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1、(10)申请公布号 CN 102298002 A (43)申请公布日 2011.12.28 CN 102298002 A *CN102298002A* (21)申请号 201010209413.2 (22)申请日 2010.06.23 G01N 33/68(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 35/00(2006.01) C12Q 1/32(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) C12Q 1/25(2006.01) (71)申请人 苏州艾杰生物科技有限公司 地址 215006 江苏省苏州市工业园区宏业路 128 路 B2 栋 (72)发明人 王。
2、尔中 (54) 发明名称 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及利用二倍扩增法、 酶比色法及酶 联法技术的甘氨酸含量的测定方法、 试剂的组成 及成分， 其测定的技术原理是依据氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶的 系列催化反应完成， 本发明还涉及一种甘氨酸测 定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、 误差小， 因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用 于食品检验。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 10 页 CN 102298011 A1/3 页 2 1。
3、. 一种利用二倍扩增法、 酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法， 其测定的技 术原理是根据下述氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶的系列催 化反应完成 ： 甘氨酸 +2 辅酶氰化氢合成酶氰化氢 + 二氧化碳 +2 还原型辅酶 二氧化碳 + 腺苷三磷酸 +Geranoyl CoA Geranoyl CoA 羧化酶 腺苷二磷酸 + 磷酸根 +3-(4- 甲基戊烯 -3- 醇 -1- 基 ) 戊烯 -2- 烯二醇 - 辅酶 A 磷酸根 + 甘油醛 -3- 磷酸 + 辅酶甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 甘油酸 -1， 3- 双磷酸 + 还原型辅酶。 2. 一种。
4、甘氨酸的测定方法， 其特征在于该方法的步骤如下 ： 2.1 样品准备 ： 2.1.1 标准样品的制备 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将其浓度调整到 1 毫摩尔 / 升 ； 2.1.2 待测样品的制备 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样 溶于水或缓冲液中 ； 2.1.3 空白样品 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 2.2 试剂溶液的制备 ： 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 。
5、与甘油醛 -3- 磷酸， 然后将它们混合均 匀， 用水溶解得到所述的试剂溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-5mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； 2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合， 在温 度15-45下反应5-60分钟， 在主波长340nm与副波长405nm(如果受 仪器限制， 可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ；。
6、 2.4 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定步骤 2.1.1) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 2.5 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定在步骤 2.1.3) 使用的水或缓冲液作为空白溶液 的吸光度随时间的变化 ； 2.6 数据处理 由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 ： 式中 ： A( 样品 ) 表示步骤 2.3) 得到的待测样品的吸光度变化 ； A( 空白 ) 表示步骤 2.5) 得到的空白溶液的吸光度变化 ； 权 利 要 求 书 CN 102298002 A CN 102298011 A2/3 页 3 A( 标准 。
7、) 表示步骤 2.4) 标准样品的吸光度变化。 3. 根据权利要求 1、 2 所述的测定方法， 其特征在于使用全自动生化分析仪测定时， 待 测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样， 然后在下述条 件下进行测定 ： 测定方法为终点法， 温度37， 反应时间10分钟， 测试主波长340nm， 测试副 波长 405nm， 被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为正反应， 延迟时 间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的测定方法， 其特征在于， 所述的稳定剂是一种或多种 选自硫酸铵、 氯化钠、 乙。
8、二醇、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠、 叠氮钠等防腐剂的稳定剂 ； 所述的 缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸 缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼 砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液 ； 所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 5. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的测定方法， 其特征在于 ： 5.1 所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂 ： 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 腺苷三磷酸、 Ge。
9、ranoyl CoA、 甘油醛 -3- 磷酸、 氰 化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶与甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶组成的 ； 5.2 所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 与甘油 醛 -3- 磷酸组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶与甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶组成的 ； 其中辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA、 甘油醛 -3- 磷。
10、酸在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 5.3 所述的试剂配制成如下三剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 与甘油 醛 -3- 磷酸组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 Geranoyl CoA 羧化酶与甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 组成的 ； 试剂 3， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂与氰化氢合成酶组成的 ； 其中辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA、 甘油醛 -3- 磷酸在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位。
11、置是不限定的。 6. 一种甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于 ： 6.1 它由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmol/L 氰化氢合成酶 1000-80000U/L Geranoyl CoA 羧化酶 1000-80000U/L 权 利 要 求 书 CN 102298002 A CN 102298011 A3/3 页 4 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 1000-80000U/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L Geranoyl CoA 1-100mmol/。
12、L 甘油醛 -3- 磷酸 1-100mmol/L。 6.2 根据权利要求 6.1 所述的甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmol/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L Geranoyl CoA 1-100mmol/L 甘油醛 -3- 磷酸 1-100mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 氰化氢合成酶 1000-80000U/L Geranoyl CoA 羧化酶 1000-80000U/L 甘油醛 -3- 磷。
13、酸脱氢酶 1000-80000U/L。 6.3 根据权利要求 6.1 所述的甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmol/L 腺苷三磷酸 1-100mmol/L Geranoyl CoA 1-100mmol/L 甘油醛 -3- 磷酸 1-100mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L Geranoyl CoA 羧化酶 1000-80000U/L 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 1000-80000U/L ； 组成如下的试。
14、剂 3 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 氰化氢合成酶 1000-80000U/L。 权 利 要 求 书 CN 102298002 A CN 102298011 A1/10 页 5 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 【技术领域】 0001 本发明涉及食品检验测定技术领域， 更具体地， 本发明涉及甘氨酸测定方法及其 试剂盒。 【背景技术】 0002 甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味， 能缓和酸、 碱味， 掩盖食品中 添加糖精的苦味并增强甜味。 人体若摄入甘氨酸的量过多， 不仅不能被人体吸收利用， 而且 会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基。
15、酸的吸收， 导致营养失衡而影响健康。甘 氨酸不能被人体利用， 只能分解转化为热能， 这样会增加肝脏负担。 而分解产物中的含氮化 合物要通过尿液排出体外， 又会增加肾脏负担。如果大量、 长期食用这类食品， 可能造成肝 肾损伤。 部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量， 在生产加工中违规使用甘氨酸， 对青 少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。 0003 按照我国 食品添加剂使用卫生标准 GB2760 规定， 甘氨酸在作为食品添加剂只允 许在调味剂与豆奶中使用， 且最高限量为每公斤 1 克， 但在含乳饮料中不允许使用。 【发明内容】 0004 要解决的技术问题 0005 本发明的目的是提供一。
16、种甘氨酸的测定方法。 0006 本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。 0007 技术方案 0008 本发明是通过下述技术方案实现的。 0009 本发明的方法是一种采用二倍扩增法、 酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺 辅酶(还 原型辅酶 ) 在 340nm 波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。 0010 本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧 化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶的系列催化反应完成 ： 0011 甘氨酸 +。
17、2 辅酶氰化氢合成酶氰化氢 + 二氧化碳 +2 还原型辅酶 0012 二氧化碳 + 腺苷三磷酸 +Geranoyl CoA Geranoyl CoA 羧化酶 0013 腺苷二磷酸 + 磷酸根 +3-(4- 甲基戊烯 -3- 醇 -1- 基 ) 戊烯 -2- 烯二醇 - 辅酶 A 0014 磷酸根 + 甘油醛 -3- 磷酸 + 辅酶甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 0015 甘油酸 -1， 3- 双磷酸 + 还原型辅酶 0016 本发明的方法利用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase ； EC 1.4.99.5)酶 (偶)联Geranoyl CoA羧化酶(geranoyl C。
18、oA carboxylase ； EC 6.4.1.5)、 甘油醛-3-磷酸 脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ； EC 1.2.1.59) 酶促反应终点法。 氰化氢合成酶酶解甘氨酸反应产生二氧化碳， 再通过 ( 偶 ) 联合 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘 油醛 -3- 磷酸脱氢酶的作用， 最终将辅酶 ( 在 340nm 处没有吸收峰 ) 还原成为还原型辅酶 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A2/10 页 6 ( 在 340nm 处有吸收峰 )， 从而得以测定还原型辅酶在 340nm 处吸光。
19、度上升的程度， 这样可 以通过测量 340nm 处吸光度上升的程度， 可以测算甘氨酸的浓度大小。 0017 本发明是通过下述技术方案实现的。 0018 本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下 ： 0019 A、 样品准备 ： 0020 A.1 标准样品的制备 0021 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升， 得到 的溶液作为标准样品 ； 0022 A.2 待测样品的制备 0023 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中 ； 0024 A.3 空白样品 0025 所述的水或缓冲液作为空。
20、白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0026 B、 试剂溶液的制备 ： 0027 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘 油醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 与甘油醛 -3- 磷酸， 然后将它们混合 均匀， 用水溶解得到所述的试剂溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-5mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L、 1-100mmol/L 与 1-100mm。
21、ol/L ； 0028 C、 待测样品与在步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/10 至 1/500 进行混合， 在 温度15-45下反应5-60分钟， 在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 0029 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 0030 E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 空白样品的吸光度随时间的变化 ； 0031 F、 数据处理 0032 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 ：。
22、 0033 0034 式中 ： 0035 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0036 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0037 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0038 根据本发明， 在所述的甘氨酸测定方法中， 所述的缓冲液应该理解是能够使其测 定介质的 pH 基本保持稳定 ( 一般是 6.5-8.5) 的溶液。如果该 pH 高于 8.5 或 pH 低于 6.5， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果， 因此需要添加更多的介质与酶， 才 有可能达到预期的活性效果。 说 明 书 CN 10229800。
23、2 A CN 102298011 A3/10 页 7 0039 在本发明中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴 比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。 0040 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0041 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液。
24、或磷酸盐缓冲液。 0042 根据本发明， 在所述的甘氨酸测定方法中， 所述的稳定剂应该理解是一种能保护 试剂中的介质 ( 底物 ) 与酶， 使其不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命， 通常长达数月， 甚至一、 二年。 如果没有所述的稳定剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时， 顶多数天， 就会逐渐失去活性而不再具备检测 性能。在本发明中， 所述的稳定剂使用量是 0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够， 则试剂活性的寿命就会缩短 ； 如果所述的稳定剂使用量过高， 则会增加成本。 0043 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自硫。
25、酸铵、 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘 油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0044 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 丙二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。 0045 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、 硫酸铵或双乙酸钠的稳定 剂。 0046 在本发明中， 所述的辅酶是一种或多种选自 NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 0047 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明使用全自动生化分析仪测定甘氨酸时， 待测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样， 然后 在下述条件下进行测定 ： 测定方法。
26、为二点终点法 / 终点法， 温度 37， 反应时间 10 分钟， 测 试主波长 340nm， 测试副波长 405nm， 被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反 应方向为正反应， 延迟时间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 0048 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂 试 剂 ： 0049 由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 与甘油醛 -3- 磷酸组 成的试剂 1 ； 0050 由所述的缓冲液、 稳定剂、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶与甘油醛 -3- 磷酸 脱氢酶组成的试剂。
27、 2 ； 0051 其中辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三 磷酸、 Geranoyl CoA、 甘油醛 -3- 磷酸在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 0052 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂 ： 0053 由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 腺苷三磷酸、 Geranoyl CoA 与甘油醛 -3- 磷酸组 成的试剂 1 ； 0054 由所述的缓冲液、 稳定剂、 Geranoyl CoA 羧化酶与甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶组成的 试剂 2 ； 0055 由所述的缓冲液、 稳定剂与氰化氢。
28、合成酶组成的试剂 3 ； 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A4/10 页 8 0056 其中辅酶、 氰化氢合成酶、 Geranoyl CoA 羧化酶、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶、 腺苷三 磷酸、 Geranoyl CoA、 甘油醛 -3- 磷酸在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 0057 在本发明甘氨酸测定方法中使用的测定仪器可以是紫外 / 可见光分析仪， 例如 上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限 公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的 B。
29、TS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林 帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商 品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。 0058 本发明还涉及甘氨酸测定试剂盒。该甘氨酸测定试剂盒由下述粉状试剂组成， 在 使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂 ： 0059 缓冲液 20-500mmol/L 0060 稳定剂 0.001-7mol/L 0061 辅酶 0.1-5mmol/L 0062 氰化氢合成酶 100。
30、0-80000U/L 0063 Geranoyl CoA 羧化酶 1000-80000U/L 0064 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 1000-80000U/L 0065 腺苷三磷酸 1-100mmol/L 0066 Geranoyl CoA 1-100mmol/L 0067 甘油醛 -3- 磷酸 1-100mmol/L。 0068 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明的甘氨酸测定试剂盒有 ： 0069 试剂 1 ： 0070 缓冲液 100mmol/L 0071 稳定剂 500mmol/L 0072 辅酶 1.25mmol/L 0073 腺苷三磷酸 5mmol/L 0074 Geranoyl。
31、 CoA 5mmol/L 0075 甘油醛 -3- 磷酸 5mmol/L ； 0076 组成如下的试剂 2 ： 0077 缓冲液 100mmol/L 0078 稳定剂 500mmol/L 0079 氰化氢合成酶 16000U/L 0080 Geranoyl CoA 羧化酶 18000U/L 0081 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 12000U/L。 0082 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明的甘氨酸测定试剂盒有 ： 0083 试剂 1 ： 0084 缓冲液 100mmol/L 0085 稳定剂 500mmol/L 0086 辅酶 1.25mmol/L 0087 腺苷三磷酸 5mmol/L。
32、 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A5/10 页 9 0088 Geranoyl CoA 5mmol/L 0089 甘油醛 -3- 磷酸 5mmol/L ； 0090 组成如下的试剂 2 ： 0091 缓冲液 100mmol/L 0092 稳定剂 500mmol/L 0093 Geranoyl CoA 羧化酶 18000U/L 0094 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 12000U/L ； 0095 组成如下的试剂 3 ： 0096 缓冲液 100mmol/L 0097 稳定剂 500mmol/L 0098 氰化氢合成酶 16000U/L。 0099 根据另一种。
33、本发明的优选实施方式， 在本发明的甘氨酸测定试剂盒中， 所述的缓 冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓 冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂 缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。 0100 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0101 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0。
34、102 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘 油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0103 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 丙二醇、 甘油、 双乙 酸钠或叠氮钠的稳定剂。 0104 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、 硫酸铵或双乙酸钠的稳定 剂。 0105 在本发明中， 无论是单剂试剂、 双剂试剂或三剂试剂， 在本发明测定甘氨酸的方法 中， 所述的辅酶可以是一种或多种选自 NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 0106 使用本发明的甘氨酸测定试剂盒时， 可以使用紫外 / 可见光分析仪。
35、， 例如上海精 密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售 的723可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半 自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林帕斯公司以 商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销 售的全自动生化分析仪。 0107 在采用本发明方法测定甘氨酸时， 根据实验要求进行多次试验， 然后将得到的这 些试验结果按照下式计算出精密度 (CV) ： 。
36、0108 0109 式中 ： 0110 - 试验结果平均值 ； 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A6/10 页 10 0111 Xi- 各次试验结果 ； 0112 n- 试验次数 .N 10 0113 0114 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差 ： 0115 0116 第一批各次试验结果平均值 0117 第二批各次试验结果平均值 0118 第三批各次试验结果平均值 0119 为 X， Y， Z 中的最大值 0120 为 X， Y， Z 中的最小值 0121 每批试样数取 n 3 0122 经过大量试验确定， 对于甘氨酸含量为 0-2mmol/L 的。
37、样品， 其分析误差可以达到 5。 0123 本发明方法的灵敏度可以达到 0.0001mmol/L。 0124 通过大量试验确定， 本发明方法测定甘氨酸含量范围是 0-2mmol/L， 本发明方法适 合于食品检测。 【具体实施方式】 0125 下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 0126 实施例 1 ： 牛奶中甘氨酸含量的测定 0127 1) 标准样品的制备 0128 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将甘氨酸浓度调整到 1 毫摩尔 / 升 ； 0129 2) 待测样品预处理 0130 牛奶样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0131 3) 空白样品 0132 所述的水或缓冲液作。
38、为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0133 B、 试剂溶液的制备 ： 0134 本实施例的甘氨酸测定试剂为单剂试剂， 它含有 ： 0135 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0136 甘油 1mol/L 0137 NADP+ 1.25mmol/L 0138 氰化氢合成酶 16000U/L 0139 Geranoyl CoA 羧化酶 18000U/L 0140 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 12000U/L 0141 腺苷三磷酸 5mmol/L 0142 Geranoyl CoA 3mmol/L 说 明 书 CN 102298002 A CN 1。
39、02298011 A7/10 页 11 0143 甘油醛 -3- 磷酸 4mmol/L。 0144 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0145 C、 待测牛奶样品， 与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/50进行混合， 在温度 37下反应 5 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变 化 A( 样品 ) 为 0.0498 ； 0146 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 A( 标准 ) 为 0.1638 ； 0147 E、 在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶。
40、液的吸光度随时 间的变化 A( 空白 ) 为 0.0011 ； 0148 F、 数据处理 0149 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 ： 0150 0151 式中 ： 0152 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0153 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0154 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0155 通 过 上 式 计 算 得 到 该 牛 奶 样 品 的 甘 氨 酸 含 量 为 0.30mmol/L， 其 误 差 是 0.002mmol/L。 。
41、0156 实施例 2 ： 牛奶中甘氨酸含量的测定 0157 1) 标准样品的制备 0158 将一定量的甘氨酸溶于水中， 再将甘氨酸浓度调整到 1 毫摩尔 / 升， 作为标准样 品 ； 0159 2) 待测样品的制备 0160 牛奶样品作为待测样品， 无须处理 ； 0161 3) 空白样品 0162 所述的水作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0163 B、 试剂溶液的制备 ： 0164 甘氨酸测定试剂为双剂试剂， 它含有 ： 0165 组成如下的试剂 1 ： 0166 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0167 NAD+ 2.25mmol/L 0168 腺苷三磷酸 5mmo。
42、l/L 0169 Geranoyl CoA 5mmol/L 0170 甘油醛 -3- 磷酸 5mmol/L ； 0171 组成如下的试剂 2 ： 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A8/10 页 12 0172 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0173 乙二醇 5mol/L 0174 氰化氢合成酶 16000U/L 0175 Geranoyl CoA 羧化酶 32000U/L 0176 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 40000U/L。 0177 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0178 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定。
43、 0179 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0180 计量方法 ： 两点终点法 0181 测试计量时间点 ： 21， 31 0182 主波长 ： 340 0183 副波长 ： 405 0184 反应温度 ： 37 0185 样品体积 ： 5 0186 试剂 1(R1) 体积 ： 200 0187 试剂 2(R3) 体积 ： 50 0188 反应方向 ： 正 0189 标准样品 1 ： 0.00 0190 标准样品 2 ： 1.00 0191 定标结果显示 K 值为 611， 换算成灵敏度为 0.1637A/mmol/L。 0192 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为 0.53mmol/L。
44、。其误差是 0.003mmol/L。 0193 实施例 3 ： 牛奶样品中甘氨酸含量的测定 0194 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是本实施例 ： 0195 B、 试剂溶液的制备 ： 0196 甘氨酸测定试剂为三剂试剂， 它含有 ： 0197 组成如下的试剂 1 ： 0198 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0199 NAD+ 1.25mmol/L 0200 腺苷三磷酸 6mmol/L 0201 Geranoyl CoA 5mmol/L 0202 甘油醛 -3- 磷酸 4mmol/L ； 0203 组成如下的试剂 2 ： 0204 三 ( 羧甲基 。
45、) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0205 硫酸铵 1mol/L 0206 Geranoyl CoA 羧化酶 28000U/L 0207 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 50000U/L ； 0208 组成如下的试剂 3 ： 0209 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0210 硫酸铵 2mol/L 说 明 书 CN 102298002 A CN 102298011 A9/10 页 13 0211 氰化氢合成酶 26000U/L。 0212 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0213 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析。
46、仪测定 0214 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0215 计量方法 ： 两点终点法 0216 测试计量时间点 ： 21， 31 0217 主波长 ： 340 0218 副波长 ： 405 0219 反应温度 ： 37 0220 样品体积 ： 5 0221 试剂 1(R1) 体积 ： 20 0222 试剂 2(R2) 体积 ： 180 0223 试剂 3(R3) 体积 ： 50 0224 反应方向 ： 正 0225 标准样品 1 ： 0.00 0226 标准样品 2 ： 1.00 0227 定标结果显示 K 值为 605， 换算成灵敏度为 0.1653A/mmol/L。 0228 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为 0.51mmol/L。其误差是 0.001mmol/L。 0229 实施例 4 ： 稳定性试验 0230 该实施例的操作方式与实施例 1 相同， 只是在实施例 1 实施后， 实施例 1 使用的试 剂在密闭试剂瓶中在 2-8下存放了半年与一年。 0231 使用同样的标准样品， 使用与实施例 2 同样的新试剂。