一种苹果酸舒尼替尼有关物质分析方法.pdf

本发明涉及一种苹果酸舒尼替尼有关物质分析方法，所述方法在高效液相色谱上进行，采用Poroshell120 Bonus RP色谱柱，醋酸铵水溶液和有机溶剂乙腈作为流动相，液相二极管阵列检测器(DAD)或紫外(UV)检测器进行梯度洗脱检测，有效的分离并检测有关物质B、有关物质C、有关物质E以及其他有关物质。本发明所述的分析方法具有专属性好,准确率高和简便快捷的特点。

权利要求书
1.  一种苹果酸舒尼替尼有关物质分析方法，其特征是：
所述方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是二极管阵列检测器或者紫外吸收检测器，检测波长是268nm；
液相色谱柱是Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱，色谱柱温度是20℃～30℃；
流动相是由作为缓冲液的乙酸铵水溶液和有机溶剂乙腈组成的，并进行梯度洗脱，流动相的流速是约 0.9mL/min～1.1mL/min；
注入苹果酸舒尼替尼供试品溶液和苹果酸舒尼替尼对照品溶液进行检测，按不加校正因子的主成分自 身对照法计算有关物质的含量。

2.  根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱是由粒径是约2.7μm 的填料颗粒填充的，其中填料颗粒是由1.7μm直径的内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的 多孔外层构成的，其中固定相是键合在所述填料颗粒上的正十八烷烃。

3.  根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的乙酸铵水溶液的浓度是约3.45g/L～4.20g/L，pH约5.5～6.0。

4.  根据权利要求1所述的分析方法，其中所述梯度洗脱，梯度如下：
时间(min)          乙酸铵水溶液(v/v，％)          乙腈(v/v，％)
0                          90                         10
12                         37                         63

5.  根据权利要求1所述的分析方法，其中所述的苹果酸舒尼替尼供试品溶液是取苹果酸舒尼替尼供试品 用水和乙腈的混合溶液溶解，稀释，最终浓度是约0.10mg/mL～1.0mg/mL；所述的苹果酸舒尼替尼对 照品溶液取苹果酸舒尼替尼供试品用水和乙腈的混合溶液溶解，稀释，最终浓度是约0.2μg/mL ～2.0μg/mL。

6.  根据权利要求5所述的分析方法，其中所述的水和乙腈的混合溶液中水和乙腈的体积比是7:3。

7.  一种苹果酸舒尼替尼有关物质分析方法，其特征是：
所述方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是二极管阵列检测器，检测波长是268nm；
液相色谱柱是Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱，色谱柱温度是25℃；
流速是约1.0mL/min；
梯度洗脱：
时间(min)          乙酸铵水溶液(v/v，％)          乙腈(v/v，％)
0                          90                         10
12                         37                         63
注入苹果酸舒尼替尼供试品溶液和苹果酸舒尼替尼对照品溶液进行检测，按不加校正因子的主成分自 身对照法计算有关物质的含量；
其中，Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱是由粒径是约2.7μm的填料颗粒填充的，其中填料颗粒 是由1.7μm直径的内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的多孔外层构成的，其中固定相是键 合在所述填料颗粒上的正十八烷烃，柱子长度是50mm，柱子内直径是4.6mm；
其中乙酸铵水溶液浓度是约3.85g/L，pH约5.7；
其中，苹果酸舒尼替尼供试品溶液是苹果酸舒尼替尼浓度约0.50mg/mL的乙腈和水的混合溶液，苹果 酸舒尼替尼对照品溶液是苹果酸舒尼替尼浓度约1.0μg/mL的乙腈和水的混合溶液，其中所述的水和 乙腈的混合溶液中，水和乙腈的体积比是7:3。

8.  根据权利要求1-7任一所述的分析方法，其中所述的高效液相色谱仪是Agilent 1260、Agilent 1290 或者Waters UPLC。

9.  根据权利要求8所述的分析方法，其中所述方法是用于检测苹果酸舒尼替尼原料药中的有关物质B、 有关物质C和有关物质E。

说明书一种苹果酸舒尼替尼有关物质分析方法
技术领域
本发明涉及医药化工领域，更具体地涉及一种优化的检测化学原料药苹果酸舒尼替尼有关物质的方 法。
背景技术
苹果酸舒尼替尼，化学名为N-(2-二乙胺乙基)-5[(Z)-(5-氟-2-氧-1氢-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4- 二甲基-1氢-吡咯-3-甲酰胺苹果酸盐，其化学结构式为：

是一种多靶点受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，其主要用于通过口服给药治疗对标准疗法没有响应或不 能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌。该药目前已经被美国FDA和欧洲EMEA批准上市，商品为 Sutent。中国授权专利CN 1329390C公开了苹果酸舒尼替尼的制备方法。
通常苹果酸舒尼替尼原料药中还含有舒尼替尼的降解有关物质B以及工艺制备过程引入有关物质C和 有关物质E，以及其他有关物质。
有关物质B、C和E的结构式见表1
表1


为了保证药品的安全使用通常需要对药品进行质量控制，而有关物质是绝大多数药物必须要检测的项 目。目前，苹果酸舒尼替尼的质量标准在现行版《欧洲药典》及其药典论坛、《美国药典》以及其药典论 坛和中国药典2010版中均没有收载。因此开发有关物质B、C、E和其他未知杂质的有效的检测方法是非常 必要的。
为了确保检测方法对药物在生产阶段和存放阶段期的适用性和有效性，通常需要对分析方法进行验 证，包括专属性、精密度和准确度等实验，参见中国药典2010版第二部附录ⅩⅨA药品质量标准分析方法 验证指导原则(国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010:194～195)。 在专属性的考察过程中，通常需要通过酸(碱)水解、高温、强光照射或氧化等方法加速破坏药品，研究 药品可能的降解产物和降解途径，并验证分析方法具有专属性。
采用高效液相色谱法通常具有内标法、外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主 成分自身对照法和面积归一化法，参见中国药典2010版第二部附录ⅤD高效液相色谱法(国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010:29～31)。按面积归一化法准确地测定样品 中的有关物质是假设待测样品中所有测定组分都被检出，并且在相同的紫外检测波长下的具有相同的响应 因子。然而事实上，不同的化合物在相同的紫外检测波长下往往具有不一样的响应因子，这是为本领域技 术人员所熟知的。因此峰面积归一化法测量误差大，通常只适用于粗略考察供试品中的杂质含量。
其中，不加校正因子的主成分自身对照法是指测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可以采用不加 校正因子的主成分自身对照法。同加校正因子的主成分自身对照法配置对照溶液并调节检测灵敏度后，取 供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的 2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。
现有技术国家食品药品监督管理局进口药品注册标准，苹果酸舒尼替尼胶囊(标准编号：JX20060174)， 中公开了苹果酸舒尼替尼的有关物质的检测方法。所述方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如Supelco  Discovery C18，150×4.6mm，5μm)，柱温为45℃，检测波长为268nm，以0.05mol/L的醋酸铵缓冲溶液 (pH 5.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按如下梯度洗脱,

在高效液相色谱系统中对苹果酸舒尼替尼有关物质进行检测，按面积归一化法计算所有有关物质的含 量。因此所述方法存在专属性差、准确度低和运行时间过长，效率低的问题。
为了解决现有的苹果酸舒尼替尼有关物质检测方法中存在的技术问题，本发明提供一种准确、快速和 简便的苹果酸舒尼替尼原料药有关物质分析方法。
发明内容
发明概述
本发明人通过反复实验，筛选不同类型的色谱柱，尝试不同的流动相条件，最终获得一种适合于检测 苹果酸舒尼替尼原料药中有关物质的分析方法。所述方法是在高效液相色谱上进行的，检测器是液相二极 管阵列检测器(DAD)或紫外(UV)检测器，以醋酸铵水溶液和有机溶剂乙腈作为流动相进行洗脱，采用 Poroshell 120Bonus RP色谱柱进行色谱分离检测，该方法具有优越的专属性、高灵敏度、高准确度和高 效的特点，解决了现有技术中存在的问题。
其中，Poroshell 120Bonus RP色谱柱的填料颗粒的粒径是约2.7μm，其中颗粒是由1.7μm直径的 内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的多孔外层构成的，其中固定相是键合在所述填料颗粒上的 正十八烷烃。由于该色谱柱的填料颗粒的特殊结构使得其在检测苹果酸舒尼替尼原料药的有关物质B、C 和E时表现出优越的专属性。选择Poroshell 120Bonus RP色谱柱作为苹果酸舒尼替尼原料药有关物质 的分析方法的应用色谱柱是经过多次筛选的结果。
术语定义
术语“填料颗粒”是指在液相色谱柱领域，液相色谱柱是通过在柱子中填装表面上有固定相的颗粒 (可以是不同的材质，如硅胶)制备而得，颗粒的构造、大小、耐压性等属性都会影响到液相色谱柱的在 分析检测特定组分时的专属性等效能。
术语“峰纯度”是指HPLC检测中，用于判断某一色谱峰是否只是由一个物质引起的一个考察参数， 一般认为峰纯度在0.990～1.000之间即认为所考察的某一色谱峰纯净，该色谱峰是某单一物质的色谱峰。
术语“RT”是指HPLC检测中的色谱峰的保留时间，单位是分钟(min)；“RRT“是指HPLC检测中的 色谱峰的相对保留时间，没有单位，通常以相应图谱中的主峰作为参照峰，主峰的相对保留时间是1。
术语“v/v”是指体积比，“w/w”是指质量比。
发明详述
本发明提供的苹果酸舒尼替尼原料药的有关物质分析方法，其特征是：
所述方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是二极管阵列检测器(DAD)或者紫外吸收检测器(UV)，检测波长是268nm；
液相色谱柱是Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱，色谱柱温度是20℃～30℃；
流动相是由作为缓冲液的乙酸铵水溶液和有机溶剂乙腈组成的，并进行梯度洗脱，流动相的流速是约 0.9mL/min～1.1mL/min；
注入苹果酸舒尼替尼供试品溶液和苹果酸舒尼替尼对照品溶液进行检测,按不加校正因子的主成分自 身对照法计算有关物质的含量。
在一些实施例中，Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱是由粒径是约2.7μm的填料颗粒填充的，其 中填料颗粒是由1.7μm直径的内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的多孔外层构成的，其中固定 相是键合在所述填料颗粒上的正十八烷烃。
在一些实施例中，乙酸铵水溶液浓度是约3.45g/L～4.20g/L，pH约5.5～6.0。
在一些实施例中，本发明所述的方法是采用梯度洗脱的方式对检测样品进行分离检测的，所述梯度洗 脱方式可以是
时间(min)          乙酸铵水溶液(v/v，％)          乙腈(v/v，％)
0                           90                        10
12                          37                        63
在一些实施例中，高效液相色谱仪可以是Agilent 1260、Agilent 1290或者Waters UPLC。
在一些实施例中，供试品溶液的配置是避光条件下进行的。取适量苹果酸舒尼替尼的供试品用水和乙 腈的混合溶液溶解，稀释，最终浓度是约0.10mg/mL～1.0mg/mL，更优选供试品溶液浓度是约0.50mg/mL； 对照品溶液是取适量苹果酸舒尼替尼的供试品用水和乙腈的混合溶液溶解，稀释，最终浓度是约0.2μg/mL ～2.0μg/mL，更优选对照品溶液浓度是约1.0μg/mL。其中所述的水和乙腈的混合溶液中，水和乙腈的体 积比可以是7:3。
在一些实施例中，本发明提供的有关物质方法，其特征是：
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
检测器是二极管阵列检测器(DAD)，检测波长是268nm；
液相色谱柱是Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱，色谱柱温度是25℃；
流速是约1.0mL/min；
梯度洗脱：
时间(min)          乙酸铵水溶液(v/v，％)          乙腈(v/v，％)
0                           90                           10
12                           37                           63
注入苹果酸舒尼替尼供试品溶液和苹果酸舒尼替尼对照品溶液进行检测，按不加校正因子的主成分自 身对照法计算有关物质的含量；
其中，Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱是由粒径是约2.7μm的填料颗粒填充的，其中填料颗粒 是由1.7μm直径的内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的多孔外层构成的，其中固定相是键合在 所述填料颗粒上的正十八烷烃，柱子长度是50mm，柱子内直径是4.6mm；
其中乙酸铵水溶液浓度是约3.85g/L，pH约5.7；
其中，苹果酸舒尼替尼供试品溶液是苹果酸舒尼替尼浓度约0.50mg/mL的乙腈和水的混合溶液，苹果 酸舒尼替尼对照品溶液是苹果酸舒尼替尼浓度约1.0μg/mL的乙腈和水的混合溶液，其中所述的水和乙腈 的混合溶液中，水和乙腈的体积比可以是7:3。
本发明所提供的分析方法适合于检测苹果酸舒尼替尼原料药中的有关物质，特别适合于检测其中的有 关物质B、有关物质C和有关物质E。
附图说明
图1示实施例1中的空白溶液的检测色谱图
图2示实施例1中的苹果酸舒尼替尼对照品溶液的检测色谱图
图3示实施例1中的苹果酸舒尼替尼供试品溶液的检测色谱图
图4示实施例1中的增敏溶液的检测色谱图
图5示实施例2中的未破坏溶液的检测色谱图
图6示实施例2中的酸破坏溶液的检测色谱图
图7示实施例2中的碱破坏溶液的检测色谱图
图8示实施例2中的氧化破坏溶液的检测色谱图
图9示实施例2中的光照破坏溶液的检测色谱图
图10示实施例2中的高温破坏溶液的检测色谱图
图11示实施例5中的氧化破坏溶液用对比检测方法检测的色谱图
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明 作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
实施例1系统适应性实验
溶液配制：
空白溶液(稀释液)：配制水和乙腈的混合溶液，体积比为7:3。
苹果酸舒尼替尼供试品溶液：在避光条件下，取苹果酸舒尼替尼供试品适量，精密称定，置容量瓶中， 用适量稀释液配制成苹果酸舒尼替尼浓度为约0.50mg/mL的溶液。
苹果酸舒尼替尼对照品溶液：在避光条件下，精密移取苹果酸舒尼替尼供试品溶液适量，置容量瓶中， 用适量稀释液稀释至苹果酸舒尼替尼浓度为约1.0μg/mL的溶液。
增敏溶液：取苹果酸舒尼替尼供试品、有关物质B、有关物质C和有关物质E适量，精密称定，置于 容量瓶中用稀释液配制成含苹果酸舒尼替尼浓度为约0.50mg/mL，含有关物质B浓度为约1.6μg/mL、有 关物质C浓度为约0.6μg/mL和有关物质E浓度分别为约0.6μg/mL的溶液。
进样检测：
色谱条件如下：
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
检测器是二极管阵列检测器(DAD)，检测波长是268nm；
液相色谱柱是Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱，色谱柱温度是25℃；
流速是约1.0mL/min；
梯度洗脱：
时间(min)          乙酸铵水溶液(v/v，％)          乙腈(v/v，％)
0                           90                           10
12                           37                           63
其中，Poroshell 120Bonus RP反相色谱柱是由粒径是约2.7μm的填料颗粒填充的，其中填料颗粒 是由1.7μm直径的内部实心核和包覆在内部实心核的0.5μm厚的多孔外层构成的，其中固定相是键合在 所述填料颗粒上的正十八烷烃，柱子长度是50mm，柱子内直径是4.6mm；
其中乙酸铵水溶液浓度是约3.85g/L，pH约5.7；
取空白溶液、苹果酸舒尼替尼供试品溶液、苹果酸舒尼替尼对照品溶液和增敏溶液，各进样1针，记 录色谱图。报告苹果酸舒尼替尼供试品溶液、苹果酸舒尼替尼对照品溶液和增敏溶液中主峰的保留时间 (RT)；苹果酸舒尼替尼供试品溶液与增敏溶液中主峰的峰纯度、有关物质B、C和E的相对保留时间(RRT) 及峰面积、主峰及有关物质B、C和E与相邻峰的分离度。图1表明空白溶液对苹果酸舒尼替尼供试品检 测无干扰；图2表明苹果酸舒尼替尼对照品溶液检测色谱图中，对照品具有很好的响应值，灵敏度高；图 3表明苹果酸舒尼替尼供试品中主峰及各已知单杂(有关物质B、C和E)和相邻峰的分离度都良好和图4 表明增敏溶液中各添加的已知有关物质(有关物质B、C和E)峰面积显著增大，峰面积和杂质量具有线性 关系。检测结果见表1。
表1

根据实验结果和图谱，
空白溶液、供试品溶液和增敏溶液相比较，空白溶液在主峰及各已知单杂(有关物质B、C和E)保留 时间处无干扰；供试品溶液和增敏溶液色谱图中主峰及各已知单杂(有关物质B、C和E)和相邻峰的分离 度都不小于1.5；供试品溶液与增敏溶液和对照溶液中的主峰保留时间一致；供试品溶液与增敏溶液色谱 图中主峰的峰纯度因子都大于0.990；与供试品溶液相比，增敏溶液色谱图中杂质B、杂质C、杂质E的保 留时间处的峰的峰面积明显增强。因此，本发明提供的方法专属性好。
实施例2强降解破坏实验
破坏样品溶液配制：
稀释液：配制水和乙腈的混合溶液，体积比为7:3。
供试品贮备液：在避光条件下，取供试品135mg，精密称定至50mL容量瓶中，用稀释液超声溶解并定 容，摇匀，即得。
未破坏供试品溶液：在避光条件下，精密移取取供试品贮备液5mL至25mL容量瓶中，用稀释液定容， 摇匀，即得。
酸破坏溶液：在避光条件下，精密移取供试品贮备液5mL至25mL容量瓶中，加6mol/L的盐酸溶液1mL， 摇匀，密封，在室温中放置24h后，加6mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，放冷，用稀释液定容，摇匀，即 得；
碱破坏溶液：在避光条件下，精密移取供试品贮备液5mL至25mL容量瓶中，加6mol/L的氢氧化钠溶液 1mL，摇匀，密封，在室温中放置24h后，加6mol/L盐酸溶液1mL中和，放冷，用稀释液定容，摇匀，即得；
氧化破坏溶液：在避光条件下，精密移取供试品贮备液5mL至25mL容量瓶中，加入15％双氧水1mL，在 室温中放置24h后，用稀释液定容，摇匀，即得；
光照破坏溶液：取供试品适量，平铺至称量瓶中，置可见光4500Lux±500Lux、紫外光1.7W*h/m2条件 下光照13天使可见光照强度总量达到1200000Lux，紫外光强度达到200W/m2以上，然后取上述样品27mg， 精密称定，置100mL容量瓶中，在避光条件下，用稀释液定容，摇匀，即得；
高温破坏溶液：取供试品适量，平铺至称量瓶中，在105℃烘箱中放置24h，取出放冷，然后取上述 样品约27mg，精密称定，置100mL量瓶中，在避光条件下，用稀释液定容，摇匀，即得；
进样检测：
色谱条件如实施例1；
取上述未破坏的溶液和各破坏溶液各进样1针，记录色谱图。报告各破坏溶液中主峰与相邻峰的分离 度、主峰峰纯度和总杂峰面积百分含量。
图5、图6、图7、图8、图9和图10分别是未破坏溶液、酸破坏溶液、碱破坏溶液、氧化破坏溶 液、光照破坏溶液和高温破坏溶液的色谱图，表明未破坏条件下和各破坏条件下的溶液测定的结果。
检测结果见表2。
表2
溶液名称 总杂(％) 主峰纯度因子 主峰与相邻峰分离度 未破坏溶液 0.37 1.0000 1.5 酸破坏溶液 1.06 1.000 1.5 碱破坏溶液 1.45 1.000 2.5 氧化破坏溶液 6.72 1.000 2.7 光照破坏溶液 0.36 1.000 1.5 高温破坏溶液 0.34 1.000 1.6
根据图谱5-10和表4的结果可知，本发明所述方法在检测未经破坏的苹果酸舒尼替尼溶液和经破坏 的苹果酸舒尼替尼溶液中，主峰的峰纯度很高，表明主峰不包含有其他杂质峰；主峰与其他杂质色谱峰分 离度良好，≥1.5。因此本发明的方法在测定苹果酸舒尼替尼，甚至是苹果酸舒尼替尼降解样品的有关物 质时都是有良好专属性的，可以有效的检测控制保存过程中的苹果酸舒尼替尼的有关物质的含量。
实施例3精密度实验
溶液配制：
稀释液：配制水和乙腈的混合溶液，体积比为7:3。
苹果酸舒尼替尼供试品溶液：在避光条件下，取苹果酸舒尼替尼供试品适量，精密称定，置容量瓶中， 用适量稀释液配制成苹果酸舒尼替尼浓度为约0.50mg/mL的溶液，平行配制6份。
苹果酸舒尼替尼对照品溶液：在避光条件下，精密移取苹果酸舒尼替尼供试品溶液适量，置容量瓶中， 用适量稀释液稀释至苹果酸舒尼替尼浓度为约1.0μg/mL的溶液。
进样检测：
色谱条件如实施例1；
取苹果酸舒尼替尼对照品溶液进样2针，取6份苹果酸舒尼替尼供试品溶液各进样1针。按不加校正 因子的主成分自身对照法计算6份苹果酸舒尼替尼供试品溶液中各个杂质的含量、含量均值和总杂的相对 标准偏差值，并记录各杂质的保留时间及保留时间的相对标准偏差。
检测结果见表3
表3

根据检测结果可知，本发明提供的方法在检测苹果酸舒尼替尼有关物质的精密度实验中，各杂质的保 留时间基本稳定，采用不加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质的含量，各杂质的含量基本一致，总 杂相对标准偏差小于5.0％，具有非常好的精密度。
实施例4准确度实验
溶液配制：
稀释液：配制水和乙腈的混合溶液，体积比为7:3。
苹果酸舒尼替尼供试品溶液：在避光条件下，取苹果酸舒尼替尼供试品约27mg，精密称定，置50mL 容量瓶中，用适量稀释液使超声溶解并稀释至刻度，配制成苹果酸舒尼替尼浓度为约0.50mg/mL的溶液。
苹果酸舒尼替尼对照品溶液：在避光条件下，精密移取1mL苹果酸舒尼替尼供试品溶液至50mL容量 瓶中，用稀释液定容，摇匀；再精密移取上述溶液5mL至50mL容量瓶中，用稀释液定容，配制成苹果酸 舒尼替尼浓度为约1.0μg/mL的溶液。
有关物质B、C和E储备液：取有关物质B约16mg、有关物质C约6mg和有关物质E约6mg，精密称 定，置1000mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。
加标溶液：在避光条件下，取苹果酸舒尼替尼的供试品约27mg，精密称定，置于50mL的容量瓶中； 再精密移取5mL有关物质B、C和E储备液至上述50mL的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，配制成苹果酸 舒尼替尼浓度为约0.50mg/mL、含有关物质B浓度为约1.6μg/mL、有关物质C浓度为约0.6μg/mL和有 关物质E浓度分别为约0.6μg/mL的溶液，平行配制3份。
进样检测：
色谱条件如实施例1；
取配制好的苹果酸舒尼替尼对照品溶液、苹果酸舒尼替尼供试品溶液和加标溶液按实施例1的色谱条 件进行检测，每份样品进样1针，记录苹果酸舒尼替尼对照品溶液中对照峰的峰面积，记录苹果酸舒尼替 尼供试品溶液和加标溶液中有关物质B、有关物质C和有关物质E的峰面积，并按下式计算各杂质的加标 回收率：

理论量(mg)＝Wx×Px

式中：WSTD为苹果酸舒尼替尼对照品溶液中苹果酸舒尼替尼的称样量，mg；
Wx为有关物质B、有关物质C和有关物质E的称量；
ASTD为苹果酸舒尼替尼对照品溶液中对照峰峰面积；
AS为苹果酸舒尼替尼供试品溶液中有关物质(有关物质B、C或E)的峰面积；
AX为各加标溶液中有关物质(有关物质B、C或E)的峰面积；DStd为苹果酸舒尼替尼对照品 溶液的稀释倍数；
DX为各加标溶液的稀释倍数；
PStd为苹果酸舒尼替尼供试品的含量,为99.4％，w/w；
PX为有关物质B(98.7％，w/w)、有关物质C(99.7％，w/w)和有关物质E(99.2％，w/w) 的含量；
实验结果如表4
表4

实施例5对比实施例
取实施例2强降解实验中氧化破坏溶液作为测试液，按现有技术国家食品药品监督管理局进口药品注 册标准，苹果酸舒尼替尼胶囊(标准编号：JX20060174)，中公开的苹果酸舒尼替尼的有关物质的检测方 法进行检测，进样1针，记录色谱图。如图11，表明氧化破坏产生的杂质与主峰无法分离。
综上所述，
本发明所述的苹果酸舒尼替尼的有关物质的方法具有很好的专属性，精密度良好，准确度高和检测速 度快，可适用于生产以及保存期间的有关物质的控制。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文 所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明内。