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1、(10)申请公布号 CN 103528872 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103528872 A (21)申请号 201310478787.8 (22)申请日 2013.10.14 G01N 1/30(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 米国华 高坤 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技 术及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种植物根组织活体组织切。
2、片 的荧光染色技术及其应用。本发明公开的一种对 植物根组织进行染色的方法， 包括如下步骤 ： 将 植物根组织置于 PI 水溶液中， 进行染色， 即得被 染上色的植物根组织。本发明提供的一种植物根 组织活体组织切片的荧光染色技术， 克服了常规 切片过程中高温或低温固定包埋对根尖幼嫩组织 产生的损伤， 并且操作流程简单， 极大的节省了切 片制作的时间， 利用本发明的方法可以实现快速 便捷的制作植物根组织活体组织切片的目的。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (1。
3、0)申请公布号 CN 103528872 A CN 103528872 A 1/1 页 2 1. 一种对植物根组织进行染色的方法， 包括如下步骤 ： 将植物根组织置于 PI 水溶液 中， 进行染色， 即得被染上色的植物根组织。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 PI 水溶液中 PI 的浓度为 1-50mM。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述染色的时间为 1-60min。 4. 根据权利要求 1-3 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述根组织包括根尖组织和 / 或 根的成熟区。 5.根据权利要求1-4任一所述的方法， 其特征在于 ： 。
4、所述根组织的直径为10-1050m， 所述直径为所述根组织的根基部方向一端的直径 ； 所述根组织的直径为 10-300m 时， 染色条件如下 ： PI 浓度为 1-5mM， 染色时间 1-10min ； 所述根组织的直径为 300-600m 时， 染色条件如下 ： PI 浓度为 5-15mM， 染色时间 10-20min ； 所述根组织的直径为 600-1050m 时， 染色条件如下 ： PI 浓度为 15-50mM， 染色 时间 20-60min。 6. 根据权利要求 1-5 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物为玉米。 7. 根据权利要求 1-6 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所。
5、述方法中， 在将植物根组织置于 PI 水溶液中之前， 包括如下步骤 ： （1） 取植物的根组织， 将根组织的分泌物吸取干净， 然后吸干根组织的表面水分 ； （2） 在环境温度下， 将根组织放到 0.1M 的磷酸钠缓冲液或高纯水中清洗， 清洗后吸干 根组织的表面水分 ； 所述环境温度为 10-30 ； 所述 0.1M 的磷酸钠缓冲液的 pH 为 5.8-7.0 ； 和 / 或， 所述方法中， 在将植物根组织置于 PI 水溶液中进行染色之后， 包括如下步骤 ： （1） 把根组织放到高纯水中， 摇床漂洗 ； 所述漂洗的时间为 15-30min。 8. 一种对植物根组织进行染色制片观察的方法， 包括如。
6、下步骤 ： 按照权利要求 1-7 任 一所述的方法， 得到染色后的根组织 ； 再将根组织放到载玻片上， 滴上高纯水， 盖上盖玻片， 制成切片 ； 然后在荧光共聚焦显微镜下对切片进行镜检， 在 535nm 或氙灯或汞灯或氩离子 激光器下 488 通道激发， 617nm 检测荧光， 连续拍摄图片， 将图片拼接， 即得到根组织完整的 染色图片 ； 所述根组织包括根尖组织和 / 或根的成熟区。 9. 权利要求 1-8 任一所述的方法在观察植物根组织中的应用 ； 所述根组织包括根尖组织和 / 或根的成熟区。 10. 根据权利要求 9 所述的应用， 其特征在于 ： 所述植物为玉米。 权 利 要 求 书 C。
7、N 103528872 A 2 1/5 页 3 一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用。 背景技术 0002 切片技术是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。 该种技术不仅用于观察 正常细胞组织的形态结构， 也是病理学和植物学等学科用以研究、 观察及判断细胞组织的 形态变化的主要方法， 而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。组织切片伴 随着显微镜技术和免疫实验等的发展而得到广泛的应用。 但是在切片 （如石蜡切片、 冰冻切 片） 制作过程中， 材料经常会要经过高温或低温固定包埋， 导致材料组织变。
8、形或破碎。同时 现有的切片技术， 固定包埋的步骤繁琐， 时间周期过长。 为了快速简单的得到形态完整的组 织切片， 活体切片是最简单有效的切片方法。 0003 研究表明， 由于根尖是透明的， 并且涵盖了根系生长成熟的不同位点， 是研究植物 发育的很好材料。同时根系除了支持植物的地上部分， 还是植物吸收水分和养分的主要器 官， 根系发育直接关系到作物的产量。 由于根系的重要性， 根尖的结构引起越来越多的研究 人员的重视。根尖是植物根系中最 “柔软脆弱” 的组织， 高温或低温情况下， 根尖细胞极易 变形或破碎。现有的应用于根尖的切片技术还存在很多不完善的地方， 主要表现在以下三 方面 ： 一是组织切。
9、片流程繁琐， 耗费的时间和经费大 ； 二是制作过程中， 通常对材料高温或 低温处理， 对于 “鲜嫩” 的新生组织， 尤其是根尖组织细胞极易变形或破碎 ； 三是根尖样品长 度相对长 （超过 5mm） ， 切片很难保持样品的连续性和完整性。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术及其应用。 0005 本发明提供的一种对植物根组织进行染色的方法， 包括如下步骤 ： 将植物根组织 置于 PI 水溶液中， 进行染色， 即得被染上色的植物根组织。 0006 上述方法中， 所述 PI 水溶液中 PI 的浓度为 1-50mM。 0007 上述任一所述的方法中， 所述染色。
10、的时间为 1-60min。 0008 上述任一所述的方法中， 所述根组织包括根尖组织和 / 或根的成熟区。 0009 上述任一所述的方法中， 所述根组织的直径为 10-1050m， 所述直径为所述根组 织根基部方向一端的直径。 0010 上述任一所述的方法中， 所述根组织的长度为 2cm。 0011 上述任一所述的方法中， 所述根组织的直径为 10-300m 时， 染色条件如下 ： PI 浓 度为 1-5mM， 染色时间 1-10min ； 所述根组织的直径为 300-600m 时， 染色条件如下 ： PI 浓 度为 5-15mM， 染色时间 10-20min ； 所述根组织的直径为 600-。
11、1050m 时， 染色条件如下 ： PI 浓度为 15-50mM， 染色时间 20-60min， 在上述各根段直径范围内， 随着根段直径的增大染色 时间和 PI 浓度都随之增大。 0012 上述任一所述的方法中， 所述植物为玉米。 说 明 书 CN 103528872 A 3 2/5 页 4 0013 所述方法中， 在将植物根组织置于 PI 水溶液中之前， 包括如下步骤 ： 0014 （1） 取植物的根组织， 将根组织的分泌物吸取干净， 然后吸干根组织的表面水分 ； 0015 （2） 在环境温度下， 将根组织放到 0.1M 的磷酸钠缓冲液或高纯水中清洗， 清洗后 吸干根组织的表面水分 ； 00。
12、16 所述环境温度为 10-30 ； 0017 所述 0.1M 的磷酸钠缓冲液的 pH 为 5.8-7.0 ； 0018 和 / 或， 0019 上述方法中， 在将植物根组织置于 PI 水溶液中进行染色之后， 包括如下步骤 ： 0020 （1） 把根组织放到高纯水中， 摇床漂洗 ； 0021 所述漂洗的时间为 15-30min ； 0022 上述步骤也属于本发明的保护范围。 0023 上述任一所述的方法中， 将根组织放到 0.1M 的磷酸钠缓冲液中清洗的条件是所 述根组织取材于非中性环境。 0024 上述任一所述的方法中， 将根组织放到高纯水中清洗的条件是所述根组织取材于 中性环境。 0025。
13、 一种对植物根组织进行染色制片观察的方法也属于本发明的保护范围， 包括如下 步骤 ： 按照上述任一所述的方法， 得到染色后的根组织 ； 再将根组织放到载玻片上， 滴上高 纯水， 盖上盖玻片， 制成切片 ； 然后在荧光共聚焦显微镜下对切片进行镜检， 在 535nm 或氙 灯或汞灯或氩离子激光器下 488 通道激发， 617nm 检测荧光， 连续拍摄图片， 将图片拼接， 即 得到根组织完整的染色图片 ； 0026 上述方法中， 所述根组织包括根尖组织和 / 或根的成熟区。 0027 上述任一所述的方法中， 所述根组织的直径为 10-1050m， 所述直径为所述根组 织根基部方向一端的直径。 002。
14、8 上述任一所述的方法中， 所述根组织的长度为 2cm。 0029 上述步骤均保持在黑暗环境下完成。 0030 上述任一所述的方法在观察植物根组织中的应用也属于本发明的保护范围。 0031 上述应用中， 所述根组织包括根尖组织和 / 或根的成熟区。 0032 上述任一所述的应用中， 所述根组织的直径为 10-1050m， 所述直径为所述根组 织根基部方向一端的直径。 0033 上述任一所述的应用中， 所述根组织的长度为 2cm。 0034 上述任一所述的应用中， 所述植物为玉米。 0035 本发明提供的一种植物根组织活体组织切片的荧光染色技术， 克服了常规切片过 程中高温或低温固定包埋对根尖幼。
15、嫩组织产生的损伤， 并且操作流程简单， 极大的节省了 切片制作的时间， 利用本发明的方法可以实现快速便捷的制作植物根组织活体组织切片的 目的。 附图说明 0036 图 1 为不同直径的玉米幼苗根尖组织的活体组织切片。 0037 图 2 为玉米幼苗根尖组织的活体组织切片。 说 明 书 CN 103528872 A 4 3/5 页 5 0038 图 3 为玉米幼苗根的成熟区活体组织切片。 具体实施方式 0039 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0040 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0041 PI（碘化丙啶， Propidiu。
16、m Iodide） 购自 Sigma 公司， 货号为 P4170。 0042 PI 染色剂母液的配制 ： 0043 避光条件下， 取 PI 加入高纯水， 混匀， 使混合液中 PI 的浓度为 10mg/ml， 配制成 10mg/ml 的 PI 母液 , 用离心管分装后， 避光保存于 -20 , 注意避免反复冻融使用。 0044 磷酸钠缓冲液的配制 ： 0045 1M 磷酸氢二钠母液配制 ： Na2HPO4分子量 358， 购自国药， 称取 358g 溶解在高纯水 中， 定容至 1L， 即配制成 1M 的磷酸氢二钠溶液。 0046 1M 磷酸二氢钠母液配制 ： NaH2PO4分子量 156， 购自。
17、国药， 称取 156g 溶解在高纯水 中， 定容至 1L， 即配制成 1M 的磷酸二氢钠溶液。 0047 pH=5.8 的 0.1M 磷酸钠缓冲液配制 ： 将 1M 磷酸氢二钠母液和 1M 磷酸二氢钠母液 以体积比 7.9ml ： 92.1ml 混合。 0048 pH=6.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液配制 ： 将 1M 磷酸氢二钠母液和 1M 磷酸二氢钠母液 以体积比 12.0ml ： 88.0ml 混合。 0049 pH=7.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液配制 ： 将 1M 磷酸氢二钠母液和 1M 磷酸二氢钠母液 以体积比 57.7ml ： 42.3ml 混合。 0050 （注 ： 配制方。
18、法源自 分子克隆 ， pH 值计算根据 Henderson-Hasselbalch 方程式 ： pH=pK +Log 质子受体 / 质子供体 ， pK =6.86(25 )。 ） 0051 实施例 1、 植物根组织活体组织切片的制作及镜检 0052 一、 切片的制作 0053 （一） 取一定体积的 PI 母液加入到 2ml 高纯水中， 配制成一定浓度的 PI 染色剂， 均 匀混合。 0054 （二） 用手术刀片切取植物自根末梢开始到根基部方向 2cm 的根段， 用 1ml 的移液 枪将根段的分泌物吸取干净， 然后将用吸水纸吸干。 0055 （三） 在环境温度 10-30下， 将根段放到 0.1。
19、M 的磷酸钠缓冲液中或高纯水中清洗 3 遍， 每次清洗后都用吸水纸吸干。 0056 （四） 然后将根段放入一定浓度的 PI 染色剂中， 在 100r/min 的转速的摇床上染色。 0057 （五） 把根段放到高纯水中， 在 100r/min 转速的摇床上漂洗 15-30min。 0058 （六） 将根段放到载玻片上， 滴 2-3 滴高纯水， 盖上盖玻片。 0059 二、 切片镜检 0060 玉米根尖组织容易破碎， 自发荧光为蓝色， PI 染料能结合活体细胞壁胶质发射出 红色荧光。 0061 在荧光共聚焦显微镜下对切片进行镜检， 最大激发光为 535nm， 最大发射光为 617nm， 可以观测到。
20、 PI 发射出的红色光 （PI 也可以在氙灯或汞灯下激发， 也可以在氩离子激 光器下 488 通道激发） 。 说 明 书 CN 103528872 A 5 4/5 页 6 0062 镜检过程 ： 首先在眀场 10 倍镜下迅速找到清晰的视野， 然后换到荧光界面， 在 1024 的像素下拍摄图片， 每张图片大约能拍摄 750m 的根段， 在每个图片上设定标记， 然 后拍摄下一张图片， 如此连续拍摄。 0063 注意 ： 在染色和镜检过程要保持在黑暗环境下完成， 在转移根段的过程中要保持 根段表面不被移液器， 吸水纸， 镊子和其它物品碰伤， 因为轻微碰伤后根段在镜检过程中会 出现黑色。 0064 实。
21、施例 2、 不同直径玉米幼苗根段活体切片的制作及镜检 0065 一、 用手术刀片切取不同直径的玉米幼苗根段 （自根末稍开始到根基部方向长度 为 2cm， 直径指根段的根基部方向一端的直径） ， 用 1ml 的移液器将根段的分泌物吸取干净， 然后用吸水纸吸干。 0066 二、 在环境温度 10-30下， 将植物材料放到高纯水中清洗 3 遍， 每次清洗后都用 吸收纸吸干。 0067 三、 然后将各直径的根段分别放入不同浓度的PI染色剂中， 在100r/min的转速的 摇床上染色， 染色时间为 1-60min。 0068 四、 把染色后的各根段放到高纯水中， 在 100r/min 的转速的摇床上漂洗。
22、 15-30min。 0069 五、 将各根段放到载玻片上， 滴 2-3 滴高纯水， 盖上盖玻片。 0070 六、 按照实施例 1 的切片镜检方法观测根段 0071 根据镜检和观察到的切片结果。 0072 各组根段的染色条件如表 1 所示。染色浓度和染色时间根据根段的直径变化而增 加。 0073 表 1 不同直径的根段染色条件 0074 0075 根段的切片染色如图 1 所示， 结果表明， 采用该方法染色可以得到清晰的荧光显 微镜图片。 0076 图 1A ： 根段直径 10-300m， 染色时间 5min,PI 浓度 3mM。 0077 图 1B ： 根段直径 300-600m， 染色时间 。
23、15min,PI 浓度 10mM。 0078 图 1C ： 根段直径 600-1050m， 染色时间 30min,PI 浓度 20mM。 0079 表 1 中各直径根段的染色结果与图 1 中对应直径根段的染色结果无显著差异。 0080 实施例 3、 pH 及环境温度对玉米幼苗根段活体切片的影响 0081 一、 用手术刀片切取在非中性环境下生长的 600-1050m 的玉米幼苗根段 （自根 说 明 书 CN 103528872 A 6 5/5 页 7 末梢开始到根基部方向长度为 2cm， 直径指根段的根基部方向一端的直径） 和 600-1050m 的玉米幼苗根组织成熟区的根段 （根段长 2cm，。
24、 直径指根段的根基部方向一端的直径） ， 用 1ml 的移液器将根段的分泌物吸取干净， 然后用吸水纸吸干。 0082 二、 在一定环境温度下， 将根段放到一定 pH 值的 0.1M 磷酸钠缓冲液中清洗 3 遍， 每次清洗后都用吸水纸吸干。 0083 三、 将根段放入 20mM 的 PI 染色剂中， 在 100 转 /min 的转速的摇床上染色 30min。 0084 四、 将根段放到高纯水中， 在 100 转 /min 的转速的摇床上漂洗 15-30min。 0085 五、 将根段放到载玻片上， 滴 2-3 滴高纯水， 盖上盖玻片。 0086 六、 按照实施例 1 的切片镜检方法观测根段 00。
25、87 自根末梢开始到根基部方向长度为 2cm 玉米幼苗根段的切片染色如图 2 所示。 0088 图 2A ： pH=5.8 的 0.1M 磷酸钠缓冲液 , 环境温度 30。 0089 图 2B ： pH=6.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液 , 环境温度 25。 0090 图 2C ： pH=7.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液， 环境温度 10。 0091 玉米幼苗根组织成熟区的根段切片染色如图 3 所示。 0092 图 3A ： pH=5.8 的 0.1M 磷酸钠缓冲液 , 环境温度 30。 0093 图 3B ： pH=6.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液 , 环境温度 25。 0094 图 3C ： pH=7.0 的 0.1M 磷酸钠缓冲液， 环境温度 10。 0095 结果表明， 采用该方法可以得到清晰的荧光显微镜图片。 说 明 书 CN 103528872 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103528872 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103528872 A 9 。