高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置及检测方法技术领域
本发明属于激光共聚焦拉曼光谱检测领域，具体来说，涉及一种高稳定性的表面
增强拉曼光谱的液相检测装置及检测方法。
背景技术
拉曼光谱是一种散射光谱。光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射，弹性散
射的散射光是与激发光波长相同，非弹性散射的散射光有比激发光波长长的或短的成分，
统称为拉曼效应。拉曼效应起源于分子振动与转动，因此拉曼光谱能够提供分子内部各种
简正振动频率及其振动能级情况，从而鉴定分子中存在的官能团、分子特征结构及其所处
的环境。利用拉曼光谱技术对样品进行检测和鉴别具有非接触、无破坏等优点，无需特殊样
品制备步骤，并且由于水对拉曼光谱的影响非常小，所以拉曼光谱可以被广泛地应用于生
物体系中具备生物活性样品的检测。然而拉曼散射光谱的强度仅为入射光强的10-10，信号
太弱以致难以收集检测。近年来，随着纳米技术的不断发展，表面增强拉曼散射光谱技术
（SurfaceEnhancedRamanScattering，SERS）的出现极大的提高了拉曼光谱技术的检测
灵敏度。当具有拉曼活性的分子与金属纳米结构接触时，通过金属纳米结构的电磁增强和
化学增强效应作用，能够使分子的拉曼光谱得到极大增强，增强能力达104~107。因此，基于
SERS的拉曼检测技术在超灵敏检测中已有广泛应用。
但是长久以来，基于SERS的拉曼检测技术只能够对样品进行定性的分析，极大地
限制其在定量分析领域中的应用，造成这一结果最为关键一点就是缺少简单易行的手段将
纳米结构排列成均匀的SERS基底，从而在不同的基底区域获得均匀一致可重复的SERS信
号。通过离子束或电子束光刻技术能够获得大范围均匀的金属纳米结构阵列，用作可重复
的SERS基底，但该方法需要大型设备，花费大产出低。较常用的方法就是将金属纳米颗粒与
拉曼活性分子的混合溶液滴在硅片上，等液滴干燥后直接对硅片表面混合物质检测，由于
干燥过程中“咖啡环”效应而导致干燥后的液滴区域内物质分布不均，液滴边缘浓度大，而
中间区域稀少，从而导致SERS信号严重不均匀，同一个基片上不同点测得的拉曼信号强度
千差万别无法重复，虽然方法简单，但只能用于定性分析。此外，静电吸附组装方法制备
SERS基底也得到广泛应用。通过静电吸附作用，可以将带电金属纳米颗粒均匀铺散在硅片
表面得到均一SERS基底，但由于颗粒结构和尺寸不同导致沉降速率不一样，在硅片表面通
过静电吸附形成的颗粒阵列密度不同，因此也无法定量评价不同金属纳米颗粒之间的SERS
活性的相对高低。传统表面增强拉曼光谱检测方法耗时、耗力且效果不佳这些问题，无法满
足样品的简单、快速、准确定量分析要求。因此本团队将注意力从固相加测转移到液相检测
中来，因为固相检测的不确定性就是由于分子浓度或者增加结构不均匀导致，而在溶液中
金属纳米颗粒和拉曼分子都是均匀分布的，且很多生物活性物质在溶液中才能保证其活性
不变，因此液相拉曼检测对于很多物质的分析和鉴别具有重要意义。然而，目前用市面上常
用的耦合正置激光共聚焦显微镜的拉曼光谱仪来检测溶液样品，所得到的拉曼光谱强度也
是忽高忽低，很不精确。在实验过程中我们发现，造成这一现象的原因主要是激光聚焦点选
取不当：当选取溶液表面或者溶液与容器底部接触面作为聚焦点，因纳米颗粒会在液体表
面形成膜状漂浮团聚体，在容器底部也会不可避免的存在一些团聚体受重力作用沉降下
来，从而造成聚焦点测得拉曼光谱局部增强，而在其他地方强度较低；当选择溶液中心作为
聚焦点，在检测过程中大家都忽视了检测光程对结果造成的影响，激光在检测溶液中光程
不同，进而光程内被激发的拉曼分子数量不同，最终导致拉曼信号强度不稳定。
发明内容
技术问题：本发明所要解决的技术问题是：提供一种高稳定性的表面增强拉曼光
谱的液相检测装置，该检测装置可以定量的检测溶液样品的表面增强拉曼光谱，且拉曼光
谱具有稳定性，满足样品无损、无需预处理、快速准确等检测需求；同时还提供检测方法，
简单易操作，且检测准确。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明实施例采用的技术方案是：
一方面，本实施例提供一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置，该检测装
置包括带有物镜的倒置激光共聚焦显微镜、拉曼光谱仪、用于盛放待测溶液的容器、聚焦基
片和隔片，隔片中设有通孔；隔片置于容器中，聚焦基片位于隔片上方，且聚焦基片覆盖隔
片的通孔；待测溶液完全浸没聚焦基片和隔片通孔；容器位于激光共聚焦显微镜的样品台
上，物镜位于激光共聚焦显微镜的样品台下方；物镜镜头与隔片的通孔相对；拉曼光谱仪的
光路与激光共聚焦显微镜的物镜的光路连接。
作为优选例，所述的容器为透明光学石英材质制成。
作为优选例，所述的聚焦基片为石英片或者硅片，且石英片的光滑面或者硅片的
光滑面与隔片相对。
作为优选例，所述的隔片和聚焦基片完全浸没在待测溶液液面下方。
另一方面，本实施例提供一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测方法，该
检测方法包括：
第一步：连接检测装置：将隔片置于容器内侧底面上，然后将聚焦基片置于隔片上，且
聚焦基片覆盖隔片的通孔；将激光共聚焦显微镜倒置；将容器置于激光共聚焦显微镜的样
品台上，调整激光共聚焦显微镜的样品台，使容器位置正对位于激光共聚焦显微镜样品台
下方的物镜，且物镜镜头与隔片的通孔相对；将拉曼光谱仪的光路与激光共聚焦显微镜的
物镜的光路连接；
第二步：将待测溶液倒入容器中，待测溶液完全浸没聚焦基片和隔片的通孔，且待测溶
液的液面位于聚焦基片上方；
第三步：开启激光共聚焦显微镜和拉曼光谱仪，拉曼光谱仪的激发光束通过共聚焦显
微镜的物镜聚焦为光斑，调节聚焦平面将光斑映射在聚焦基片和待测溶液交界面处，激光
光束和光斑所在范围内，激发出的拉曼散射信号通过激光共聚焦显微镜的物镜接收并传送
到拉曼光谱仪中，拉曼光谱仪采集拉曼散射信号并绘制出拉曼光谱。
作为优选例，通过调节隔片的厚度对检测光程进行精确调节，检测光程为拉曼光
谱仪发出的激光光束和光斑在待测溶液中所占范围。
有益效果：与现有技术相比，本发明实施例具有以下有益效果：
1.本发明实施例的液相检测装置及方法，无需将金属纳米颗粒利用各种费时费力的方
法排列成均匀的阵列或单层膜，直接对溶液中颗粒和拉曼分子进行检测，无需特殊处理制
样简单快速，由于颗粒和拉曼分子在溶液中自由分散、密度均匀，排除了颗粒不规则团聚的
耦合作用对检测造成的误差，极大的提高了所测拉曼光谱的重复性。
2.本发明实施例的检测装置及方法，选取溶液中间界面（如图1中的P3）作为激光
光斑聚焦点，而非使用传统液相检测方法中选取的溶液上液面（如图1中的P1）或者溶液与
容器底接触面（如图1中的P2）作为聚焦点。在溶液上液面（如图1中的P1）纳米颗粒会由于自
组装作用形成微小的膜碎片漂浮在溶液上表面。容器底部接触面（如图1中的P2）因为沉降
作用而积累了不均匀分散的纳米颗粒微小团簇。因此将激光光斑聚焦在溶液上液面或者容
器底接触面这两个界面，获得的拉曼光谱稳定重复性非常差，不均匀分散的颗粒团聚体或
组装体导致拉曼光谱强度忽高忽低。本实施例选取溶液中间界面作为激光聚焦点，有效避
开团聚体和组装体，通过检测均匀分散的颗粒和拉曼分子复合物获得稳定的拉曼光谱。
3.本发明实施例的检测装置及方法中，隔片的厚度可调，从而调节激光在液体中
的光程，通过使用不同厚度的隔片，所测得的拉曼光谱强度随着光程增加而线性增加。这是
因为光程增加导致所被激发的颗粒和拉曼分子数量增加，从而获得了更强的拉曼散射信
号。而传统液相拉曼检测方法是使用拉曼光谱仪结合正置激光共聚焦显微系统，对石英片
上微小液滴或者石英毛细管中溶液进行测量，没有考虑到检测方法中光程对检测结果的影
响，而且在这些方法中很难保证不同样品在检测时光程一致，导致检测中产生误差。考虑到
光程能够极大影响所测得拉曼光谱的强度，本实施例的检测方法可以非常简单地通过调节
隔片的厚度来调节和固定光程，有效排除传统方法中光程不确定对结果的误差，获得更加
准确的拉曼光谱。
附图说明
图1为本发明实施例液相检测装置的结构示意图；
图2为本发明实施例1的拉曼光谱图；
图3为本发明实施例2的拉曼光谱图；
图4为本发明实施例3的拉曼光谱图；
图5为本发明实施例1—实施例3所测得的拉曼光谱平均值示意图；
图6为本发明实施例1—实施例3中所得的拉曼光谱强度随检测光程变化关系曲线图；
图7为本发明实施例4的拉曼光谱图；
图8为本发明对比例1的拉曼光谱图；
图9为本发明对比例2的拉曼光谱图；
图10为本发明实施例1、对比例1和对比例2的拉曼光谱相对标准偏差示意图。
图中有：激光共聚焦显微镜1、物镜101、光路102、拉曼光谱仪2、容器3、聚焦基片4、
隔片5、待测溶液6、待测溶液上液面P1、待测溶液与容器底接触面P2、聚焦基片光滑一侧与
待测溶液接触面P3、检测光程D。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不用来限制本发明的范围。
如图1所示，本发明实施例的一种高稳定性的表面增强拉曼光谱的液相检测装置，
包括带有物镜101的倒置激光共聚焦显微镜1、拉曼光谱仪2、用于盛放待测溶液的容器3、聚
焦基片4和隔片5，隔片5中设有通孔；隔片5置于容器3中，聚焦基片4位于隔片5上方，且聚焦
基片4覆盖隔片5的通孔；待测溶液6完全浸没聚焦基片4和隔片5的通孔。容器3位于激光共
聚焦显微镜1的样品台上，物镜101位于激光共聚焦显微镜1的样品台下方。物镜101镜头与
隔片5的通孔相对；拉曼光谱仪2的光路102与激光共聚焦显微镜的物镜101的光路连接。拉
曼光谱仪2的光路102包括激光发射和散射光接收线路。
上述结构的液相检测装置，激光共聚焦显微镜1为倒置型显微镜，其物镜101位于
激光共聚焦显微镜1的样品台下方。使用时，聚焦基片4和隔片5浸没在待测溶液6中。拉曼光
谱仪2发射的激光束通过激光共聚焦显微镜1的物镜101，聚焦到聚焦基片4底面和待测溶液
的交界面上，为一光斑。激光光束和光斑所在范围内激发的拉曼散射信号，又通过激光共聚
焦显微镜的物镜101接收并传送到拉曼光谱仪2中，由拉曼光谱仪2采集拉曼散射信号并绘
制出拉曼光谱。
待测溶液可以为金属纳米颗粒与拉曼活性分子的混合溶液。激光束从容器正下方
穿过，打到金属纳米颗粒与拉曼活性分子混合溶液中，调节激光聚焦点，将激光束聚焦在聚
焦基片光亮面与液体接触面，此时会从电脑上看到明场内有一个较强的激光反射斑块，证
明聚焦成功。
本实施例通过激光共聚焦显微镜1将激发光束聚焦点调节到待测溶液中部。在溶
液表面纳米颗粒会由于自组装作用形成微小的膜碎片漂浮在溶液上表面。容器底部因为沉
降作用而积累了不均匀分散的纳米颗粒微小团簇。因此，将激光光斑聚焦在溶液上液面或
者容器底部这两个界面，获得的拉曼光谱稳定重复性非常差，不均匀分散的颗粒团聚体或
组装体导致拉曼光谱强度忽高忽低。本实施例选取溶液中间界面作为激光聚焦点，有效避
开团聚体和组装体，通过检测均匀分散的颗粒和拉曼分子复合物获得稳定的拉曼光谱。
将激发光束聚焦点调节到待测溶液中部，如果激光共聚焦显微镜1位于聚焦基片4
上方，即激光共聚焦显微镜1正置，那么聚焦基片4相当于容器底部，在聚焦基片4的顶面仍
然会因为沉降作用而积累了不均匀分散的纳米颗粒微小团簇，影响检测的准确性。本实施
例将激光共聚焦显微镜1倒置，且位于聚焦基片4的下方，激光聚焦点位于聚焦基片4的底
面。在聚焦基片4的底面不会产生不均匀分散的颗粒团聚体或组装体。因此，本实施例的检
测装置能够更加精准的检测拉曼光谱。
作为优选例，所述的容器为透明光学石英材质制成。石英材质相对于其他透明容
器（如玻璃和聚合物塑料）的优点就是容器本身不会产生拉曼信号而干扰到检测结果。所述
的聚焦基片4为石英片或者硅片，且石英片的光滑面或者硅片的光滑面与隔片5相对。光滑
表面便于激光光斑发生镜面反射，从而更容易确定聚焦成功。
作为优选例，所述的隔片5和聚焦基片4完全浸没在待测溶液液面下方。为确保检
测的准确性，隔片5和聚焦基片4完全浸没在待测溶液液面下方，可以使激发光束聚焦点位
于待测溶液中部。在溶液表面，纳米颗粒会由于自组装作用形成微小的膜碎片漂浮在溶液
上表面；容器底部，因为沉降作用而积累了不均匀分散的纳米颗粒微小团簇。这些都会影响
检测的准确性。
利用上述实施例的检测装置进行表面增强拉曼光谱的液相检测方法，包括以下步
骤：
第一步：连接检测装置：将隔片5置于容器3内侧底面上，然后将聚焦基片4置于隔片5
上，且聚焦基片4覆盖隔片5的通孔；将激光共聚焦显微镜（1）倒置，将容器3置于激光共聚焦
显微镜样品台上，调整激光共聚焦显微镜1的样品台，使容器3位置正对位于激光共聚焦显
微镜1样品台下方的物镜101，且物镜101镜头与隔片5的通孔相对；将拉曼光谱仪2的光路
102（包括激光发射和散射光接收线路）与激光共聚焦显微镜的物镜101光路连接；
第二步：将待测溶液6缓慢倒入容器中，待测溶液6完全浸没聚焦基片4和隔片5的通孔，
且待测溶液的液面位于聚焦基片4上方；
第三步：开启激光共聚焦显微镜1和拉曼光谱仪2，拉曼光谱仪2的激发光束通过共聚焦
显微镜的物镜101聚焦为光斑，调节聚焦平面将光斑映射在聚焦基片4和待测溶液交界面
处，激光光束和光斑所在范围内，激发出的拉曼散射信号通过激光共聚焦显微镜的物镜101
接收并传送到拉曼光谱仪2中，拉曼光谱仪2采集拉曼散射信号并绘制出拉曼光谱。
在上述检测方法中，通过调节隔片5的厚度，对检测光程D进行精确调节，检测光程
为拉曼光谱仪2发出的激光光束和光斑在检测溶液中所占范围。通过调节隔片5的厚度，可
以实现对检测光程中受激发拉曼分子数量精确控制，在同一聚焦平面内随机选取任意一点
进行测量，所得拉曼光谱能够保持较高稳定性和重复性，排除传统方法中因检测浓度和检
测光程不均匀所带来的误差。
下面通过实施例来验证本发明的液相检测装置和方法能够更加准确、稳定地检测
拉曼光谱。
实施例1
待测溶液：将柠檬酸钠法合成的银纳米颗粒与拉曼信号分子尼罗蓝A（NBA）共孵育，NBA
分子的终浓度为1×10-5M，孵育3h。
检测装置：采用本实施例的检测装置。取2mL上述银纳米颗粒与NBA混合溶液置于
石英培养皿（直径30mm）中，溶液中放置一片隔片。隔片为方形玻片，边长为15mm，孔径为
10mm，厚度为1mm。玻片圆孔正上方盖上一块硅片（即聚焦基片），硅片光亮一面朝下。
调节激光光斑聚焦在硅片光亮面与溶液接触界面，此时显微镜软件明场可视窗口
中会观察到较强的激光反射斑块，证明激光已成功聚焦在接触界面处。
在同一聚焦平面内，任意选取6个不同区域作为检测点，调节软件参数，检测拉曼
光谱。6个聚焦点为，以玻片圆孔轴线和硅片交点为对称中心，在半径为2mm的圆上均匀选取
6个点。检测的拉曼光谱图如图2所示。图2中，X轴向表示样品编号，Y轴向表示波数，单位cm
-1，Z轴向表示相对强度，单位a.u.（arbitraryunits的缩写，表示任意单位）。从图2可以看
出：这6个不同聚焦点测得的拉曼光谱的相对强度非常相近，在一些特征峰上也未看出在波
数上的偏移因此，这6个点的拉曼光谱重复性很好。
实施例2
待测溶液和检测装置与实施例1相同。所不同的是玻片厚度为0.2mm。
调节激光光斑聚焦在硅片光亮面与溶液接触界面，此时显微镜软件明场可视窗口
中会观察到明亮的激光反射斑块，证明激光已成功聚焦在接触界面处。
聚焦点位置为：以玻片圆孔轴线和硅片交点为圆心，以距离该圆心2mm的圆上任意
选取6个点为聚焦点。检测的拉曼光谱图如图3所示。图3中，X轴向表示样品编号，Y轴向表
示波数，单位cm-1，Z轴向表示相对强度，单位a.u.。从图3可以看出：这6个不同聚焦点测得的
拉曼光谱的相对强度非常相近，在一些特征峰上也未看出在波数上的偏移。因此，这6个点
的拉曼光谱重复性很好。
图3和图2比较，拉曼光谱的强度大大降低，因为通过将隔片5厚度从1mm降低到
0.2mm，检测光程减小，从而被激光激发的纳米颗粒和拉曼分子数量减小。
实施例3
待测溶液和检测装置与实施例1相同。所不同的是玻片厚度为0.5mm。
调节激光光斑聚焦在硅片光亮面与溶液接触界面，此时显微镜软件明场可视窗口
中会观察到明亮的激光反射斑块，证明激光已成功聚焦在接触界面处。
聚焦点位置为：以玻片圆孔轴线和硅片交点为圆心，以距离该圆心2mm的圆上任意
选取6个点为聚焦点。检测的拉曼光谱图如图4所示。图4中，X轴向表示样品编号，Y轴向表示
波数，单位cm-1，Z轴向表示相对强度，单位a.u.。从图4可以看出：这6个不同聚焦点测得的拉
曼光谱的相对强度非常相近，在一些特征峰上也未看出在波数上的偏移。因此，这6个点的
拉曼光谱重复性很好。
图4和图3比较，拉曼光谱信号的强度有所增加，因为将隔片5的厚度从0.2mm增加
到0.5mm，检测光程增加，因此被激光所激发的纳米颗粒和拉曼分子的数量也有所增加。
对实施例1、实施例2和实施例3所测得的拉曼光谱的相对强度进行绘制，每个实施
例检测六个聚焦点所得拉曼光谱取平均值，形成图5，算得每个实施例所测六点拉曼光谱最
高峰591cm-1处强度平均值和标准差，形成图6。其中，图5的横坐标为拉曼波数，纵坐标为不
同检测光程处所测得拉曼光谱相对强度。检测光程分别为实施例1的1mm、实施例2的0.2
mm、实施例3的0.5mm。图6的横坐标为检测光程，纵坐标为不同检测光程处所测得拉曼光谱
最高峰相对强度的平均值和标准差。图6是图5中所得的拉曼光谱相对强度，随检测光程D变
化关系曲线（0.2mm、0.5mm、1mm）。从图5和图6可以看出，所测得拉曼信号的强度随着检
测光程增加而增强。通过改变玻片厚度，即改变检测光程，可以改变拉曼信号的强度。
实施例4
待测溶液：将Galvanicreplacement法合成的金银合金纳米颗粒与拉曼信号分子尼罗
蓝A（NBA）共孵育，NBA分子的终浓度为1×10-5M，孵育3h。
检测装置：取2mL上述金银合金纳米颗粒与NBA混合溶液置于石英培养皿（直径30
mm）中，溶液中放置一片隔片。隔片为方形玻片，边长为15mm，孔径为10mm，玻片厚度为1
mm。玻片圆孔正上方盖上一块硅片，硅片光亮一面朝下。
调节激光光斑聚焦在硅片光亮面与溶液接触界面，此时显微镜软件明场可视窗口
中会观察到明亮的激光反射斑块，证明激光已成功聚焦在接触界面处。
聚焦点位置为：以玻片圆孔轴线和硅片交点为对称中心，在半径为2mm的圆上均匀
选取6个点。检测的拉曼光谱图如图7所示。图7中，X轴向表示样品编号，Y轴向表示波数，单
位cm-1，Z轴向表示相对强度，单位a.u.。从图7中可以看出：这6个不同聚焦点测得的拉曼光
谱的相对强度非常相近，在一些特征峰上也未看出在波数上的偏移。本发明实施例方法可
以拓展到其他液体样品的检测上，并且同意具备良好的重复性。
对比例1
待测溶液与实施例1相同。
采用传统正置激光共聚焦显微拉曼光谱仪在待测溶液上液面（如图1中的P1处）测
得的拉曼光谱。以石英容器轴心为对称中心，在上液面半径为2mm的圆上均匀选取6个点。拉
曼光谱如图8所示，从图8中可以看出，6个不同点所测得拉曼光谱差异很大，所测得拉曼信
号强度时强时弱难以重复。
对比例2
待测溶液与实施例1相同。
采用传统正置激光共聚焦显微拉曼光谱仪在待测溶液底面（如图1中的P2处）测得
的拉曼光谱。6个聚焦点位置为：以石英容器轴心为对称中心，在溶液底接触面半径为2mm的
圆上均匀选取6个点。拉曼光谱如图9所示。从图9上可以看出，6个不同点所测得拉曼光谱差
异很大，所测得拉曼信号强度时强时弱难以重复。
图10为图2、图8和图9所测得拉曼光谱的相对标准偏差，相对标准偏差为标准偏差
与平均值的比值，用来衡量一组数据的波动性。相对标准偏差越小，证明数据波动性越小。
从图10中可以看出：实施例1的相对标准偏差为4.78，明显小于对比例1的26.6和对比例2的
64.9。因此，本发明拉曼光谱检测方法有着很好的重复性，更加稳定。