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1、(10)申请公布号 CN 102225995 A (43)申请公布日 2011.10.26 CN 102225995 A *CN102225995A* (21)申请号 201110099493.5 (22)申请日 2011.04.20 C08G 65/38(2006.01) C12P 1/02(2006.01) A01N 25/22(2006.01) A61K 8/86(2006.01) A61Q 5/10(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 谭仁祥 汪伟 宋雅男 沈薇 宋勇。
2、春 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 胡锡瑜 (54) 发明名称 一种单一型黑色素及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开一种单一型黑色素及其制备方 法和在药品及化妆品中的应用 ： 本发明一是以 1， 8- 二羟基萘为原料在酸性条件下与 NaNO2作 用得到的黑色粉末即为粉末二羟基萘黑色素 （DHN-melanin） ； 二是以 1， 8- 二羟基萘在真菌 DaldiniaeschscholziiIFB-TL01 胞外粗蛋白的 催化下得到片状的 DHN-melanin。得到的两种形 态的黑色素均有较强的羟基自由基清除活性。本 发明可以用在化妆品中起抗氧化和射线。
3、、 清除自 由基的作用， 可以用在染发剂中起装饰作用， 也可 用在生物杀虫剂方面起光保护剂的作用， 适用于 药品及化妆品等生物医药技术领域。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 CN 102226002 A1/1 页 2 1. 一种单一型黑色素， 其特征是黑色的高分子聚合物， 不溶于水、 强酸和其他有机溶 剂， 微溶于强碱， EPR 测试显示其含有 1, 8-DHN 自由基， 红外光谱。 2. 根据权利要求 1 所述单一型黑色素的制备方法， 其特征是 ： 由下列步骤组成 ： (1) 粉末状 DHN。
4、-melanin 1) 将 1， 8-DHN 加入酸性缓冲液中， 搅拌， 2) 搅拌过程中不断加入 NaNO2至等摩尔， 室温搅拌半小时， 3) 将反应产物过滤， 得到的沉淀分别用乙酸乙酯、 甲醇、 水漂洗两次， 4) 沉淀自然挥干， 经过 ESR 测试、 电镜观察证实为粉末 DHN-melanin ； (2) 片状 DHN-melanin 1) 硫酸铵浓缩法制备真菌Daldinia eschscholzii IFB-TL01 胞外粗蛋白， 利用 ABTS 法测定粗蛋白中含有的漆酶， 2) 粗蛋白的 pH 为 5， 在 10 ml pH5 的柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液中加入 5 mg 1，。
5、 8-DHN、 200U 的粗蛋白， 28， 180 rpm 反应 8 h， 3) 将反应液用乙酸乙酯萃取， 有机相 / 水相界面有不溶物， 将不溶物收集， 分别 用甲醇、 水漂洗两次， 凉干即得到片状黑色固体， 经过 ESR 测试、 电镜观察证实为片状 DHN-melanin。 3. 权利要求 1 所述单一型黑色素在清除羟自由基中的应用。 4. 权利要求 1 所述单一型黑色素在制备化妆品中起抗氧化和射线、 清除自由基的作 用。 5. 权利要求 1 所述单一型黑色素在制备染发剂中起装饰作用。 6. 权利要求 1 所述单一型黑色素在制备生物杀虫剂中起光保护剂作用。 权 利 要 求 书 CN 10。
6、2225995 A CN 102226002 A1/3 页 3 一种单一型黑色素及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种黑色素及其合成方法和在药品及化 妆品中的应用。 背景技术 0002 黑色素 (melanin) 是不溶于水和几乎所有溶剂的无定形小颗粒， 黑色素广泛存在 于动植物和微生物中的非均质的类多酚聚合体。 目前天然黑色素的提取主要是用动物组织 （乌骨鸡、 章鱼等） 、 植物 （黑米、 黑芝麻等） 、 微生物 （产黑色素放线菌、 真菌等） 。 黑色素的应用 广泛， 能作为紫外线吸收剂、 抗氧化剂、 自由基清除剂、 阳离子螯合剂和新型天然的药物载。
7、 体， 也可用来治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病。另外， 黑色素在化妆品、 染发剂 的装饰作用以及生物杀虫剂的光保护剂等方面有着广阔的应用前景。 0003 早在 1954 年 Commoner 在研究蛙卵的黑素组织工作中就提出黑素可以俘获自由 基,并把他们稳定在黑素基质中,亦即说明黑色素中含有自由基。 电子顺磁共振 （Electron Paramagnetic Resonance ， EPR） 的工作原理是未成对电子在外加磁场中吸收微波辐射会 改变电子自旋的状态， 所以 EPR 波谱可以用来检测自由基是否存在、 自由基浓度、 顺磁性物 质的电子顺磁共振光谱及证明自由基的结构， 波峰大小代。
8、表未成对电子含量的多寡。 0004 由于黑色素不溶于水和其他的有机容易， 不能用核磁共振等技术测定其复杂的结 构， 而红外光谱 (Infrared Spectroscopy, IR) 可以测试固态的样品， 且测试迅速， 操作方 便， 重复性好， 灵敏度高。IR 能够提供许多关于官能团的信息， 可以帮助确定部分乃至全部 分子类型及结构， 常用来测定黑色素等固态样品。 0005 目前已知的黑色素是复合型黑色素， 尚未见单一型黑色素的报道。 发明内容 0006 本发明需要解决的问题是公开一种单一型黑色素及其制备方法和在药品及化妆 品中的应用。 本发明所述黑色素的特征是黑色的高分子聚合物， 不溶于水、。
9、 强酸和其他有机 溶剂， 微溶于强碱， EPR 测试显示其含有 1, 8-DHN 自由基。 0007 本发明所采用的技术方案是 ： 一是以 1， 8- 二羟基萘为原料在酸性条件下与 等摩尔的 NaNO2作用， 产物过滤后沉淀用乙酸乙酯洗三次， 得到的黑色粉末即为粉末状 DHN-melanin。二是以 1， 8- 二羟基萘为原料在 pH5 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中加入真 菌 TL01 胞外粗蛋白 （含有漆酶） 进行催化， 反应液用乙酸乙酯萃取， 水相 / 有机相界面有不 溶物， 收集不溶物， 分别用水、 甲醇漂洗， 晾干后得到片状 DHN-melanin。 0008 一、 粉末状 DHN-me。
10、lanin 的制备方法 (1) 将 1， 8-DHN 加入酸性缓冲液中， 搅拌， (2) 搅拌过程中不断加入 NaNO2至等摩尔， 室温搅拌半小时， (3) 将反应产物过滤， 得到的沉淀分别用乙酸乙酯、 甲醇、 水漂洗两次， (4) 沉淀自然晾干， 经过 EPR 测试、 IR 测试、 电镜观察证实为粉末 DHN-melanin。 说 明 书 CN 102225995 A CN 102226002 A2/3 页 4 0009 二、 片状 DHN-melanin 的制备方法 (1) 硫酸铵浓缩法制备真菌 IFB-TL01（Daldinia eschscholzii IFB-TL01， 现保藏在 中。
11、国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 ： CCTCCM 207198， 保藏日期是 2007.12.13） 胞外粗 蛋白， 利用 ABTS 法测定粗蛋白中含有漆酶等氧化酶， (2) 粗蛋白的最适 pH 在 5， 在 10ml pH5 的柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液中加入 5 mg 1， 8-DHN、 200U 的粗蛋白， 28， 180 rpm 反应 8 h， (3) 将反应液用乙酸乙酯萃取， 有机相 / 水相界面有不溶物， 将不溶物收集， 分别用甲 醇、 水漂洗两次， 晾干后得到片状黑色固体， 经过 EPR 测试、 IR 测试、 电镜观察证实为片状 DHN-melanin。 0010 mel。
12、anin 的 EPR 测试说明片状 DHN-melanin 相对粉末状 DHN-melanin 含有较多的 自由基。电镜结果显示粉末状 DHN-melanin 是不均一的颗粒， 大小在 400-1200 nm 之间 ； 片 状 DHN-melanin 是不规则片状。 0011 本发明的有益效果体现在 ： 公开了一种单一型的黑色素的制备方法， 可以用在化 妆品中起抗氧化和射线、 清除自由基的作用， 可以用在染发剂中起装饰作用， 也可用在生物 杀虫剂方面起光保护剂的作用。 附图说明 0012 图 1 为粉末状 DHN-melanin 的电镜照片 图 2 为粉末状 DHN-melanin 的 EPR。
13、 测试图 图 3 为粉末状 DHN-melanin 的 IR 测试图 图 4 为片状 DHN-melanin 的电镜照片 图 5 为片状 DHN-melanin 的 ESR 测试图 图 6 为片状 DHN-melanin 的 IR 测试图。 具体实施方式 0013 通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限 定。 0014 实施例 1 ： 粉末状 DHN-melanin 的制备方法 1) 将 1， 8-DHN 慢慢加入柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液 （pH5.0） 中， 搅拌， 2) 搅拌过程中不断加入 1M 的 NaNO2溶液至等摩尔， 室温搅拌半小时， 3) 将反。
14、应产物过滤， 不溶物分别用乙酸乙酯、 甲醇、 水漂洗两次， 4) 沉淀自然晾干， 经过 EPR 测试、 IR 测试、 电镜观察证实为粉末 DHN-melanin。 0015 实施例 2 ： 硫酸铵浓缩法制备真菌Daldinia eschscholzii IFB-TL01 胞外粗蛋白 真菌IFB-TL01在PDA平板上活化， 将新鲜的菌体块接种到1 L 锥形瓶中， 每瓶含有400 mL 的 ME 培养基， 接种 5 6 瓶于摇床上， 在 150 200 rpm、 28条件下培养 4 天后， 将菌 体过滤， 菌液在 4， 10,000 rpm 离心 20 min 出去残留菌丝体 ； 菌液中缓慢加入。
15、硫酸铵， 使 其终浓度为 80% （每升菌液加入 516g 硫酸铵） ， 4下磁力搅拌器搅拌过夜使蛋白充分沉淀 ； 4下10,000rpm离心20 min后去除上清 ； 沉淀用适量柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解 （滤纸过 滤除去不溶物） ； 置于透析袋中透析 ； 之后将酶液进行冻干成褐色粉末。 说 明 书 CN 102225995 A CN 102226002 A3/3 页 5 0016 实施例 3 ： 真菌 IFB-TL01 胞外粗蛋白酶活测定 参照 Robort Bourbounais 方法， 以 3- 乙基苯并噻唑 -6- 磺酸 (ABTS) 为底物， 测定酶 对其的氧化速率。具体方法。
16、为 ： 反应在室温下进行， 总反应体积为 3 ml， 包括 0.5 ml 0.5 mmol/L ABTS 和 1.5 ml 0.1 mmol/L 柠檬酸， 添加 1 ml 发酵液， 在 420 nm 下测定其吸光值 的变化， 酶的单位定义为每分钟酶液吸光值增加量 OD420/(ml.min)， 证明 TL01 胞外粗蛋 白有漆酶 （或氧化酶） 活性。 0017 实施例 4 ： 片状 DHN-melanin 的制备方法 1) 硫酸铵浓缩制备的粗蛋白的最适 pH 在 5， 在 10ml pH5 的柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液中 加入 5 mg 1， 8-DHN、 200 U 的粗蛋白， 28， 。
17、180 rpm 反应 8 h， 2) 将反应液用乙酸乙酯萃取， 有机相 / 水相界面有不溶物， 将不溶物收集， 分别用甲 醇、 水漂洗两次， 晾干后得到片状黑色固体， 经过 EPR 测试、 IR 测试、 电镜观察证实为片状 DHN-melanin。 0018 实施例 5 ： 两种 melanin 的OH 自由基清除活性测定 1） 所需溶剂 ： CuSO4溶液， 1.14 mmol/ L ； 苯甲酸溶液， 0. 925 mmol/ L ； 抗坏血酸(AA)， 0. 97mmol/ L 溶液 （使用前配制） ； 磷酸盐缓冲溶液， pH7.40。 0019 2） 在 10mL 的试管中依次分别加入 。
18、5. 00 mL pH7.4 的磷酸盐缓冲溶液， 0.30 mL 1.14 mol/ L CuSO4溶液， 1.20 L 0.925 mmol/ L 苯甲酸和 1.00mL 97 mol/ L AA ， 定 容至 10 ml 摇匀， 在室温下放置 90 min， 取 200l 加到黑色的 96 孔板上， 然后在激发波长 和发射波长分别为 294 nm 和 414 nm 下测定相对荧光强度。 0020 3） 在以上体系中加入一定量的黑色素 , 测定荧光强度为 F黑, 未加黑色素的空白 体系 , 其荧光强度为 F0 ； 未加抗坏血酸及黑色素的体系， 其荧光强度为 F， 则清除率 清除率 (%)=(。
19、F0-F黑)/(F0-F) 4） 清除率计算 三次平均值 F0130.5 F60.13 F黑粉(10-6g/mL)87.8 F黑片(10-6g/mL)94.1 F黑粉=60.7% F黑片=51.7% 以上结果提示， 两种黑色素具有较强的清除羟基自由基的能力。 说 明 书 CN 102225995 A CN 102226002 A1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102225995 A CN 102226002 A2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102225995 A CN 102226002 A3/3 页 8 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102225995 A 。