一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法.pdf

本发明涉及一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法。本发明对胸膜肺炎放线杆菌蛋白提取方法进行了优化，将液氮研磨与超声震荡结合，苯酚溶液与醋酸铵溶液相结合提高了蛋白质的提取效率。本发明的方法具有操作简便、省工省时、蛋白提取效率高、干扰物少的特点。该方法比较适合于蛋白提取困难、蛋白提取收率低、干扰杂质多的材料。同时所得蛋白易于二次溶解、杂质和干扰物少，完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、重复性好、蛋白点分布均匀、蛋白点清晰的图谱，对胸膜肺炎放线杆菌组学研究及免疫蛋白的筛选和疫苗候选蛋白筛选的研究具有重要的意义。

权利要求书
1.  一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，其特征在于，操作步骤如下：
(1)取-80℃冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.05g粉末至2ml离心管中；
(2)往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取液配方为：0.5M Tris-base，0.1M氯化钾，0.7M 蔗糖，30mM盐酸，50mM DTT，50mM EDTA，40mMβ-二巯基乙醇；
(3)将上述溶液充分混匀后，恒温4℃超声震荡30min；
(4)13200r／min4℃离心30min，收集上清液，上清液中加入等量的pH8.0的苯酚溶液；
(5)4℃漩涡混悬15min，4℃13200r／min离心20min，收集酚相部分；
(6)将酚相部分转移到另一个新的离心管中，加入等量的蛋白提取液重复提取三次，每次均收集酚相部 分；
(7)酚相中加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液-20℃过夜，13200r／min4℃条件下离心30min，收集蛋白沉淀；
(8)蛋白质沉淀用0.1M醋酸铵乙醇漂洗两次，然后再用-20℃丙酮漂洗一次，用真空冷冻离心干燥机处 理蛋白沉淀，获得蛋白粉末，置-80℃冰箱中保存。

2.  根据权利要求1所述的一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，其特征在于液氮研磨和 超声震荡相结合，超声震荡时间为30min，功率为95W。

3.  根据权利要求1或2所述的一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，其特征在于上清液 中加入等量的pH8.0苯酚溶液。

4.  根据权利要求1、2或3所述的一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法，其特征在于酚相 中加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液。

说明书一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白的提取方法，具体涉及一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌蛋白提取方 法，属于生物技术领域。
背景技术
猪接触传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia)又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺 炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主 要特征。急性者病死率高，慢性者常能耐过。本病于1957年由英国的Pattison首次报道。目前该病在世界 上广泛存在，造成了巨大的经济损失。美国、丹麦、瑞士将本病列为主要猪病之一。我国近年来由于引种 频繁，该病也随之侵入，其发生和流行日趋严重，已有多个地区报道了此病。
[0002]本病对各种猪均易感，在新引进猪群多呈急性爆发，其发病率和死亡率常在20％以上，最急性型 的死亡率可高达80％～100％。该病在我国发生呈逐年上升的趋势，已成为危害养猪业最严重的疾病之一， 给我国养猪业造成严重的经济损失。
近年来，由放线杆菌所引起的传染性胸膜肺炎已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发 病后及时采用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率，同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度 上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用，细菌对抗菌药物的耐 药性问题日趋突出，与此同时也有研究资料表明亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌 的毒力或细菌对环境的适应能力等。
上个世纪人类对人的基因组进行了研究，对整个基因组进行了测序，其中一些基因的遗传密码被 破译，还有些基因的功能未研究清楚。蛋白质是基因功能的体现者，执行生理功能。在众多生物学机制研 究中，许多问题在基因水平上不能完全被揭示，所以就要研究其功能，从其体现者蛋白质角度来研究。蛋 白质组起初由澳大利亚学者提出，它包含两个方面的含义，一个是蛋白质方面的研究，一个是基因组方面 的研究，它的具体含义是细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质信息。蛋白质组学是以蛋白质组为研究中 心，在整体水平上系统研究细胞或组织的全部蛋白质信息，它具有大规模、高通量的特点。21世纪是生命 科学领域大发展时期，基因组学研究已进入后基因组学时代，即功能蛋白质组学。蛋白质组学的研究内容 非常广泛主要包括以下几个方面：即结构蛋白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、差异蛋白质组 学等几个方面的内容。双向电泳是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，其步骤较多，研究内容 复杂，主要包括以下几个方面内容：原料的采集与回收、蛋白质的提取、蛋白质的纯化、蛋白质的透析脱 盐、第一向等电聚焦、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱鉴定、生物信息学分析研究等内容。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，包括样品制备、胶条水化、等电 聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶固定及染色等一系列步骤。其中样品制备、等电聚焦和凝胶染色是最关 键的，决定了双向电泳能否顺利进行及成败的关键。等电聚焦对样品的要求极其严格，若样品中含有过多 杂质将使等电聚焦过程终止。目前有很多种蛋白质提取方法，但没有一种方法是通用的，因此要对不同的 生物组织采取不同的措施。细菌中含有大量干扰物质，这些物质严重干扰等电聚焦及影响电泳图谱的分析。
本研究为克服上述困难，发明了一种适合双向电泳的蛋白提取方法，对蛋白提取步骤和所使用的 试剂进行了优化，增加了超声波处理方法和延长了超声的处理时间，对细胞内的蛋白进行了有效释放，大 大提高了蛋白提取的效率和纯净度。有效除去了双向电泳中干扰第一向和第二向的杂质。建立了一种稳定、 高效适用于双向电泳的胸膜肺炎放线杆菌的蛋白提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定、高效适用于双向电泳的放线杆菌的蛋白提取方法，本方法操作 简便、蛋白提取效率高、杂质少、不干扰第一向等电聚焦和第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳。为胸膜肺炎杆 菌的蛋白组学研究及疫苗候选蛋白筛选提供技术支持和理论基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌的蛋白提取方法，其特征和具体操作步骤如下：
(1)取-80℃冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.05g粉末至2ml离心管中；
(2)往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取液配方为：0.5M Tris-base，0.1M氯化钾， 0.7M蔗糖，30mM盐酸，50mM DTT，50mM EDTA，40mMβ-二巯基乙醇；
(3)将上述溶液充分混匀后，恒温4℃超声震荡30min；
(4)13200r／min4℃离心30min，收集上清液，上清液中加入等量的pH8.0的苯酚溶液；
(5)4℃漩涡混悬15min，4℃13200r／min离心20min，收集酚相部分；
(6)将酚相部分转移到另一个新的离心管中，加入等量的蛋白提取液重复提取三次，每次均收 集酚相部分；
(7)酚相中加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液-20℃过夜，13200r／min4℃条件下离心30min，收集 蛋白沉淀；
(8)蛋白质沉淀用0.1M醋酸铵乙醇漂洗两次，然后再用-20℃丙酮漂洗一次，用真空冷冻离心 干燥机处理蛋白沉淀，获得蛋白粉末，置-80℃冰箱中保存。
本发明中所用的试剂均为分析纯，水为超纯水。操作条件在4℃条件下进行。
本发明的有益效果如下：
1、步骤(2)优化了蛋白提取液配方，可有效除去样品中的杂质，使等电聚焦顺利进行。
2、步骤(3)延长了超声时间，使胞内蛋白有效释放，提高了蛋白提取的效率。同时操作条件在 4℃条件下，防止蛋白变性。
3、步骤(4)中在蛋白上清液中加入等量的pH8.0的苯酚溶液，可有效除去蛋白中盐类、酸性杂 质。
4、步骤(5)使蛋白集中于酚相，进一步使蛋白与非蛋白和杂质分开，利于蛋白的进一步提取和 纯化。
5、步骤(6)反复用蛋白提取液对酚相部分进行提取，提高蛋白的收率。
6、步骤(7)加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液，使蛋白沉淀，除去非必须溶液。
7、步骤(8)用-20℃丙酮漂洗，可以进一步除去样品的盐类、核酸、色素、油脂杂质，使蛋白更 加纯净。用真空冷冻离心干燥机处理蛋白沉淀，使蛋白成粉末状，可保证蛋白的二次溶解和提高样品的上 样量及等电聚焦的顺利进行。
综上所述，本发明对胸膜肺炎放线杆菌的蛋白提取进行了优化，建立了一套稳定、高效适于双向 电泳的放线杆菌的蛋白提取方法。与传统方法相比，该方法省工省时、操作简便、蛋白提取效率高、杂质 少、能有效除去等电聚焦干扰物等优点，另外，该方法将液氮研磨与超声相结合，使蛋白有效释放出来， 提高了蛋白的提取效率和质量。该方法比较适合于蛋白难提取的材料及杂质含量较多的材料。
本发明的方法有效提高了蛋白含量，省去了传统的透析除盐的繁琐步骤，整个过程在4℃条件下 进行，减少了蛋白的变性。
本发明的优点在于操作简便，省工省时，蛋白纯净度较高，可获得清晰、均匀、重复性好、分辨 率高的电泳图谱，有利于蛋白点的后续质谱分析，为放线杆菌的组学研究提供了技术支持。对放线杆菌致 病机理及免疫蛋白的筛选具有重要的意义。
附图说明
图1为放线杆菌蛋白双向电泳图谱。图1中的点为蛋白点，图的顶端为蛋白的等电点，右边为蛋 白的分子质量，根据此图可知每个蛋白点的等电点和分子量。
具体实施方法：
实例1：一种稳定、高效适于双向电泳的放线杆菌的蛋白提取方法，包括以下步骤：
(1)取-80℃冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.05g粉末至2ml离心管中；
(2)往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取液配方为：0.5M Tris-base，0.1M氯化钾，0.7M 蔗糖，30mM盐酸，50mM DTT，50mM EDTA，40mMβ-二巯基乙醇；
(3)将上述溶液充分混匀后，恒温4℃超声震荡30min；
(4)13200r／min4℃条件下离心30min，收集上清液，上清液中加入等量的pH8.0的苯酚溶液；
(5)4℃漩涡混悬15min，4℃13200r／min离心20min，收集酚相部分；
(6)将酚相部分转移到另一个新的离心管中，并加入等量的蛋白提取液重复提取三次，每次均收集酚相 部分；
(7)酚相中加入5倍体积的醋酸铵乙醇溶液-20℃过夜，13200r／min4℃条件下离心30min，收集蛋白沉淀；
(8)蛋白质沉淀用0.1M醋酸铵乙醇漂洗两次，然后再用-20丙酮℃漂洗一次，用真空冷冻离心干燥机 处理蛋白沉淀，获得蛋白粉末，置-80℃冰箱中保存。
(9)蛋白浓度的检测采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准，用无菌去离子水将牛血清蛋白质(BSA) 配制成不同浓度的标准溶液，加入考马斯亮蓝G-250溶液中，以考马斯亮蓝G-250染色液为对照，混匀放 置10min。用紫外分光光度仪测定在595nm处的吸光值，绘制标准曲线。取待测蛋白质样品，于595nm 波长下OD595吸光值，根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
(10)样品水化，用移液器吸取样品，沿着水化盘至左而右线性加入样品，在水化盘的两端各1cm处不要 加样，加样时不要有气泡产生。从-80℃的冰箱中取出冷冻保存的IPG胶条(18cm pH3-11)，室温放置10min。 分清胶条的正负极，从胶条的一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，慢慢放入水化盘中，不要把样品溶 液弄到胶条背面上，因为这些溶液不容易被胶条吸收到。并前后移动，避免产生气泡。如果产生气泡，用 镊子轻轻提起胶条的一端，前后移动，直到气泡被赶走为止。为了防止液体蒸发，在胶条的上方覆盖3ml 的矿物油，盖上盖子。室温下水化，放置24h。
(11)第一向等电聚焦(IEF)，取两个IEF电极片，用7μl超纯水湿润。分别将两个电极片放在IPG胶 条槽的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。将充分水化的胶条从水化盘中取出，超纯水冲洗胶条， 去除胶条表面的矿物油和未被吸收的样品液，用镊子将胶条胶面朝下轻轻放入胶条槽，加入2-3ml矿物油 覆盖胶条，将聚焦盘移入聚焦仪中。将标准型胶条槽的尖端面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触，胶条 槽的平端面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触。设定IEF程序并启动，进行等电聚焦。当电压和时间达 到所要求的数值时终止等电聚焦程序。等电聚焦的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或将IPG 胶条放置于水化盘中，-80℃冰箱中保存。
(12)IPG胶条的平衡，从聚焦盘中取出胶条，用无菌去离子水冲洗胶条，去除矿物油和杂质，将胶条的 胶面朝上放入平衡盘中。IPG胶条平衡两次，每次15min。在第一次平衡缓冲液中加入DTT，使变性的蛋 白处于还原状态，第二次平衡缓冲液中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化。取20ml平衡缓冲液I，在每 一个胶条上加10ml，置于水平摇床上震荡15min，倒掉平衡缓冲液I，用去离子水润洗IPG胶条30s，将 胶条的边缘置于滤纸上1min，以除去多余的平衡缓冲液I。取20ml平衡缓冲液II，在每一个胶条上加10ml， 置于水平摇床上震荡15min，倒掉平衡缓冲液II，用去离子水润洗IPG胶条30s，将胶条的边缘置于滤纸 上1min，以除去多余的平衡缓冲液II。
(13)第二向垂直SDS-PAGE电泳，配制12％的丙烯酰胺凝胶两块。配120ml凝胶溶液，每块凝胶60ml。 装好灌胶模具，倒入凝胶溶液，上部留1cm的空间，用异丙醇封顶，以减少凝胶溶液暴露于空气，保持胶 面平整。放入4℃房间聚合过夜。凝胶溶液配比如下：当凝胶与上方的液体出现分层后，表明凝胶已完全 聚合。待凝胶完全凝固后，倒掉凝胶表面的异丁醇，并用去离子水冲洗胶面。IPG胶条的转移：将平衡后 的IPG胶条放置于玻璃板之间的凝胶表面上，用一薄尺将IPG胶条轻轻向下推，使胶条的下部与凝胶充分 接触。注意不要在胶条的下方产生任何气泡。加入分子量标准蛋白：将分子量标准蛋白胶条加在凝胶的任 何一端，使其与凝胶完全接触。琼脂糖封胶液进行封顶：在IPG胶条的上方，加入封胶液，使封胶液完全 覆盖胶条，4℃放置5min。使封胶液彻底凝固。电泳：电泳槽中装好电泳缓冲液，接通电源，开始时用低 电压(180V)电泳，待样品完全走出IPG胶条后，再加大电压(200V)。当溴酚蓝染料迁移到凝胶底部边 缘时即可结束电泳。电泳结束后，将胶片小心转移到染色盒里固定，固定后进行染色。
(14)染色结果如图1所以，图谱背景清晰、分辨率高、蛋白点清晰、具有较好的重复性，图中可辨蛋白 点为834个。满足后续组学研究的需要。
(15)以上所述为本发明的较佳实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明 的涵盖范围。