《一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102221582 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102221582 A *CN102221582A* (21)申请号 201110082949.7 (22)申请日 2011.04.02 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/14(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国陕西出入境检验检 疫局 地址 710068 陕西省西安市含光北路 10 号 (72)发明人 何强 孔祥虹 乐爱山 李建华 吴双民 (74)专利代理机构 西安弘理专利事务所 61214 代理人 罗笛 (54) 发明名称 一种火锅底料中罗丹明 B 的快速检测。
2、方法 (57) 摘要 本发明公开的一种火锅底料中罗丹明 B 的快 速检测方法， 称取一定量的待检测的火锅底料、 饱 和氯化钠溶液、 乙腈及正己烷混合置于具塞离心 管中， 振荡提取1020min， 以40006000r/min 的速度离心 4 10min， 用注射器吸取 1 2mL 乙 腈层， 过 0.2m 有机微孔滤膜， 得到净化后的火 锅底料 ； 采用液相色谱仪对净化后的火锅底料进 行离子交换色谱 - 荧光检测， 得到火锅底料的液 相色谱图， 根据液相色谱图判断火锅底料中是否 有罗丹明 B 及定量。本发明火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法快速、 灵敏、 准确、 成本低廉、 专属 性强、 实。
3、用性强， 适合火锅底料及其生产原料中罗 丹明 B 的快速检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 102221593 A1/1 页 2 1. 一种火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法， 其特征在于， 具体按照以下步骤实施 ： 步骤 1 ： 称取一定量的待检测的火锅底料， 根据称取的待检测的火锅底料与饱和氯化 钠溶液的质量-体积浓度为250-400g/L称取饱和氯化钠溶液， 根据称取的待检测的火锅底 料与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L称取乙腈， 根据称取的待检测的火锅底料与正己 。
4、烷的质量 - 体积浓度为 100-200g/L 称取正己烷， 将称取的待检测的火锅底料、 饱和氯化钠 溶液、 乙腈及正己烷混合置于具塞离心管中， 振荡1020min， 以40006000r/min的速度 离心 4 10min， 用注射器吸取 1 2mL 乙腈层， 将吸取的乙腈层过 0.2m 有机微孔滤膜， 得到净化后的火锅底料 ； 步骤 2 ： 采用液相色谱仪对步骤 1 得到的净化后的火锅底料进行离子交换色谱 - 荧光 检测， 得到火锅底料的液相色谱图， 根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明 B 及定 量。 2.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法， 其特征在于， 所述的步。
5、 骤 2 中的离子交换色谱 - 荧光检测， 设置检测参数 ： SCX 强阳离子交换色谱柱 ： 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m ； 流动相 ： 体积比为 4 6 的乙腈 -0.1氨水溶液， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.8 1.2mL/min ； 柱温 ： 30 40； 进样量 ： 10 100L ； 激发波长 ： 548 552nm， 发射波长 ： 578 582nm。 3.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法， 其特征在于， 所述的步 骤 2 中根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明 B 的判断标准为 ： 如果样品的液相色 谱图在罗丹明 B 标准溶液。
6、色谱出峰位置有色谱峰出现， 而且信噪比大于 5， 则判断样品中含 有罗丹明 B， 如果样品的液相色谱图在罗丹明 B 标准溶液色谱出峰位置没有色谱峰出现， 则 样品中未检出罗丹明 B。 4.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法， 其特征在于， 所述的步 骤 2 中罗丹明 B 的定量采用标准曲线法或者外标一点法。 权 利 要 求 书 CN 102221582 A CN 102221593 A1/5 页 3 一种火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法 技术领域 0001 本发明属于食品检测技术领域， 涉及一种食品组分的检测方法， 具体涉及一种火 锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法。 背。
7、景技术 0002 罗丹明 B 又称若丹明 B、 玫瑰红、 花粉红等， 英文名称为 Rhodamine B， 是一种人工 合成的工业染料， 主要用于纺织品、 皮革制品、 木制品、 有色玻璃等的染色， 与苏丹红一样对 人体具有致癌作用， 2008 年被中国卫生部列入第一批食品中可能违法添加的非食用物质黑 名单， 但由于罗丹明 B 具有价格低廉、 色泽红艳、 稳定性强等特点， 常被不法商贩用作替代 食品添加剂的着色剂， 严重危害人们的饮食安全。 0003 火锅是我国民间流行的美食， 流行于全国各地， 目前已形成巨大的饮食产业， 火锅 底料是火锅饮食中不可缺少的原料之一， 主流的火锅底料主要由辣椒、 。
8、豆瓣、 牛油、 植物油 等构成， 一些不法分子为了追求产品的色泽， 在辣椒、 豆瓣等原料或火锅底料产品中非法添 加工业染料罗丹明 B， 危害人们的饮食安全， 2011 年春节期间， 深圳、 重庆、 河北、 四川等地 从火锅底料中查出违法添加的罗丹明 B， 加剧了人们对罗丹明 B 的担忧， 对火锅底料中罗丹 明 B 进行快速检测具有积极的意义。 0004 目前食品中罗丹明 B 的检测方法主要有高效液相色谱 - 荧光检测法、 高效液相色 谱-紫外检测法、 液相色谱-串联质谱法， 但这些方法的样品前处理均需要采用固相萃取或 凝胶渗透色谱净化， 过程复杂、 成本高、 周期长， 检测过程采用反向 C18。
9、 色谱柱分离， 专属性 差， 易产生干扰， 而且没有专门针对火锅底料样品的检测方法。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法， 解决了现有火锅 底料中罗丹明 B 的检测方法存在的样品前处理均需要采用固相萃取或凝胶渗透色谱净化， 过程复杂、 成本高、 周期长， 且检测过程采用反向 C18 色谱柱分离， 专属性差， 易产生干扰的 问题。 0006 本发明所采用的技术方案是， 一种火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法， 具体按 照以下步骤实施 ： 0007 步骤 1 ： 称取一定量的待检测的火锅底料， 根据称取的待检测的火锅底料与饱和 氯化钠溶液的质量-体积浓。
10、度为250-400g/L称取饱和氯化钠溶液， 根据称取的待检测的火 锅底料与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L称取乙腈， 根据称取的待检测的火锅底料与 正己烷的质量 - 体积浓度为 100-200g/L 称取正己烷， 将称取的待检测的火锅底料、 饱和氯 化钠溶液、 乙腈及正己烷混合置于具塞离心管中， 振荡1020min， 以40006000r/min的 速度离心410min， 用注射器吸取12mL乙腈层， 将吸取的乙腈层过0.2m有机微孔滤 膜， 得到净化后的火锅底料 ； 0008 步骤 2 ： 采用液相色谱仪对步骤 1 得到的净化后的火锅底料进行离子交换色 说 明 书 CN 1022。
11、21582 A CN 102221593 A2/5 页 4 谱 - 荧光检测， 得到火锅底料的液相色谱图， 根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹 明 B 及定量。 0009 本发明的特点还在于， 0010 其中步骤 2 中的离子交换色谱 - 荧光检测， 设置检测参数 ： SCX 强阳离子交换色谱 柱 ： 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m ； 流动相 ： 体积比为 4 6 的乙腈 -0.1氨水 溶液， 等度洗脱 ； 流速 ： 0.8 1.2mL/min ； 柱温 ： 30 40 ； 进样量 ： 10 100L ； 激发波 长 ： 548 552nm， 发射波长 ： 57。
12、8 582nm。 0011 其中步骤 2 中根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明 B 的判断标准为 ： 如 果样品的液相色谱图在罗丹明 B 标准溶液色谱出峰位置有色谱峰出现， 而且信噪比大于 5， 则判断样品中含有罗丹明 B， 如果样品的液相色谱图在罗丹明 B 标准溶液色谱出峰位置没 有色谱峰出现， 则样品中未检出罗丹明 B。 0012 其中步骤 2 中罗丹明 B 的定量采用标准曲线法或者外标一点法。 0013 本发明的有益效果是， 将样品提取、 净化在一步完成， 免去了传统方法中的固相萃 取或凝胶渗透净化过程， 节省样品前处理时间5倍以上， 降低前处理成本10倍以上， 利用选 择性强的离。
13、子交换色谱柱分离样品， 并结合专属性强的荧光检测器检测， 可以大幅提高抗 干扰能力， 避免假阳性结果， 提高检测结果的准确性。 本检测方法完整检测一个样品仅需不 到40min时间， 试剂成本2元左右， 检出限可达到5g/kg， 检测周期短、 检测成本低、 检测结 果准确、 灵敏度高， 适合生产企业及管理部门进行产品质量检测， 在大批量样品检测时更能 体现本方法的检测速度及检测成本优势。 附图说明 0014 图 1 为罗丹明 B 的化学结构式 ； 0015 图 2 为 2ng/mL 的罗丹明 B 标准溶液的液相色谱图 ； 0016 图 3 为试剂空白液相色谱图 ； 0017 图 4 为火锅底料样。
14、品液相色谱图 ； 0018 图 5 为火锅底料样品加标水平为 10g/kg 的液相色谱图 ； 0019 图 6 为罗丹明 B 的可见光吸收图谱。 具体实施方式 0020 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。 0021 本发明火锅底料中罗丹明 B 的快速检测方法， 具体按照以下步骤实施 ： 0022 步骤 1 ： 称取一定量的待检测的火锅底料， 进行提取和净化， 根据称取的待检测的 火锅底料与饱和氯化钠溶液的质量-体积浓度为250-400g/L称取饱和氯化钠溶液， 根据称 取的待检测的火锅底料与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L称取乙腈， 根据称取的待检 测的火锅底料与正己烷。
15、的质量-体积浓度为100-200g/L称取正己烷， 混合置于具塞离心管 中， 振荡提取 10 20min， 4000 6000r/min 离心 4 10min， 用注射器吸取 1 2mL 乙腈 层 ( 中间层 )， 过 0.2m 有机微孔滤膜， 得到净化后的火锅底料样品 ； 0023 步骤2 ： 采用液相色谱仪进行离子交换色谱-荧光检测， 设置检测参数为 ： 色谱柱 ： SCX 强阳离子交换色谱柱 ( 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m)， 或相当者 ； 流动相 ： 说 明 书 CN 102221582 A CN 102221593 A3/5 页 5 乙腈 -0.1氨水溶。
16、液 (4+6， 体积比 ) 等度洗脱 ； 流速 ： 0.8 1.2mL/min ； 柱温 ： 30 40； 进样量 ： 10100L ； 激发波长(Ex)548552nm， 发射波长(Em)578582nm， 对上步得到 的火锅底料样品进行检测， 得到火锅底料样品的液相色谱图， 如果样品的液相色谱图在罗 丹明 B 标准溶液色谱出峰位置有色谱峰出现， 而且信噪比大于 5， 则可判断样品中含有罗丹 明 B， 反之， 如果样品的液相色谱图在罗丹明 B 标准溶液色谱出峰位置没有色谱峰出现， 则 样品中未检出罗丹明B。 样品中的罗丹明B采用外标法进行定量， 定量方法可选择标准曲线 法或外标一点法。 00。
17、24 实施例 1 0025 称取 1g( 精确至 0.01g) 不含有罗丹明 B 的火锅底料样品于 50mL 具塞离心管中， 添加 50ng 罗丹明 B 标准， 加入 4.0mL 饱和氯化钠溶液、 10mL 乙腈、 10mL 正己烷， 振荡提取 10min， 4000r/min 离心 10min， 用注射器吸取约 2mL 乙腈层， 过 0.2m 有机微孔滤膜。分 析时采用 Supelco SCX 色谱柱 ( 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m)， 流动相为乙 腈 -0.1氨水溶液 (4+6， 体积比 )， 流速 1.0mL/min， 柱温 35， 进样量 50L， 激发波。
18、长 550nm， 发射波长 580nm， 加标样品中罗丹明 B 在 7.1min 出峰， 与标准溶液中罗丹明 B 的出 峰时间相同， 利用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹 B 的含量为 9.53ng/mL， 回收率为 95.3。 0026 实施例 2 0027 称取2g(精确至0.01g)不含有罗丹明B的火锅底料样品于50mL具塞离心管中， 添 加100ng罗丹明B标准， 加入5mL饱和氯化钠溶液、 10mL乙腈、 10mL正己烷， 振荡提取15min， 5000r/min 离心 6min， 用注射器吸取约 1.5mL 乙腈层， 过 0.2m 有机微孔滤膜。分析时采 用 Supelco SCX。
19、 色谱柱 ( 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m)， 流动相为乙腈 -0.1 氨水溶液 (4+6， 体积比 )， 流速 0.8mL/min， 柱温 40， 进样量 100L， 激发波长 548nm， 发射 波长 578nm， 加标样品中罗丹明 B 在 7.5min 出峰， 与标准溶液中罗丹明 B 的出峰时间相同， 利用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹 B 的含量为 9.85ng/mL， 回收率为 98.5。 0028 实施例 3 0029 称取3g(精确至0.01g)不含有罗丹明B的火锅底料样品于50mL具塞离心管中， 添 加150ng罗丹明B标准， 加入9mL饱和氯化钠。
20、溶液、 18mL乙腈、 18mL正己烷， 振荡提取20min， 6000r/min 离心 4min， 用注射器吸取约 2mL 乙腈层， 过 0.2m 有机微孔滤膜。分析时采用 Supelco SCX 色谱柱 ( 柱长 250mm， 柱内径 4.6mm， 填料粒径 5m)， 流动相为乙腈 -0.1氨 水溶液 (4+6， 体积比 )， 流速 1.2mL/min， 柱温 30， 进样量 10L， 激发波长 552nm， 发射波 长 582nm， 加标样品中罗丹明 B 在 6.1min 出峰， 与标准溶液中罗丹明 B 的出峰时间相同， 利 用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹 B 的含量为 9.72ng。
21、/mL， 回收率为 97.2。 0030 以下从原理方面对本发明进行说明 ： 0031 液相色谱条件的选择 ： 罗丹明 B 的化学结构式如图 1 所示， 其结构中含有两个可 以形成正离子的含氮基团， 适合用阳离子交换色谱进行分离分析。传统的罗丹明 B 分析均 采用反向C18色谱柱， 而C18色谱柱主要依靠化合物的极性大小来分离不同化合物， 选择性 低， 样品分析时要排除干扰就必须要有净化良好的样品前处理过程， 会延长样品检测的时 间， 升高检测成本。 阳离子交换色谱柱只对能够阳离子化的化合物有色谱保留， 所以专属性 强， 抗干扰能力强， 可以简化样品的前处理， 所以选择阳离子交换色谱柱分析罗丹。
22、明 B。 说 明 书 CN 102221582 A CN 102221593 A4/5 页 6 0032 阳离子交换色谱常用的流动相是磷酸盐缓冲液和有机相， 并通过调节磷酸盐缓冲 液的 pH 值及有机相的比例来调整化合物的出峰时间及峰形， 实验中先考察了 0.1mol/L 磷 酸二氢钠缓冲液与乙腈作为流动相的情况， 缓冲液与乙腈的体积比为11(因缓冲液中盐 浓度较高， 乙腈比例最好不要超过 50， 否则会造成盐析出， 损坏色谱系统 )， 当磷酸二氢 钠缓冲液 pH 为 3.0 时， 罗丹明 B 吸附在阳离子交换色谱柱上， 不能被洗脱下来， 当磷酸二氢 钠缓冲液pH为5.6时， 罗丹明B在13m。
23、in左右出峰， 但峰形胖， 灵敏度低， 当调节磷酸二氢钠 缓冲液 pH 为 8.0 时， 罗丹明 B 出峰时间提前， 峰形改善， 但考虑到磷酸二氢钠缓冲液配制比 较复杂而且高浓度的缓冲盐体系不适合大体积的有机溶剂 ( 本方法中为乙腈 ) 直接进样， 对液相色谱系统也有害， 后来选择 0.1氨水溶液和乙腈系统进行实验， 当 0.1氨水溶液 与乙腈为 1 1 时， 罗丹明 B 在 5min 左右出峰， 峰形尖锐， 但出峰时间过早， 少数样品会出 现一小的干扰峰， 而 0.1氨水溶液与乙腈为 3 2 时， 罗丹明 B 在 7min 左右出峰， 峰形良 好， 而且无干扰， 所以最终选择 0.1氨水溶液。
24、 - 乙腈 (3+2) 为流动相， 标准溶液、 试剂空白 的液相色谱图如图 2、 图 3 所示。 0033 接着对进样体积进行了考察， 用乙腈溶解标准， 分别进样 10、 20、 50、 100L 时， 罗丹明 B 的色谱保留时间和色谱峰形无显著差别， 为提高检测方法的灵敏度， 选择进样 100L。 0034 罗丹明 B 检测时所用的检测器主要有可见光检测器和荧光检测器， 罗丹明 B 的最 大可见吸收为 550nm( 图 6)， 荧光激发波长为 550nm， 荧光发射波长为 580nm， 可见光检测器 检测时选择罗丹明 B 的最大吸收波长 550nm， 但罗丹明 B 的灵敏度仅有荧光检测的二分。
25、之 一， 而且可见光检测的抗干扰能力比荧光检测要差， 所以选择荧光检测。 0035 将罗丹明 B 标准溶液 (2ng/mL) 按上述实验确定的液相色谱条件进样， 按 5 倍信噪 比计算方法的检出限， 按 10 倍信噪比计算方法的定量低限， 方法的检出限和定量低限分别 为 0.5ng/mL、 1.0ng/mL。 0036 提取净化条件的选择 ： 罗丹明 B 易溶于甲醇、 乙腈、 丙酮， 微溶于饱和氯化钠溶液， 在正己烷中溶解度也远低于甲醇和乙腈， 传统的方法采用丙酮或甲醇等溶剂提取食品中的 罗丹明 B， 然后采用氧化铝固相萃取柱或凝胶渗透色谱进行净化， 操作过程复杂， 耗时长， 成 本高。本检测。
26、方法根据罗丹明 B 的溶解性质和火锅底料的样品特点， 考察了甲醇、 乙腈、 丙 酮三种提取溶剂， 由于火锅底料中含有较多的油脂和一些水溶性物质， 提取净化过程中需 要考虑去除这些物质。由于液液萃取的简便性和低成本， 考虑用水和正己烷液液萃取来净 化， 而甲醇和丙酮与水互溶， 与正己烷也能够互溶， 萃取净化时需要转换溶剂， 操作复杂费 时， 而乙腈在高浓度盐存在的条件下能够与水分层， 与正己烷也能够有效分层， 所以选择用 乙腈进行样品提取， 在乙腈提取的同时加入饱和氯化钠溶液和正己烷， 振荡提取的同时进 行液液分配净化， 离心后罗丹明 B 存在于乙腈层中， 大大节省了样品前处理时间和成本。 00。
27、37 实验中考察了提取净化用乙腈体积和正己烷体积， 按照待检测的火锅底料与饱和 氯化钠溶液的质量 - 体积浓度为 250-400g/L， 与乙腈的质量 - 体积浓度为 100-200g/L， 与 正己烷的质量 - 体积浓度为 100-200g/L， 对净化效果 ( 脱脂 ) 和罗丹明 B 的加标回收率无 显著影响， 所以从节省试剂的角度考虑， 选择上述比例进行提取和净化。 0038 实验中考察了将乙腈层浓缩后定容进样检测和乙腈层过滤后直接进样检测两种 方式， 将乙腈提取液浓缩至干， 用 1mL 乙腈溶解定容， 过滤后进样检测， 灵敏度比乙腈层直 说 明 书 CN 102221582 A CN 。
28、102221593 A5/5 页 7 接进样能够提高 10 倍， 但增加了操作过程， 抬高了前处理成本， 延长了检测时间， 而且乙腈 提取液直接进样时方法的定量低限已经达到5g/kg(称样2.0g时)， 完全能够满足检测要 求， 没必要将操作过程复杂化， 所以选择将乙腈层过滤后直接进样。 火锅底料样品及样品加 标 ( 加标水平为 10g/kg) 的液相色谱图如图 4 和图 5 所示。 0039 线性关系 ： 取 1.0g/mL 的罗丹明 B 标准中间液， 用乙腈逐级稀释， 配制成 1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 20.0、 50.0、 100.0ng/mL 的罗丹明 B 系列标准工作。
29、液， 按上述实验确定的色 谱条件进样， 并以罗丹明 B 的色谱峰面积 Y 和质量浓度 X 进行线性拟合， 线性回归方程为 Y 4.56X-0.83， 线性相关系数 r 为 0.9999， 表明在 1.0ng/mL 100.0ng/mL 浓度范围内罗 丹明 B 的线性关系良好。 0040 火锅底料中加标回收率及精密度实验 ： 确定检测方法后， 以不含罗丹明 B 的火锅 底料为测试对象， 进行加标回收率实验及精密度实验， 以考察方法的适用性。 采用5g/kg、 10g/kg、 20g/kg 三个加标水平， 称样 2.0g， 分别加入 10ng、 20ng、 40ng 罗丹明 B 标准， 每 个加标。
30、水平重复 6 次， 加标回收率及精密度实验结果如表 1 所示， 罗丹明 B 的加标回收率在 76.7 105.5范围内， 回收率相对标准偏差低于 8.6， 回收率及重现性良好， 完全能 够满足检测要求。 0041 表 1 阴性火锅底料中罗丹明 B 加标回收率实验结果 (n 6) 0042 0043 辣椒及豆瓣酱中加标回收率实验 ： 按确定的检测方法， 以不含罗丹明 B 的辣椒和 豆瓣酱为测试对象， 进行加标回收率实验， 以考察方法对这两种样品的适用性。 按火锅底料 样品最低加标水平5g/kg进行加标， 称样2.0g， 加入10ng罗丹明B标准， 辣椒和豆瓣酱样 品均重复加标 3 次， 辣椒样品的加标回收率分别为 85.6、 97.2、 90.5， 豆瓣酱样品的 加标回收率为 92.8、 102.4、 95.3， 回收率均良好， 能够满足检测要求。 说 明 书 CN 102221582 A CN 102221593 A1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102221582 A CN 102221593 A2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102221582 A CN 102221593 A3/3 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102221582 A 。