一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及寡核苷酸序列.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110330473.4	申请日：	2011.10.27
公开号：	CN102373276A	公开日：	2012.03.14
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20111027\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/04; C12N15/11; G01N21/64	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	中华人民共和国北京出入境检验检疫局; 中国兽医药品监察所; 北京农学院
发明人：	张伟; 高志强; 李宁; 安健; 凌凤俊; 张鹤晓; 张利峰; 汪琳; 柏亚铎; 谷强; 乔彩霞; 蒲静; 吴丹; 赖平安
地址：	100026 北京市朝阳区甜水园街6号
优先权：
专利代理机构：	北京正理专利代理有限公司 11257	代理人：	张文祎
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内容摘要

本发明公开了一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及核苷酸序列。所述一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表SEQIDNo：1至序列表SEQIDNo：3所示的寡核苷酸序列。本发明还提供了一种含有上述寡核苷酸序列的检测试剂盒。本发明的优点是：实时荧光PCR技术被应用到猪痢疾的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光PCR最低可检测至102拷贝/反应的病原量。该方法还对来自七个猪场的318份临床样品进行了检测。实验结果

权利要求书

1：一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于，其寡核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 至 SEQ ID NO ： 3，其中 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 分别为检测猪痢疾的引物 I 和引物 II，序列 SEQ ID NO ： 3 为检测猪痢疾的荧光探针。
2：根据权利要求 1 所述的检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列 SEQ ID NO ： 3 的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA，第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰。
3：一种检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：（1） DNA 提取液 I ：其配制方法为 PEG 8000 20.74g，加 NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 100mL ；（2） DNA 提取液 II ：其配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA 0.5mL， NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL ；（3） PCR 反应液，包括： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTP、引物 I、引物 II 和探针；（4） Taq DNA 聚合酶；（5）无 DNA 酶的灭菌纯化水；（6）阴性对照： DEPC 水；（7）阳性对照：为猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段，所述 nox 基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示，引物 2 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA，第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰。
4：根据权利要求 3 所述的检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于：所述 PCR 反应液为 1×PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2、 0.2mM dNTP、 0.2μM 引物 I、 0.2 μM 引物 II 和 0.1 μM 探针。 5. 一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取样品 DNA ；（2）进行实时荧光 PCR 反应；（3）反应条件：扩增条件为 94℃ /3min， 1 个循环；94℃ /10sec， 55℃ /5sec， 60℃ /30 sec， 40 个循环，每个循环结束时收集荧光；（4）阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整，质控标准，阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线；阳性对照的 Ct 值应≤ 30.0，并出现特定的扩增曲线，如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体，阳性， Ct 值≤ 30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。
5： 0mL， 0.5 mol/L EDTA 0.5mL， NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL ；（3） PCR 反应液，包括： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTP、引物 I、引物 II 和探针；（4） Taq DNA 聚合酶；（5）无 DNA 酶的灭菌纯化水；（6）阴性对照： DEPC 水；（7）阳性对照：为猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段，所述 nox 基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示，引物 2 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA，第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰。 4. 根据权利要求 3 所述的检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于：所述 PCR 反应液为 1×PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2、 0.2mM dNTP、 0.2μM 引物 I、 0.2 μM 引物 II 和 0.1 μM 探针。 5. 一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取样品 DNA ；（2）进行实时荧光 PCR 反应；（3）反应条件：扩增条件为 94℃ /3min， 1 个循环；94℃ /10sec， 55℃ /5sec， 60℃ /30 sec， 40 个循环，每个循环结束时收集荧光；（4）阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整，质控标准，阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线；阳性对照的 Ct 值应≤ 30.0，并出现特定的扩增曲线，如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体，阳性， Ct 值≤ 30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。

说明书

一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及寡核苷酸序列
    【技术领域】
     本发明涉及一种实时荧光 PCR 检测猪痢疾的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。背景技术
     猪痢疾（Swine dysentery ； SD ）的病原体是一种革兰氏阴性的厌氧性螺旋体，先后命名为是由猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae ;T.h）、猪痢疾蛇形螺旋体（Serpulinahyodysenteriae ； S.h）。现在统一命名为猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae ； B.h），目前猪痢疾密螺旋体这一名称由于历史的原因还被广泛使用。该病是猪的一种肠道传染病，以黏液性或黏液出血性腹泻为特征。在猪群中的发病率相当高，病猪生长发育受阻，耗料增加，给各地养猪业造成很大的经济损失。据统计病猪的饲料消耗率为正常猪的 2 倍，而增重率仅为正常猪的 1/2。根据 1983 年 Lyson 的统计，为控制猪痢疾在饲料中添加的药物，每头猪花费 2.5-2.8 美元。根据 Wood 等（1988 年）的计算，猪痢疾猪群的饲料消耗，每头上市猪要多花 12.6 美元，同时每头猪还要多花费 2.4 美元。在美国估计每年由于猪痢疾而损失 6400 万美元。
     该病遍布五大洲 50 多个国家和地区。在我国，许多省、市都有该病的存在，并且一旦传入猪群，若不采取严格的处理措施很难根除。
     1978 年 10 月，上海口岸在从美国进口的 451 头商品猪的检疫中确诊猪痢疾后， 1979 年初又在我国猪只中确诊猪痢疾，并从国内猪只分离得到猪痢疾短螺旋体纯培养，引起我国兽医界的重视，并被列入《中华人民共和国进境一、二类传染病》。
     在进出口的双边协议中美国、英国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、爱尔兰、及日本等国的进口猪要求进行猪痢疾短螺旋体的检测。现有检测条件要求高（严格的厌氧培养），一般实验室很难满足检测的要求。
     到目前为止，该病还没有满意的简单可行的检测方法。在入境检测中采用行业标准 SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》，检验周期要两周时间，并且要求严格的厌氧培养监控，因此急需一种快速、敏感、特异性强的检测方法以替代或者补充该规程。
     Taqman 荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通 PCR 灵敏度高 100 倍以上，最大限度的避免了交叉污染，是国际上公认的快速准确技术之一，可检测到很微量的病毒核酸。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲 1 型的检测领域，取得了很好的技术效果。
     TaqMan 技术的要点是在普通 PCR 原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的 5’ 端和 3’ 端分别标记不同的荧光素，如 5’ 端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用 R 表示）， 3’ 端标记的荧光素，在近距离内能吸收 5’ 端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用 Q 表示）。当 PCR 反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到 R 所发出的荧光信号； PCR 反应进行到延伸阶段时， Taq 酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的 Taq 酶发挥它的 5’ → 3’ 外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的 R 基团游离出来， R 所发出的荧光再不为 Q 所吸收而被检测仪所接收。
     PCR 进行一个循环，合成了 N 条新链的同时，就水解了 N 条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与 PCR 反应产物的量呈对应关系。随着 PCR 反应的循环往复， PCR 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个 PCR 循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以 PCR 循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线—称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈 “S” 型；而当标本中不含病原体，则 PCR 过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。
     PCR 扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在 S 型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线（Threshold）；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为 Ct 值。样本中病原体的浓度越高， Ct 值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光 PCR 本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。实时荧光 PCR 技术具有高灵敏度和高特异性的优点，还可做到实时定量，具有快速、特异、敏感和较强防止交叉污染的特点，可检测到很微量的细菌。
     本发明的优点在于，与病原分离培养相比， 1、实时荧光 PCR 更快、更便捷，细菌分离培养方法至少需要 10 天且培养条件苛刻，需要严格的厌氧培养，而荧光 PCR 仅需 4 小时； 2、由于病原为厌氧菌，如果采样及运输时间过长则对于少量感染的样品容易出现培养失败的现象，而荧光 PCR 检测的是核酸，在特异性相当的情况下可以有效地提高检测的敏感性。
     本发明在我国首次将实时荧光 PCR 技术应用于猪痢疾检测，提供了针对猪痢疾短 / 密螺旋体特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。与传统的病原分离方法相比具有快速高效的特点。
     发明内容
     本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测猪痢疾的寡核苷酸序列。
     本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测猪痢疾的试剂盒。
     为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表 SEQ ID No ： 1 至序列表 SEQ ID No ： 3 所示的寡核苷酸序列；其中 SEQ ID No ： 1 和 SEQ ID No ： 2 为检验猪痢疾的引物对，SEQ ID No ： 3 为猪痢疾的探针序列。详见表 1。4102373276 A CN 102373279
     说明书序列表编号 SEQIDNo ： 1 SEQIDNo ： 2 SEQIDNo ： 33/8 页表 1. 引物和探针序列名称序列（5’ -3’ ）引物 I ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT 引物 II ACCCATTCTTACAGCATTWGT 探针 [FAM]-CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC-[TAMRA]注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）； W 代表 A/T ；其中，引物 I 和引物 II 分别为检测猪痢疾的正义引物和反义引物，探针为猪痢疾检测荧光探针，加号 “+” 后面的碱基需用 LNA 进行修饰，即第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰，探针的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM（6 －羧基荧光素）， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA。
     一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒，保存于 -20℃，由以下试剂组成： 1） DNA 提取液 I ： 5mL/ 管 ×5 管；其配制方法为 PEG 8000 20.74g，加 NaCl 17.53g，用三蒸水定容至 100mL，分装 5.0mL/ 管； 2） DNA 提取液 II ： 500μL / 管 ×1 管；其配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA 0.5mL， NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL，分装 500μL/ 管； 3） PCR 反应液， 750μL×1 管，包括： 1×PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2 、 0.2mM dNTP、 0.2μM 引物 I 、 0.2 μM 引物 II 和 0.1 μM 探针；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示，引物 II 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA ；第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰； 15μL×1 管； 4） Taq DNA 聚合酶 5 U/μL， 5）无 DNA 酶的灭菌纯化水， 1mL×1 管； 6）阴性对照： 1mL×1 管： DEPC 水； 7）阳性对照： 1mL×1 管；为猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段， Ct 值为 20.0 ～ 28.0，所述 nox 基因的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示。
     本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测猪痢疾的方法，包括如下步骤： 1）提取样品 DNA ； 2）对提取的样品 DNA 进行 PCR 扩增：引物 I ： 5’ -ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT-3’ （SEQ ID NO ： 1）引物 II ： 5’ -ACCCATTCTTACAGCATTWGT-3’ （SEQ ID NO ： 2）荧光探针为 5’ -[FAM] CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC[TAMRA]-3’ （SEQ ID NO ：； 3）第一步 94℃ ：3 min，1 个循环；第二步 94℃ ：10 sec，55℃ ：5 sec， 60℃ ：30 sec（收集荧光信号）， 40 个循环。
     3）结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。阳性对照的 Ct 值应≤ 30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体；阳性， Ct 值≤ 30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。
     本发明中发明人以实时荧光 PCR 对模板进行检测，验证了该方法的特异性。实时荧光 PCR 与传统的分离培养法的比较实验的结果也表明，两种方法在检测上并没有明显差异。
     本发明以通过对稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检 2 测到 10 拷贝 / 反应的 DNA 模板量，具有较高的灵敏度。
     用该方法对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。由此我们也可以得出结论，在大批量样本检测中，完全可以用实时荧光 PCR 方法，以达到减少工作量，提高工作效率，减少检测成本的目的。
     本发明的优点是：实时荧光 PCR 技术被应用到猪痢疾检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光 PCR 最低可检测至 102 拷贝 / 反应的细菌量。该方法还对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
     下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。附图说明图 1 为实时荧光 PCR 反应体系优化后，得到的特异性扩增曲线；其中， 1 ：阳性对照； 2：阴性对照；图 2A 为检测猪痢疾的实时荧光 PCR 检测试剂盒 B.h 七个标准菌株的特异性试验试验结果；其中， 1 ：阳性对照； 2：阴性对照； 3-9 ： B.h（ATCC 编号依次为 49526、 27164、 31287、 49527、 49886、 31212、 49887）；图 2B 为检测猪痢疾的实时荧光 PCR 检测试剂盒肠道致病菌特异性试验结果；其中，1 ：阳性对照； 5：阴性对照； 2：沙门氏菌； 3： B.i （ATCC 编号： 29796）； 4：猪链球菌（已灭活）； 6：大肠杆菌；图 3 为检测猪痢疾的实时荧光 PCR 检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中，1-7 ： 106-1.0 拷贝 / 微升（依次作 10 倍梯度稀释）； 8：阴性对照。
     具体实施方式
     本发明所用 Brachyspira hyodysenteriae （B.h）、 Brachyspira innocens （B.i）、大肠杆菌和沙门氏菌，均为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存，灭活的猪链球菌由中国兽医药品监察所提供。
     实施例 1 ： Taqman 探针和引物的设计与合成根据 Genbank 中登录的猪痢疾密螺旋体的相关基因序列，用 DNAMAN 软件进行比对分析，分别选择 nox 基因高度保守的区域，用 Primer Express V2.0 软件，设计出针对猪痢疾密螺旋体的探针和引物。同表 1。
     引物和探针由上海旭冠生物技术有限公司合成。
     实施例 2 ：猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA 的提取用 DNA 提取试剂提取猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA。具体操作如下： ①取 n 个 1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
     ②每管加入 200μL DNA 提取液 I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各 200 μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s。于 4 ℃ ~25℃条件下， 13000 r/min 离心 10 min。
     ③尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 10μL DNA 提取液 II，混匀器上震荡混匀 5 s。于 4℃ ~25℃条件下， 2000 r/min 离心 10 s。
     ④ 100 ℃干浴或沸水浴 10min ； 5000 r/min 离心 5s, 充分振荡一下， 5000 r/min 再次离心 5s，加入 90μL 无 DNA 酶的灭菌纯化水，充分振荡后， 5000 r/min 离心 5 min，上清即为提取的 DNA，冰上保存备用。
     ⑤提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于 -80℃冰箱。
     实施例 3 ：实时荧光 PCR 的建立一、对探针和引物浓度、镁离子浓度和酶浓度分别进行了优化，建立了实时荧光 PCR 的反应体系。按照实施例 2 方法获得猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA，模板浓度约为 104-106 拷贝 / 微升，进行实时荧光 PCR，优化反应体系。
     （1）探针和引物浓度的优化对探针和引物分别进行优化。从 0.1 µM 至 0.8 µM 以 0.1 µM 间距递增的引物浓度和从 0.1 µM 至 0.5 µM 以 0.1 µM 间距递增的探针浓度交叉配比，进行实时荧光 PCR，以选择最适的引物和探针浓度。反应体系件见表 2，所用引物和探针序列见表 1 ：表 2 引物探针优化 PCR 反应体系
     组分 10×PCRbuffer 2.5mM dNTP 25mMMgCl2 引物 I(10μM) 引物 II(10μM) 探针 (10μM) 模板 DNA 5U/μlTaqDNA 聚合酶补灭菌去离子水加入量 / 终浓度 2.5μl 2μl 3.0mM xμM yμM zμM 10μl 0.25μl 至 25μl（2）镁离子浓度的优化通过加入 MgCl2 溶液（25mM）进行镁离子浓度的优化，分别以 1.0 mM-5.0 mM 的镁离子浓度（以 0.5 mM 递增）进行实时荧光 RT-PCR，以确定反应体系中镁离子的最适浓度。反应体系中其它条件见表 3，所用引物探针序列见表 1。
     表3 镁离子优化 PCR 反应体系组分 10×PCRbuffer 2.5mM dNTP 25mMMgCl2 引物 I(10μM) 引物 II(10μM) 7 加入量 / 终浓度 2.5μl 2μl xμl 1μl 1μl102373276 A CN 102373279说探针 (10μM) 模板 DNA 5U/μlTaqDNA 聚合酶补灭菌去离子水明书0.5μl 10μl 0.25μl 至 25μl6/8 页二、结果：经过多次试验最终引物浓度确定为 0.2µM，探针浓度确定为 0.1µM ；镁离子浓度确定为 3.0 mM。图 1 为以优化的反应体系进行实时荧光 PCR，得到的猪痢疾短 / 密螺旋体特异性扩增曲线。
     实施例 4 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及其使用一、试剂盒的组成（48 tests/ 盒，保存于 -20℃）（1） DNA 提取液 I ： 5ml/ 管 ×6 管，配制方法为 PEG 8000 20.74g，加 NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 100mL，分装 5.0mL/ 管；（2） DNA 提取液 II ： 500μL / 管 ×1 管，配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl（pH 8.9） 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA( 乙二胺四乙酸 )0.5mL， NP-40（乙基苯基聚乙二醇） 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL，分装 500μL/ 管；（3） PCR 反应液， 750μL×1 管，包括： 1×PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2、 0.2mM dNTP、 0.2μM 引物 I、 0.2 μM 引物 II 和 0.1 μM 探针；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示，引物 II 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5’ 端标记报告荧光基团 FAM， 3’ 端标记淬灭荧光基团 TAMRA ；第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰； 10×PCR 缓冲液的组成为： 500mmol/L KCl 、 100mmol/L Tris-HCl(pH9.0， 25 ℃ )、 1.0%Triton X-100，使用时可以根据所需浓度进行稀释；货号 M1665S）；（4） Taq DNA 聚合酶 5 U/μL， 15μL×1 管；（上海 Promega，（5）无 DNA 酶的灭菌纯化水， 1mL×1 管；（6）阴性对照： 1mL×1 管： DEPC 水；（7）阳性对照： 1mL×1 管；为含有猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段的 DNA 溶液，所述猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示，由上海旭冠生物技术发展有限公司合成， Ct 值为 20.0 ～ 28.0。
     二、试剂盒的使用（1）提取样品的 DNA，即模板 DNA，具体操作如下： ①取 n 个 1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
     ②每管加入 200μL DNA 提取液 I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各 200 μL，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s。于 4 ℃ ~25℃条件下， 13000 r/min 离心 10 min。
     ③尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 10μL DNA 提取液 II，混匀器上震荡混匀 5 s。于 4℃ ~25℃条件下， 2000 r/min 离心 10 s。 ④ 100 ℃干浴或沸水浴 10min ； 5000 r/min 离心 5s, 充分振荡一下， 5000 r/min 再次离心 5s，加入 90μL 无 DNA 酶的灭菌纯化水，充分振荡后， 5000 r/min 离心 5 min，上清即为提取的 DNA，冰上保存备用。
     ⑤提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于 -80℃冰箱。
     （2）进行实时荧光 PCR 反应，最适反应体系如下：表 4 实时荧光 PCR 反应体系组成组分 PCR 反应液 TaqDNA 聚合酶（5U/μl）模板 DNA 体积 15μl 0.25μl 10μl（3）最适反应条件： 94℃ ：3 min，1 个循环； 94℃ ：10 sec，55℃ ：5 sec， 60℃ ：30 sec（收集荧光信号）， 40 个循环。
     （4）结果的判定标准：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。阳性对照的 Ct 值应≤ 30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体；阳性， Ct 值≤ 30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。实施例 5 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒的特异性试验一．方法提取 Brachyspira hyodysenteriae（7 株）和 Brachyspira innocens、沙门氏菌、大肠杆菌和猪链球菌（详见表 5）的 DNA 做为模板，用实施例 4 所建立的试剂盒和方法对提取的 DNA 进行实时荧光 PCR 检测，以确定检测试剂盒的特异性。
     表 5 方法研究过程中应用到的菌株
     菌株 B.h（ATCC 编号： 27164） B.h（ATCC 编号： 31212） B.h（ATCC 编号： 31287） B.h（ATCC 编号： 49526） B.h（ATCC 编号： 49527） B.h（ATCC 编号： 49886） B.h（ATCC 编号： 49887） B.i（ATCC 编号： 29796）沙门氏菌大肠杆菌猪链球菌（已灭活）来源引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存引自 ATCC，本实验室保存本实验室保存本实验室保存中国兽医药品监察所二．结果结果见图 2 （2A、 2B）。图 2A 结果显示 7 株从 ATCC 引进的 B.h 均出现了特征性的扩增，图 2B 结果显示除阳性外，其他结果均为阴性。由此证明该方法有较强特异性。
     实施例 6 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒的敏感性试验一．方法：用实施例 4 所建立的试剂盒和方法对实施例 4 所述的阳性标准品进行实时荧光 PCR 检测，以确定反应的灵敏度。稀释后，得到 DNA 浓度分别为 106， 105， 104， 103， 102， 10， 1.0 拷贝 / 微升的溶液。
     二．结果9102373276 A CN 1023732796说明书8/8 页对稀释的阳性标准品（10 -1.0 拷贝 / 微升）进行实时荧光 PCR 检测，结果如图 3 所示。结果表明，实时荧光 PCR 对系列梯度稀释的阳性标准品（从左至右分别为 106-1.0 拷贝 / 反应对应的结果）进行检测，在模板浓度为 102 拷贝 / 反应时，成弱阳性反应， 10 拷贝 / 反应的 2 模板浓度结果接近阴性。故实时荧光 PCR 对 DNA 模板最低可检测至 10 拷贝 / 反应。
     实施例 7 ：临床样品的检测一．方法参照行业标准 SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》对采集样品进行病原分离。采集的样品同时参照实例 4 的方法进行实时荧光 PCR 检测。
     二．结果表 6 实时荧光 PCR 检测结果与病原分离法结果汇总结果见表 6，用该方法对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。10102373276 A CN 102373279序列表1/2 页<110><120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213>序列表中华人民共和国北京出入境检验检疫局中国兽医药品监察所北京农学院一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及寡核苷酸序列 4 PatentIn version 3.3 1 23 DNA 人工合成引物 I<400> 1 atggtgctat tgtagtwgat act <210> <211> <212> <213> 2 21 DNA 人工合成引物 II23<400> 2 acccattctt acagcattwg t <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> 3 22 DNA 人工合成探针21modified_base (10， 14， 16) LAN 修饰<400> 3 ctaaagatcc tgatgtattt gc2211102373276 A CN 102373279序列表2/2 页<210> <211> <212> <213>4 1705 DNA 猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段<400> 4 aatgccaata aattatcata aaaatttact acaccaattt aataggttgt ttgtcaagta actttgggtt tttgagaggt taacaaaaaa taaacttatt agaaggaact acaagaaatt tggatacata aatggaagct tgaaaaaaga tgaaggtgat ggtagttatg tttacctaat atttgctata tgctttagct acatgttgaa ggcttctact cttcttcaaa aatcatttat tcatgctgaa atttgcattg tatggttgct ccctaataaa ataaattaaattttataata attcatgata aagttacata tatattagat aaccatgctg gttacttacg ggtggcgtag gaaggcatcg ttatgtgtaa cttgctactg acttacggac attgatgaaa ggtgttgaac atgcctagag atcaaagaag gacagagtta tctgttggtt ggtgctattg ggtgactgtg actaatgctg tattgcggta ggttggtctg gattctgaaa gaagaaggca gctattcatg tcagatttct tatactgcta tttattttat aaacgaaaattaaacatttt attagtgaaa taatataact tatttttaat gtacatgggc atagaaatga ttaaagatcc atgtttatat aagaactaaa gttcttggcc ttaaaaaagg tagctaaacc ttatagaagc ttatggctaa ctggcataga aaaaagttgt tcagacctaa tagtagatac ctactgtata taagaatggg ctcaaggttc aagaaactgc gaccagaatt gcagacgttt cattctctct tcttcctacc aataattata tagggggttt cataattgtaaaatt tcattatata tgactaagta aaggggttaa agcaaaaact taatatatct taaaggatta gggacatgat aacaggaaaa tgtaactcct tattttcttc agatgttaaa attcaaaaac ctactttgat aatgcattta tactgacaaa taatgaactt tactatgaaa ttcaagagct tattgttgct taatgctatt taagaaaaaa tatgcctact attaggtgct tgctatacaa tcactacaac gaaaatataa ttataatcaatatatacatt aaaaacatac ttttttttgt attattatga ttgaaagcta ttcttagcct ttctatgcta gttactaaaa gagtttgaag cctatcgaag tctaagcttt aaagttatgg catggtaaag aaagaaatca ggtgaaactg ggttcttatg tataaagatt actactaaag tctgaaaaac gctaataatg tgtgtatttg ggattaaaag aatgaagatg caaatagctt aatggtatga aaaccattat ttagtttaag taaatatttttaatgctttt taaaactatt actataataa aagttattgt cagatcctaa gcggtatcgc gtcctgaaag tagactgggc acacttacga gcttaaaaca atcagcaagg tagttggtgc aagttatctt ctgatgaagc ttaagaaatt atgtagatat atttagaaac atcctgatgt aagaatatat ctttaggaaa gatacaatat taaaatctaa ttttagtaaa ctaaacacaa ctgttgatca cttggatgac aatatttacc actcacatat60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1705

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1、(10)申请公布号 CN 102373276 A (43)申请公布日 2012.03.14 CN 102373276 A *CN102373276A* (21)申请号 201110330473.4 (22)申请日 2011.10.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人中华人民共和国北京出入境检验检疫局地址 100026 北京市朝阳区甜水园街 6 号申请人中国兽医药品监察所北京农学院 (72)发明人张伟高志强李宁安健凌凤俊张鹤晓张利峰。

2、汪琳柏亚铎谷强乔彩霞蒲静吴丹赖平安 (74)专利代理机构北京正理专利代理有限公司 11257 代理人张文祎 (54) 发明名称一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及寡核苷酸序列 (57) 摘要本发明公开了一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及核苷酸序列。所述一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表 SEQIDNo ： 1 至序列表 SEQIDNo ： 3 所示的寡核苷酸序列。本发明还提供了一种含有上述寡核苷酸序列的检测试剂盒。本发明的优点是：实时荧光 PCR 技术被应用到猪痢疾的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了。

3、工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光 PCR 最低可检测至 102拷贝 / 反应的病原量。该方法还对来自七个猪场的 318 份临床样品进行了检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 8 页序列表 2 页附图 4 页 CN 102373279 A1/1 页 2 1. 一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于，其寡核苷酸序列如序。

4、列表 SEQ ID NO ： 1 至 SEQ ID NO ： 3，其中 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 分别为检测猪痢疾的引物 I 和引物 II，序列 SEQ ID NO ： 3 为检测猪痢疾的荧光探针。 2.根据权利要求1所述的检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO ： 3 的 5 端标记报告荧光基团 FAM， 3 端标记淬灭荧光基团 TAMRA，第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰。 3. 一种检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：（1） DNA 提取液 I ：其配制方法为 PE。

5、G 8000 20.74g，加 NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 100mL ；（2） DNA 提取液 II ：其配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA 0.5mL， NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL ；（3） PCR 反应液，包括： PCR 缓冲液、 MgCl2、 dNTP、引物 I、引物 II 和探针；（4） Taq DNA 聚合酶；（5）无 DNA 酶的灭菌纯化水；（6）阴性对照： DEPC 水；（7）阳性对照：为猪痢疾。

6、短 / 密螺旋体 nox 基因片段，所述 nox 基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO ： 1所示，引物2的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5 端标记报告荧光基团 FAM， 3 端标记淬灭荧光基团 TAMRA，第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰。 4. 根据权利要求 3 所述的检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于：所述 PCR 反应液为 1PCR缓冲液、 3.0mM MgCl2、 0.2m。

7、M dNTP、 0.2M引物I、 0.2 M引物II和0.1 M探针。 5. 一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取样品 DNA ；（2）进行实时荧光 PCR 反应；（3）反应条件：扩增条件为 94 /3min， 1 个循环； 94 /10sec， 55 /5sec， 60 /30 sec， 40 个循环，每个循环结束时收集荧光；（4）阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整，质控标准，阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线；阳性对照的 Ct 值应 30.0，。

8、并出现特定的扩增曲线，如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体，阳性， Ct 值 30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。权利要求书 CN 102373276 A CN 102373279 A1/8 页 3 一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及寡核苷酸序列技术领域 0001 本发明涉及一种实时荧光 PCR 检测猪痢疾的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。背景技术 0002 猪痢疾（Swine dysentery；。

9、SD）的病原体是一种革兰氏阴性的厌氧性螺旋体，先后命名为是由猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae;T.h）、猪痢疾蛇形螺旋体（Serpulinahyodysenteriae ；S.h）。现在统一命名为猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae； B.h），目前猪痢疾密螺旋体这一名称由于历史的原因还被广泛使用。该病是猪的一种肠道传染病，以黏液性或黏液出血性腹泻为特征。在猪群中的发病率相当高，病猪生长发育受阻，耗料增加，给各地养猪业造成很大的经济损失。据统计病猪的饲料消耗率为正常猪的 2 倍，而增重率仅。

10、为正常猪的 1/2。根据 1983 年 Lyson 的统计，为控制猪痢疾在饲料中添加的药物，每头猪花费 2.5-2.8 美元。根据 Wood 等（1988 年）的计算，猪痢疾猪群的饲料消耗，每头上市猪要多花 12.6 美元，同时每头猪还要多花费 2.4 美元。在美国估计每年由于猪痢疾而损失 6400 万美元。 0003 该病遍布五大洲 50 多个国家和地区。在我国，许多省、市都有该病的存在，并且一旦传入猪群，若不采取严格的处理措施很难根除。 0004 1978 年 10 月，上海口岸在从美国进口的 451 头商品猪的检疫中确诊猪痢疾后， 1979 年初又在我国猪。

11、只中确诊猪痢疾，并从国内猪只分离得到猪痢疾短螺旋体纯培养，引起我国兽医界的重视，并被列入中华人民共和国进境一、二类传染病。 0005 在进出口的双边协议中美国、英国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、爱尔兰、及日本等国的进口猪要求进行猪痢疾短螺旋体的检测。现有检测条件要求高（严格的厌氧培养），一般实验室很难满足检测的要求。 0006 到目前为止，该病还没有满意的简单可行的检测方法。在入境检测中采用行业标准 SN/T 1207-2003猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程，检验周期要两周时间，并且要求严格的厌氧培养监控，因此急需一种快速、敏感、特异性强。

12、的检测方法以替代或者补充该规程。 0007 Taqman 荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，最大限度的避免了交叉污染，是国际上公认的快速准确技术之一，可检测到很微量的病毒核酸。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲 1 型的检测领域，取得了很好的技术效果。 0008 TaqMan 技术的要点是在普通 PCR 原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位。

13、位于引物结合区域的中间。探针的 5 端和 3 端分别标记不同的荧光素，如 5 端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用 R 表示）， 3 端标记的荧光素，在近距离内能吸收 5 端报告荧光基团发出的荧光信号，称说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A2/8 页 4 为淬灭荧光基团（用 Q 表示）。当 PCR 反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到 R 所发出的荧光信号； PCR 反应进行到延伸阶段时， Taq 酶在引物的引导下。

14、，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的 Taq 酶发挥它的 5 3 外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的 R 基团游离出来， R 所发出的荧光再不为 Q 所吸收而被检测仪所接收。 0009 PCR进行一个循环，合成了N条新链的同时，就水解了N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与 PCR 反应产物的量呈对应关系。随着 PCR 反应的循环往复， PCR 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个 PCR 循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以 PCR 循环数为横坐标作图，即可得到一。

15、条连接每一个循环后荧光值的曲线称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈 “S” 型；而当标本中不含病原体，则 PCR 过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。 0010 PCR 扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在 S 型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线（Threshold）；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为 Ct 值。样本中病原体的浓度越高， Ct 值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光 PCR 本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力。

16、，可以实现对病原体核酸的定量。 0011 实时荧光 PCR 技术具有高灵敏度和高特异性的优点，还可做到实时定量，具有快速、特异、敏感和较强防止交叉污染的特点，可检测到很微量的细菌。 0012 本发明的优点在于，与病原分离培养相比， 1、实时荧光 PCR 更快、更便捷，细菌分离培养方法至少需要 10 天且培养条件苛刻，需要严格的厌氧培养，而荧光 PCR 仅需 4 小时； 2、由于病原为厌氧菌，如果采样及运输时间过长则对于少量感染的样品容易出现培养失败的现象，而荧光 PCR 检测的是核酸，在特异性相当的情况下可以有效地提高检测的敏感性。 0013 本发明在。

17、我国首次将实时荧光 PCR 技术应用于猪痢疾检测，提供了针对猪痢疾短 / 密螺旋体特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。与传统的病原分离方法相比具有快速高效的特点。发明内容 0014 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测猪痢疾的寡核苷酸序列。 0015 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测猪痢疾的试剂盒。 0016 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表 SEQ ID No ： 1 至序列表 SEQ ID No ： 3 所示的寡核苷酸序列；其中 SEQ ID 。

18、No ： 1 和 SEQ ID No ： 2 为检验猪痢疾的引物对， SEQ ID No ： 3 为猪痢疾的探针序列。详见表 1。说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A3/8 页 5 0017 表 1. 引物和探针序列名称序列（5 -3 ）序列表编号引物 I ATGGTGCTATTGTAGTWGATACTSEQIDNo ： 1 引物 II ACCCATTCTTACAGCATTWGTSEQIDNo ： 2 探针FAM-CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC-TAMRASEQIDNo ： 3 注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤。

19、（A）、胸腺嘧啶（T）； W 代表 A/T ；其中，引物 I 和引物 II 分别为检测猪痢疾的正义引物和反义引物，探针为猪痢疾检测荧光探针，加号 “+” 后面的碱基需用 LNA 进行修饰，即第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰，探针的 5 端标记报告荧光基团 FAM（6 羧基荧光素）， 3 端标记淬灭荧光基团 TAMRA。 0018 一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒，保存于 -20，由以下试剂组成： 1） DNA 提取液 I ： 5mL/ 管 5 管；其配制方法为 PEG 8000 20.74g，加 NaCl 17.53g，用。

20、三蒸水定容至 100mL，分装 5.0mL/ 管； 2） DNA 提取液 II ： 500L / 管 1 管；其配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA 0.5mL， NP-40 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL，分装 500L/ 管； 3） PCR 反应液， 750L1 管，包括： 1PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2 、 0.2mM dNTP、 0.2M 引物 I 、 0.2 M 引物 II 和 0.1 M 探针；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ。

21、 ID NO ： 1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO ： 2所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5 端标记报告荧光基团 FAM， 3 端标记淬灭荧光基团 TAMRA ；第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰； 4） Taq DNA 聚合酶 5 U/L， 15L1 管； 5）无 DNA 酶的灭菌纯化水， 1mL1 管； 6）阴性对照： 1mL1 管： DEPC 水； 7）阳性对照： 1mL1 管；为猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段， Ct 值为 20.0 28.0，所述 nox 。

22、基因的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示。 0019 本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测猪痢疾的方法，包括如下步骤： 1）提取样品 DNA ； 2）对提取的样品 DNA 进行 PCR 扩增：引物 I ： 5 -ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT-3 （SEQ ID NO ： 1）引物 II ： 5 -ACCCATTCTTACAGCATTWGT-3 （SEQ ID NO ： 2）荧光探针为 5 -FAM CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGCTAMRA-3 ；（SEQ ID NO ： 3）第一步 94 ： 3 min， 1 个循环；。

23、第二步 94 ： 10 sec， 55 ： 5 sec， 60 ： 30 sec（收集荧光信号）， 40 个循环。 0020 3）结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应 30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短/密螺旋体；阳性， Ct值30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密。

24、螺旋体。 0021 本发明中发明人以实时荧光 PCR 对模板进行检测，验证了该方法的特异性。实时说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A4/8 页 6 荧光 PCR 与传统的分离培养法的比较实验的结果也表明，两种方法在检测上并没有明显差异。 0022 本发明以通过对稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检测到 102拷贝 / 反应的 DNA 模板量，具有较高的灵敏度。 0023 用该方法对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。由此我们也可以得出结论，在大。

25、批量样本检测中，完全可以用实时荧光 PCR 方法，以达到减少工作量，提高工作效率，减少检测成本的目的。 0024 本发明的优点是：实时荧光 PCR 技术被应用到猪痢疾检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光 PCR 最低可检测至 102拷贝 / 反应的细菌量。该方法还对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。 0025 下面结。

26、合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。附图说明 0026 图 1 为实时荧光 PCR 反应体系优化后，得到的特异性扩增曲线；其中， 1 ：阳性对照； 2 ：阴性对照；图 2A 为检测猪痢疾的实时荧光 PCR 检测试剂盒 B.h 七个标准菌株的特异性试验试验结果；其中， 1 ：阳性对照； 2 ：阴性对照； 3-9 ： B.h（ATCC 编号依次为 49526、 27164、 31287、 49527、 49886、 31212、 49887）；图2B为检测猪痢疾的实时荧光。

27、PCR检测试剂盒肠道致病菌特异性试验结果；其中， 1 ：阳性对照； 5 ：阴性对照； 2 ：沙门氏菌； 3 ： B.i （ATCC 编号： 29796）； 4 ：猪链球菌（已灭活）； 6 ：大肠杆菌；图3为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中， 1-7 ： 106-1.0 拷贝 / 微升（依次作 10 倍梯度稀释）； 8 ：阴性对照。具体实施方式 0027 本发明所用 Brachyspira hyodysenteriae （B.h）、 Brachyspira innocens （B.i）、大肠杆菌和沙门氏菌，均为北京出入。

28、境检验检疫局检验检疫技术中心保存，灭活的猪链球菌由中国兽医药品监察所提供。 0028 实施例 1 ： Taqman 探针和引物的设计与合成根据 Genbank 中登录的猪痢疾密螺旋体的相关基因序列，用 DNAMAN 软件进行比对分析，分别选择 nox 基因高度保守的区域，用 Primer Express V2.0 软件，设计出针对猪痢疾密螺旋体的探针和引物。同表 1。 0029 引物和探针由上海旭冠生物技术有限公司合成。 0030 实施例 2 ：猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA 的提取用 DNA 提取试剂提取猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA。说明书 CN 1023732。

29、76 A CN 102373279 A5/8 页 7 0031 具体操作如下：取 n 个 1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。 0032 每管加入 200L DNA 提取液 I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各 200 L，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s。于 4 25条件下， 13000 r/min 离心 10 min。 0033 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10L DNA提取液II，混匀器上震荡混匀5 s。于 4 25条件下， 2000 r/min 离心 10 s。。

30、0034 100 干浴或沸水浴 10min ； 5000 r/min 离心 5s, 充分振荡一下， 5000 r/min 再次离心5s，加入90L无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后， 5000 r/min离心5 min，上清即为提取的 DNA，冰上保存备用。 0035 提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于 -80冰箱。 0036 实施例 3 ：实时荧光 PCR 的建立一、对探针和引物浓度、镁离子浓度和酶浓度分别进行了优化，建立了实时荧光 PCR 的反应体系。 0037 按照实施例 2 方法获得猪痢疾短 / 密螺旋体 DNA，模板浓度约为 104-10。

31、6 拷贝 / 微升，进行实时荧光 PCR，优化反应体系。 0038 （1）探针和引物浓度的优化对探针和引物分别进行优化。从 0.1 M 至 0.8 M 以 0.1 M 间距递增的引物浓度和从0.1 M至0.5 M以0.1 M间距递增的探针浓度交叉配比，进行实时荧光PCR，以选择最适的引物和探针浓度。反应体系件见表 2，所用引物和探针序列见表 1 ：表 2 引物探针优化 PCR 反应体系组分加入量 / 终浓度 10PCRbuffer2.5l 2.5mM dNTP2l 25mMMgCl23.0mM 引物 I(10M)xM 引物 II(10M)yM 探针 (10M)zM 模。

32、板 DNA10l 5U/lTaqDNA 聚合酶0.25l 补灭菌去离子水至 25l （2）镁离子浓度的优化通过加入 MgCl2溶液（25mM）进行镁离子浓度的优化，分别以 1.0 mM-5.0 mM 的镁离子浓度（以 0.5 mM 递增）进行实时荧光 RT-PCR，以确定反应体系中镁离子的最适浓度。反应体系中其它条件见表 3，所用引物探针序列见表 1。 0039 表 3 镁离子优化 PCR 反应体系组分加入量 / 终浓度 10PCRbuffer2.5l 2.5mM dNTP2l 25mMMgCl2xl 引物 I(10M)1l 引物 II(10M)1l 说明书 CN。

33、 102373276 A CN 102373279 A6/8 页 8 探针 (10M)0.5l 模板 DNA10l 5U/lTaqDNA 聚合酶0.25l 补灭菌去离子水至 25l 二、结果：经过多次试验最终引物浓度确定为 0.2M，探针浓度确定为 0.1M ；镁离子浓度确定为 3.0 mM。图1为以优化的反应体系进行实时荧光PCR，得到的猪痢疾短/密螺旋体特异性扩增曲线。 0040 实施例 4 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及其使用一、试剂盒的组成（48 tests/ 盒，保存于 -20）（1） DNA 提取液 I ： 5ml/ 管 6 管，配制方法。

34、为 PEG 8000 20.74g，加 NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 100mL，分装 5.0mL/ 管；（2） DNA 提取液 II ： 500L / 管 1 管，配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl（pH 8.9） 2.0mL， 2.0 mol/L KCl 5.0mL， 0.5 mol/L EDTA( 乙二胺四乙酸 )0.5mL， NP-40（乙基苯基聚乙二醇） 1.0 mL, 用三蒸水定容至 100mL，分装 500L/ 管；（3） PCR 反应液， 750L1 管，包括： 1PCR 缓冲液、 3.0mM MgCl2、 0.2mM dNTP。

35、、 0.2M 引物 I、 0.2 M 引物 II 和 0.1 M 探针；其中，引物 I 的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO ： 2所示，探针的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 3 所示，探针的 5 端标记报告荧光基团 FAM， 3 端标记淬灭荧光基团 TAMRA ；第 10、 14、 16 位的碱基用 LNA 进行修饰； 10PCR 缓冲液的组成为： 500mmol/L KCl 、 100mmol/L Tris-HCl(pH9.0， 25 )、 1.0%Triton X-100，使用时。

36、可以根据所需浓度进行稀释；（4） Taq DNA 聚合酶 5 U/L， 15L1 管；（上海 Promega，货号 M1665S）；（5）无 DNA 酶的灭菌纯化水， 1mL1 管；（6）阴性对照： 1mL1 管： DEPC 水；（7）阳性对照： 1mL1 管；为含有猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段的 DNA 溶液，所述猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 4 所示，由上海旭冠生物技术发展有限公司合成， Ct 值为 20.0 28.0。 0041 二、试剂盒的使用（1）提取样品的 DNA，。

37、即模板 DNA，具体操作如下：取 n 个 1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。 0042 每管加入 200L DNA 提取液 I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各 200 L，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s。于 4 25条件下， 13000 r/min 离心 10 min。 0043 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10L DNA提取液II，混匀器上震荡混匀5 s。于 4 25条件下， 2000 r/min 离心 10 s。 0044 100 干浴或沸水浴 10min 。

38、； 5000 r/min 离心 5s, 充分振荡一下， 5000 r/min 再次离心5s，加入90L无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后， 5000 r/min离心5 min，上清即为提取的 DNA，冰上保存备用。说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A7/8 页 9 0045 提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于 -80冰箱。 0046 （2）进行实时荧光 PCR 反应，最适反应体系如下：表 4 实时荧光 PCR 反应体系组成组分体积 PCR 反应液15l TaqDNA 聚合酶（5U/l）0.25l 模板 DNA10。

39、l （3）最适反应条件： 94 ： 3 min， 1 个循环； 94 ： 10 sec， 55 ： 5 sec， 60 ： 30 sec（收集荧光信号）， 40 个循环。 0047 （4）结果的判定标准：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应 30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短 / 密螺旋体；阳性， Ct 值 30.0。

40、，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短 / 密螺旋体。 0048 实施例 5 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒的特异性试验一方法提取 Brachyspira hyodysenteriae（7 株）和 Brachyspira innocens、沙门氏菌、大肠杆菌和猪链球菌（详见表 5）的 DNA 做为模板，用实施例 4 所建立的试剂盒和方法对提取的 DNA 进行实时荧光 PCR 检测，以确定检测试剂盒的特异性。 0049 表 5 方法研究过程中应用到的菌株菌株来源 B.h（ATCC 编号： 27164）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATC。

41、C 编号： 31212）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATCC 编号： 31287）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATCC 编号： 49526）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATCC 编号： 49527）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATCC 编号： 49886）引自 ATCC，本实验室保存 B.h（ATCC 编号： 49887）引自 ATCC，本实验室保存 B.i（ATCC 编号： 29796）引自 ATCC，本实验室保存沙门氏菌本实验室保存大肠杆菌本实验室保存猪链球菌（已灭活）中国兽医药品监察所二结果结果见图 2 （2。

42、A、 2B）。图 2A 结果显示 7 株从 ATCC 引进的 B.h 均出现了特征性的扩增，图 2B 结果显示除阳性外，其他结果均为阴性。由此证明该方法有较强特异性。 0050 实施例 6 ：一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒的敏感性试验一方法：用实施例 4 所建立的试剂盒和方法对实施例 4 所述的阳性标准品进行实时荧光 PCR 检测，以确定反应的灵敏度。稀释后，得到 DNA 浓度分别为 106， 105， 104， 103， 102， 10， 1.0 拷贝 / 微升的溶液。 0051 二结果说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A8/。

43、8 页 10 对稀释的阳性标准品（106-1.0 拷贝 / 微升）进行实时荧光 PCR 检测，结果如图 3 所示。结果表明，实时荧光 PCR 对系列梯度稀释的阳性标准品（从左至右分别为 106-1.0 拷贝 / 反应对应的结果）进行检测，在模板浓度为 102拷贝 / 反应时，成弱阳性反应， 10 拷贝 / 反应的模板浓度结果接近阴性。故实时荧光 PCR 对 DNA 模板最低可检测至 102拷贝 / 反应。 0052 实施例 7 ：临床样品的检测一方法参照行业标准 SN/T 1207-2003猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程对采集样品进行病原分离。采集的样品同时参照。

44、实例 4 的方法进行实时荧光 PCR 检测。 0053 二结果表 6 实时荧光 PCR 检测结果与病原分离法结果汇总结果见表 6，用该方法对 7 个猪场采集的 318 份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。说明书 CN 102373276 A CN 102373279 A1/2 页 11 序列表中华人民共和国北京出入境检验检疫局中国兽医药品监察所北京农学院一种检测猪痢疾的实时荧光 PCR 试剂盒及寡核苷酸序列 4 PatentIn version 3.3 1。

45、 23 DNA 人工合成引物 I 1 atggtgctat tgtagtwgat act 23 2 21 DNA 人工合成引物 II 2 acccattctt acagcattwg t 21 3 22 DNA 人工合成探针 modified_base (10， 14， 16) LAN 修饰 3 ctaaagatcc tgatgtattt gc 22 序列表 CN 102373276 A CN 102373279 A2/2 页 12 4 1705 DNA 猪痢疾短 / 密螺旋体 nox 基因片段 4 aatgccaata ttttataata taaacatttt ttgtaaaatt ta。

46、tatacatt taatgctttt 60 aattatcata attcatgata attagtgaaa tcattatata aaaaacatac taaaactatt 120 aaaatttact aagttacata taatataact tgactaagta ttttttttgt actataataa 180 acaccaattt tatattagat tatttttaat aaggggttaa attattatga aagttattgt 240 aataggttgt aaccatgctg gtacatgggc agcaaaaact ttgaaagcta cagatcctaa 3。

47、00 ttgtcaagta gttacttacg atagaaatga taatatatct ttcttagcct gcggtatcgc 360 actttgggtt ggtggcgtag ttaaagatcc taaaggatta ttctatgcta gtcctgaaag 420 tttgagaggt gaaggcatcg atgtttatat gggacatgat gttactaaaa tagactgggc 480 taacaaaaaa ttatgtgtaa aagaactaaa aacaggaaaa gagtttgaag acacttacga 540 taaacttatt cttgct。

48、actg gttcttggcc tgtaactcct cctatcgaag gcttaaaaca 600 agaaggaact acttacggac ttaaaaaagg tattttcttc tctaagcttt atcagcaagg 660 acaagaaatt attgatgaaa tagctaaacc agatgttaaa aaagttatgg tagttggtgc 720 tggatacata ggtgttgaac ttatagaagc attcaaaaac catggtaaag aagttatctt 780 aatggaagct atgcctagag ttatggctaa ctactttgat aaagaaatca ctgatgaagc 840 tgaaaaaaga atcaaagaag ctggcataga aatgcattta ggtgaaactg ttaagaaatt 900 tgaaggtgat gacagagtta aaaaagttgt tactgacaaa ggttcttatg atgtagatat 960 ggtagttatg tctgttggtt tcagacc。

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