一种N-甲基吡咯烷酮降解芽孢杆菌NMP-2及其应用技术领域
本发明提供一种N-甲基吡咯烷酮（简称NMP）降解菌及其生产的菌剂，属于生物高科技技术领域，是利用微生物的方法降解废水中的污染物，适用于现代废水处理工艺。
背景技术
N-甲基吡咯烷酮是一种是重要的化工原料，是一种选择性强和稳定性好的极性溶剂，广泛用于芳烃萃取、乙炔、烯烃、二烯烃的纯化，聚偏二氟乙烯的溶剂，锂离子电池的电极辅助材料，合成气脱硫、润滑油精制、润滑油抗冻剂、烯烃萃取剂、难溶工程塑料聚合时的溶剂，农用除草剂，绝缘材料、集成电路制作，半导体行业精密仪器、线路板的洗净，PVC尾气回收，清洗剂、染料助剂、分散剂等。也用于聚合物的溶剂及聚合反应的介质，如工程塑料及芳纶纤维。
N-甲基吡咯烷酮广泛存在于有机合成、农药、染料等生产废水中，目前对于含N-甲基吡咯烷酮废水的处理多采用物理化学方法，其成本较高，且易造成二次污染；而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除N-甲基吡咯烷酮的有效菌种具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发出一种N-甲基吡咯烷酮降解菌株及其菌剂，使用本菌株或菌剂可以降解废水中的N-甲基吡咯烷酮，使废水达标排放，同时降低生产和使用成本。
本发明提供一种消除N-甲基吡咯烷酮污染的降解菌，其菌株是一株革兰氏染色反应阳性菌NMP-2，于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC NO.10544，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。主要生物学特性为G+，对数生长期菌体杆状，具有内生孢子，好氧生长。菌落圆形，不透明，边缘整齐，呈淡黄色；能以N-甲基吡咯烷酮为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮。在实验室摇瓶条件下36h对500mg/L N-甲基吡咯烷酮的降解率达100％。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
本发明提供含有芽孢杆菌NMP-2的菌剂。
本发明提供含有所述芽孢杆菌NMP-2菌剂的生产方法，包括：斜面种－摇瓶诱导－种子罐诱导－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。
所述菌剂的生产方法，具体为：
1）将芽孢杆菌NMP-2的试管种接种于含有500mg/L N-甲基吡咯烷酮的LB培养基中，诱导培养至至对数期；
2）将步骤1）培养好的菌种按5％的接种量接种入500升含有500mg/L N-甲基吡咯烷酮的种子罐，诱导生长至对数期，即种子液；
3）将步骤2）所述种子液按5％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。
步骤1）中所述的LB培养基配方为：500mg/L N-甲基吡咯烷酮，NaCl 10.00g/L,蛋白胨5.00g/L,酵母粉5.00g/L,pH7.0。
步骤2）所述的种子罐所用的培养基质量百分比的配方为：N-甲基吡咯烷酮0.5%，葡萄糖0.8%， K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。
步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为220转/分，培养温度为3℃，步骤2）和3）的整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。
本发明还提供含有芽孢杆菌NMP-2的菌剂在N-甲基吡咯烷酮降解中的应用。
本发明所提供的消除N-甲基吡咯烷酮污染的降解菌NMP-2，实验室生物降解实验结果表明，对500mg/L NMP的降解率达到100％。
该发明生产的降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在含有NMP的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。
附图说明
图1 为菌株NMP-2的菌体结晶紫染色照片（1000x）；
图2为菌株NMP-2利用N-甲基吡咯烷酮的生长降解曲线；
图3为接种量对N-甲基吡咯烷酮降解效率的影响；
图4为温度对N-甲基吡咯烷酮降解效率的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、菌株的分离和鉴定
从含N-甲基吡咯烷酮的废水处理池中得到的活性污泥3.0ml加入N-甲基吡咯烷酮浓度为500mg/L的100ml无机盐液体培养中，其配方为：每升含1.50 g K2HPO4、0.50 g KH2PO4、0.20 g MgSO4×7H2O、1.00 g NaCl、pH 7.0，于160r/min，37℃条件下振荡培养，每隔36h按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。
取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成10-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含N甲基吡咯烷酮的浓度为500mg/L无机盐固体培养基(配方为：每升含1.50g K2HPO4、0.50g KH2PO4、0.20g MgSO4×7H2O、1.00g NaCl、12.00g 琼脂，pH 7.0)上，37℃培养2天。2天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨5.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于12000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入3.0ml的无菌水摇匀，仍于12000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入100ml含N-甲基吡咯烷酮浓度为500mg/L的无机盐液体培养基中，于220r/min，37℃条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。
将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,琼脂20.00g/L, pH7.0, 37℃恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态（1000X），如图1所示。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）；命名为：NMP-2。主要生物学特性为 G+，对数生长期菌体为杆状，具有内生孢子，好氧生长。能以N甲基吡咯烷酮为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮，如图2所示。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
实施例2 实验室生物降解实验
2.1 接种量对N-甲基吡咯烷酮降解效率的影响
NMP-2在LB培养基中培养至对数期后期，按0.1、0.5、1、2、3、4%、5%的接种量分别接入含500mg/LN-甲基吡咯烷酮的无机盐培养基（无机盐培养基配方为：每升含1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、1.0g NaCl、pH=7.0下文同）中，30℃、160r/min摇床培养，72h后取样N-甲基吡咯烷酮的含量，结果如图3所示，测定结果表明，按接种量从低到高排列，N-甲基吡咯烷酮的降解率依次为30％、58％、75％、85％、95％、96%、98％。由此可见，接种量的大小对N-甲基吡咯烷酮的降解效率有直接的关系，当接种量小于2％时，提高接种量，N-甲基吡咯烷酮的降解效率有大幅增加，但接种量达到超过3％时，降解率只有微量提高，可能此时酶反应已接近饱和。
2. 2 温度对N-甲基吡咯烷酮的影响
NMP-2在LB培养基中培养到对数后期，按5％的接种量接到含500mg/L N甲基吡咯烷酮的无机盐培养基中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、40℃的温度下，160r/min摇床培养，72h后测定其中N-甲基吡咯烷酮的含量，结果如图4所示。在15℃时，NMP-2对N-甲基吡咯烷酮的降解率为14％；在20℃～30℃的范围内，随着温度的升高降解菌降解N甲基吡咯烷酮性能明显上升，在30℃时，降解率达98％。而当温度达到37℃时，NMP-2对N-甲基吡咯烷酮的降解率下降为49％。以上数据说明，NMP-2的最适降解温度为30℃，而过低或过高的环境温度会抑制N-甲基吡咯烷酮的降解。
实施例3 生产实施
将本发明的微生物N-甲基吡咯烷酮降解菌NMP-2的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB 培养基(LB 培养基配方 g/L：N-甲基吡咯烷酮0.5，酵母粉 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.00，pH=7. 0)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500 升，投料量400升，（培养基质量百分比的配方为：N-甲基吡咯烷酮0.5%，葡萄糖0.8%， K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。）投料完毕后115℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按5％的接种量接入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后生产罐1. 1kg/cm2的压力下，115℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用，将达到对数生长期的种子液按5％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后菌体数量达到10 亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。