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1、(10)申请公布号 CN 102262079 A (43)申请公布日 2011.11.30 CN 102262079 A *CN102262079A* (21)申请号 201010193065.4 (22)申请日 2010.05.27 G01N 21/64(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 中国科学院物理研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村南三街 8 号 (72)发明人 李辉 王鹏业 窦硕星 刘玉如 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 曹津燕 (54) 发明名称 一种通过实时监测细胞内吞研究抗癌药物的 方。
2、法 (57) 摘要 本发明提供一种实时监测细胞内吞研究抗癌 药物的方法。本发明提供的实时监测细胞内吞过 程的方法包括以下步骤 ： 1) 加入抗癌药物， 使其 作用于待测细胞 ； 2) 通过两步标记法， 在待测细 胞的细胞膜上连接表皮生长因子 - 量子点探针 ； 3)采用荧光显微镜， 在光强小于100W条件下进 行观测并拍摄， 根据量子点标记来追踪细胞内吞 过程 ； 4) 定量分析拍摄数据， 得到相对内吞曲线。 本发明所提供的方法通过全程实时观测， 定量分 析抗癌药物对细胞内吞的影响来达到研究其药物 作用效果， 还考虑了细胞形状的影响， 将不同细胞 的内吞输运数据规范化， 完全可实现横向比较， 。
3、为 抗癌药物的研究、 研制、 筛选、 治疗效果等提供一 种新的定量研究方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 CN 102262092 A1/1 页 2 1. 一种实时监测细胞内吞过程的方法， 其包括以下步骤 ： 1) 加入抗癌药物， 使其作用于待测细胞 ； 2) 通过两步标记法， 在待测细胞的细胞膜上连接表皮生长因子 - 量子点探针 ； 3) 采用荧光显微镜， 在光强小于 100W 条件下进行观测并拍摄， 根据量子点标记来追 踪细胞内吞过程 ； 4) 定量分析拍摄数据， 得到相对内吞曲线。 。
4、2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 其中所述步骤 1) 中的作用于待测细胞的 抗癌药物浓度为 100nM-4M， 作用时间为 2-18 小时。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 其中所述步骤 2) 中的两步标记法包 括以下步骤 ： a) 将 10-50nM 浓度的表皮生长因子 - 生物素结合体溶液加入至经步骤 1) 处理的待测 细胞中， 在冰浴下培育 5-10min 后吸出溶液， 并用培养液冲洗 ； 优选地， 所述培养液为 4无 酚红的 DMEM 培养液 ； b) 将 0.1-1nM 浓度的量子点 - 链霉亲和素结合体溶液加入步骤 a) 处理后的待测细。
5、胞 中， 冰浴培育 1-5min 后， 吸出溶液， 并用缓冲液冲洗 ； 优选地， 所述缓冲液为 4的 PBS 缓冲 液 ； c) 将培养液加入步骤 b) 处理后的待测细胞中作为观测液 ； 优选地， 所述培养液为无酚 红的 DMEM 培养液。 4. 根据权利要求 1 至 3 中任一项所述的方法， 其特征在于， 其中所述步骤 3) 中将细胞 放置在荧光显微镜载物台上的 37二氧化碳培养室进行观测。 5. 根据权利要求 1 至 4 中任一项所述的方法， 其特征在于， 其中所述步骤 3) 中用荧光 显微镜进行观测的方法为快门和 CCD 曝光同步， 每帧 150ms 曝光， 间隔 1 秒， 持续 60m。
6、in。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括以下的数据 处理方法 ： a) 找到每帧图片中的光点的位置坐标并记录 ； b) 画出细胞轮廓线， 记录轮廓线坐标， 并设细胞核中心为点 O ； c) 求出每帧图片中的光点相对于点 O 的距离的平均值 S， 细胞轮廓线的各坐标相对于 点 O 的距离的平均值 L， 计算出每帧 S/L 的值， 将其定义为相对内吞距离 ； d) 将帧数换算为时间， 以相对距离和时间作图， 即得到相对内吞曲线。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法中的待测细胞为癌 细胞， 优选选自人肺癌细胞、 人宫颈癌细胞和人。
7、皮肤鳞癌细胞。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法中的抗癌药物为以 微管为靶点的抗癌药物， 优选选自秋水仙素、 长春碱、 诺考达唑和紫杉醇。 9.权利要求1至8中任一项所述方法在实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程中的用 途。 10. 一种实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程的方法， 其特征在于， 所述方法包括采 用权利要求 1 至 8 中任一项所述方法实时监测细胞内吞过程。 权 利 要 求 书 CN 102262079 A CN 102262092 A1/4 页 3 一种通过实时监测细胞内吞研究抗癌药物的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地，。
8、 本发明涉及一种通过实时监测细胞内吞研究 抗癌药物的方法。 背景技术 0002 随着生命科学研究的快速发展， 生物荧光技术在细胞免疫学、 分子生物学、 肿瘤学 等方面的应用越来越广泛。荧光技术已经成为生命科学研究的重要手段之一。但是传统的 荧光探针如绿色荧光蛋白 (GFP)、 Alexa Fluro、 Cy3、 Cy5 等有一些无法克服的缺点， 比如会 有不同程度的荧光淬灭， 光强不稳定， 无法应用于长时间观测实验。 然而许多生命过程是一 种长时间， 持续性的变化， 所以需要一种稳定性好的荧光探针。 0003 量子点 (quantum dots， QDs) 又可称为半导体纳米微晶体， 是一种稳。
9、定的、 可溶于 水的、 尺寸为 2-20nm 的纳米晶体。作为一种新型的荧光材料， 与传统的有机染料分子相比， 量子点具有多种优势， 例如激发光谱宽， 稳定性好， 发光寿命长等。正是由于其优良的光谱 特征和光化学稳定性， 量子点已经被应用于活细胞成像观察， 并在生物化学， 分子生物学， 基因组学， 生物大分子相互作用等研究中有极广的应用前景。 0004 很多抗癌药物都是以细胞骨架为靶点， 如秋水仙素、 紫杉醇等。 这些药物让细胞的 微管解聚， 或者促进微管聚合并使其在细胞内聚集。 这样干扰了微管的功能， 从而阻断细胞 的分裂， 以治疗癌症。 但是微管的功能不仅是帮助细胞完成有丝分裂， 同时还是。
10、细胞内吞输 运的重要通道。其中一个重要的方面就是细胞膜上受体介导的内吞过程， 比如 EGFR( 表皮 生长因子受体 )。此外， 抗癌药物对细胞内吞功能的影响也是衡量其药效的一个重要方面。 0005 目前对细胞内吞的研究策略是在的不同时间点来拍照取数据， 通过几个时间点的 静态图片来找到抗癌药物的影响， 多是定性结论， 且不是针对某一个特定细胞的。 这样的结 果进行横向比较时， 其可信度降低， 更重要的是， 无法得到内吞输运的全面、 动态、 实时可见 的数据。 发明内容 0006 因此， 本发明的目的是提供一种实时监测细胞内吞过程的方法。 0007 本发明的另一个目的是提供上述方法在实时监测抗癌。
11、药物作用于细胞内吞过程 中的用途。 0008 本发明的又一个目的是提供一种实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程的方法。 0009 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面， 本发明提供一种实时监测 细胞内吞过程的方法， 其包括以下步骤 ： 1) 加入抗癌药物， 使其作用于待测细胞 ； 2) 通过两 步标记法， 在待测细胞的细胞膜上连接 EGF-QD( 表皮生长因子 - 量子点 ) 探针 ； 3) 采用荧 光显微镜， 在光强小于 100W 条件下进行观测并拍摄， 根据量子点标记来追踪细胞内吞过 程 ； 4) 定量分析拍摄数据， 得到相对内吞曲线。 0010 优选地， 其中所述步骤 1) 中将。
12、抗癌药物用细胞培养液 DMEM 稀释到工作浓度 说 明 书 CN 102262079 A CN 102262092 A2/4 页 4 100nM-4uM 后， 加入生长待测细胞的培养皿中， 并在培养箱中放置相应的时间， 一般 2-18 小 时。 0011 优选地， 其中所述步骤 2) 中的两步标记法包括以下步骤 ： a) 吸出培养皿中的原培 养液， 将 10-50nM 浓度的 biotin-EGF( 表皮生长因子 - 生物素结合体 ) 溶液加入至培养皿 中， 并在冰浴下培育 5-10min 后吸出 biotin-EGF 溶液， 并用 4无酚红的 DMEM 培养液冲洗 3 遍 ； b) 将 0.。
13、1-1nM 浓度的 streptavidin-QD( 量子点 - 链霉亲和素结合体 ) 溶液加入至步 骤 a) 处理后的待测细胞的培养皿中， 冰浴培育 1-5min 后， 吸出 steptavidin-QD 溶液， 并用 4的 PBS 缓冲液冲洗 ； c) 将无酚红的 DMEM 培养液加入至步骤 b) 处理后的待测细胞的培 养皿中作为观测液。 0012 优选地， 其中所述步骤 3) 中的光强及拍摄参数调节如下 ： 在荧光显微镜汞灯后 加光强衰减片， 以使物镜出射光强小于 100W， 保证细胞在长时间的激光照射下不会受影 响。另调节控制激发光快门的打开时间， 与 CCD 曝光时间同步以进一步减少。
14、激光对细胞的 损害。安全范围是每次曝光时间 150-300ms， 每帧拍摄间隔 1-3 秒。将细胞放置在荧光显微 镜载物台上的 37二氧化碳 5培养室进行观测。 0013 优选地， 其中所述步骤 4) 定量分析录像数据包括以下步骤 ： a) 找到每帧图片中的 光点的位置坐标并记录 ； b) 画出细胞轮廓线， 记录轮廓线坐标， 并设细胞核中心为点 O ； c) 求出每帧图片中的光点相对于点O的距离的平均值S， 细胞轮廓线的各坐标相对于点O的距 离的平均值L， 计算出每帧S/L的值， 将其定义为相对内吞距离 ； d)将帧数换算为时间， 以相 对距离和时间作图， 即得到相对内吞曲线。相对内吞曲线的变。
15、化范围即说明了内吞过程的 相对大小。 0014 优选地， 所述方法中的待测细胞为癌细胞， 优选选自人肺癌细胞 (A549)、 人宫颈癌 细胞 (Hela)、 人皮肤鳞癌细胞 (A431) 等贴壁细胞。 0015 优选地， 所述抗癌药物为以微管为靶点的抗癌药物， 优选选自秋水仙素、 长春碱、 诺考达唑、 紫杉醇等。 0016 另一方面， 本发明提供了上述方法在实时监测抗癌药物作用于细胞内吞过程中的 用途。 0017 由此可见， 本发明利用了量子点的光稳定特性， 通过全程实时观测， 定量分析抗癌 药物对细胞内吞的影响来达到研究其药物作用效果， 是一种全新的研究策略。本发明还对 实时观测过程中采用的。
16、荧光显微镜的配置激光光强进行了优化， 筛选出对细胞没有损伤的 光强(小于100W以下， 优选为60100W)， 在此光强下细胞没有发生收缩和结构形变， 有利于采用荧光显微镜准确真实的记录细胞内吞过程。此外， 本发明还考虑了细胞形状的 影响， 将不同细胞的内吞输运数据规范化， 完全可实现横向比较。因而， 本发明为抗癌药物 的研究、 研制、 筛选、 治疗效果等方面提供了一种新的定量研究方法。本发明还提出了实验 数据处理方法， 以抗癌药物紫杉醇为例做出了相对内吞曲线， 对其他影响微管的类似药物 也能得到相应的曲线。这样抗癌药物对内吞输运的影响就可以定量分析出， 得到持续长时 间的动态数据， 贯穿整个。
17、内吞过程。本发明提供的方法可以应用于各种作用于微管的抗癌 药物， 例如秋水仙素， 长春碱， 紫杉醇等上， 同时对于不同的细胞一样适用， 例如 A549、 A431、 Hela 等。 说 明 书 CN 102262079 A CN 102262092 A3/4 页 5 附图说明 0018 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中 ： 0019 图 1 为本发明实施例 1 中所使用的荧光显微镜。 0020 图 2 为本发明实施例 1 中所使用的 37二氧化碳培养室。 0021 图 3 为本发明实施例 1 中使用不同光强拍摄实验前后的细胞明场图像， 其中图 3A 为约 100W， 图 3B。
18、 为约 150W， 图 3C 为约 300W。 0022 图 4 为本发明实施例 1 中的实验数据处理过程， 其中 A 为细胞明场和暗场的叠加 图， 细胞内的光点是 EGF(R)-QD， 光点随时间将向细胞核附近运动 ； B 为通过细胞明场图可 以画出细胞轮廓和细胞核中心点O ； C为定位细胞内的光点位置(小圈) ； D为将光点位置和 细胞轮廓输入计算机， 程序计算距离 S 和 L 值。 0023 图5为本发明实施例1中做出的相对内吞曲线图， 其中横轴是时间， 纵轴是相对内 吞距离。 可以看出加入紫杉醇和对照的相对内吞曲线的位置， 在实验开始时几乎相同， 但是 之后紫杉醇的相对内吞曲线的变化量。
19、明显小于对照曲线， 说明紫杉醇药物严重影响了细胞 的内吞输运。 具体实施方式 0024 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解， 这些实施例仅 用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。 0025 实施例 1 本发明提供的实时监测细胞内吞的方法 0026 本实施例以抗癌药物紫杉醇为例， 详细描述本发明所提供的实时监测细胞内吞的 方法， 评价紫杉醇对细胞内吞功能的影响， 具体详述如下 0027 先将紫杉醇作用于细胞上。具体方法是 ： 将紫杉醇 (Invitrogen) 用 DMEM 培养液 (Hyclone) 稀释至浓度 4M， 加入至生长有人肺癌细胞 (A549， 购。
20、自北京协和细胞资源中 心 ) 的培养皿中。并放置在 37培养箱中作用 2-4 小时。 0028 通过两步标记法， 使细胞膜连接上 EGF-QD 探针， 具体可参见 Jaiswal， J.K.， H.Mattoussi， et al.Long-term multiple color imaging of live cells usingquantum dot bioconjugates. Nature Biotechnology 21， 47-51(2002)， 方 法 如 下 ： 首 先 将 10-50nM浓度的biotin-EGF(表皮生长因子-生物素结合体， Invitrogen)溶液30。
21、0-500l 加入培养皿， 并在冰浴培育5-10min。 然后吸出biotin-EGF溶液， 并用4无酚红的DMEM培 养液 (Hyclone) 冲洗 3 遍。之后将 0.1-1nM 浓度的 streptavidin-QD655( 量子点 - 链霉亲 和素结合体， 量子点发射波长655nm， Invitrogen)溶液500-1000l加入细胞培养皿， 冰浴 培育 1-5min。然后吸出 steptavidin-QD655 溶液， 以 4的 PBS 缓冲液冲洗 3 遍以上。最 后加入 4无酚红 DMEM 培养液 (Hyclone)， 采用荧光显微镜来观测。 0029 荧光显微镜 (Olympu。
22、s X70) 如图 1 所示， 安装有油镜 (OlympusPlanApoN60X)， CCD(Andor iXon+DU-897) 以及快门 (Ludl ElectronicProducts)。细胞培养皿需要放置在 载物台上的 37二氧化碳培养室 ( 如图 2 所示， TOKIAHIT INU-ONICS-HIR-F1， 37、 二氧 化碳浓度 5 ) 中。 0030 首先对荧光显微镜配置激光的光强及曝光时间进行了测试， 以保护细胞在 60 分 钟的绿色激光照射中不受损伤。由于激发光汇聚于物镜的焦平面上， 所测量的荧光显微镜 说 明 书 CN 102262079 A CN 102262092。
23、 A4/4 页 6 配置激光的光强是焦平面上方的发散光， 而激光功率探测器 (LaserCheck， COHERENT) 的感 光部位不一定完全覆盖整个发散面 ； 此外， 在微瓦这个范围上， 此功率探测器的读出值也有 误差， 所以探测的光强值是测定值 5W。图 3A 示出光强约为 100W 实验前后的细胞明 场图像， 细胞没有收缩及结构形变， 图 3B 和图 3C 分别是相同曝光时间， 光强约为 150W 和 300W 的实验前后图像， 可看出在 300W 下 ( 图 3C)， 细胞发生了明显的收缩， 这会影响实 验的结果， 而在 150W 下 ( 图 3B)， 细胞虽然没有明显的收缩， 但是。
24、出现中间这个细胞的细 胞核鼓起的现象， 表明该光强下会明显影响细胞的结构， 由此会影响内吞。因此， 筛选出的 配置激光的光强为 100W 以下。 0031 将荧光显微镜的汞灯后添加衰减片 ND6， 选用绿色激发块 U-MWG2， 并用光强计在 物镜处测的激光强度为 78W。将快门和 CCD 曝光同步， 每帧 150ms 曝光， 1s 间隔 EGFR 内 吞过程将由量子点来标记追踪， 持续拍摄 3600s， 即 60 分钟。 0032 对以上实验数据进行处理， 具体包括以下过程。首先找到每帧图片中的光点的位 置坐标并记录 ； 画出细胞轮廓线， 记录轮廓线坐标。细胞的内吞是受体 ( 如 EGFR)。
25、 从细胞膜 到细胞内输运， 最终被运往细胞核附近的过程， 可以设细胞核中心为点 O。然后求出每帧图 片中的光点相对于点O的距离的平均值S， 细胞轮廓线的各坐标相对于点O的距离的平均值 L， 计算出每帧 S/L 的值， 将其定义为相对内吞距离 (Relative Distance)( 如图 4 所示 )。 同时， 将帧数换算为时间(time)。 以相对距离vs.时间作图， 即可得到相对内吞曲线(见图 5)， 从图 5 中可以清楚的看出紫杉醇这种抗癌药物阻碍了细胞的内吞输运， 在 3600 秒的时 间内， 其相对内吞距离的下降速率和幅度均明显低于无药物的对照细胞。 说 明 书 CN 102262079 A CN 102262092 A1/4 页 7 图 1 图 2 图 3A 说 明 书 附 图 CN 102262079 A CN 102262092 A2/4 页 8 图 3B 图 3C 说 明 书 附 图 CN 102262079 A CN 102262092 A3/4 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102262079 A CN 102262092 A4/4 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102262079 A 。