继续1次直至照射后26周处死时（关于细节参见方法）。 
（a）3G9和可溶性TGFβ受体减少纤维化。所有存活小鼠在照射后26周时被处死。尽管与对照比较0.3-mg/kg组没有显示纤维化％减少，但1-mg/kg组纤维化显著减少。尽管可溶性TGFβ受体和10-mg/kg组同样显示比对照更少的纤维化，但在仅被处死的小鼠的分析中这个结果没有达到统计学显著性（图47）。可能在计划处死时间点之前死亡的小鼠在生物学上不同于存活小鼠。因此对在研究期间死亡或被处死的所有小鼠进行类似分析。当考虑所有小鼠（被处死和在处死前濒死的小鼠）时，与对照比较在1-mg/kg、10-mg/kg和可溶性TGFβ受体组中存在明显更少的纤维化。与对照比较0.3-mg/kg组再次没有显著差异（图48）。 
（b）10-mg/kg剂量的3G9引起嗜中性粒细胞和淋巴细胞性肺泡炎。与对照比较，在10-mg/kg组中对所有被处死的小鼠进行的BAL显示嗜中性粒细胞和淋巴细胞百分比增加（图49）。其他组没有显示类似增加。 
（c）经由较低剂量抗体的α_vβ₆阻断不影响肺照射后的存活。当比较所有组时，在存活中没有显著差异（p=0.088；通过时序Mantel-Cox检验比较所有组）。然而，在10-mg/kg组中朝向死亡率增加的趋势很明显（图50）。如果只比较10-mg/kg/周和对照组（即，没有关于多重比较的校正），那么存活曲线之间的差异是统计上显著的。 
3.3G9（1、3、6和10mg/kg/周皮下给药）在鼠类RILF模型中的效应。先前研究指出鼠类模型中的RILF是TGFβ介导的，且经由1mg/kg和10mg/kg剂量的3G9显著减少。然而，在10-mg/kg剂量时存在增加的肺泡炎症和朝向死亡率增加的趋势。在这个实验中，评估了稍后时间点（高达照射后32周）上的纤维化，以测试3G9处理仅仅使RILF发作延迟数周而不是预防它的可能性。同样，为了更好地限定1和10-mg/kg剂量之间肺泡炎症和可能地存活中的差异，测试1－10mg/kg之间的另外剂量。照射了270只小鼠且将其分成相等的组以接受4种3G9剂量之 一（1、3、6和10mg/kg）或对照Ab（10mg/kg）。处理在照射后15周时开始，且每周继续1次至稍后的处死日期。该实验用间隔约1个月被照射的2组小鼠来进行。在一个组中，在它们存活至照射后28周时（组1），开始处理的小鼠被处死，和在另一个组中，在它们存活至32周时（组2）。抗体皮下给予（不是与先前实验中一样的腹膜内）。 
（a）1、3、6和10mg/kg剂量的3G9减少纤维化。与对照比较，在接受3G9的所有组中观察到纤维化水平显著减少（p<0.01）。这些差异对于被发现死亡或垂死的小鼠、在最后时间点上被处死的小鼠、和所有组合的小鼠是显著的（图51）。 
（b）剂量较高的3G9引起嗜中性粒细胞和淋巴细胞性肺泡炎。与对照比较，在3-mg/kg、6-mg/kg和10-mg/kg组中，对所有被处死的小鼠（N=101）进行的BALs显示更高百分比的嗜中性粒细胞和淋巴细胞（图52）（p<0.02）。同样，与1-mg/kg组比较，在10-mg/kg组中存在显著更高的百分比（p<0.001）。定性地，在更高剂量时可见“泡沫状”巨噬细胞（与在Itgb6-/-小鼠中可见的那些相同）和细胞碎片数量增加（图53）。 
（c）剂量6mg/kg的3G9与存活减少相关。与1-mg/kg和3-mg/kg组比较，对照组之间在死亡率中没有差异（图54和55）。然而，与对照比较，在6-mg/kg组中死亡率明显更高（p<0.05）。与对照小鼠比较，10-mg/kg组没有存活减少。6-mg/kg/周3G9组在28周处死（组1）和32周处死（组2）股中具有更差的存活，尽管差异在28周组中更显著（图54和55）。 
（d）肺照射对RV/LV质量比和肺灌注的影响。先前研究暗示在肺照射后纤维化期间的死亡是由于呼吸性窘迫，所述呼吸性窘迫起因于空隙梗阻（主要是由于纤维化）和肺泡灌流丧失的组合（Sharplin和Franko1989）。灌注丧失应当导致肺动脉压过高和右心室肥大，和增加的RV质量已在这种模型中被报道。测量了存活至32周的小鼠和相同股中在 28－32周之间死亡的小鼠的RV/LV质量比。与存活小鼠和未受照射的小鼠比较，死亡小鼠具有显著增加的RV/LV比（图56）。此外，在死亡的某些小鼠中，注意到肺泡壁中完全缺乏红细胞的不同区域，这个发现指示肺泡灌流的完全丧失（图57）。 
讨论 
TGFβ已知为促纤维化介质。先前工作显示整联蛋白α_vβ₆激活潜伏TGFβ1和TGFβ3，和Itgb6-/-小鼠被保护不受博来霉素诱导的肺纤维化。本文呈现的结果指出Itgb6-/-小鼠也被保护不受辐射诱导的肺纤维化。这些结果提供了靶向α_vβ₆整联蛋白的抗纤维化治疗原理。 
在这些研究中发现以1mg/kg/周和更高剂量施用的3G9一贯地且有效减少RILF。更高的剂量，特别是6－10mg/kg/周的剂量与BAL流体中嗜中性粒细胞和淋巴细胞百分比增加相关。这些变化与Itgb6-/-小鼠的表型一致，且暗示这些3G9剂量抑制α_vβ₆介导的TGFβ活化至动物表型模拟敲除的程度。 
此外，更高的3G9剂量不定地与鼠类RILF模型中的存活减少相关。在第一种试验中，使用10-mg/kg/周剂量存在死亡率增加的强烈趋势，而在用1或0.3mg/kg/周处理的小鼠中则没有。在第二种试验中，在6-mg/kg/周组中存在死亡率增加，而在其他组中则没有（包括10mg/kg/周）。尽管剂量/应答中的差异原因不明，但一般结果是在测试的最高剂量时存活减少的趋势。 
在RILF模型中发生的死亡看起来是由于呼吸性窘迫。死亡率是品系依赖性和性别依赖性的（Haston，Zhou等人2002）。鼠类RILF模型中的肺机能障碍和死亡率的原因已被广泛研究（Sharplin和Franko1989）。这个研究的作者得出结论肺灌注在辐射后减少，且这种缺乏可能促成死亡率。在辐射诱导的肺纤维化模型中，对辐射诱导的肺纤维化有抵抗力的小鼠同样具有减少的存活。这些小鼠中的肺灌注减少已发现是促成其在这种模型中死亡的主因。灌注缺乏模式取决于品系。在有纤维化趋向 的小鼠中，灌注的完全丧失（如通过胶体碳的存在或不存在判断的，所述胶体碳在处死前30秒静脉内注入）限制于纤维化区域和邻近纤维化损害的偶然小区域。此外，与未受照射的对照比较，在被照射小鼠灌注区域的碳量中存在更大的区域至区域（region-to-region）变异性，暗示具有减少但并非缺乏灌注的大量区域。在多个小鼠品系中可见的肺灌注丧失的其他证据是无损害肺中的小血管数目减少，和如通过RV/LV厚度比评估的RV肥大。肺泡壁中的红细胞数目（评估灌注的不同方法）在被照射的小鼠（A/J品系）中也是减少的。大多数C57BL/6小鼠没有胸膜渗漏。除了C57BL/10J品系外，心肌损伤没有由于照射而发生。 
关于死亡率的观察与Sharplin和的Franko更广泛的观察一致。在对照小鼠中，纤维化的量在死亡小鼠中大于存活至处死的那些（图51），暗示更大的肺机能障碍与死亡相关。死亡的小鼠具有右心室肥大（定义为RV/LV质量指数增加），而存活至处死的小鼠则没有（图56），这个观察暗示肺灌注丧失与死亡相关。在被发现死亡的某些小鼠中，肺泡壁中缺乏红细胞的肺区域在组织学切片上是明显的（图57），与那些区域中的灌注完全丧失一致，且与先前描述一致（Sharplin和Franko1989）。没有发现将是死亡原因的食道机能障碍（瘢痕化、穿孔）的证据，也没有发现心肌坏死。依据先前工作解释的，我们的证据暗示即使当纤维化被阻止时，肺灌注丧失也在C57BL/6小鼠中发生，和肺灌注丧失而不是纤维化是造成死亡的原因。还注意到小鼠更可能在注射（对照Ab或3G9）后的2天期间死亡，暗示处理应激和来自注射的可能额外流体量，促进临界小鼠死亡。 
尽管通过遗传除去丧失α_vβ₆不影响这种模型中的死亡率，但与用较低剂量的3G9或对照Ab处理的小鼠比较，高剂量的3G9（6－10mg/kg/周）与较早期的死亡相关。最明显的解释是较高剂量的3G9使死亡率恶化。然而，不能排除对照Ab和较低剂量的3G9实际上改善存活的可能性。关于3次实验至50％存活的时间比较看起来显示了2个组。在腹膜内实 验中野生型和Itgb6-/-小鼠（图46）、PBS处理和10-mg/kg/周3G9处理小鼠（图50），以及皮下实验中6-mg/kg/周3G9处理小鼠（图54）的平均存活时间为～22.5－25周，而所有其他处理组的平均存活时间为～24.5－30周（图50和54）。关于这点的确定结论是不可能的，因为实验条件不同和其他条件可能已在实验之间改变，引起基线死亡率变化。在用6－10mg/kg/周的3G9处理的小鼠中，在解剖时肉眼检查小鼠或在肺组织学上没有发现会导致存活变化的新异常（除肺炎症外）。RILF模型中较低和较高剂量3G9之间的存活差异原因仍不明了。 
这些研究支持下述结论：推测不会最大限度减少α_vβ₆介导的TGFβ活化的较低剂量3G9，安全地预防鼠类RILF模型中的肺纤维化。 
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实施例16：抗α_vβ₆整联蛋白单克隆抗体在肺纤维化博来霉素模型中的功效 
概述 
用于肺纤维化的目前治疗在很大程度上是无效的且非常需要开发新型疗法。由于TGF-β在驱动特征为肺纤维化的许多病理过程中的关键作用，所以阻断TGF-β途径的试剂是特别感兴趣的，所述病理过程包括成纤维细胞活化和增殖、和细胞外基质分子表达。除了其促纤维化活性外，TGF-β是重要的抗炎细胞因子，且因此TGF-β的治疗抑制应当理想地阻断纤维化而不促进过度炎症。先前工作已显示整联蛋白α_vβ₆是体内TGF-β活化的关键介质，特别是在肺中。α_vβ₆与细胞外间隙中的潜伏TGF-β复合物直接结合，且在许多情况下这种结合是活性形式释放所需的。由于肺中TGF-β信号受损，对于α_vβ₆缺陷的小鼠具有轻度肺部炎症，且对博来霉素诱导的肺纤维化有抵抗力。已开发了阻断α_vβ₆与潜伏TGF-β结合且抑制TGF-β活化和后续信号的单克隆抗体。在本文中我们证实这些抗体在小鼠中减少博来霉素诱导纤维化中有效。如通过支气管肺泡灌洗中的炎症细胞数目测量的，进一步显示在减少肺胶原表达中接近最大的功效可以在不产生另外炎症的剂量时达到。与α_vβ₆缺陷小鼠中可见的一致，同样减少纤维化的更高剂量抗体可以减少炎症。这些发现表明阻断性α_vβ₆介导的TGF-β的促炎和抗纤维化效应在这种模型中是可分离的，和纤维化抑制在比促炎效应更低的剂量时发生。 
引言 
TGF-β1细胞因子对于纤维化起始和维持是关键的，所述纤维化是特征为用过量细胞外基质（ECM）替换患病组织且最终导致器官瘢痕化和衰竭的病理过程。TGF-β1促进成纤维细胞增殖和成肌纤维细胞活化，这负责分泌ECM和维持纤维化过程进展[1-6]。TGF-β1在组织重塑事件中起良好调节的作用，所述组织重塑事件在创伤愈合期间发生；然而，在许多疾病中这种组织重塑过程变得异常且特征在于TGF-β信号上调延长、过量成纤维细胞积聚、ECM沉积、和瘢痕化。TGF-β1在体内纤维化进展中的重要性已通过功能获得研究以及经由阻断来显示[1，7-12]。 在肺中腺病毒和转基因过量表达的各种细胞因子已显示，在不存在显著炎症的情况下TGF-β1在其促进纤维化的能力方面是独特的。促进纤维化的其他细胞因子通常通过上调组织中的TGF-β1表达来达到这点。此外，研究已显示对SMAD3缺陷的敲除小鼠对肺纤维化发展有抵抗力，所述SMAD3是TGF-β信号的介质[13]。使用抗TGF-β试剂的许多研究显示在疾病模型中不受纤维化的显著保护[8，9，11，14-17]。因此，TGF-β1已鉴定为用于治疗与纤维化病理状态相关疾病的潜在治疗靶。 
α_vβ₆整联蛋白已鉴定为TGF-β1活化的关键调节物。TGF-β1合成为被切割的潜伏蛋白质，且与N末端LAP一起分泌，所述N末端LAP与鼠类活性C末端TGF-β细胞因子非共价结合。潜伏TGF-β1复合物不能与其同类受体结合且因此保持生物学无活性，直至通过几种可替代机制之一转变成活性形式，所述可替代机制包括通过蛋白酶切割、暴露于低pH或电离辐射、和潜伏复合物中的构象变化允许其与其同类受体结合[18-21]。α_vβ₆整联蛋白与潜伏TGF-β1复合物中的RGD基序结合，且使其转变成活性形式[18，22-25]。尽管关于TGF-β活化的几种其他机制已被鉴定，但在beta6整联蛋白缺陷小鼠（β₆无效小鼠）中的研究暗示α_vβ₆介导的TGF-β活化是肺和肾中纤维化发展所必需的[18，26]。α_vβ₆在正常成人组织中以低或无法检测的水平表达，但在炎性/纤维化疾病中强烈上调，且一般限制于上皮细胞[27-30]。因此，在组织损伤期间上皮细胞中的α_vβ₆表达上调提供了用于增加TGF-β局部活化和在旁观者细胞中的后续TGF-β依赖性事件的机制。阻断α_vβ₆[31]配体结合提供了用于使TGF-β活化特异性局部限制在其中α_vβ₆表达上调的组织中的方法。这种方法提供了减少与TGF-β途径总体抑制相关的临床安全风险的可能性。 
在本文描述的研究中，显示α_vβ₆在与炎症和纤维化病理状态，包括特发性肺纤维化（IPF）相关的人肺病中是显著上调的。先前研究已表明缺乏α_vβ₆功能的β₆无效小鼠被保护不受博来霉素诱导的肺纤维化 [18]。在本文中显示在各种小鼠品系中且通过纤维化的许多不同测量，阻断配体结合和α_vβ₆的TGF-β活化功能的单克隆抗体有效抑制博来霉素诱导的纤维化。进一步表明肺泡细胞群体在博来霉素损伤的肺中在低有效剂量时不改变，且因此如预期的，抗纤维化作用的机制不通过抑制炎症来介导。只有使用高的频繁给药具有在这种模型中已注意到的另外炎症，与β₆无效小鼠中另外炎症的发现一致。 
材料和方法 
1.试剂。α_vβ₆mAbs如本文其他地方所述和先前所述[31]产生。人/小鼠嵌合2A1和3G9cDNAs由分别的亲本杂交瘤总RNAs产生，其中恒定区引物CDL-739用于重链和CDL-738用于轻链，使用First Strand cDNA合成试剂盒（Amersham/Pharmacia，Piscataway，NJ）。重和轻链可变区基因通过聚合酶链式反应进行扩增，使用用于cDNA合成的相同3'引物、和对大多数鼠类抗体基因信号序列（在检索后可获得的序列）特异的简并引物库、以及Pfu DNA聚合酶（Stratagene，La Jolla CA）。将克隆的重和轻链可变区连接到具有人IgGl恒定区的哺乳动物表达载体内。重组可溶性鼠类TGF-β受体II型-Ig融合蛋白（sTGF-bRII-Ig）如先前所述[32]产生。在所有实验中使用研究级mu3G9、1E6和sTGF-bRII-Ig（在磷酸盐缓冲盐水中的纯化蛋白质）。 
2.动物。 
小鼠。对于使用肺羟脯氨酸作为终末点的实验使用SV129小鼠（Sheppard Laboratory，UCSF）。对于使用组织形态测定术或BAL收集和分析作为终末点的实验使用C57B16小鼠（Biogen Idec）。对于胶原基因表达作为终末点的定量分析，使用转基因报道小鼠（Biogen Idec）。携带在colIα2基因启动子的17kb区域控制下的萤光素酶报道基因的转基因小鼠先前已被描述[33]。通过使转基因雄性与C57B1/6X DBA/2Fl杂种雌性（Jackson Laboratories）交配来维持这些小鼠。选择对于转基因阳性（如通过尾萤光素酶表达所评估的）的后代用于下文概述的博 来霉素攻击实验。 
仓鼠（Giri Laboratory）。重量为90－100g的雄性金黄色叙利亚仓鼠购自Simonsens，Inc.（Gilroy，CA）。仓鼠以4只的组饲养在具有滤过空气以及恒温和恒湿的实验室中。所有管理依照国立卫生研究院动物福利活动健康指南（National Institutes of Health Guide for Animal Welfare Act）。在任何处理前允许仓鼠在实验室中适应1周。维持12小时光/暗循环。 
3.免疫组织化学。将小鼠肺收集到10％缓冲的福尔马林中且依照通常实践进行加工用于石蜡组织学。来自具有纤维化病理状态的肺病患者肺的石蜡组织切片得自G.Davis（U.Vermont）、R.Lafyatis（Boston University）、Ardais Corp.（Lexington，MA）和Asterand Inc.（Detroit，MI）。将组织切片在二甲苯和乙醇中去石蜡化、在蒸馏水中再水合、且随后浸入包含0.45％H₂O的甲醇中。组织与胃蛋白酶（00-3009，Zymed，San Francisco，CA）一起温育，且用抗生物素蛋白和生物素（SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA）封闭。初级抗体在包含0.1％BSA的PBS中稀释，且使组织于4℃温育过夜。对于小鼠组织，切片与人/小鼠嵌合型抗α_vβ₆mAb－2A1[31]，和抗人生物素化次级抗体（PK-6103，Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起温育。 
对于人组织，切片与鼠类2A1[31]和抗小鼠-生物素化次级抗体（PK-6102，Vector Laboratories）一起温育。将抗生物素蛋白-生物素复合物-辣根过氧化物酶（Vector Kit，PK-6102）应用于切片、在室温下温育30分钟，且如示的（SK-4100，Vector Laboratories）制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物，且于室温应用于切片5分钟。组织切片用Mayer's Hematoxylin染色1分钟且在水和PBS中漂洗。所有人组织样品在地方检查机构同意和患者同意下获得。 
3.1在小鼠中的博来霉素滴注。 
SV129品系（D.Sheppard，UCSF）。如先前所述[18]，小鼠用博来 霉素或盐水滴注到气管内。简言之，将年龄和性别相配的8－12周大的129/terSVEMS品系小鼠维持在无特异病原体的环境中。将博来霉素（Mead Johnson，Princeton，NJ）溶解于无菌盐水中（在60ml中0.03或0.05单位）。博来霉素或盐水通过直接切断在甲氧氟烷麻醉下经气管施用。 
C57B1/6品系和胶原报道小鼠（Biogen IDEC）。通过用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪腹膜内注射来麻醉小鼠。使用无菌#15解剖刀在颈部进行0.5－1.0cm中线切口以暴露气管用于目测。气管暴露和通过口腔在气管中放置喷雾尖端后，用Penn Century微喷射装置滴注博来霉素。在对照动物中滴注盐水。滴注后，手术位点用无菌闭合夹来关闭。对于术后痛皮下施用丁丙诺啡0.05mg/kg。 
多种处理方案在这些小鼠博来霉素研究中用于评估测试物品且因此将在结果部分描述。 
3.2在仓鼠中的博来霉素滴注。在戊巴比妥麻醉下，在第0、7和14天时仓鼠用盐水（SA；4ml/kg）或博来霉素（BL；6.5U/4ml/kg）进行IT滴注。动物随机分成6个实验组：SA-滴注，用PBS处理（SA+PBS）；BL-滴注，用PBS处理（BL+PBS）；BL-滴注，在第0天时开始用mu3G9处理（BL+Ab1）；BL-滴注，在第7天时开始用mu3G9处理（BL+Ab2）；BL-滴注，在第14天时开始用mu3G9处理（BL+Ab3）；和BL-滴注，在第0天时开始用1E6处理（BL+1E6）。动物在第28天时被处死，且取出其肺并加工用于羟脯氨酸和脂质过氧化测定法。 
4.关于胶原含量的羟脯氨酸测定法。肺在玻璃管（Fisher#14961）的1ml dH₂0中进行均质化。将125μl50％三氯乙酸（TCA）加入组织匀浆中且在冰上温育20分钟。样品在1000rpm和4℃下离心5分钟。弃去上清液，且将1ml12N HCL加入玻璃管的团块中。样品随后于110℃烘焙24小时（在玻璃烧杯中）。干燥团块用2ml dH₂0复原。制备从0.25mg/ml开始的6个羟脯氨酸标准（Sigma-H6002）。在包含500μl氯胺 T（在0.5M乙酸钠和10％异丙醇中的1.4％氯胺T）的1.5ml Eppendorf管中，加入200μl样品且在室温下温育20分钟。随后，加入500μlEhrlich's/pDMBA（在70％异丙醇和30％高氯酸中的1M p-DMBA（p-二甲氨基苯甲醛）），且于65℃温育15分钟。将100μl最终反应溶液转移至96孔板，对于每个样品进行一式三份测量，且在2小时后于550nm处阅读样品。 
5.组织学指数。对于使用组织形态测定术作为终末点的实验，在处死时在组织学上评估每只小鼠的整个肺。横切面被切割且通过标准常规用Masson's Trichrome进行染色。选择横切面以包括来自每只小鼠肺的多个叶。进行包含完整三色染色切片的高倍（100X）视野摄像（每只小鼠平均约30张）。通过Metamorph6.0.5软件评估每张照片的胶原含量（这在三色染色的组织学切片中呈现蓝色）。通过颜色阈值选择蓝色面积，且表示为组织总面积百分比。 
6.萤光素酶测定法。收集肺并在1ml裂解缓冲液（0.1M KH₂PO₄-ph7.8和1mM DL-二硫苏糖醇）中进行均质化。随后将样品置于冰上10分钟，在12,000rpm和4℃下离心10分钟，且随后将100μl的每种样品转移至Wallac Isoplatter。在加入100μl Luclite底物（Perkin Elmer#601911）前，将样品再次置于冰上15分钟。随后在光度计上阅读萤光素酶活性。 
7.支气管肺泡（BAL）收集和BAL细胞差异染色。小鼠用过度剂量的Inactin（Sigma）腹膜内注射（IP）实施安乐死。主要使用钝器解剖法暴露气管。随后用剪刀在2个软骨环之间打开气管，且将23-计量钝头针插入气管内。通过用Schwartz临时夹（Roboz）轻轻夹住使针保持在原位。通过将不含Ca²⁺或Mg²⁺的0.8ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）注入肺内来进行BAL。随后不应用太多压力将流体收回注射器内，且转移到在冰上的15ml聚丙烯Falcon管内。随后重复该操作，不施加过度负压将BAL流体回吸到注射器内。将样品贮藏在冰上且加工用于细胞计数、分 化，且收集BAL团块和流体且贮藏于-80℃。 
1.BAL随后在180g，1000rpm（Beckman GPR）和4℃下在台式离心机上旋转10分钟。随后取出上清液（BAL流体）且冷冻于-80℃。将1.0ml RBC裂解溶液（Sigma）加入团块中且涡旋20秒。随后进行细胞计数和细胞离心涂片。 
2.将样品贮藏于冰上且使用血球计进行计数，将细胞施加于血球计之后和读数之前允许1分钟以允许细胞沉降。 
3.将l00μl细胞悬浮液在500RPM和室温下细胞离心涂片（ThermoShandon）5分钟。细胞离心涂片制剂通过将细胞溶液放置到细胞离心涂片装置内且在500rpm下旋转5分钟来制备。检查细胞浓度以确保在载玻片上的浓度不是太高。允许载玻片干燥过夜且随后用DiffQuik（Fisher）染色。根据制造商的（DiffQuik）方案来进行染色。载玻片被干燥且用Permount（Fisher）盖上盖玻片后，细胞通过类型进行分类，使用实验室细胞计数器（Fisher）计数随机选择的100个细胞。 
8.统计分析。使用方差分析（ANOVA）在媒介物对照和/或同种型对照、和测试物品之间进行统计比较。当使用ANOVA在p<0.05的概率上确定统计上显著的差异时，通过Dunnet's多重比较检验来评估组间的显著差异。 
结果 
1.α_vβ₆在人肺病和博来霉素模型中的表达。在各种人肺病包括纤维化或炎性病理状态中上调的TGF-β表达和信号已得到描述[20，34]。然而，α_vβ₆表达仅在纤维-炎性肺病的少量样品中得到描述[28]。已评估来自具有肺病患者的41个肺组织样品中的α_vβ₆表达，所述肺病的特征为具有纤维化和/或炎性变化（表16-1）。另外，染色来自癌症患者肺活检的表面上正常区域的肺组织阵列（Imgenex）。α_vβ₆在正常肺中的表达通过免疫组织化学几乎无法检测。在“正常”肺组织阵列上的某些组织切片显示阳性α_vβ₆染色，但那些切片各自同样具有附近的炎性 病理状态。在所有41个患病肺样品中，具有纤维化和/或炎性变化的肺区域显示α_vβ₆表达强烈上调（图58）。α_vβ₆局限于覆盖明显纤维化的区域，或邻近于炎性浸润的区域中的上皮细胞。在一系列纤维-炎性疾病中可见上调的α_vβ₆的存在，所述纤维-炎性疾病包括特发性肺纤维化、硬皮病肺病、和慢性阻塞性肺病。 
为了使表达与特异性病理学变化更好地关联，将染色的组织样品送给外部受过训练的肺病理学家。尽管他不能证实许多商购可得样品（Ardais和Asterand）的病理诊断，但他一贯地指出与非特异性间质性肺炎（NSIP）比较，“对于常见间质性肺炎可见高得多的α_vβ₆染色强度”，所述NSIP是与更少的纤维化和更好的预后相关的病理状态，所述常见间质性肺炎是与纤维化和进行性疾病相关的病理状态。在来自具有UIP患者的所有活检中，在内衬肺泡管和肺泡的II型和I型肺细胞内可见强烈染色，而大的气道在很大程度上是阴性的和肺泡内的巨噬细胞是阴性的。总之，“高水平的染色与纤维化区域和UIP相关”，和在其他纤维化包括NSIP的情况下可见染色强度较低的类似模式。因为UIP是具有特发性肺纤维化（IPF）的患者中占优势的病理状态，所以在具有这种病理状态的患者中强烈过度表达的α_vβ₆暗示它可能在驱动纤维化进展中具有功能作用，所述α_vβ₆是促纤维化细胞因子TGF-β的激活物。 
2.α_vβ₆在小鼠博来霉素模型中的表达。为了证实α_vβ₆在肺纤维化博来霉素小鼠模型中也是上调的，对于在博来霉素滴注后1、5和15天获取的组织切片上α_vβ₆蛋白质的存在进行免疫染色。在第5天时，在受博来霉素攻击损害的肺区域各处的肺泡上皮上，α_vβ₆表达是上调的（图59）。在第15天时，当显著纤维化的区域明显时，α_vβ₆在这些纤维化区域的肺泡上皮中更强烈地上调。 
3.在SV129小鼠中通过羟脯氨酸评估纤维化。在遗传上对于α_vβ₆缺陷（β₆无效）的小鼠先前已显示在SV129小鼠品系中不受博来霉素诱导的肺纤维化的保护[18]。尝试评估抗α_vβ₆单克隆抗体mu3G9在这个 相同品系中减少博来霉素诱导的纤维化的功效。在我们合作者UCSF的Dean Sheppard的实验室中进行一系列4次实验（表16-2）。在第0天时用博来霉素滴注到SV129小鼠气管内，在博来霉素滴注后第0、15或30天时开始腹膜内注射4mg/kg的mu3G9，每周3次。对照小鼠用PBS或阴性对照抗体1E6进行注射。1E6是针对人LFA-3的鼠类IgGl抗体，且不与任何小鼠抗原结合。小鼠在第30或60天时被处死，且通过羟脯氨酸含量评估纤维化，所述羟脯氨酸含量是组织总胶原测量。在4次实验的3次中，mu3G9处理小鼠中的羟脯氨酸存在统计上显著的减少，指示在减少博来霉素诱导的纤维化方面的功效（图60）。只有当处理延迟直至博来霉素滴注后30天时（图60C），与PBS处理或同种型对照处理小鼠比较，mu3G9处理小鼠肺中的羟脯氨酸含量没有显著减少。 
4.在处理46天、博来霉素攻击小鼠中的存活评估。在博来霉素模型中的抗纤维化功效一般与存活改善无关，且因此并未预期存活在mu3G9处理小鼠中得到改善。然而，因为从第15天到60天每周3次用4mg/kg mu3G9处理的这些小鼠（图60D）代表已测试直至那个点的最长处理期（46天），所以分析以察看在那个实验中测试的组的存活中是否存在任何差异。当比较用mu3G9处理的小鼠与用PBS和4B4非阻断性对照抗体处理的那些时，在总体存活中没有显著差异（表16-2）。 
5.在C57B16小鼠中纤维化的组织形态测定术分析。为了证实mu3G9在不同小鼠品系和不同实验室中的抗纤维化功效，在Biogen Idec的一系列实验中使用C57B16小鼠品系评估mu3G9。这种品系经常在博来霉素模型中使用，且产生可以在滴注后14天测量的快速纤维化。在前3次实验中，小鼠在第0天时用博来霉素滴注到气管内，在博来霉素攻击前1天（第-1天）开始用mu3G9每周处理3次，且在第14天时实施安乐死用于肺收集。在第4次实验中，处理延迟直至第14天，且在第28天时收集肺。在这些实验的每一个中（图61），相对于PBS处理的对照，mu3G9一贯地减少了纤维化肺组织百分比，所述纤维化肺组织在组织形态测定 术上测量为Masson's三色染色的组织切片中的蓝色染色区域。在其中1E6mAb用作阴性IgG对照的2次实验之一中，1E6mAb同样显著减少纤维化组织百分比（图61A）。1E6mAb的这种效应在使用羟脯氨酸作为终末点的较早期实验（图60）和延迟处理（第14－28天）实验（图61D）中都没有观察到。总之，多次实验显示mu3G9mAb在C57B16小鼠中减少由博来霉素诱导的纤维化组织百分比方面的功效。然而，由于组织形态测定术终末点的劳动密集性质，所以寻找用于测量纤维化的更快速和定量方法。 
6.胶原-萤光素酶报道转基因作为定量终末点的用途。携带转基因的转基因小鼠先前已用于在纤维化模型中提供胶原表达的定量读出，在所述转基因中萤光素酶报道基因在胶原Iα2启动子的控制下表达[33]；[35]。在14天时，相对于盐水对照，博来霉素攻击小鼠中肺萤光素酶水平的增加为约10倍，使得它成为比羟脯氨酸测量敏感得多的终末点。使用这种系统，进行使用每周一次给药的3G9抗体剂量逐步增加，但包括用4mg/kg处理的小鼠组－在用羟脯氨酸和三色组织形态测定术作为终末点的实验中使用每周3次的给药方案。剂量逐步增加在3次实验中进行评估，其中每次实验具有PBS处理的对照组（n=6、5和6，总共为n=17）。为了校正萤光素酶测量中实验至实验的变化，关于每次实验中所有组的萤光素酶值对PBS对照的平均值进行标准化。博来霉素攻击报道小鼠的mu3G9处理产生胶原萤光素酶报道分子中的剂量依赖性减少（图62），其中在0.3mg/kg的周剂量时可见显著功效和在1－3mg/kg时可见最大功效。 
7.支气管肺泡灌洗细胞组成分析。分析在第2、5、8和11天时博来霉素模型的支气管肺泡灌洗（BAL）细胞群体，以确定纤维化抑制是由于炎症减少还是由于肺中炎症细胞主要亚群中的改变。如预期的，当与盐水滴注小鼠比较时，由于博来霉素的气管内施用存在BAL细胞计数升高。然而，与用同种型对照抗体1E6处理的小鼠比较，时程自始至终在 用有效剂量0.3、1.0、和3mg/kg的3G9处理的小鼠中没有看到BAL细胞总数目，以及巨噬细胞、嗜中性粒细胞或淋巴细胞数目或百分比中的显著差异。随后使用每周3次的处理测试高得多的剂量，所述高得多的剂量起初已用于显示用羟脯氨酸和组织形态测定术终末点的功效。在相对于博来霉素攻击的-1、+1和+3天时，小鼠给予4、20和40mg/kg的3种剂量m3G9。小鼠在第5天时实施安乐死且分析BAL细胞含量。在4mg/kg的剂量（12mg/kg总剂量）时，再一次在BAL细胞总数目和巨噬细胞、嗜中性粒细胞或淋巴细胞数目或百分比中都没有显著变化。在20和40mg/kg剂量（总共60和120mg/kg）时，相对于PBS对照，但不是相对于IgGl对照，在巨噬细胞数目中存在显著增加（图62）。在40mg/kg剂量时，与PBS和IgG对照比较时，BAL中嗜中性粒细胞百分比存在显著增加，尽管嗜中性粒细胞总数目变化没有达到显著性。在非常高剂量（总共120mg/kg）时发生的这种嗜中性粒细胞增加类似于在辐射纤维化模型中使用高剂量、较长期处理（6和10mg/kg处理，3－4个月）可见的那种（参见实施例15）。总之，抗α_vβ₆抗体在低至0.3mg/kg的周剂量时能够减少博来霉素诱导的胶原表达，而总共高达12mg/kg的剂量在这种模型中不产生BAL细胞群体的显著改变。更高的剂量可以产生巨噬细胞总数目和嗜中性粒细胞百分比增加。 
8.在多重博来霉素剂量仓鼠模型中的评估。在仓鼠肺纤维化模型中检查mu3G9的功效，其中在第0、7和14天时气管内给予连续3次博来霉素剂量。3组仓鼠用5mg/kg mu3G9进行处理，每周3次（总共15mg/kg/周），在第0、7或14天时开始。动物在第28天时被处死，且通过羟脯氨酸（图65A）和脂质过氧化测定法（图65B）评估纤维化（在U.California-Davis，Davis，CA进行）。出乎意料地，在这种模型中没有看到纤维化减少方面的功效。在组之一中，仓鼠在第7和14天时开始用mu3G9进行处理，相对于PBS和IgG对照组，小鼠显示在肺羟脯氨酸中统计上显著的增加。与IgG对照组比较，脂质过氧化值没有显著升高。 分析各种处理组的存活曲线以察看这种外观恶化是否对仓鼠存活具有影响。在第0天开始处理的mu3G9小鼠（在图65C中的BL+AB（b）l组）比PBS和IgG对照略微更早地开始死亡；然而，当分别针对PBS和IgG对照比较Bl（L）+Ab1存活曲线时，差异没有显著性（时序检验：p=0.15对PBS和p=0.25对IgG对照mAb）。mu3G9单克隆抗体是否与仓鼠交叉反应是未知的，且可能仓鼠可能已产生针对这种模型中使用的鼠类抗体的抗体应答。由于这种模型中解释结果方面的困难，没有继续不同剂量关于功效的评估，因为在2种不同鼠类肺纤维化模型（博来霉素和辐射诱导的）中可见一致功效。 
表 
表16-1：关于α_vβ₆表达免疫染色的人肺病样品 

表16-2：用mu3G9处理46天的博来霉素攻击小鼠的存活