一种重组核酸酶及其制备方法.pdf

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1、10申请公布号CN104099310A43申请公布日20141015CN104099310A21申请号201310131713722申请日20130412C12N9/22200601C12N15/70200601C12R1/4320060171申请人杭州俊丰生物工程有限公司地址310023浙江省杭州市西湖区留下工业园11号20172发明人刘国安徐辉方芳54发明名称一种重组核酸酶及其制备方法57摘要本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。本发明的重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。本发明还提供了制备重组核酸酶的方法，包括基因序列的优化、融合标签肽段的编码序列与。

2、核酸酶基因相连接、克隆、转化和筛选高表达菌株、培养并进行分离纯化得到高纯度重组核酸酶。本发明的重组核酸酶及其制备方法，表达方案简单，表达量高，达到30，纯化工艺特异性强，收率高。本发明的重组核酸酶应用于医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，有助于提高产品质量。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表8页附图2页10申请公布号CN104099310ACN104099310A1/1页21一种重组核酸酶，其特征在于由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。2根据权利。

3、要求1所述的重组核酸酶，其特征在于融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的N端，或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的C端，或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的N端和C端。3根据权利要求1所述的重组核酸酶，其特征在于融合标签肽段为210个组氨酸、FLAG。人CMYC蛋白表位、流感病毒血凝素表面抗原决定簇、葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白和硫氧环蛋白。4根据权利要求1所述的重组核酸酶，其特征在于优选的融合标签肽段为6个组氨酸序列。5根据权利要求14任意一项权利要求所述的重组核酸酶，其特征在于重组核酸酶的分子量为26KD45KD。6根据权利要求14任意一项权。

4、利要求所述的重组核酸酶，其特征在于重组核酸酶的比活性为0215X106U/MG。7一种制备如权利要求1所述的重组核酸酶的的方法，其特征在于1重组核酸酶基因的获得；2表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌将融合标签肽段的编码序列与核酸酶基因序列相连接的片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后转化大肠杆菌宿主菌；3阳性克隆的筛选、培养、诱导表达筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；4重组核酸酶的分离、纯化首先将大肠杆菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化得到重组核酸酶。8根据权利要求7所述的一种重组核酸酶的制备方法，其特征在于表达载体是PET系列载体质粒。

5、或载体上带有融合标签肽段编码序列的质粒载体。9根据权利要求7所述的一种重组核酸酶的制备方法，其特征在于步骤3中培养的温度控制在2540，优选在2830。10根据权利要求7所述的一种重组核酸酶的制备方法，其特征在于采用亲和层析技术，凝胶颗粒上结合了能与融合标签肽段特异结合的配基，再结合离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化。权利要求书CN104099310A1/11页3一种重组核酸酶及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸酶及其制备方法。背景技术0002生物技术产品在高效表达时宿主细胞或菌体也大量增殖，这一过程中往往伴随着大量的宿主或菌体核酸的扩增，。

6、在后续的分离过程中大量的核酸释放会给目标产品的分离纯化增加难度，同时部分残留宿主DNA与产品结合也很难去除。宿主细胞的DNA同药物一起进入人体会产生不可预料的副作用，残留DNA可能造成机体DNA的插入突变，导致抑癌基因失活、癌基因被激活等，有可能造成药物使用者致癌，因此宿主细胞DNA残留量是产品质量控制的重要指标之一。0003许多机构都对重组蛋白类药物的DNA残留制定了严格的标准，1984年的国际会议上采纳了残余DNA的临时限度标准，即来自连续传代细胞系的生物制品每人份剂量DNA残留不能超过10PG。1986年WHO会议一致认为不高于100PG/剂量的细胞DNA对于非口服途径的产品，其危险性是。

7、可以忽略不计的。1987年，美国FDA建议每人份剂量残余细胞DNA的可接受限度为10PG。1997年，美国FDA将生物制品可以允许的残余DNA限度修改为不超过100PG。欧洲药典通则中对于残余DNA的限度规定为不超过10NG/剂量，但针对个别疫苗如甲型肝炎灭活疫苗残余DNA应不超过100PG/剂量；乙型肝炎疫苗DNA残留量应不超过10PG/剂量会有所不同。00041990年2月，卫生部颁布的人用重组DNA制品质量控制要点3316条款规定，必须用敏感的方法测定来源于宿主细胞的残余DNA含量，这对于用哺乳动物传代细胞转化的细胞系生产的制品尤为重要。一般认为残余DNA含量小于100PG/剂量是安全的。

8、。中国药典三部2005年版对CHO细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出CHO细胞残余DNA含量不高于10PG/剂量。近几年，我国采用VERO细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类包括人用狂犬病纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫苗。中国药典2005年版三部及2010年版三部对于VERO细胞培养疫苗一般要求残余外源DNA不超过100PG/剂量。0005生物组织及菌体裂解后大量的核酸释放使样品的黏度很高，不利于分析及从中分离目标产品。使用核酸酶降解DNA是除去宿主细胞DNA残留的常用方法。核酸酶通过降低生物制品，尤其是病毒类产品外源性核酸的含量，减少过敏反应，提高制品安全性。。

9、工程细胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀和上清液的分离，超滤时有利于各成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性。颗粒病毒、包涵体等用核酸酶预处理有助于颗粒的纯化。在ELISA、柱层析、二维电泳和免疫印迹等生物样品分析中，通过核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。0006非特异性核酸内切酶是一类高活性的水解酶，其最大特点是能非特异性地降解几乎所有形式的核酸。来自粘质沙雷氏菌非特异性核酸内切酶SERRATIAMARCESCENSNONSPECIFICENDONUCLEASE，SMNE，EC31302是其中的典型代表，该酶能降解各种形说明书CN104099310。

10、A2/11页4式核酸的核酸内切酶，包括单链，双链，线性和环状DNA和RNA以及基因组DNA，对核酸的序列没有严格要求，并且没有蛋白酶活性。该酶在广泛条件范围具有很高的核酸降解活性，能将核酸完全消化成杂交限度以下的25个碱基长度的5单磷酸寡核苷酸。0007该酶由分子量为30KDA的两个亚基组成，作用的PH范围为610，温度042，酶发挥活性需要12MMMG2。在离子型及非离子型表面活性剂和1MMOL/LPMSF，1MMOL/LEDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150MMOL/L的单价阳离子，大于100MMOL/L的磷酸根，大于100MMOL/L硫酸铵和大于100MMOL/L盐酸胍抑制酶。

11、的活性。0008核酸酶具有广阔的应用前景，目前市场上销售的核酸酶产品主要是德国MERCK公司的ENDONUCLEASE。该产品是将SERRATIAMARCESCENS核酸酶基因克隆到PNUC1质粒载体，转化大肠杆菌W3310实现核酸酶基因的分泌表达，生产工艺保证了产品的纯度和活性，使该产品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒污染。0009美国ACAMBIS公司的CHIMERIVAXTMPLATFORM疫苗研究平台系统，采用黄热病毒载体研究生产登革热、WN和JE脑炎疫苗。这些重组疫苗的研发始于19971999年，在20002003年获得IND批准。在质量控制方面包括1种子系统外源因。

12、子检测，逆转录病毒检测，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别，小鼠和猴体神经毒力的安全性，无菌性等；2疫苗收获液检定无菌性，效力，外源因子检测，逆转录病毒检测，基因序列鉴别等；3纯化的疫苗原液无菌性，效力，基因序列鉴别，HAS，残余DNA检测，内毒素等；4半成品无菌性，效力，基因序列鉴别和免疫染色鉴别小鼠神经毒力安全性，残余BENZONASE检测，残余DNA检测，赋形剂，渗透压等；5成品无菌性，内毒素，免疫染色鉴别，一般安全性、外观、PH、渗透压、赋形剂等。这表明BENZONASE核酸酶已经用于疫苗的开发和生产。00102007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200HENDOSTATIN的质量控制及其大。

13、规模扩增纯化的初步研究中应用BENZONASE提高重组腺病毒的质量，工艺条件最佳的作用浓度在100200U/ML，置于37水浴，60分钟。重组复制型溶瘤腺病毒P53产品工艺中也使用了BENZONASE酶，质量标准制定了相应的残留量检测项目。VACCINE杂志2007年发表了关于人用罗斯河病毒感染ROSSRIVERVIRUS疫苗的临床前试验文章，其中疫苗制备工艺首先是40升反应器中病毒的微载体培养，然后收获培养上清进行过滤，滤液中加入BENZONASE核酸酶处理，浓度2000U/L，37，1小时以消化残留的VERO细胞DNA。后续病毒经甲醛灭活24小时后再加入BENZONASE核酸酶1000U/。

14、L以进一步处理残留的核酸。00112009年发表于THEJOURNALOFGENEMEDICINE的一项关于腺病毒载体纯化的研究PURIFICATIONOFADENOVIRALVECTORSBYCOMBINEDANIONEXCHANGEANDGELFILTRATIONCHROMATOGRAPHY中应用BENZONASE的条件为1200UBENZONASE加到125ML98U/ML粗裂解物，37保温1小时，然后28条件3000G离心10分钟后进一步纯化。结果病毒颗粒的收率有很大改善，在超滤后纯化的第一步97的BENZONASE核酸酶能够去除。00122010年GENETHERAPY杂志报道了通过。

15、单纯疱疹病毒互补系统生产、纯化腺相关病毒的工作，其中重组病毒颗粒释放后采用BENZONASE核酸酶25UML/L，MGCL22MMOL/L处理，37振荡保温24小时，这样便于在后续的工艺中有效地去除残留DNA。00132011年，LANGFIELDKK等在METHODSMOLBIOL杂志发表了关于制备麻疹病毒的文章。麻疹病毒作为具有肿瘤治疗前景的溶瘤病毒，正在进行临床试验，但溶瘤病毒的说明书CN104099310A3/11页5活性依赖于高浓度具有感染性的病毒颗粒。在纯化中，病毒培养上清过滤后采用BENZONASE核酸酶处理来消化其中的核酸以便于后续的制备工作。00142012年，BANDEIR。

16、AV等在纯化慢病毒颗粒载体LENTIVIRALVECTOR的工艺过程中使用了BENZONASE核酸酶，结果能去除99的DNA残留。美国食品药品监督管理局网站WWWFDAGOV公开了病毒载体的生产工艺过程，其中有BENZONASE核酸酶的处理步骤，通过37保温1小时，就能有效去除细胞及质粒DNA。宫颈癌疫苗GARDASIL的工艺过程中使用BENZONASE核酸酶4处理病毒颗粒过夜以帮助消化DNA从而使宿主残留DNA在后续纯化过程中容易去掉，降低终产品中宿主DNA的残留量。0015BENZONASE核酸酶的应用使细胞基质DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸后在疫苗的纯化过程中很容易去除，大大降低了残留。

17、DNA的含量，提高了疫苗产品的质量。保证了产品的安全性。同时与疫苗颗粒相比，BENZONASE核酸酶是小分子蛋白质，在去除血清蛋白的过程中也很容易去除。然而BENZONASE核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，终产品可以控制含量，但无法完全避免。BENZONASE核酸酶是外源性蛋白，极微量的残留都有可能引发个别接种者出现过敏反应，导致临床不测事件发生。00162009年，张开俊等发表了SERRATIAMARCESCENS非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用的研究工作，其中采用分泌表达的方式进行表达，表达量非常低，目标蛋白占大肠杆菌菌体总蛋白约5，只有80MG/L。2011年，蔡俊杰进行了粘质沙。

18、雷氏菌胞外核酸酶重组表达纯化及鉴定的研究工作，表达量有所提高，达到菌体总蛋白的10。但产品没有活性。0017因此非常有必要开发一种高效表达的重组核酸酶以满足医药产品开发的需求，又能方便地与产品实现分离。发明内容0018本发明的目的在于提供一种表达量高，而且使用后容易从样品中去除的重组核酸酶，为了实现发明的目的，本发明采用了以下技术方案0019一种重组核酸酶，由粘质沙雷氏菌胞外核酸酶和融合标签肽段组成。0020融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的N端，或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的C端。或者融合标签肽段序列在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的的N端和C端。0021本发明采用的融合标。

19、签肽段为210个组氨酸的多聚氨基酸、FLAGDYKDDDDK氨基酸序列、人CMYC蛋白表位、流感病毒血凝素表面抗原决定簇、葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽巯基转移酶、绿色荧光蛋白和硫氧环蛋白序列。0022优选的融合标签多聚氨基酸肽段序列为6个组氨酸序列。0023本发明的重组核酸酶的分子量为26KD45KD，优选的分子量为3040KD，其中最优选的为28KD。0024本发明重组核酸酶的比活性为0215X106U/MG，优选的为1015X106U/MG0025本发明还提供了一种制备重组核酸酶的方法，包括1、重组核酸酶基因的获得；2表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌将融合标签肽段的编码序列与核酸酶CDNA相。

20、连接的片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后转化大肠杆菌宿主菌；3、阳性克隆说明书CN104099310A4/11页6的筛选、培养、诱导表达筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；4、重组核酸酶的分离、纯化首先将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化得到重组核酸酶。0026核酸酶CDNA序列是已知的，编码一个全长246个氨基酸的蛋白质。核酸酶的编码序列可以来源于基因文库，再1根据表达的序列进行序列优化；或根据文献报道的核酸酶CDNA序列优化后进行全基因合成，标签肽段的编码序列和核酸酶编码序列通过PCR扩增获得重组核酸酶的编码序列。00。

21、27本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤3中是用氨苄青霉素做抗性筛选，也可以使用卡那霉素做抗性筛选。0028本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤3中诱导表达使用浓度为0115MMOL/L的IPTG作为诱导剂，优选0410MMOL/L的IPTG作为诱导剂。0029本发明一种重组核酸酶的制备方法步骤3中诱导表达使用浓度为0120MMOL/L的乳糖作为诱导剂，优选15MMOL/L的乳糖作为诱导剂。0030本发明一种重组核酸酶的制备方法，表达载体是PET系列载体质粒和载体上含有融合标签肽段编码序列的质粒载体。0031本发明一种重组核酸酶的制备方法，步骤3中培养的温度控制在2540，优选在2830。0032。

22、本发明一种重组核酸酶的制备方法，采用亲和层析技术，凝胶颗粒上结合了能与融合标签肽段特异结合的配基，再结合离子交换层析、分子筛层析、疏水层析一种或多种方法进行纯化使产品纯度达到95以上。0033本发明一种重组核酸酶及其制备方法，其表达方案简单，表达量高，达到30，纯化工艺特异性强，收率高。本发明的重组核酸酶应用在医药产品的工艺中，在产品分离纯化过程中很容易利用亲和层析技术从产品中去除，从而提高了产品的质量。附图说明0034附图1、PET22ANUN质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDSPAGE分析0035M标准蛋白质分子量974、662、43、31、20、144KD；00361未诱导菌体总蛋白；0。

23、03724诱导菌体总蛋白。0038附图2、PET11BNUC质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDSPAGE分析0039M标准蛋白质分子量974、662、43、30、201、144KD；00401、2诱导菌体总蛋白；00413未诱导菌体总蛋白。0042附图3、PET28ANUNC质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDSPAGE分析0043M标准蛋白质分子量974、662、43、31、20、144KD；00441未诱导菌体总蛋白；004525诱导菌体总蛋白。0046附图4、PGEXNUGST质粒编码重组核酸酶表达全菌蛋白SDSPAGE分析0047M标准蛋白质分子量974、662、43、31、20、144。

24、KD；说明书CN104099310A5/11页700481未诱导菌体总蛋白；00492、3诱导菌体总蛋白。0050附图5、IMAC亲和层析结果图谱0051附图6、离子交换Q柱层析结果图谱0052附图7、HIC疏水层析结果图谱0053附图8、纯化重组核酸酶PET28ANUNC质粒编码SDSPAGE分析0054M标准蛋白质分子量974、662、43、31、20、144KD；00551重组核酸酶5G；00562重组核酸酶2G；00573重组核酸酶1G。0058附图9、纯化重组核酸酶PET28ANUNC质粒编码免疫印迹分析0059M标准蛋白质分子量974、714、43、31、247、166KD；006。

25、01重组核酸酶2G；00612重组核酸酶1G；00623重组核酸酶05G；00634BENZONASE酶05G。0064附图10、ELISA检测重组核酸酶含量与OD450NM的关系图具体实施例0065下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。0066实施例一重组核酸酶基因的获得0067根据文献报道GENBANKM194951的粘质沙雷菌SMARCESCENS核酸酶基因序列，进行基因表达序列优化，优化后序列见序列表1，合成20段互补的寡核苷酸，按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37处理30MIN，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合，94变性5MIN，立即65退火10。

26、MIN，然后加入T4连接酶，16连接过夜，获得目的基因模板片段。取4个灭菌的微量离心管，加入00680069上述混合物轻轻震荡混匀后再短暂离心，然后置于14水浴中保温连接过夜1216H。取5L连接产物加入到50L冰上解冻的大肠杆菌TOP10感受态细胞中，轻旋几次混匀，冰上放置30分钟。将管放入预加温到42的水浴中，热激90秒。然后迅速置于冰上，使细胞冷却10分钟。每管中加800LLB培养基不含抗生素，37振荡培养1小时。室温4,000RPM离心5分钟，弃去800L上清后，用剩余50L培养基重悬细胞说明书CN104099310A6/11页8并涂布到含AMP的LB琼脂平板表面，再在平板上滴加40L。

27、20MG/MLXGAL、7L200MG/MLIPTG。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37培养，1216小时后可出现菌落，白色菌落即为获得阳性菌落。0070实施例二N端带融合标签重组核酸酶基因的表达0071设计一对引物，引物1和2分别见序列表序列2和序列3，基因5端引物带有NDEI酶切位点，3端引物带有BAMHI酶切位点，在02MLPCR微量离心管中配制25L反应体系0072007394预变性5MIN，设置941MIN、551MIN、722MIN，共30个循环，最后7210MIN。PCR结束后取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小777BP一致，见序列表序列4，其编码的。

28、氨基酸序列见序列表序列5。0074PET22A质粒用NDEI、BAMHI双酶切回收大片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20L反应体系基因片段与载体大片段的比例为101，加T4DNA连接酶300单位，15连接过夜，取10L连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21DE3感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。0075氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆PET22ANUN。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。0076接种阳性克隆进行培养，经08MMOL/L的IPTG诱导，表达结果见附图1，与对照相比，。

29、重组核酸酶的表达量达到30以上。0077实施例三C端带融合标签重组核酸酶基因的表达0078设计一对引物，引物3和4分别见序列表序列6和序列7，基因5端引物带有NDEI酶切位点，3端引物带有BAMHI酶切位点，在02MLPCR微量离心管中配制25L反应体系0079说明书CN104099310A7/11页9008094预变性5MIN，设置941MIN、561MIN、722MIN，共30个循环，最后7210MIN。PCR结束后取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小784BP一致，见序列表序列8，其编码的氨基酸序列见序列表序列9。0081PET11B质粒用NDEI、BAMHI双酶切回收大。

30、片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20L反应体系基因片段与载体大片段的比例为101，加T4DNA连接酶300单位，15连接过夜，取10L连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21DE3感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。0082氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆PET11BNUC。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。0083接种阳性克隆进行培养30，250RPM，6个小时，经10MMOL/L的IPTG诱导，表达结果见附图2，与对照相比，重组核酸酶的表达量达到30以上。0084实施例四两端带融。

31、合标签重组核酸酶基因的表达0085设计一对引物，引物5和6分别见序列表序列10和序列11，基因5端引物带有NDEI酶切位点，3端引物带有BAMHI酶切位点，在02MLPCR微量离心管中配制25L反应体系0086008794预变性5MIN，设置941MIN、581MIN、7290S，共35个循环，最后7210MIN。PCR结束后取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳，片段大小与设计的大小811BP一致，见序列表序列12，其编码的氨基酸序列见序列表序列13。说明书CN104099310A8/11页100088PET28A质粒用NDEI、BAMHI双酶切回收大片段，与PCR的核酸酶基因片段连接，20L反应体。

32、系基因片段与载体大片段的比例为101，加T4DNA连接酶300单位，15连接过夜，取10L连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21DE3感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37培养过夜，获得工程菌进行进一步筛选。0089氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆PET28ANUNC。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。0090接种阳性克隆进行培养，经05MMOL/L的IPTG诱导，表达结果见附图3，与对照相比，重组核酸酶的表达量达到30以上。0091实施例五GST融合重组核酸酶基因的表达0092设计一对引物，引物7和8分别见序列表序列14。

33、和序列15，引物7带有BAMHI酶切位点，引物8带有XHOI酶切位点。以重组质粒PET22ANUN为模板，50L体系扩增核酸酶基因，扩增程序为945MIN；9430S，5230S，7230S，30个循环；最后72延伸10MIN。将PCR产物切胶回收，用BAMHI和XHOI同时酶切PCR纯化产物和PGEX4T1，酶切后切胶回收，以T4连接酶16连接过夜，构建表达载体PGEXNUGST，转化GT116，提取质粒，双酶切鉴定及测序。重组质粒的GST融合重组核酸酶编码基因序列见序列表序列16，其编码的氨基酸序列见序列表序列17。重组表达载体PGEXNUGST转化到感受态大肠杆菌BL21DE3中。将阳性。

34、菌落过夜培养物按1比例接种到含氨苄青霉素AMP100G/ML的LB液体培养基中，37、250RPM培养至OD600约06，取2ML菌液做未诱导对照，剩余菌液添加IPTG至终浓度为1MMOL/L，25继续培养6H，离心收集菌体，进行SDSPAGE分析，结果见图4，目标蛋白的表达量大于30。0093实施例六重组核酸酶的分离纯化00941、菌体培养0095配制4升LB培养基胰蛋白胨10G/L、酵母提取物5G/L、氯化钠10G/L，PH70，培养基配好后于121温度下湿热消毒灭菌30MIN。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加AMP使其终浓度为100MG/L，冷却后置4冰箱中备用。0096无菌操。

35、作条件下在平板中挑取PET22ANUNC单菌落于100MLLB培养基含AAMP中，然后置于37下，180RPM摇床培养过夜。从培养过夜的种子培养物按2接种量转接于LB培养基中，于37、250RPM培养4小时，培养液的OD600约为08，然后加入诱导剂IPTG至终浓度1MMOL/L。继续培养4小时，离心收集菌体5,000RPM10MIN。菌体用洗涤液20MMTRISHCL，PH70，015MNACL洗涤23次。00972、菌体破碎0098取约10G湿菌体，按1G湿菌体加20ML破菌缓冲液50MMTRISHCLBUFFER，01MNACL，PH85悬浮菌体，即用200ML破菌缓冲液悬浮菌体，然后冰。

36、浴超声破碎超声功率5000W，每次超声5S，间歇5S，即占空比50，共进行90个循环，收集破菌上清10,000RPM离心10MIN，收集上清液。00993、产物的分离0100IMAC层析柱CHELATINGSEPHAROSEFASTFLOW凝胶用蒸馏水以流速10ML/MIN冲洗100ML。再用平衡液20MMTRISHCL，05MNACL，PH80平衡5CV至流出液与平衡液电导及紫外吸收值一致。破菌上清补加NACL使终浓度为05M，调PH至80，然后上层说明书CN104099310A109/11页11析柱，收集流出液。用平衡液洗涤层析柱使紫外吸收和电导均达到基线。用洗脱液20MMTRISHCL，。

37、05MNACL，05M咪唑，PH80进行梯度洗脱，分别用150MM咪唑和300MM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰，层析图谱见图5。最后用100洗脱液洗涤层析柱。层析结束后用蒸馏水冲洗层析柱后保存于20酒精中。01014、产物的进一步纯化0102将收集到的目标峰去盐后进行离子交换层析法纯化，其过程为用PH值为85的20MMOL/LTRISCL缓冲液稀释，使其电导率小于5MS/CM。用同样的缓冲液平衡Q柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用00105MOL/LDNACL梯度洗脱，收集目标蛋白峰，层析图谱见图6。目标蛋白补加NH42SO4使终浓度为1015MOL/L，样品上10MOL/LNH42SO4，20M。

38、MOL/LPB，PH74的缓冲液平衡的PHENYLSEPHAROSEFASTFLOW柱，通过降低盐浓度梯度洗拖，收集目标蛋白峰，见图7的疏水层析图谱。0103得到的疏水层析峰经SEPHADEXG25脱盐，平衡液为20MMOL/LPB，PH74。样品脱盐后即为精细纯化的核酸酶，15SDSPAGE电泳分析样品纯度，结果见图8，样品纯度达到99以上。0104实施例七GST融合重组核酸酶基因的表达0105含PGEXNUGST表达质粒的重组接种至LB液体培养基含AMP，100G/ML，30摇床振荡250RPM培养过夜。次日按1接种LB液体培养基中含AMP，100G/ML，30摇床振荡250RPM培养至O。

39、D60005时，加入IPTG终浓度为1MMOL/L，诱导表达5H，离心，4，5000RPM，20MIN，弃上清，收集沉淀称重。菌体用裂解液500MMOL/LNACL，20MMOL/LTRISHCL，PH75重悬菌体沉淀，超声波破碎菌体冰上操作，15S/5S，全程15MIN，破碎后于14000RPM、4离心20MIN，分别收集裂解上清和沉淀，0106裂解上清使用GSTRAPFF谷胱甘肽琼脂糖树脂GLUTATHIONESEPHAROSE4B柱进行亲和层析纯化，其中平衡缓冲液为PBS140MMOL/LNACL，27MMOL/LKCL，10MMOL/LNA2HPO4，18MMOL/LKH2PO4，PH。

40、73，洗脱缓冲液50MMOL/LTRISHCL，10MMOL/L还原型谷胱甘肽，PH80，用大约5倍柱床容积的平衡缓冲液PBS平衡柱子，上样经045M的过滤器过滤的超声裂解液的上清，再用PBS平衡洗脱杂蛋白，用5倍柱床容积的洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的融合蛋白，收集洗脱液。对目标蛋白进行过夜透析，透析液为凝血酶裂解液PBS，PH73，以除去还原型谷胱甘肽。LOWRY法融合蛋白的浓度，根据每毫克蛋白加入10L10单位的凝血酶，室温2225孵育16H，用PBSPH73缓冲液过夜透析除去GST。然后与GLUTATHIONESEPHAROSE4B按每毫升层析介质结合8MG蛋白孵育30MIN，500G离。

41、心5MIN，上清中为不带标签的核酸酶。0107实施例八重组核酸酶的活性分析0108重组核酸酶能够将DNA消化分解为38B的寡核苷酸链。采用分光光度法进行酶活性测定。配制以下活性测定试剂0109溶液A称取30GTRIS溶解于450ML蒸馏水中，用10MOL/LHCL调PH为80，定容至500ML，即为50MMTRISHCLPH80的溶液。取100ML50MMTRISHCLPH80，加入20MGMGCL2，10MGBSA，完全溶解后4冰箱备用。0110溶液B10MG鱼精DNA用10ML溶液A溶解，鱼精DNA的浓度为1MG/ML。并经超声处理。说明书CN104099310A1110/11页12011。

42、1溶液C08ML高氯酸加蒸馏水至20ML。0112将纯化的带标签重组核酸酶用溶液A稀释30000倍备用。按表1依次加样，每个样品平行2管，然后置于37水浴中，保温15、30、45、60分钟后分别取样05ML，加入已含有05ML高氯酸溶液的小管中，混匀后置冰浴3060分钟，然后4离心10,000RPM，5分钟，转移上清液1ML置于新的小管中，以空白管上清液调零，测定OD260NM的吸收值。0113表1酶活性测定加样表0114重组核酸酶管空白管溶液B2500ML2500ML酶溶液0125ML溶液A0125ML0115活性单位定义为37，30分钟，鱼精DNA吸光值A260增加10所需的酶量为一个活性。

43、单位相当于完全消化37G鱼精DNA的酶量。01160117测得的带标签重组核酸酶的活性为150U/L。LOWRY法测定的蛋白浓度为014MG/ML，因此酶的比活性为107X106U/MG。0118实施例九重组核酸酶的免疫印迹检测0119配制试验所需要的溶012010缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷58G与甘氨酸29G，加水溶液并稀释至1000ML。4保存。0121电转膜缓冲液取10缓冲液100ML与甲醇200ML，加水稀释至1000ML。0122TTBS缓冲液取三羟甲基氨基甲烷605G与氯化钠45G，取聚山梨酯80055ML，加适量水溶液，用盐酸调PH至75，加水稀释至500ML。4保存。0123底。

44、物缓冲液取3，3二氨基联苯胺盐酸盐15MG，加甲醇5ML与30过氧化氢15UL，加TTBS缓冲液25ML溶解，即得。临用前配制。0124重组核酸酶样品先进行125SDSPAGE电泳分离，样品与阳性对照品上样量应大于100NG。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于电转膜缓冲液中。另取与凝胶同样大小的厚滤纸2张、垫片2张、硝酸纤维素膜1张，用电转膜缓冲液浸透。用湿转膜法进行转移在电极板的黑片到白片上依次放上湿垫片1张、湿滤纸1张、电泳凝胶、硝酸纤维素膜1张、湿滤纸1张、湿垫片1张，盖上电极板，按08MA/CM2硝酸纤维素膜恒电流转移。取出硝酸纤维素膜浸入封闭液2牛血清白蛋白的TTBS缓冲液4度封闭过夜或室。

45、温封闭2H。弃去液体。加入TTBS缓冲液20ML，摇动加入适量的重组核酸酶抗体稀释度12000，4振荡结合过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8MIN。弃去液体，再加入TTBS缓冲液20ML，摇动加入适量的第二抗体二抗稀释度11万，室温1H。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8MIN。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色10MIN，显色程度适当时水洗终止反应，结果见图9。0125实施例十重组核酸酶的ELISA检测说明书CN104099310A1211/11页130126重组核酸酶一抗用包被缓冲液005M。

46、碳酸盐缓冲液，PH96稀释至终浓度分别为100G/ML，酶标板每孔加100L，放置于4包被过夜。次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液PBS，015M，005TWEEN20，PH74洗涤3次加200L/孔，每次洗涤后要在滤纸上扣干样品孔中的残留液体。然后每孔加入300L封闭液BSA05G/洗涤缓冲液100ML进行封闭，于37放置2H。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔2次。用稀释液将标准重组核酸酶稀释成1280、640、320、160、80、40、20PG/ML，每孔分别加100L，然后于37保温2H。倒掉样品孔中的反应液，用蒸馏水将洗涤液20倍稀释后每孔200L振荡洗涤13MIN，洗板5次，。

47、每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。用稀释液将酶标抗体稀释1000倍后每孔加入100L，然后于37反应15H。倒掉未结合的酶标抗体，每孔加入200L稀释后的洗涤液振荡洗涤，每次13MIN，共5次。然后加入显色液置37，20MIN。每孔加入100L终止液终止反应。将96孔板放入酶标仪中，进行读数，结果见表2。以标准品OD450NM值对核酸酶含量作图，结果见图10，进行线性回归得到公式Y00012X00137R209989，以样品OD450NM吸收值代入公式计算样品中核酸酶的含量。0127经过重组核酸酶作用的狂犬疫苗产品酶用量10,000U/L，37，1小时，PH74过SEPHAROSE4B分子筛纯。

48、化后样品中重组核酸酶残留量ELISA检测结果为小于20PG/ML。0128表2ELISA分析OD450NM读数0129说明书CN104099310A131/8页140001序列表CN104099310A142/8页1500020003序列表CN104099310A153/8页160004序列表CN104099310A164/8页170005序列表CN104099310A175/8页180006序列表CN104099310A186/8页190007序列表CN104099310A197/8页200008序列表CN104099310A208/8页21序列表CN104099310A211/2页22图1图2图3图4图5说明书附图CN104099310A222/2页23图6图7图8图9图10说明书附图CN104099310A23。