基于压力-响应关系的溶解氧水生态基准验证方法技术领域：
本发明属于环境科学水体保护领域，涉及一种水质基准值的实验室验证方法，特别涉及
将斑马鱼作为受试生物的水质基准验证方法，用于溶解氧生态学基准值的室内验证。
背景技术：
水质基准(Water Quality Criteria)是基于科学实验数据和科学推论而获得的，在特定的
水生态环境中某污染物对特定对象(人或者其他生物)不产生不良影响的最大可接受剂量或
浓度。
水生态基准(Water Ecological Criteria)是水质基准体系中的重要组成部分之一，旨在保
护水生生物及水生态系统使用功能，一般是指对水生生物多样性及水生生态系统结构和功能
的完整性不产生短期及长期有害效应的允许浓度。生态学基准可用于评价水生态系统结构和
功能的完整性，并有助于找出其它水质基准评价分析可能忽视的潜在问题。
美国自20世纪60年代就开始了水质基准的研究和制定工作，建立了包括人体健康基准
(Human Health Criteria)、水生物基准(Aquatic Life Criteria)、沉积物质量基准(Sediment
Quality Criteria)、生物学基准(Biological Criteria)和营养物基准(Nutrient Criteria)在内的
一系列基准指标体系。除美国以外，欧盟、加拿大、澳大利亚荷兰等也分别制定了相应的水
质基准推导方法(PNEC，2003；CCME，1999；ANZECC&ARMCANZ，2000；RIVM，
2001)。近年来，我国学者也对水质基准进行过许多研究，其中参照美国的生物学基准体系和
营养物基准体系，推导了一些化合物的水质基准。前述基准体系的共同点，是其推导方法均
是基于毒理学方法建立的。
然而，毒理学方法的缺点在于忽略了生物的种间关系(共生、共栖、捕食、竞争、寄生
等)和种内关系(种内互助、种内斗争)，因而无法对污染物对于生物群落的效应做出准确的
判断。于是，我国研究人员开发了从生态学角度研究水质基准的生态学基准方法，从生态学
角度建立生态学基准(Ecological Criteria)体系。
溶解氧(Dissolved Oxygen)是指溶于水中的分子态氧，是维持需氧水生生物生存的必要
条件，还是表征水体自净能力的一个重要指标，在水生生态系统中发挥着极为重要的生态学
作用。水体中的溶解氧水平变化，对水生态系统的健康和完整性有直接影响，因而溶解氧的
生态学基准是生态学基准体系中重要的组成部分。
溶解氧水平对于生态系统的影响，可以通过其水平变化对于水生生物的影响来反映。通
过不同的实验，可以观察到溶解氧对于水生生物从个体水平到分子水平的不同影响。
溶解氧在个体水平上对水生生物的影响主要体现在生长、摄食和运动等生理活动上。当
水体出现缺氧现象时，鱼类的各项生理活动也会受到极大的影响，生长摄食等会受到抑制，
甚至能造成生物个体的死亡。
溶解氧对水生生物呼吸代谢的影响，可以表现在对耗氧率和呼吸代谢酶活性的影响上。
对于大部分鱼类来说，在一定的溶解氧范围内，其静止代谢能维持相对稳定的水平，直到溶
解氧下降到某一水平后，其静止代谢会随溶氧下降呈现线性下降的趋势，而鱼类静止代谢急
剧下降时所对应的溶解氧则是该实验鱼的临界氧浓度。当溶解氧低于临界氧浓度时，鱼类无
法维持正常的标准代谢率，其供能系统会受到重大影响，在此环境下，鱼类将很快面临死亡。
另一方面，在溶解氧降低到一定程度时，鱼类不能维持正常的有氧呼吸，进行厌氧代谢是其
适应缺氧环境的重要生理对策，此时动物机体除进行有氧呼吸代谢外，还进行无氧呼吸代谢。
因而，有氧代谢过程中的重要标志酶SDH(琥珀酸脱氢酶)，以及无氧代谢过程中的关键酶
LDH(乳酸脱氢酶)，是表征溶解氧变化对水生生物呼吸代谢酶系统影响的重要标志。
溶解氧还可以对生物的抗氧化系统产生影响。如鱼类在水体溶解氧降低等刺激下，氧自
由基(ROS)的水平会产生变化。而为应对缺氧的不利环境，鱼类体内的抗氧化防御系统会
受到激发，以提高它们抵抗氧化损伤的能力。酶促体系中包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物
歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)在内的抗氧化酶，对自由基引起的氧化损
伤具有保护作用，它们的水平变化对于溶解氧对生物体的影响也具有表征作用。
由于溶解氧与纳入生态学基准体系的其他化合物指标的性质差异，传统的基准方法不一
定能推导较准确的溶解氧基准值，于是在客观上造成了发布溶解氧基准指南的国家较少。其
中，美国环境保护总署(USEPA)所发布的溶解氧基准建议值得到了较广泛的应用。USEPA于
1980年开始发布适用于淡水水生生物的溶解氧基准，并且1986年进行了修订。USEPA在制
定淡水溶解氧基准时，除了参考不同溶解氧环境下鱼类(尤其是商业价值高的鱼类)致死率
的耐受性实验数据外，还结合了不同种鱼类的生理反应、生长、繁殖、生命早期阶段反应、
行为、游泳运动及现场调查等研究资料，最终制定了保护淡水水生生物多样性的最低溶解氧
基准值。同时，USEPA在制定淡水溶解氧基准值时，除了考虑冷水水域及温水水域温度的差
异，还对鲑科鱼类及非鲑科鱼类不同生命阶段对溶解氧的敏感程度差异进行了分析，最终确
定的对淡水水生生物产生不同效应的溶解氧基准值，见表1。
表1 USEPA对淡水水生生物产生不同效应的溶解氧基准值
1产量无影响：表示对渔业资源起最大保护作用的浓度
2产量轻微影响：表示对重要渔业资源高效保护，在大多数情况下有轻微生产减值的影响
3产量中度影响：保护现有的鱼类种群，但是对鱼类资源产量有重大影响
4产量严重影响：保护渔业资源的最低溶解氧浓度，但是根据水体使用功能的不同，此指标不作为主
要的污染物控制指标
*与括号内数值有3mg/L的差异是因为鲑科鱼类的胚胎及幼体呼吸作用消耗大量溶解氧，为了保护
鲑科鱼类的胚胎及幼体需预留3mg/L溶解氧空间
随后，基于以上对淡水水生生物产生不同效应的溶解氧数据，通过对产量影响的重要性
进行评估，USEPA制定了保护淡水水生生物的国家溶解氧基准值，见表2。
表2 淡水溶解氧基准值(USEPA)
1早期生命阶段包括胚胎及孵化时间小于30大的幼体
21天最小值适用于溶解氧急剧变化的环境，最小值是指1天中任何时刻获得的瞬时浓度
-表示无相应数据
本发明在溶解氧基准值的验证中，主要验证“无影响”、“严重影响”和“死亡阈值”三
个水平下的基准值。
发明内容：
本发明为解决溶解氧基准值的验证问题，依据国外已有溶解氧基准数据及溶解氧基准制
定方法，结合我国水环境质量标准，选取代表性水生生物作为受试生物，建立溶解氧和生物
指标间的压力-响应关系，研究不同水平溶解氧对目标生物静止代谢、呼吸代谢相关酶(琥珀
酸脱氢酶SDH、乳酸脱氢酶LDH)及抗氧化防御系统关键酶(过氧化氢酶CAT、超氧化物
歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX)的影响。分析已有的溶解氧基准值对水生生物
的适用情况，验证溶解氧基准的适用性和科学性。
本发明采用室内实验方法，控制不同的溶解氧水平，测定受试生物的响应指标。以鲤科
鱼类斑马鱼为例，本发明提供静止代谢率测定和酶活性测定两组方法。
本发明中溶解氧降低压力下斑马鱼静止代谢率的测定，步骤如下：
1.将驯化后的斑马鱼转入密闭的呼吸室(95mL)，每个呼吸室放置一条斑马鱼；
2.用光纤测氧仪每隔10min测定呼吸室内的溶解氧浓度，实现对呼吸室内溶解氧的连续
测定；
3.盖上密封盖使呼吸室内的溶解氧随斑马鱼自身代谢耗氧而下降，直至鱼死亡，过程中
呼吸室密封，无空气进入，且置于(25±0.5)℃的水浴环境中。
4.每条鱼的静止代谢率MO2(mg O2g-1h-1)用下式来计算：
MO2＝V([O2]k-[O2]k+1-RT)/WT
其中V为减去实验鱼体积后的呼吸室容积；[O2]k是K时刻溶解氧浓度，[O2]k+1是下一
时刻溶解氧浓度；R为水体自身耗氧率(mg O2g-1h-1)，R的测定方法是：在同样的条件下，
不放入斑马鱼测定呼吸室内溶解氧随时间的变化曲线，用线性回归法进行拟合得出每小时水
体自身耗氧率R；W为鱼的总重(g)；T为K与K+1时刻的时间间隔(h)；
5.实验重复6次，得出6组数据，以溶解氧为横坐标，静止代谢率为纵坐标做出各溶解
氧水平下静止代谢率的散点图，最后用分段回归的方法对数据进行拟合，得出两条斜率不同
的直线相交于一点，该点对应的溶解氧即为斑马鱼的临界氧浓度。
本发明中不同溶解氧水平下斑马鱼酶活性测定，步骤如下：
1.取5L的大烧杯加初始浓度为(8±0.5)mg/L的曝气水至4.5L刻度处，用潜水泵使烧
杯内的水处于不断循环的流动状态，通过调节潜水泵出水口的高度来控制曝气量从而达到控
制溶解氧浓度的目标；
2.用光纤测氧仪每隔30s读取溶解氧及温度的数值，实现对溶解氧浓度的实时监控，保
证溶解氧及温度稳定在一定范围内；
3.共设5mg/L、3mg/L、2mg/L、1mg/L四个实验组溶解氧梯度及一个对照组，对照组
溶解氧维持在(8±0.5)mg/L；
4.每个烧杯中放入120条斑马鱼，维持烧杯内溶解氧为8mg/L 24小时，对斑马鱼进行驯
化；
5.通过调节曝气量使实验组的溶解氧从最初的8mg/L以每小时下降1mg/L的速度依次
缓慢降至所设定的实验组，即5mg/L、3mg/L、2mg/L及1mg/L，与此同时，对照组溶解氧
维持在8mg/L；
6.当溶解氧降至实验浓度时，同时对实验组和对照组取样进行酶活性分析。
本发明中持续低氧处理及复氧对斑马鱼酶活性的影响，步骤如下：
1.斑马鱼在5L烧杯中驯养24h，随后调节曝气量使烧杯内溶解氧从8mg/L匀速下降至
3mg/L；
2.设定溶解氧刚降到3mg/L为处理0时，随后调节曝气量将溶解氧维持在(3±0.3)
mg/L；
3.分别于0、8、24、48h取样；
4.低氧处理48h后将实验组复氧至(8±0.5)mg/L，并分别于复氧24、48、96h取样进
行酶活性分析；
5.1mg/L的低溶氧处理及复氧实验与3mg/L的实验方法相同；
6.数据采用独立样本t检验比较组间的差异显著性。
本发明中酶活性测定，步骤如下：
1.样品处理。斑马鱼称重后迅速在冰盘上解剖，取其内脏团用于酶活性分析。将斑马鱼
内脏团按1∶9加入Tris-HCl缓冲溶液，在冰浴中用玻璃匀浆器制备成10％组织匀浆，组织匀
浆液经高速冷冻离心机4℃，3000r/min离心15min，取上清液，用0.86％冷生理盐水稀释成
测定各个酶活性所需浓度的组织匀浆液；
2.CAT、SOD、GSH-PX、SDH、LDH酶活性均按照酶试剂盒标准方法进行测定，总蛋
白用蛋白定量试剂盒测定；
3.其中：过氧化氢酶(CAT)活性测定采用钼酸铵分光光度法，超氧化物歧化酶(SOD)
活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力测定采用GSH消耗方
法，琥珀酸脱氢酶(SDH)活力测定采用FAD还原方法，乳酸脱氢酶(LDH)活力测定采用
丙酮酸方法；
4.实验蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法；
5.每个溶解氧浓度组均设置3个平行，每个平行取4条斑马鱼。所有酶活力数据为3个
平行样的平均值，实验结果均采用平均数±标准差表示。数据采用单因素方差分析(One-Way
ANOVA)，用Dunnett检验比较实验组与对照组的差异。
附图说明：
图1：不同溶解氧水平下斑马鱼的静止代谢率。
图2：溶解氧水平对斑马鱼内脏团SDH酶活性的影响。
图3：溶解氧对斑马鱼内脏团LDH酶活性的影响。
图4：溶解氧水平对斑马鱼内脏团CAT酶活性的影响。
图5：溶解氧水平对斑马鱼内脏团SOD酶活性的影响。
图6：溶解氧对斑马鱼内脏团GSH-PX酶活性的影响。
具体实施方式：
为理解本发明，以使用斑马鱼对温带地区温水淡水环境下溶解氧的生态学基准值的验证
过程为例，进一步说明本发明的技术方案，但本发明不限于此。
实验用鱼及驯养。实验用斑马鱼购于某实验生物培养机构，购回后在实验室水族箱(体
积500L、配备循环过滤装置)饲养1个月以上，自然死亡率低于1％，饲养用水为曝气后的
自来水，饲养时用曝气装置向水体充气使溶解氧维持在7.5-8.5mg/L。实验前使斑马鱼在25℃
下禁食24小时，选取平均体长(3.0±0.2)cm，平均体质量(0.38±0.05)g，大小基本一致
的斑马鱼进行实验。所用实验用水均为曝气48小时以上的自来水，水温(25±0.5)℃，溶
解氧为(8±0.5)mg/L。
实验仪器，如表3所示。
表3 主要实验仪器
化学药品及试剂，如表4所示。
表4 主要药品及试剂
实验使用的Tris-HCl缓冲溶液的配制。500ml蒸馏水溶解1.21g Tris及37.23mg
EDTA-2Na，用200mmol/L的HCl溶液将pH调至7.4，然后加入3.42g蔗糖，8g NaCl，定容
至1000ml，棕色试剂瓶储存，高压灭菌后放入4℃冰箱中备用。
本发明中“不同溶解氧水平下斑马鱼酶活性测定”部分的溶解氧和温度数据，如表5所
示。
表5 “不同溶解氧水平下斑马鱼酶活性测定”溶解氧与温度数据
本发明中“持续低氧处理及复氧对斑马鱼酶活性的影响”部分的溶解氧与温度数据，如
表6所示。
表6 “持续低氧处理及复氧对斑马鱼酶活性的影响”溶解氧与温度数据
不同溶解氧下斑马鱼静止代谢率的测定结果如附图1，可见斑马鱼的临界氧浓度为
0.55mg/L。
溶解氧对斑马鱼呼吸代谢酶活性影响的测定结果如附图2(SDH酶)及附图3(LDH酶)
所示。在溶解氧为5mg/L的水环境中SDH及LDH活性都与对照组无差异，因此在5mg/L
溶解氧环境下斑马鱼呼吸代谢没有受到影响；当而溶解氧降为3mg/L时，LDH活力被显著
诱导，这说明斑马鱼在3mg/L溶解氧环境下无氧代谢被激活。持续处于3mg/L环境中，SDH
活性显著降低，而LDH活性反而升高，这显示在3mg/L溶解氧下，斑马鱼体内有氧呼吸被
抑制、无氧呼吸被激活以应对低氧的环境。当溶解氧为1mg/L时，斑马鱼体内SDH活性最
初显著上升，但随着处理时间延长，SDH活性又急剧下降。尽管SDH及LDH两种酶活性被
抑制的时间不同，但48h后两种酶活性均显著低于对照组，显示低氧胁迫已经对斑马鱼的呼
吸代谢造成了损伤。经过96h复氧，SDH活性仍低于对照组但已无显著性差异，而LDH活
性则显著低于对照组，这说明低氧胁迫对呼吸代谢产生了一定程度的永久性损伤，可见1mg/L
溶解氧环境会斑马鱼机体产生严重影响。综合测定结果可知，3mg/L为溶解氧对水生生物的
临界浓度，而1mg/L则是能对水生生物产生严重影响的临界浓度。于是，可以验证3mg/L的
基准值水平是合理的，而在极端情况下，可以使用1mg/L的基准值。
溶解氧对斑马鱼抗氧化系统酶的影响，测定结果如附图4(CAT酶)、附图5(SOD酶)
及附图6(GSH-PX酶)所示。对各溶解氧下CAT、SOD、GSH-PX三种抗氧化酶活性变化趋
势进行分析发现，三种抗氧化酶在溶解氧为5mg/L时其活性与对照组无差异，这表明斑马鱼
比较适应5mg/L溶解氧环境；而溶解氧降至3mg/L时，CAT、SOD、GSH-PX三种酶被同时
诱导升高，这说明在3mg/L的低氧环境下斑马鱼体内的自由基增多，抗氧化酶开始发挥作用
清除体内ROS的影响。持续处于1mg/L溶解氧环境下，斑马鱼三种抗氧化酶活性一直被抑制，
这说明在1mg/L的极低溶解氧环境下，斑马鱼机体受到严重的氧化胁迫，产生的抗氧化酶不
足以抑制体内产生的自由基，使机体受损程度加剧。综合测定结果同样可知，3mg/L为溶解
氧对水生生物的临界浓度，而1mg/L则是能对水生生物产生严重影响的临界浓度。于是，可
以验证3mg/L的基准值水平是合理的，而在极端情况下，可以使用1mg/L的基准值。