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1、(10)申请公布号 CN 102298020 A (43)申请公布日 2011.12.28 CN 102298020 A *CN102298020A* (21)申请号 201010215317.9 (22)申请日 2010.06.25 G01N 33/68(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/33(2006.01) C12Q 1/527(2006.01) C12Q 1/52(2006.01) C12Q 1/32(2006.01) (71)申请人 苏州艾杰生物科技有限公司 地址 215006 江苏省苏州市工业园区宏业路 128 号 B2 栋 (72)发明人 。
2、王尔中 (54) 发明名称 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的甘 氨酸含量的测定方法、 试剂的组成及成分， 其测定 的技术原理是依据甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成， 本发明 还涉及一种甘氨酸测定试剂盒。本发明的测定方 法灵敏度高、 误差小， 因此本发明的测定方法与试 剂盒可以广泛地应用于食品检验。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 10 页 CN 102298029 A1/3 页 2 1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓。
3、度测定方法， 其测定的技术原理是根据 下述甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成 ： 甘氨酸 + 酮戊二酸 甘氨酸转氨酶 乙醛酸 + 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸脱羧酶 4- 氨基丁酸 + 二氧化碳 二氧化碳 + 核糖 -5- 磷酸 + 还原型辅酶 磷酸葡糖酸脱氢酶 磷酸葡糖酸 + 辅酶 2. 一种甘氨酸的测定方法， 其特征在于该方法的步骤如下 ： 2.1 样品准备 ： 2.1.1 标准样品的制备 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将其浓度调整到 1 毫摩尔 / 升 ； 2.1.2 待测样品的制备 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标。
4、准样品一样 溶于水或缓冲液中 ； 2.1.3 空白样品 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 2.2 试剂溶液的制备 ： 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡 糖酸脱氢酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得到所述的试剂 溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-0.35mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； 2.。
5、3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合， 在温 度 15-45下反应 5-60 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm( 如果受仪器限制， 可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 2.4 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定步骤 2.1.1) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 2.5 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定在步骤 2.1.3) 使用的水或缓冲液作为空白溶液 的吸光度随时间的变化 ； 2.6 数据处理 由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 。
6、： 式中 ： A( 样品 ) 表示步骤 2.3) 得到的待测样品的吸光度变化 ； A( 空白 ) 表示步骤 2.5) 得到的空白溶液的吸光度变化 ； A( 标准 ) 表示步骤 2.4) 标准样品的吸光度变化。 3. 根据权利要求 1、 2 所述的测定方法， 其特征在于使用全自动生化分析仪测定时， 待 测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样， 然后在下述条 件下进行测定 ： 测定方法为终点法， 温度37， 反应时间10分钟， 测试主波长340nm， 测试副 权 利 要 求 书 CN 102298020 A CN 102298029 A2/3 页 3 波长 405nm，。
7、 被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为负反应， 延迟时 间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 4.根据权利要求1、 2或3所述的测定方法， 其特征在于， 所述的稳定剂是一种或多种选 自硫酸铵、 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠、 叠氮钠等防腐剂的稳定剂 ； 所述的缓 冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓 冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂 缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液 ； 所述的还原。
8、型辅酶是一种或多种选自 NADPH、 NADH 或 thio-NADH 的还原型辅酶。 5. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的测定方法， 其特征在于 ： 5.1 所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂 ： 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 酮戊二酸、 核糖 -5- 磷酸、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成的 ； 5.2 所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶与磷酸葡糖酸脱氢 酶组成的 ； 其中还原。
9、型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶、 酮戊二酸、 核 糖 -5- 磷酸在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 5.3 所述的试剂配制成如下三剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 谷氨酸脱羧酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成的 ； 试剂 3， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂与甘氨酸转氨酶组成的 ； 其中还原型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶、 酮戊二酸、 核 糖 -5- 磷酸在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 6. 一。
10、种甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于 ： 6.1 它由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 甘氨酸转氨酶 1000-80000U/L 谷氨酸脱羧酶 1000-80000U/L 磷酸葡糖酸脱氢酶 1000-80000U/L 酮戊二酸 1-100mmol/L 核糖 -5- 磷酸 1-100mmol/L。 6.2 根据权利要求 6.1 所述的甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定。
11、剂 0.001-7mol/L 权 利 要 求 书 CN 102298020 A CN 102298029 A3/3 页 4 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 酮戊二酸 1-100mmol/L 核糖 -5- 磷酸 1-100mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 甘氨酸转氨酶 1000-80000U/L 谷氨酸脱羧酶 1000-80000U/L 磷酸葡糖酸脱氢酶 1000-80000U/L。 6.3 根据权利要求 6.1 所述的甘氨酸测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol。
12、/L 稳定剂 0.001-7mol/L 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 酮戊二酸 1-100mmol/L 核糖 -5- 磷酸 1-100mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 谷氨酸脱羧酶 1000-80000U/L 磷酸葡糖酸脱氢酶 1000-80000U/L ； 组成如下的试剂 3 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 甘氨酸转氨酶 1000-80000U/L。 权 利 要 求 书 CN 102298020 A CN 102298029 A1/10 页 5 甘氨酸的测定方法与甘。
13、氨酸测定试剂盒 【技术领域】 0001 本发明涉及食品检验测定技术领域， 更具体地， 本发明涉及甘氨酸测定方法及其 试剂盒。 【背景技术】 0002 甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味， 能缓和酸、 碱味， 掩盖食品中 添加糖精的苦味并增强甜味。 人体若摄入甘氨酸的量过多， 不仅不能被人体吸收利用， 而且 会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收， 导致营养失衡而影响健康。甘 氨酸不能被人体利用， 只能分解转化为热能， 这样会增加肝脏负担。 而分解产物中的含氮化 合物要通过尿液排出体外， 又会增加肾脏负担。如果大量、 长期食用这类食品， 可能造成肝 肾损伤。 部分含乳饮料企。
14、业为提高产品中蛋白质含量， 在生产加工中违规使用甘氨酸， 对青 少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。 0003 按照我国 食品添加剂使用卫生标准 GB2760 规定， 甘氨酸在作为食品添加剂只允 许在调味剂与豆奶中使用， 且最高限量为每公斤 1 克， 但在含乳饮料中不允许使用。 【发明内容】 0004 要解决的技术问题 0005 本发明的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。 0006 本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。 0007 技术方案 0008 本发明是通过下述技术方案实现的。 0009 本发明的方法是一种采用酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Met。
15、hod) 与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在 340nm 波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。 0010 本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成 ： 0011 甘氨酸 + 酮戊二酸 甘氨酸转氨酶 乙醛酸 + 谷氨酸 0012 谷氨酸 谷氨酸脱羧酶 4- 氨基丁酸 + 二氧化碳 0013 二氧化碳 + 核糖 -5- 磷酸 + 还原型辅酶 磷酸葡糖酸脱氢酶 0014 磷酸葡糖酸 + 辅酶 0015 本发明的方法利用甘氨酸转氨酶 (glycine transa。
16、minase ； EC 2.6.1.4) 酶 ( 偶 ) 联谷氨酸脱羧酶 (glutamate decarboxylase ； EC 4.1.1.15)、 磷酸葡糖酸脱氢酶 (phosphogluconate dehydrogenase ； EC 1.1.1.44) 酶促反应终点法。甘氨酸转氨酶酶解 甘氨酸反应产生谷氨酸， 再通过 ( 偶 ) 联合谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶的作用， 最终 将还原型辅酶 ( 在 340nm 处有吸收峰 ) 氧化成为辅酶 ( 在 340nm 处没有吸收峰 )， 从而得以 测定还原型辅酶在 340nm 处吸光度下降的程度， 这样可以通过测量 340nm 处吸光。
17、度下降的 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A2/10 页 6 程度， 可以测算甘氨酸的浓度大小。 0016 本发明是通过下述技术方案实现的。 0017 本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下 ： 0018 A、 样品准备 ： 0019 A.1 标准样品的制备 0020 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升， 得到 的溶液作为标准样品 ； 0021 A.2 待测样品的制备 0022 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中 ； 0023 A.3 空白样。
18、品 0024 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0025 B、 试剂溶液的制备 ： 0026 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸 葡糖酸脱氢酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得到所述的试剂 溶液， 它们的浓度分别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-0.35mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L、 1-100mmol/L 与 1-100mmol/L ； 0027 C、 待测样品与在。
19、步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/10 至 1/500 进行混合， 在 温度15-45下反应5-60分钟， 在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 0028 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 0029 E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 空白样品的吸光度随时间的变化 ； 0030 F、 数据处理 0031 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 ： 0032 0033 式中 ： 0034 。
20、A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0035 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0036 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0037 根据本发明， 在所述的甘氨酸测定方法中， 所述的缓冲液应该理解是能够使其测 定介质的 pH 基本保持稳定 ( 一般是 6.5-8.5) 的溶液。如果该 pH 高于 8.5 或 pH 低于 6.5， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果， 因此需要添加更多的介质与酶， 才 有可能达到预期的活性效果。 0038 在本发明中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基。
21、甲烷 - 盐酸缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A3/10 页 7 比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲 液的缓冲液。 0039 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0040 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0041 根据本发明，。
22、 在所述的甘氨酸测定方法中， 所述的稳定剂应该理解是一种能保护 试剂中的介质 ( 底物 ) 与酶， 使其不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命， 通常长达数月， 甚至一、 二年。 如果没有所述的稳定剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时， 顶多数天， 就会逐渐失去活性而不再具备检测 性能。在本发明中， 所述的稳定剂使用量是 0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够， 则试剂活性的寿命就会缩短 ； 如果所述的稳定剂使用量过高， 则会增加成本。 0042 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘。
23、 油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0043 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 丙二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。 0044 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、 硫酸铵或双乙酸钠的稳定 剂。 0045 在本发明中， 所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、 NADH或thio-NADH的还 原型辅酶。 0046 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明使用全自动生化分析仪测定甘氨酸时， 待测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样， 然后 在下述条件下进行测定 ： 测定方法为二点终点法 / 终点法， 温。
24、度 37， 反应时间 10 分钟， 测 试主波长 340nm， 测试副波长 405nm， 被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反 应方向为负反应， 延迟时间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 0047 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试 剂 ： 0048 由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸组成的试剂 1 ； 0049 由所述的缓冲液、 稳定剂、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成 的试剂 2 ； 0050 其中还原型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶、 酮。
25、戊二酸、 核 糖 -5- 磷酸在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 0051 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂 ： 0052 由所述的缓冲液、 稳定剂、 还原型辅酶、 酮戊二酸与核糖 -5- 磷酸组成的试剂 1 ； 0053 由所述的缓冲液、 稳定剂、 谷氨酸脱羧酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成的试剂 2 ； 0054 由所述的缓冲液、 稳定剂与甘氨酸转氨酶组成的试剂 3 ； 0055 其中还原型辅酶、 甘氨酸转氨酶、 谷氨酸脱羧酶、 磷酸葡糖酸脱氢酶、 酮戊二酸、 核 糖 -5- 磷酸在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 0056 在本。
26、发明甘氨酸测定方法中使用的测定仪器可以是紫外 / 可见光分析仪， 例如 上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A4/10 页 8 公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林 帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商 品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销。
27、售的全自动生化分析仪。 0057 本发明还涉及甘氨酸测定试剂盒。该甘氨酸测定试剂盒由下述粉状试剂组成， 在 使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂 ： 0058 缓冲液 20-500mmol/L 0059 稳定剂 0.001-7mol/L 0060 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L 0061 甘氨酸转氨酶 1000-80000U/L 0062 谷氨酸脱羧酶 1000-80000U/L 0063 磷酸葡糖酸脱氢酶 1000-80000U/L 0064 酮戊二酸 1-100mmol/L 0065 核糖 -5- 磷酸 1-100mmol/L。 0066 根据一种本发明。
28、的优选实施方式， 本发明的甘氨酸测定试剂盒有 ： 0067 试剂 1 ： 0068 缓冲液 100mmol/L 0069 稳定剂 500mmol/L 0070 还原型辅酶 0.25mmol/L 0071 酮戊二酸 15mmol/L 0072 核糖 -5- 磷酸 15mmol/L ； 0073 组成如下的试剂 2 ： 0074 缓冲液 100mmol/L 0075 稳定剂 500mmol/L 0076 甘氨酸转氨酶 16000U/L 0077 谷氨酸脱羧酶 18000U/L 0078 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L。 0079 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明的甘氨酸测定试剂盒有 ：。
29、 0080 试剂 1 ： 0081 缓冲液 100mmol/L 0082 稳定剂 500mmol/L 0083 还原型辅酶 0.25mmol/L 0084 酮戊二酸 15mmol/L 0085 核糖 -5- 磷酸 15mmol/L ； 0086 组成如下的试剂 2 ： 0087 缓冲液 100mmol/L 0088 稳定剂 500mmol/L 0089 谷氨酸脱羧酶 18000U/L 0090 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L ； 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A5/10 页 9 0091 组成如下的试剂 3 ： 0092 缓冲液 100mmol/L 0。
30、093 稳定剂 500mmol/L 0094 甘氨酸转氨酶 16000U/L。 0095 根据另一种本发明的优选实施方式， 在本发明的甘氨酸测定试剂盒中， 所述的缓 冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓 冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂 缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。 0096 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0097 更优选地， 所述的缓冲。
31、液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0098 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘 油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0099 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、 氯化钠、 丙二醇、 甘油、 双乙 酸钠或叠氮钠的稳定剂。 0100 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、 硫酸铵或双乙酸钠的稳定 剂。 0101 在本发明中， 无论是单剂试剂、 双剂试剂或三剂试剂， 在本发明测定甘氨酸的方法 中， 所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自 NADPH、 NADH。
32、 或 thio-NADH 的还原型辅酶。 0102 使用本发明的甘氨酸测定试剂盒时， 可以使用紫外 / 可见光分析仪， 例如上海精 密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售 的723可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半 自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥林帕斯公司以 商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以商品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。 0103 在采用本。
33、发明方法测定甘氨酸时， 根据实验要求进行多次试验， 然后将得到的这 些试验结果按照下式计算出精密度 (CV) ： 0104 0105 式中 ： 0106 - 试验结果平均值 ； 0107 Xi- 各次试验结果 ； 0108 n- 试验次数 .N 10 0109 0110 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差 ： 0111 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A6/10 页 10 0112 第一批各次试验结果平均值 0113 第二批各次试验结果平均值 0114 第三批各次试验结果平均值 0115 为 X， Y， Z 中的最大值 0116 为 X， Y， Z 。
34、中的最小值 0117 每批试样数取 n 3 0118 经过大量试验确定， 对于甘氨酸含量为 0-2mmol/L 的样品， 其分析误差可以达到 5。 0119 本发明方法的灵敏度可以达到 0.0001mmol/L。 0120 通过大量试验确定， 本发明方法测定甘氨酸含量范围是 0-2mmol/L， 本发明方法适 合于食品检测。 【具体实施方式】 0121 下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 0122 实施例 1 ： 牛奶中甘氨酸含量的测定 0123 1) 标准样品的制备 0124 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中， 再将甘氨酸浓度调整到 1 毫摩尔 / 升 ； 0125 2) 待测样。
35、品预处理 0126 牛奶样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0127 3) 空白样品 0128 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0129 B、 试剂溶液的制备 ： 0130 本实施例的甘氨酸测定试剂为单剂试剂， 它含有 ： 0131 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0132 甘油 1mol/L 0133 NADPH 0.25mmol/L 0134 甘氨酸转氨酶 16000U/L 0135 谷氨酸脱羧酶 18000U/L 0136 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L 0137 酮戊二酸 15mmol/L 0138 核糖 -。
36、5- 磷酸 14mmol/L。 0139 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0140 C、 待测牛奶样品， 与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/50进行混合， 在温度 37下反应 5 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变 化 A( 样品 ) 为 0.0498 ； 0141 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 A( 标准 ) 为 0.1638 ； 0142 E、 在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时 说 明 书 CN 102298020 A 。
37、CN 102298029 A7/10 页 11 间的变化 A( 空白 ) 为 0.0011 ； 0143 F、 数据处理 0144 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 甘氨酸的含量 ： 0145 0146 式中 ： 0147 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0148 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0149 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0150 通 过 上 式 计 算 得 到 该 牛 奶 样 品 的 甘 氨 酸 含 量 为 0.30mmol/L， 其 误 差。
38、 是 0.002mmol/L。 0151 实施例 2 ： 牛奶中甘氨酸含量的测定 0152 1) 标准样品的制备 0153 将一定量的甘氨酸溶于水中， 再将甘氨酸浓度调整到 1 毫摩尔 / 升， 作为标准样 品 ； 0154 2) 待测样品的制备 0155 牛奶样品作为待测样品， 无须处理 ； 0156 3) 空白样品 0157 所述的水作为空白样品， 其甘氨酸浓度为 0 毫摩尔 / 升 ； 0158 B、 试剂溶液的制备 ： 0159 甘氨酸测定试剂为双剂试剂， 它含有 ： 0160 组成如下的试剂 1 ： 0161 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0162 NADH 0.25mmol/L。
39、 0163 酮戊二酸 15mmol/L 0164 核糖 -5- 磷酸 15mmol/L ； 0165 组成如下的试剂 2 ： 0166 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0167 乙二醇 5mol/L 0168 甘氨酸转氨酶 16000U/L 0169 谷氨酸脱羧酶 32000U/L 0170 磷酸葡糖酸脱氢酶 40000U/L。 0171 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0172 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0173 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0174 计量方法 ： 两点终点法 说 明 书 CN 102298020 A CN 10。
40、2298029 A8/10 页 12 0175 测试计量时间点 ： 21， 31 0176 主波长 ： 340 0177 副波长 ： 405 0178 反应温度 ： 37 0179 样品体积 ： 5 0180 试剂 1(R1) 体积 ： 200 0181 试剂 2(R3) 体积 ： 50 0182 反应方向 ： 负 0183 标准样品 1 ： 0.00 0184 标准样品 2 ： 1.00 0185 定标结果显示 K 值为 -611， 换算成灵敏度为 0.1637A/mmol/L。 0186 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为 0.39mmol/L。其误差是 0.003mmol/L。 0187 。
41、实施例 3 ： 牛奶样品中甘氨酸含量的测定 0188 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是本实施例 ： 0189 B、 试剂溶液的制备 ： 0190 甘氨酸测定试剂为三剂试剂， 它含有 ： 0191 组成如下的试剂 1 ： 0192 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0193 NADH 0.25mmol/L 0194 酮戊二酸 16mmol/L 0195 核糖 -5- 磷酸 14mmol/L ； 0196 组成如下的试剂 2 ： 0197 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0198 硫酸铵 1mol/L 0199 谷氨酸脱。
42、羧酶 28000U/L 0200 磷酸葡糖酸脱氢酶 50000U/L ； 0201 组成如下的试剂 3 ： 0202 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0203 硫酸铵 2mol/L 0204 甘氨酸转氨酶 26000U/L。 0205 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0206 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0207 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0208 计量方法 ： 两点终点法 0209 测试计量时间点 ： 21， 31 0210 主波长 ： 340 0211 副波长 ： 405 0212 反应温度 ：。
43、 37 0213 样品体积 ： 5 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A9/10 页 13 0214 试剂 1(R1) 体积 ： 20 0215 试剂 2(R2) 体积 ： 180 0216 试剂 3(R3) 体积 ： 50 0217 反应方向 ： 负 0218 标准样品 1 ： 0.00 0219 标准样品 2 ： 1.00 0220 定标结果显示 K 值为 -605， 换算成灵敏度为 0.1653A/mmol/L。 0221 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为 0.19mmol/L。其误差是 0.001mmol/L。 0222 实施例 4 ： 稳定性试验 0。
44、223 该实施例的操作方式与实施例 1 相同， 只是在实施例 1 实施后， 实施例 1 使用的试 剂在密闭试剂瓶中在 2-8下存放了半年与一年。 0224 使用同样的标准样品， 使用与实施例 2 同样的新试剂与上述存放半年与一年的试 剂分别进行了测定， 其它条件都与实施例 2 相同， 其测定结果如下 ： 0225 表 1 0226 甘氨酸含量 分析误差 新试剂 1.03mmol/L 0.001mmol/L 存放半年的试剂 1.01mmol/L 0.001mmol/L 存放一年的试剂 1.05mmol/L 0.001mmol/L 0227 表 1 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测。
45、定方法可以保证获得 稳定 的结果， 其稳定性至少一年以上。 0228 实施例 5 ： 线性试验 0229 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是配制新的标准样品浓度达到 2.50mmol/L， 将 2.50mmol/L 的甘氨酸依倍比稀释， 然后进行测试， 其测定结果如下 ： 0230 表 2 0231 甘氨酸预期值 甘氨酸测试值 0.00 0.06 0.25 0.24 0.50 0.52 0.75 0.75 1.00 1.03 1.25 1.25 1.50 1.49 2.00 2.00 2.50 2.40 0232 表 2 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证。
46、线性可以 达到 2.00mmol/L。 0233 申请人经过实验验证， 采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的， 鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。 0234 总之， 实验证明 ： 采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果空白试剂吸光度变化 (A) 0.002 ； 吸光度时间反应曲线应呈下降曲 线 ； 试剂可测有效 (R 0.99) 线形范围可达 2.00mmol/L ； 试剂测试的不准确度， 其相对偏 说 明 书 CN 102298020 A CN 102298029 A10/10 页 14 差不超过 5 ； 试剂测试的精密度 ( 重复性 ) 的变异系数 (CV) 5 ； 试剂的灵敏度可 达0.16000.0080A/mmol/L ； 试剂在2-8下保存， 活性可以稳定一年 ； 本发明灵敏度 高、 精确度好， 线形范围宽广， 稳定期长， 足以便于推广应用。 说 明 书 CN 102298020 A 。