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1、10申请公布号CN104120179A43申请公布日20141029CN104120179A21申请号201410318328822申请日20140704C12Q1/6820060171申请人深圳市格瑞斯特环保技术有限公司地址518055广东省深圳市南山区桃源街道留仙大道1213号众冠红花岭工业南区2区1栋1楼72发明人叶文婷刘博刘永清谢路顺钟得喜74专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人刘先珍54发明名称一种海洋中石油烃浓度的检测方法57摘要本发明公开了一种利用可口革囊星虫对海洋中石油烃浓度的检测方法，包括可口革囊星虫的喂养、原油水溶性溶液的配置、石油烃浓度梯度培养液的配。
2、置、石油烃的暴露和采样、单细胞凝胶电泳分析和数据分析几个步骤，本检测方法适用范围广，实验流程短，安全性好，灵敏度和准确性高，能在单细胞水平上对可口革囊星虫体腔液细胞的DNA损伤情况进行可视性研究，并换算成海洋中石油烃的浓度。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104120179ACN104120179A1/1页21一种海洋中石油烃浓度的检测方法，其特征在于包括以下步骤1）将健康的可口革囊星虫分别与添加有不同已知浓度的石油烃和待测样品的培养液共培养一定时间；检测不同培训条件下可口革囊星虫的。
3、体腔液细胞DNA损伤状况，根据已知石油烃的浓度确定DNA损伤状况与石油烃浓度之间的数值关系；2）根据确定的数值关系计算待检样品中石油烃的浓度。2根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述数值关系使用绘制标准曲线的方式来确定。3根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述培养液的配置步骤为将原油和经过滤灭菌后的天然海水按比例混合，接着超声分散后静置，吸取下层水相作为母液，将母液冷冻保存，用石油烃母液加一定量的海水配制等体积的若干个梯度浓度的石油烃溶液，随后加等量的同一批海泥混匀。4根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述原油和经过滤灭菌后的天然海水的比例为11018，所述超声分散时间为1H。
4、15H，静置时间为45H，冷冻温度为34，所述梯度浓度个数为68个。5根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述培养方法为将体重23G的可口革囊星虫，在装有湿海泥的塑料桶中养一周待其状态稳定，取健康的可口革囊星虫随机分组，每组20只分别放入所配制的石油烃培养液中培养7D10D，试验期间水温稳定为2025，并在实验的第0、1、2、4、7天，获取可口革囊星虫的体腔液细胞。6根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述DNA损伤状况的检测方法为单细胞凝胶电泳分析，其包括采用三层铺胶法制片、细胞裂解、解旋及电泳、中和、染色、镜检6个步骤。7根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述口革囊星虫体腔液。
5、细胞细胞DNA的损伤状况分析采用SPSS软件统计分析。权利要求书CN104120179A1/5页3一种海洋中石油烃浓度的检测方法技术领域0001本发明涉及海洋环境有毒物质浓度研究领域，尤其涉及一种对海洋中石油烃浓度的生物检测方法。背景技术0002石油烃是由碳氢化合物组成的复杂混合体，主要由烃类组成，尤其是轻芳香烃物质及其衍生物。石油烃对海洋生物具有毒性，主要是使生物的营养与输导产生混乱，高浓度时甚至会导致生物大量死亡，对海洋生态系统可造成极大的破坏。特别是高环芳烃毒性最强，有些组分具有致癌性，能使鱼产生油臭味，油粘在鱼鳃上或鱼卵上，很快会使之窒息死亡，或使孵化受到影响，更主要的危害是，其中含有。
6、致癌烃，被鱼贝富集以后，会通过食物链危害人体健康。近年来海上石油开采和运输事故频频发生，加之海上轮船运输业的快速发展以及工业、生活污水的大量排放，海洋环境中石油烃污染日益严重，甚至已经威胁到海洋生物的生存。0003可口革囊星虫俗称海丁、海玛蝗、沙虫、泥蒜、土笋等，隶属于星虫动物门、革囊星虫纲、革囊星虫目、革囊星虫科、革囊星虫属，为我国的特有种，广泛分布于浙江、福建、广东、广西和海南等省区。可口革囊星虫是海洋渔业资源中具有重要经济意义的种类，近年来由于沿海环境污染加剧以及人们过度采捕，造成资源严重衰退，因此，可口革囊星虫的资源保护已经开始受到人们的重视。0004目前，研究海洋中石油烃浓度的方法有。
7、很多，主要有紫外分光光度法、重量法、红外光度法、荧光分光光度法和气象色谱法等。紫外分光光度法由于灵敏度低，对饱和烃、环烃无效，比较适于高浓度样品中石油烃浓度的测定。重量法研究流程长，灵敏度低，只适合测定含油量在10MG/L以上的水样，而且在提取和溶剂蒸发过程中容易挥发掉，方法的精密度随操作条件和操作员的熟练程度不同而差别很大。红外光度法包括非色散红外吸收光度法和红外光谱法两个部分，其中前者的优点是仪器结构简单，测量具有较好的重现性，缺点是只能研究石油烃中的直链烷烃和环烷烃，不能研究苯系物，后者能准确地测量出石油烃的总浓度，但是在测定鱼贝中石油烃的浓度时，若鱼贝中动物油脂有残留，则极容易受到干扰。
8、。荧光分光光度法研究石油烃浓度的灵敏度非常高，但是它仅能测定石油烃中苯系物的浓度，无法测定石油烃中直链烷烃和直链烷烃的浓度，而且不同物质的荧光发射强度差异很大，测定结果受样品中油品组成影响很大。气相色谱法是将石油烃色谱柱分离后，分别研究不同的石油烃组分，灵敏度高，但是由于石油烃组成十分复杂，不适合石油烃总浓度的测定。发明内容0005为了解决上述技术问题，本发明提供一种对海洋中石油烃浓度的检测方法，这种检测方法适用范围广，实验流程短，安全性好，灵敏度和准确性高。0006本发明所采用的技术方案是说明书CN104120179A2/5页4一种海洋中石油烃浓度的检测方法，其特征在于包括以下步骤1）将健康。
9、的可口革囊星虫分别与添加有不同已知浓度的石油烃和待测样品的培养液共培养一定时间；检测不同培训条件下可口革囊星虫的体腔液细胞DNA损伤状况，根据已知石油烃的浓度确定DNA损伤状况与石油烃浓度之间的数值关系；2）根据确定的数值关系计算待检样品中石油烃的浓度。0007优选地，所述数值关系使用绘制标准曲线的方式来确定。优选地，所述培养液的配置步骤为将原油和经过滤灭菌后的天然海水按比例混合，接着超声分散后静置，吸取下层水相作为母液，将母液冷冻保存，用石油烃母液加一定量的海水配制等体积的若干个梯度浓度的石油烃溶液，随后加等量的同一批海泥混匀。0008优选地，所述原油和经过滤灭菌后的天然海水的比例为1101。
10、8，所述超声分散时间为1H15H，静置时间为45H，冷冻温度为34，所述梯度浓度个数为68个。0009优选地，所述培养方法为将体重23G的可口革囊星虫，在装有湿海泥的塑料桶中养一周待其状态稳定，取健康的可口革囊星虫随机分组，每组20只分别放入所配制的石油烃培养液中培养7D10D，试验期间水温稳定为2025，并在实验的第0、1、2、4、7天，获取可口革囊星虫的体腔液细胞。0010优选地，所述DNA损伤状况的检测方法为单细胞凝胶电泳分析，其包括采用三层铺胶法制片、细胞裂解、解旋及电泳、中和、染色、镜检6个步骤。0011优选地，所述口革囊星虫体腔液细胞细胞DNA的损伤状况分析采用SPSS软件统计分析。
11、。0012本发明的有益效果是本发明通过使用单细胞凝胶电泳研究技术，实现了在单细胞水平上对可口革囊星虫的DNA损伤情况进行可视性研究，进而得出海洋中石油烃的浓度，相对现有技术（如梯度沉降技术、解旋技术和洗脱技术）来说，具有试验流程性短、安全性好、准确性和灵敏度高等优点。附图说明0013下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明图1是本发明的检测方法的流程图。0014图2是本发明的未受石油烃污染的可口革囊星虫体腔液细胞彗星实验图；图3是本发明的暴露于090MG/L的石油烃培养液中4D后可口革囊星虫体腔液细胞的彗星实验图。具体实施方式0015需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施。
12、例中的特征可以相互组合。0016如图1所示，本实施例的一种利用可口革囊星虫对海洋中石油烃浓度的检测方法，包括可口革囊星虫的喂养、原油水溶性溶液的配制、石油烃浓度梯度培养液的配制、石油烃的暴露、单细胞凝胶电泳分析和数据分析等六大步骤。其中单细胞凝胶电泳研究还包含制片、细胞裂解、解旋、电泳、中和、染色、镜检等多个步骤。说明书CN104120179A3/5页50017A、可口革囊星虫的喂养优选体重23G的可口革囊星虫，养在装有湿海泥的塑料桶中，养一周待其状态稳定，并挑选活力强的健康个体实验备用。一般活动正常、对刺激反应灵敏的可口革囊星虫为活力强的个体。0018B、原油水溶性溶液的配制将原油按V（原油。
13、）V（经过滤后的天然海水）110混合，超声分散1H，静置4H后吸取下层水相作为母液，母液置于棕色玻璃瓶中于4保存备用。0019天然海水过滤时用045M的滤膜，以去除海水中的沉积物等有害物质。母液中石油烃的浓度参照海洋监测规范（GB1737842007）的方法（紫外可见分光光度法）进行测定。0020C、石油烃浓度梯度培养液的配制取6个1000ML的烧杯，分别配制6份浓度不同的石油烃溶液，将一定量的石油烃母液与一定体积的的海水混合，使得烧杯中的混合液的总体积为500ML，石油烃的最终浓度分别为0、005、030、050、070和090MG/L。随后将等量的同一批含水率40海泥分别加入以上混合液中，。
14、混匀。0021本步骤中石油烃浓度梯度的设置依据是国家海水水质标准，一、二类水中石油烃浓度005MGL1，三类水中石油烃浓度030MGL1，四类水中石油烃浓度050MGL1。0022D、石油烃的暴露取健康的可口革囊星虫120只，随机分为6组，每组20只分别放入步骤C所配制的含不同浓度石油烃的海水培养液中培养7D，试验期间水温稳定为25。并在实验的第0、1、2、4、7天采样。每次采样随机选取3个可口革囊星虫，用1ML一次性注射器采取可口革囊星虫的体腔液细胞。一次性注射器中预先抽取等量抗凝剂，将样品置于预冷的15ML离心管中，经台盼蓝染色，在显微镜下观察细胞存活率细胞存活率90，用不含钙镁的PBS缓。
15、冲液调节细胞密度为1106ML1，即可用于单细胞凝胶电泳研究实验。0023E、单细胞凝胶电泳研究采用三层铺胶法制片以质量分数为08的正常熔点琼脂糖NMA溶液铺于载玻片上为第1层胶。取可口革囊星虫体腔液细胞悬浮液与质量分数为06的低熔点琼脂糖凝胶按照比例1713混匀每个胶片上的细胞个数约10003000个，滴于第1层胶上面，迅速用盖玻片压平，置于4凝固，此为第2层胶。待第2层胶凝固后，取75L质量分数为06的低熔点琼脂糖溶液铺在第2层胶上面，立即盖上盖玻片，置在冰袋上转移到4冰箱中，使之凝固。0024细胞裂解待凝胶干后，揭去盖玻片，载玻片水平浸入盛有细胞裂解液的方形盒中。细胞裂解液的组成为25M。
16、OLL1NACL，01MOLL1NA2EDTA，001MOLL1三羟甲基氨基甲烷TRIS，质量分数为1的十二烷基肌氨酸钠，PH10，临用前加体积分数为1的聚乙二醇辛基苯基醚TRITONX100和10二甲基亚砜DMSO。于4避光裂解2H，裂解结束后，载玻片用预冷的PBS缓冲液漂洗3次。0025在细胞裂解作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在说明书CN104120179A4/5页6剩余的核骨架上，并留在原位。0026解旋及电泳载玻片并列置于水平电泳槽中，加入预冷的新配制的电泳缓冲液1MMOL。
17、L1NA2EDTA，03MOLL1NAOH，PH13，4避光解旋30MIN后，接通电源，于25V、30MA下电泳30MIN。0027中和、染色、镜检电泳结束后，取出载玻片，放入TRISHC1缓冲液PH75中和15MIN。每块胶滴加50L的30GML1溴化乙锭EB水溶液，盖上盖玻片，染色20MIN。在510560NM波长的荧光显微镜下绿光范围观察结果并拍照，放大倍数为1020倍。0028图2和图3中所示分别为未受石油烃污染的可口革囊星虫体腔液细胞的彗星实验图和暴露于090MG/L的石油烃培养液中4D后可口革囊星虫体腔液细胞的彗星实验图。图2中的可口革囊星虫体腔液细胞呈现圆形的、规则的荧光头部，无。
18、拖尾现象，说明细胞未发生断裂；图3中细胞出现类似于彗星的拖尾，这表明细胞DNA已收到损伤。0029F、SPSS软件数据分析。用CASP软件分析彗星图像，得到头长、尾长、头部DNA含量和百分比、尾部DNA含量和百分比、头部面积、尾部面积、尾矩、OLIVE尾矩等13项DNA损伤指标，其中，尾矩为尾长与DNA百分比的乘积，是一个综合指标。本实施例中探讨了尾长和尾矩2个指标的变化。每只可口革囊星虫体腔液细胞做1块胶，每块胶随机分析30个细胞，统计出不同浓度石油烃污染下细胞彗星的尾长和尾距。表1和表2中列出了不同时间、不同浓度石油烃处理后的彗星平均尾长和尾距变化。可以看出对照组中细胞的平均彗星尾长和尾距。
19、变化范围不大，经过不同浓度的石油烃培养液处理过的可口革囊星虫的体腔液细胞随着处理时间的延长，彗星拖尾平均长度和尾距逐渐增大，即细胞的DNA损伤趋于严重；另外，对于经过同样处理时间的细胞，随着石油烃浓度的增大，彗星拖尾越长。综合以上可知，海洋中石油烃对可口革囊星虫的DNA损伤毒性作用，随着石油烃浓度的增大和作用时间的延长，毒害越严重。由此，可以通过分析可口革囊星虫的体腔液细胞DNA的损伤情况来间接得出海洋中石油烃的浓度。0030表1石油烃对可口革囊星虫体腔液细胞彗星尾长的影响表2石油烃对可口革囊星虫体腔液细胞彗星尾距的影响说明书CN104120179A5/5页7以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。说明书CN104120179A1/2页8图1图2说明书附图CN104120179A2/2页9图3说明书附图CN104120179A。