《一种人泛素偶联酶UBCH10单克隆抗体杂交瘤DY03及单克隆抗体.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种人泛素偶联酶UBCH10单克隆抗体杂交瘤DY03及单克隆抗体.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102234631 A (43)申请公布日 2011.11.09 CN 102234631 A *CN102234631A* (21)申请号 201110110397.6 (22)申请日 2011.04.29 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/40(2006.01) C12N 15/06(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南路 1023 号 (72)发明人 杜红延 姚小艳 徐伟文 李明 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 。
2、代理人 陈卫 (54) 发明名称 一种人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交 瘤 DY03 及单克隆抗体 (57) 摘要 本发明公开了一种人泛素偶联酶 UbcH10 单 克隆抗体杂交瘤DY03及单克隆抗体。 抗人泛素偶 联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交瘤 DY03， 于 2010 年 11 月 19 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.4336。其 产生的单克隆抗体， 能特异性的结合重组和天然 的人泛素偶联酶 UbcH10 蛋白， 本发明所述的抗体 可用于 ELISA、 western-blot、 细胞免疫荧光以及 临床组织标本的免疫组织化。
3、学染色研究。同时本 发明所述抗体可制备成实验室和临床检测人泛素 偶联酶 UbcH10 表达情况的免疫检测试剂。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 1 页 CN 102234633 A1/1 页 2 1. 一种抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交瘤 DY03， 于 2010 年 11 月 19 日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.4336。 2. 一种抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体 DY03， 其特征是由权利要求 1 所述杂。
4、交瘤 DY03 分泌所得。 3. 权利要求 1 所述抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交瘤 DY03 的制备方法， 其 特征是 ： 取血清效价大于 1 ： 104的 BALB/c 小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞按常规方法用 50%PEG-4000 进行融合 ； 用含 20% 小牛血清的 HAT RPMI-1640 培养基筛选融合细胞， 用重组 表达的人 UbcH10 包被 ELISA 板， 进行 ELISA 筛选 ； 经过多次有限稀释， 最后获得稳定分泌 抗人 UbcH10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 标记为 DY03。 4.一种检测人泛素偶联酶UbcH10表达情况的免疫检测试剂。
5、， 其特征是含有权利要求2 所述抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体 DY03。 权 利 要 求 书 CN 102234631 A CN 102234633 A1/5 页 3 一种人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交瘤 DY03 及单克 隆抗体 0001 技术领域 0002 本发明涉及细胞工程领域， 具体涉及一种人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交 瘤 DY03 及单克隆抗体。 背景技术 0003 肿瘤的早期诊断对于肿瘤患者的治疗和预后有着非常重要的意义， 目前临床常用 的肿瘤标志物诸如甲胎蛋白 AFP 和 CEA 缺乏足够的检测特异性和灵敏性， 因此需要选择更 加特异性的检测。
6、靶点。 0004 细胞内蛋白质降解主要有两条途径 ： 蛋白酶体途径和溶酶体途径。多数短寿 命的蛋白质通过蛋白酶体途径降解。 通过蛋白酶体途径降解的蛋白质大部分首先要经过泛 素化， 然后由蛋白酶体降解。故该途径又称泛素 - 蛋白酶体途径 ( ubiquitin proteasome pathway ； UPP)。UbcH10 属于人类泛素蛋白酶体途径中泛素偶联酶家族成员之一， 编码与 泛素依赖性蛋白降解有关的蛋白质人类泛素偶联酶 E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C， UBE2C/UBCH10） ， 又称细胞周期蛋白选择性泛素载体蛋白 （cyclin-sele。
7、ctive ubiquitin carrier protein） ， 是泛素化途径中细胞周期蛋白降解所必需的。 近年来， 由于 该蛋白在细胞周期的调节、 周期蛋白的降解、 肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、 恶变、 诊断及 治疗中的特殊地位而倍受关注。 0005 人类 UbcH10 基因位于 20 号染色体， 蛋白由 179 个氨基酸编码而成， 分子量 在 19.6kDa， 由于 UbcH10 在细胞周期的调节、 周期蛋白的降解、 肿瘤的发生及肿瘤细胞的增 殖、 恶变、 诊断及治疗中的特殊地位而倍受关注。近年来针对不同肿瘤的研究中， 越来越多 的数据显示UbcH10与肿瘤的关系十分密切， 可促进细胞。
8、增殖和恶性转化， 但UbcH10的特异 性致瘤作用及致瘤机制仍需进一步研究。 0006 UbcH10 是一种与癌症相关的泛素偶联酶， 研究发现其在肺、 胃、 子宫、 乳腺、 卵巢、 膀胱等原发肿瘤组织中表达上调， 且乳腺癌细胞中高表达 UbcH10 可以促进乳腺癌细胞的 增殖， 抑制UbcH10的表达可抑制乳腺癌细胞的生长。 还有报道称UbcH10的表达与高侵袭性 和恶性程度较高的甲状腺癌相关， 与卵巢癌的恶性程度也密切相关。 同时消化道肿瘤肝癌、 食管癌、 结肠癌以及结肠癌伴肝转移都与泛素偶联酶 UbcH10 的高表达有联系， 所有的临床 和实验室研究均表明泛素偶联酶 UbcH10 有作为潜。
9、在的多种不同肿瘤的临床诊断靶标的可 能。因此制备泛素偶联酶 UbcH10 的单克隆抗体具有十分重要的意义， 可以为该蛋白功能的 研究奠定基础， 同时为其作为肿瘤标志物的可行性提供实验数据支持。 0007 由于人泛素偶联酶 UbcH10 属于非分泌型表达蛋白， 在临床血清标本中含量较低， 基本很难检测， 通常在组织标本中表达量较高， 具有临床检测和验证的价值， 目前报道的文 献不同肿瘤基本都是从基因水平或组织标本中检测人泛素偶联酶 UbcH10 表达量升高。由 说 明 书 CN 102234631 A CN 102234633 A2/5 页 4 此， 制备能用于临床标本免疫组化检测的人泛素偶联酶。
10、 UbcH10 单克隆抗体进行大批量组 织标本的验证， 可为其作为肿瘤临床诊断靶标的验证提供有力工具。 0008 本发明与现有的人泛素偶联酶 UbcH10 抗体相比具有以下的特点和优势 ： 目前尚未有国产化的人泛素偶联酶 UbcH10 的抗体， 国外有一些公司有可以检测 UbcH10 的抗体产品， 但大多数是多抗产品， 像 Abnova Corporation 公司是鼠源性的 多抗， Boston Biochem, Inc. 和 Millipore 公司是兔源性的多抗， Everest Biotech、 Novus Biologicals、 Raybiotech, Inc. 和 IMGENEX。
11、 公司是羊源性的多抗， 另外 Santa Cruz Biotechnology, Inc. 公司还有针对 UbcH10 两个不同片段的抗体产品， 只有 Novus Biologicals 公司有针对人泛素偶联酶 E2C 的鼠源性单抗产品， 但其免疫原蛋白氨基酸序 列为AAH50736包括180个氨基酸， 且其单抗亚型为IgG3b1型， 只能用于ELISA 和Western。 同时， 国外抗体的价格通常较昂贵， 也限制了该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究。 发明内容 0009 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种能用于 ELISA、 western-blot、 免 疫荧光以及组织的免疫。
12、组化检测的抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体。 0010 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 本发明所述的检测人泛素偶联酶 UbcH10 的抗体都是用原核重组表达的人泛素偶联酶 UbcH10 蛋白作为抗原免疫小鼠获得， 并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株 DY03， 杂交瘤细胞为 IgG1 阳性， 轻链均为 型。所述抗人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体 杂交瘤 DY03， 于 2010 年 11 月 19 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏号为 CGMCC No.4336。 0011 本发明中人泛素偶联酶 UbcH10 的氨基酸序列为。
13、 AAH16292， 如 SEQ ID NO ： 1 所示。 本发明中人泛素偶联酶 UbcH10 的基因序列为 NM_007019， 如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0012 本发明中 UbcH10 的全长基因是由肝癌细胞 HepG2 中由 RT-PCR 的方法钓取。扩 增人泛素偶联酶 UbcH10 基因的引物序列为 ： 上游引物 ： 5- GTCGGATCCATGGCTTCCCAAAACCG -3 （SEQ ID NO ： 3） ， 下游引物 ： 5- ATTGCGGCCGCTTAGGGCTCCTGGCTGG -3（SEQ ID NO ： 4） 。 上游引入 BamH I 内切酶位点。
14、， 下游引入 Not I 内切酶位点。原核表达载体选择 pET-22b （+） 。 0013 所述的保藏号为CGMCC No.4336的杂交瘤细胞株DY03的制备方法是 ： 取血清效价 大于 1 ： 104的 BALB/c 小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞按常规方法用 50%PEG-4000 进行融 合 ； 用含 20% 小牛血清的 HAT RPMI-1640 培养基筛选融合细胞， 用重组表达的人泛素偶联 酶 UbcH10 蛋白包被 ELISA 板， 进行 ELISA 筛选 ； 经过多次有限稀释， 最后获得稳定分泌抗 人 UbcH10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 标记为 DY03。应用此株。
15、杂交瘤细胞以 1106/ 只的 量注入石蜡预处理的 8-10 周龄的 BALB/c 雌性小鼠腹腔， 饲养观察 10-14 天后小鼠腹部膨 大时抽取腹水。采用亲和色谱法 Protein G Sepharose Fast Flow 纯化单克隆抗体， 并通 过Sepharose S-200分子筛脱盐， PBS洗脱， 以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度， 纯度达到 90% 以上。 0014 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 本发明以重组人泛素偶联酶 UbcH10 蛋白包被 ELISA 板， 通过 ELISA 法检测纯化抗体的 说 明 书 CN 102234631 A CN 102234。
16、633 A3/5 页 5 阳性， 并用此纯化抗体对肝癌细胞 HepG2 和 SMMC7721 进行 Western-blot 证明该抗体可以 识别天然变性的人泛素偶联酶 UbcH10 蛋白。 0015 本发明将此纯化抗体用于进行肝癌细胞 SMMC7721 的免疫荧光染色以及肝癌组织 的免疫组化染色证明其能识别天然的人泛素偶联酶 UbcH10 蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的 单克隆抗体为进一步研究人泛素偶联酶 UbcH10 的功能和开发人泛素偶联酶 UbcH10 的临 床诊断试剂奠定了基础， 为其作为肿瘤临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。 0016 本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达人泛。
17、素偶联酶 UbcH10 全长蛋白， 其氨基酸序列为AAH16292， 全长179个氨基酸。 与国外现有抗体仅能用于ELISA 和Western 检测变性 UbcH10 蛋白以及价格昂贵等特点相比， 本发明的单克隆抗体除了能应用于 ELISA 和 Western 检测变性 UbcH10 蛋白以外还可以应用于细胞免疫荧光和临床肿瘤组织标本免 疫组化研究检测未变性的天然UbcH10蛋白， 同时降低了应用成本。 国外现有UbcH10抗体大 多数都是多克隆抗体， 特异性和灵敏度与本发明的 UbcH10 单克隆抗体相比要低， 并且国外 现有的单克隆抗体只能与失去了高级结构的变性蛋白结合， 而本发明的抗体不。
18、仅能与变性 蛋白结合， 还能与具有高级结构的天然蛋白结合， 从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。 本发明针对人泛素偶联酶 UbcH10 全长蛋白制备出的单克隆抗体对检测该蛋白具有较高的 特异性和灵敏度， 该抗体的应用将为人泛素偶联酶 UbcH10 功能研究和其作为肿瘤标志物 的临床标本验证工作提供支持。 附图说明 0017 图 1 是本发明单抗 DY03 亚型鉴定结果 ； 图 2 是本发明单抗 DY03 对肝癌细胞 HepG2 和 SMMC7721 免疫印迹的结果以及阴性对照 结果， 其结合条带的分子量为 29kDa 附近 ； 图 3 是本发明单抗 DY03 对肝癌细胞 SMMC7721 免疫。
19、荧光染色的结果以及普通光镜下的 对照结果 （显微镜放大倍数 200 倍） ； 图4是本发明单抗DY03对肝癌组织免疫组织化学染色的结果以及阴性对照结果 （显微 镜放大倍数 100 倍） 。 具体实施方式 0018 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 0019 实施例 1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定 1、 单抗 DY03 的制备 1） 重组人泛素偶联酶 UbcH10 抗原制备 从肝癌细胞 HepG2 中调取 UbcH10 基因， 构建原核重组表达载体 pET22b(+)/UbcH10 在 大肠杆菌Escherichia coli BL21 中表达， 利用 Ni Sepharose 亲和层。
20、析纯化柱进行纯化， 获得纯度达 90% 以上的重组人 UbcH10 蛋白。 0020 2） 免疫小鼠 以纯化的重组抗原免疫 6-8 周龄雌性 BALB/c 小鼠。 0021 第一次免疫 ： 取重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂混匀后， 以每只 50g/500L 的量多点皮下注射 BALB/c 小鼠 ； 说 明 书 CN 102234631 A CN 102234633 A4/5 页 6 第二次免疫 ： 隔 2 周后， 取重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后， 以每只 50g/500L 的量多点皮下注射 BALB/c 小鼠 ； 第三次免疫 ： 再隔2周后， 取重组抗原与等体积的PBS混匀后， 以每。
21、只50g/500L的 量腹腔注射 BALB/c 小鼠 ； 第三次免疫 10 天后小鼠尾静脉取血， 以重组抗原包被， ELISA 检 测血清效价， 取效价大于 1:104的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合 ； 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。 0022 3） 免疫血清效价测定 采用间接 ELISA 法测定免疫血清效价。取 50g 重组人泛素偶联酶蛋白溶解于 10ml 0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液， 包被聚苯乙烯微96孔板， 100l/孔， 4过夜。 次日， 使用PBS （含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次， 用 10mM PBS 含 1 BSA 封闭液 。
22、150l/ 孔， 37 封闭 1h， 使用 PBS（含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次， 小鼠于第三次免疫后 15 天眼 眶采血， 鼠免疫血清用含 1 BSA 10mM PBS 以 10-1 10-8倍稀释， 加入 96 孔板， 100l/ 孔 37 1h， PBS（含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次后， 加入 1 ： 1000 倍稀释辣根过氧化 物酶标记羊抗小鼠 IgG（Sigma,INC.） ， 100l/ 孔 37 1h， 同上洗板后， TMB 显色， 100l/ 孔， 室温避光 10min， 加 100l/ 孔 2M H2SO2终止反应，。
23、 测 450nm 吸收值， 以免疫前小鼠血清 作为阴性对照， 以测定值与对照值得比 2.1 为阳性来判断免疫血清的效价。 0023 3） 杂交瘤的制备 取血清效价大于 1:104的小鼠， 融合前 3 天， 取重组抗原与等体积的 PBS 混匀后， 以每 只 50g/500L 的量腹腔注射 BALB/c 待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏， 制成 脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株 SP2/0 按 1 ： 1 的比例混合， 500g 室温离 心 5min， 弃上清， 用手指轻弹离心管底部， 使沉淀松散， 离心管置于 37 水浴中， 将在 37 水浴保温的 50% 聚乙二醇 （PEG， M。
24、W4000， Sigma） 用滴管一滴滴加入离心管中， 边滴边摇动离 心管， 1min内滴完， 滴完后静置2min， 每隔1分钟加入37 预热的无血清1640培养基1ml、 2ml、 3ml、 4ml、 5ml 和 10ml 来终止聚乙二醇的作用， 细胞混合物 500g 室温离心 5min， 弃上 清， 加入 HAT 培养液 （次黄嘌呤 （H） 、 氨基喋呤 （A） 和胸腺嘧啶核苷 （T） （HAT， Sigma） ） 轻轻 重悬细胞， 将细胞分至 96 孔板中， 每孔 200l。培养三天后， 观察细胞融合情况， 更换一半 HAT 培养液， 连续数日， 直至有克隆形成， 更换 HT 培养液 （。
25、次黄嘌呤 （H） 和胸腺嘧啶核苷 （T） （HT， Sigma） ） 培养一天， 更换 1640 完全培养基。 0024 4） 筛选分泌抗人泛素偶联酶单克隆抗体的杂交瘤细胞 间接 ELISA 法筛选细胞培养上清， 选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆 化， 并用有限稀释法连续克隆化 2-3 次， 直至到 100% 细胞阳性率， 最后获得稳定分泌抗 UbcH10 单克隆抗体细胞株， 标记为 DY03。将克隆化后阳性率达 100% 的细胞扩增培养后液 氮冻存。 0025 5） 腹水的制备和纯化 将DY03杂交瘤细胞株以1106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的Balb/c雌 性小鼠腹。
26、腔， 饲养观察 10-14 天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法 Protein G Sepharose Fast Flow 纯化单克隆抗体， 并通过 Sepharose S-200 分子筛脱盐， PBS 洗脱， 以 SDS-PAGE 测定单克隆抗体的纯度， 纯度达到 90% 以上。 0026 2、 本发明单克隆抗体的特性鉴定 说 明 书 CN 102234631 A CN 102234633 A5/5 页 7 1） 抗体浓度的测定 ： 经杂交瘤细胞 CGMCC No.4336 制备的腹水经纯化后获得人泛素偶 联酶UbcH10单克隆抗体DY03， 分别使用BIO-RAD公司生产的Smar。
27、t Spec plus核酸蛋白测 定仪测定， 其浓度分别为 1.15mg/ml。 0027 2） 抗体亚型鉴定 ： 采用 Hbt 公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚 型， DY03 分泌抗体的亚型均为 IgG1 型， 轻链均为 链， 如图 1 所示。 0028 3） 纯化抗体的效价鉴定 ： 50g 重组 UbcH10 抗原溶于 10ml pH9.6 的 0.05M 碳酸 盐包被缓冲液中， 加入 96 孔板每孔 100L， 4过夜。PBS（含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次， 用 10mM PBS 含 1 BSA 封闭液 150l/ 孔， 37封闭 1h， 使。
28、用 PBS（含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次， 每孔加入 100l 纯化抗体， 37孵育 1h， PBS（含有 0.05% (V/ V) Tween-20） 洗板三次， 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗， 37孵 育 1h， PBS（含有 0.05% (V/V) Tween-20） 洗板三次， 每孔加入 100l TMB 显色， 37孵育 15min 后， 加入 2M H2SO4溶液终止反应， 酶标仪在吸光度值 450 nm 处检测。 0029 4） 抗体的Western blot鉴定 ： 收集肝癌细胞 （HepG2和SMMC7721） ， 用1S。
29、DS裂解 缓冲液裂解后上样， 经 12%SDS-PAGE 后用 Bio-Rad 电转移装置将蛋白转移至 PVDF 膜上， 5% 脱脂奶粉封闭过夜， pH7.4的Tris-HCl缓冲液 （含有0. 1% (V/V) Tween-20） 洗膜3次， 每次 10min， 1:800加入经纯化的杂交瘤细胞CGMCC No.4336制备的抗人泛素偶联酶UbcH10单克 隆抗体DY03， 室温孵育1h后， pH7.4的Tris-HCl缓冲液 （含有0. 1% (V/V) Tween-20） 洗膜 3 次， 每次 10min， 加入 1:5000 稀释的羊抗鼠 IgG 多克隆抗体 （Sigma） 为二抗， 。
30、室温孵育 1h， TTBS洗膜3次， 用滤纸吸去多余的溶液， 平铺于干净的保鲜纸上， 加入1.4ml SuperSignal 系列 Western 化学发光底物反应液 （A:B=1:1） ， 使膜完全浸润于反应液中， 迅速取出， 用滤 纸吸去多余液体， 铺于另一张保鲜纸上， 用保鲜纸把膜包好， 放入 X 射线摄影暗盒， 在暗房 中显影。杂交瘤细胞 CGMCC No.4336 制备的抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03 均出现单一的特异 性条带， 结果如图 2 所示。 0030 5） 抗体的免疫荧光鉴定 ： 收集肝癌细胞 SMMC7721， 铺于玻璃片上生长过夜， PBS 洗涤细胞， 使用预冷。
31、的多聚甲醛固定细胞， 分别加入杂交瘤细胞 CGMCC No.4336 制备的 抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03（1:500 稀释） ， 37孵育 1h， 以 PBS 为阴性对照。PBS 洗片后 1:1000 加入荧光标记羊抗鼠二抗 （Sigma） ， 37孵育 1h， PBS 洗片后， 荧光显微镜下观察， 经 抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03 染色的细胞均观察到红色荧光， 如图 3 所示。结果证明杂交瘤 细胞 CGMCC No.4336 制备的抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03 可识别天然的人 UbcH10 蛋白。 0031 6） 抗体的免疫组化鉴定 ： 从南方医院收集石蜡包埋。
32、的肝癌组织， 利用纯化后的杂 交瘤细胞 CGMCC No.4336 制备的抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03（1:500 稀释） 进行免疫组化染 色， 使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒， 染色方法参照迈新试剂盒说明书， DAB 显色， 阴性 对照组以 PBS 代替一抗， 结果发现经抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03 染色的组织标本上在细胞 质中均发现棕色颗粒， 如图 4 所示。肝癌细胞的免疫组化染色结果证明杂交瘤细胞 CGMCC No.4336 制备的抗 UbcH10 单克隆抗体 DY03 可识别天然的人 UbcH10 蛋白。 说 明 书 CN 102234631 A CN 10223。
33、4633 A1/4 页 8 SEQUENCE LISTING 南方医科大学 一种人泛素偶联酶 UbcH10 单克隆抗体杂交瘤 DY03 及单克隆抗体 4 PatentIn version 3.5 1 179 PRT 人体 1 Met Ala Ser Gln Asn Arg Asp Pro Ala Ala Thr Ser Val Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Lys Gly Ala Glu Pro Ser Gly Gly Ala Ala Arg Gly Pro Val Gly 20 25 30 Lys Arg Leu Gln Gln Glu Leu Met Thr Leu 。
34、Met Met Ser Gly Asp Lys 35 40 45 Gly Ile Ser Ala Phe Pro Glu Ser Asp Asn Leu Phe Lys Trp Val Gly 50 55 60 Thr Ile His Gly Ala Ala Gly Thr Val Tyr Glu Asp Leu Arg Tyr Lys 65 70 75 80 序 列 表 CN 102234631 A CN 102234633 A2/4 页 9 Leu Ser Leu Glu Phe Pro Ser Gly Tyr Pro Tyr Asn Ala Pro Thr Val 85 90 95 Ly。
35、s Phe Leu Thr Pro Cys Tyr His Pro Asn Val Asp Thr Gln Gly Asn 100 105 110 Ile Cys Leu Asp Ile Leu Lys Glu Lys Trp Ser Ala Leu Tyr Asp Val 115 120 125 Arg Thr Ile Leu Leu Ser Ile Gln Ser Leu Leu Gly Glu Pro Asn Ile 130 135 140 Asp Ser Pro Leu Asn Thr His Ala Ala Glu Leu Trp Lys Asn Pro Thr 145 150 15。
36、5 160 Ala Phe Lys Lys Tyr Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Lys Gln Val Thr Ser 165 170 175 Gln Glu Pro 2 823 DNA 人体 2 aaacgcgggc gggcgggccc gcagtcctgc agttgcagtc gtgttctccg agttcctgtc 60 tctctgccaa cgccgcccgg atggcttccc aaaaccgcga cccagccgcc actagcgtcg 120 序 列 表 CN 102234631 A CN 102234633 A3/4 页 10 ccgccgcc。
37、cg taaaggagct gagccgagcg ggggcgccgc ccggggtccg gtgggcaaaa 180 ggctacagca ggagctgatg accctcatga tgtctggcga taaagggatt tctgccttcc 240 ctgaatcaga caaccttttc aaatgggtag ggaccatcca tggagcagct ggaacagtat 300 atgaagacct gaggtataag ctctcgctag agttccccag tggctaccct tacaatgcgc 360 ccacagtgaa gttcctcacg ccctgc。
38、tatc accccaacgt ggacacccag ggtaacatat 420 gcctggacat cctgaaggaa aagtggtctg ccctgtatga tgtcaggacc attctgctct 480 ccatccagag ccttctagga gaacccaaca ttgatagtcc cttgaacaca catgctgccg 540 agctctggaa aaaccccaca gcttttaaga agtacctgca agaaacctac tcaaagcagg 600 tcaccagcca ggagccctga cccaggctgc ccagcctgtc cttg。
39、tgtcgt ctttttaatt 660 tttccttaga tggtctgtcc tttttgtgat ttctgtatag gactctttat cttgagctgt 720 ggtatttttg ttttgttttt gtcttttaaa ttaagcctcg gttgagccct tgtatattaa 780 ataaatgcat ttttgtcctt ttttagacaa aaaaaaaaaa aaa 823 3 26 DNA 人工序列 3 gtcggatcca tggcttccca aaaccg 26 4 28 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102234631 A CN 102234633 A4/4 页 11 4 attgcggccg cttagggctc ctggctgg 28 序 列 表 CN 102234631 A CN 102234633 A1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102234631 A 。