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1、(10)申请公布号 CN 103411889 A (43)申请公布日 2013.11.27 CN 103411889 A *CN103411889A* (21)申请号 201310366140.6 (22)申请日 2013.08.21 G01N 21/19(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品学院 (72)发明人 胥传来 郝昌龙 徐丽广 马伟 匡华 刘丽强 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内 切酶 DNase。
2、 I 活性的方法 (57) 摘要 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内 切酶 DNaseI 活性的方法， 属于分子生物学中的酶 学技术领域。 本发明工艺步骤为 ：（一） 检测探针的 制备 ： 包括 ：（1） 15nm粒径金纳米粒子AuNP1合成， （2） 25nm 粒径金纳米粒子 AuNP2合成，（3） AuNP1和 DNA1 偶联，（4） AuNP2分别和 DNA2、 DNA3、 DNA4 偶 联，（5） AuNP1与 AuNP2组装形成具有手性的金四 面体结构 ；（二） 圆二光谱 CD 检测， 建立 CD 信号强 度与DNaseI活性之间的标准曲线。 本发明提供了 一种基于圆二光谱来检测。
3、 DNaseI 活性的方法， 与 传统的检测手段相比， 具有灵敏度高、 检测限低、 方便、 快捷的优点， 有着非常好的实际应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103411889 A CN 103411889 A *CN103411889A* 1/1 页 2 1. 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶 DNase I 活性的方法， 其特征在于 工艺步骤为 ： （一） 检测探针的制备 （1） 。
4、15nm 粒径金纳米粒子 AuNP1合成 采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成 15nm 粒径金纳米粒子 AuNP1； （2） 25nm 粒径金纳米粒子 AuNP2合成 采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成 25nm 粒径金纳米粒子 AuNP2； （3） AuNP1和 DNA1 偶联 步骤 （1） 合成出的AuNP1和巯基修饰的DNA1进行偶联形成AuNP1-DNA1复合体 ： 取50mL 2nM 的步骤 （1） 制备的 AuNP1加入 20mg 二水合双 （对 - 璜酰苯基） 苯基膦化二钾盐， 震荡混 匀， 孵育 12h 后离心去除上清液， 将沉淀以 10 mL 0.5TBE 重悬 ； 向其中加入 DNA1。
5、， 控制 DNA1 与 AuNP1的摩尔比为 5:1， 2h 后， 加入 2M 氯化钠使得氯化钠终浓度为 50mM， 12h 后， 离 心， 去除游离的 DNA1 分子， 得到 AuNP1-DNA1 复合体 ； DNA1 ： HS-5 -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3 ； （4） AuNP2分别和 DNA2、 DNA3、 DNA4 偶联 步 骤 （2）合 成 出 的 AuNP2和 巯 基 修 。
6、饰 的 DNA2、 DNA3、 DNA4 分 别 进 行 偶 联 形 成 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体， 偶联步骤与步骤 （3） 相同 ； DNA2 ： HS-5 -TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3 ； DNA3 ： HS-5 -TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC 。
7、CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3 ； DNA4 ： HS-5 -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3 ； （5） AuNP1与 AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构 分别取步骤 （4） 制备出的 1mL 2nM 的 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体和步 骤 （3） 制备出。
8、的 1mL 2nM 的 AuNP1-DNA1 复合体混匀进行杂交， 杂交缓冲液 ： 1TBE， 杂交时 间 24h， 形成具有手性的金四面体结构 ； 对该金四面体结构进行透射电镜表征与圆二光谱 表征 ； （二） 圆二光谱 CD 检测， 建立 CD 信号强度与 DNase I 活性之间的标准曲线 向步骤 （5） 制备的手性金四面体溶液 1mL, 2nM 中加入一系列不同活性浓度的 DNase I ： 分别为0U/mL、 0.005U/mL、 0.01U/mL、 0.05U/mL、 0.1 U/mL、 0.2 U/mL、 0.5 U/mL、 1U/mL、 10 U/mL ； 37下反应 10 mi。
9、n 后， 测定 CD 信号， 以 DNase I 活性为横坐标， CD 信号强度为纵坐 标， 建立标准曲线。 权 利 要 求 书 CN 103411889 A 2 1/4 页 3 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶 DNase I 活性的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶 DNase I 活性的方 法， 属于分子生物学中的酶学技术领域。 背景技术 0002 核酸内切酶是一类特殊的酶， 其能够水解破坏核酸 （包括 DNA 与 RNA） 骨架之间的 磷酸二酯键。这一类酶在分子生物学领域起着至关重要的作用， 包括 DNA 修复、 复制、 基因 分型。
10、以及分子克隆， 同时其被广泛应用在基因工程领域来制备重组 DNA 分子。随着纳米科 学与技术的发展， 核酸内切酶开始被应用于组装得到一些新型的基于 DNA 的纳米组装结 构， 也被用于对 DNA 纳米组装体的解组装， 进而研究纳米材料的一些动态的光学、 电学与磁 学性质。DNase I 是一种核酸内切酶， 其在许多生化过程中起着重要作用， 例如， 在细胞程 序化的死亡过程中， DNase I 能够将 DNA 分子水解为核小体的基本组成单元。此外， 大量的 研究表明当DNase I活性降低时， 会诱导人和动物发生系统性红斑狼疮， 也有可能会诱导产 生胃癌或结肠癌 ； 而当 DNase I 活性过。
11、高时， 有可能会导致乳腺癌的发生。因此， 非常有必 要开发一种简便、 灵敏的用于检测 DNase I 活性的方法。 0003 传统的检测 DNase I 活性的方法包括高效液相色谱 （HPLC） 与酶联免疫吸附试验 （ELISA） 等。然而， 这些方法具有灵敏度不高， 检测时间长， 需要昂贵的仪器设备等缺点。为 了解决这些问题， 新型的检测手段包括荧光试验， 电化学法与比色法被开发出来。 在这些方 法中， 比色法虽然简单、 成本低， 但是其检测限较低 ； 荧光检测法虽然方便快捷， 但是需要昂 贵的荧光素修饰的 DNA 探针 ； 电化学方法虽然检测限很低， 但是需要对电极进行修饰。所 以， 本发。
12、明提出了一种新型的、 简便的、 灵敏的检测方法， 其基于纳米材料的自组装技术构 建了具有强手性的金四面体纳米结构， 并以此作为检测基底。 0004 通过 DNA 杂交形成的手性金四面体， 其 CD 信号强度与手性组装体的含量密切相 关， 通过外加 DNase I， 水解起连接作用的 DNA 分子， 破坏手性金四面体的空间构型， 必然会 导致 CD 信号的降低。DNase I 活性越高， 金四面体被解离的越多， CD 信号降低的越厉害。 通过建立 CD 信号强度与 DNase I 活性之间的标准曲线， 可以检测溶液中 DNase I 的活性。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种基于金四面。
13、体手性纳米结构检测 DNase I 活性的方法。 0006 本发明的技术方案 ： 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶 DNase I 活 性的方法， 工艺步骤为 ： （一） 检测探针的制备 （1） 15nm 粒径金纳米粒子 （AuNP1） 合成 采用常规方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成 15nm 粒径金纳米粒子 AuNP1： 将反应用的三 角瓶用王水浸泡 12h， 然后用超纯水冲洗 3 次后， 烘干、 备用。向其中加入 100 mL 0.25 mM 说 明 书 CN 103411889 A 3 2/4 页 4 的氯金酸水溶液， 搅拌加热至沸腾， 5min后加入2.5 mL新鲜配制的质量分数。
14、为1%的柠檬酸 三钠水溶液， 继续搅拌加热， 30min 后， 结束反应， 移去热源， 待溶液冷至室温后， 将 AuNP1溶 液放入 4冰箱。 0007 （2） 25nm 粒径金纳米粒子 （AuNP2） 合成 采用常规方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成 25nm 粒径金纳米粒子 AuNP2： 方法与制备 AuNP1相同， 只是将柠檬酸三钠的用量变为 1.5mL， 其余条件均不变， 即可制备得到 AuNP2溶 液。 0008 （3） AuNP1和 DNA1 偶联 步骤 （1） 合成出的AuNP1和巯基修饰的DNA1进行偶联形成AuNP1-DNA1复合体 ： 取50mL 2nM 的步骤 （1） 制备的 。
15、AuNP1加入 20mg 二水合双 （对 - 璜酰苯基） 苯基膦化二钾盐， 震荡混 匀， 孵育 12h 后离心去除上清液， 将沉淀以 10 mL 0.5TBE 重悬 ； 向其中加入 DNA1， 控制 DNA1 与 AuNP1的摩尔比为 5:1， 2h 后， 加入 2M 氯化钠使得氯化钠终浓度为 50mM。12h 后， 离 心， 去除游离的 DNA1 分子， 得到 AuNP1-DNA1 复合体。 0009 DNA1 ： HS-5 -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG。
16、 GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3 。 0010 （4） AuNP2分别和 DNA2、 DNA3、 DNA4 偶联 步 骤 （2）合 成 出 的 AuNP2和 巯 基 修 饰 的 DNA2、 DNA3、 DNA4 分 别 进 行 偶 联 形 成 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体， 偶联步骤与步骤 （3） 相同。 0011 DNA2 ： HS-5 -TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GC。
17、T GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3 ； DNA3 ： HS-5 -TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3 ； DNA4 ： HS-5 -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3 。 。
18、0012 （5） AuNP1与 AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构 分别取步骤 （4） 制备出的 1mL 2nM 的 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体和步 骤 （3） 制备出的 1mL 2nM 的 AuNP1-DNA1 复合体混匀进行杂交 （杂交缓冲液 ： 1TBE， 杂交时 间 24h） ， 形成具有手性的金四面体结构 ； 对该金四面体结构进行透射电镜表征与圆二光谱 表征 ； （二） 圆二光谱 CD 检测， 建立 CD 信号强度与 DNase I 活性之间的标准曲线 向步骤 （5） 制备的手性金四面体溶液 （1mL, 2nM） 中加入一系列不。
19、同活性浓度的 DNase I ： 分别为0U/mL、 0.005U/mL、 0.01U/mL、 0.05U/mL、 0.1 U/mL、 0.2 U/mL、 0.5 U/mL、 1U/mL、 10 U/mL ； 37下反应 10 min 后， 测定 CD 信号， 以 DNase I 活性为横坐标， CD 信号强度为纵坐 标， 建立标准曲线。 0013 注 ： 本发明所使用的 DNA 均购自中国上海生工生物工程有限公司， 并通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行纯化。 0014 本发明的有益效果 ： 本发明提供了一种基于圆二光谱来检测 DNase I 活性的方 法， 与传统的检测手段相比， 具有灵敏度高、 。
20、检测限低、 方便、 快捷的优点， 有着非常好的实 际应用前景。 说 明 书 CN 103411889 A 4 3/4 页 5 附图说明 0015 图 1 本发明通过核酸杂交形成的金四面体手性组装体的透射电镜照片。 0016 图 2 本发明中向金四面体手性组装体中加入不同活性的 DNase I， 导致的 CD 光谱 的变化图。 0017 图 3 本发明中的圆二光谱检测 DNase I 活性的标准曲线图。 具体实施方式 0018 实施例 1 （一） 检测探针的制备 （1） 15nm 粒径金纳米粒子 （AuNP1） 合成 采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成 15nm 粒径金纳米粒子 ： 将反应用的三角瓶用。
21、王水浸 泡 12h， 然后用超纯水冲洗 3 次后， 烘干、 备用。向其中加入 100mL 0.25 mM 的氯金酸水溶 液， 搅拌加热至沸腾， 5min 后加入 2.5 mL 新鲜配制的质量分数为 1% 的柠檬酸三钠水溶液， 继续搅拌加热， 30min 后， 结束反应， 移去热源， 待溶液冷至室温后， 将 AuNP1溶液放入 4冰 箱。 0019 （2） 25nm 粒径金纳米粒子 （AuNP2） 合成 采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成 25nm 粒径金纳米粒子 ： 方法与制备 AuNP1相同， 只是 将柠檬酸三钠的用量变为 1.5 mL， 其余条件均不变， 即可制备得到 AuNP2溶液。 0020。
22、 （3） AuNP1和 DNA1 偶联 步骤 （1） 合成出的 AuNP1和巯基修饰的 DNA1 进行偶联形成 AuNP1-DNA1 复合体 ： 取 50 mL 2nM 的步骤 （1） 制备的 AuNP1加入 20mg 二水合双 （对 - 璜酰苯基） 苯基膦化二钾盐， 震荡 混匀， 孵育 12h 后离心去除上清液， 将沉淀以 10 mL 0.5TBE 重悬 ； 向其中加入 DNA1， 控制 DNA1 与 AuNP1的摩尔比为 5:1， 2h 后， 加入 2M 氯化钠使得其终浓度为 50mM。12h 后， 离心， 去除游离的 DNA1 分子， 得到 AuNP1-DNA1 复合体。 0021 DN。
23、A1 ： HS-5 -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3 。 0022 （4） AuNP2分别和 DNA2、 DNA3、 DNA4 偶联 步 骤 （2）合 成 出 的 AuNP2和 巯 基 修 饰 的 DNA2、 DNA3、 DNA4 分 别 进 行 偶 联 形 成 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体， 偶联步骤与步骤 （3） 相同。 0023 DNA2 。
24、： HS-5 -TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3 ； DNA3 ： HS-5 -TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3 ； DNA4 ： HS-5 -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TA。
25、T CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3 。 0024 （5） AuNP1与 AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构 分别取步骤 （4） 制备出的 1mL 2nM 的 AuNP2-DNA2、 AuNP2-DNA3、 AuNP2-DNA4 复合体和步 骤 （3） 制备出的 1mL 2nM 的 AuNP1-DNA1 复合体混匀进行杂交 （杂交缓冲液 ： 1TBE， 杂交时 说 明 书 CN 103411889 A 5 4/4 页 6 间 24h） ， 形成。
26、具有手性的金四面体结构。对该金四面体结构进行透射电镜表征与圆二光谱 表征。 0025 （二） 圆二光谱 CD 检测， 建立 CD 信号强度与 DNase I 活性之间的标准曲线 向步骤 （5） 制备的手性金四面体溶液 （1mL, 2nM） 中加入一系列不同活性浓度的 DNase I ： 分别为0U/mL、 0.005U/mL、 0.01U/mL、 0.05U/mL、 0.1 U/mL、 0.2 U/mL、 0.5 U/mL、 1U/mL、 10 U/mL ； 37下反应10min后， 测定CD信号， 以DNase I活性为横坐标， CD信号强度为纵坐标， 建立标准曲线。 说 明 书 CN 10。
27、3411889 A 6 1/1 页 7 DNA1 ： HS-5 -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3 ； DNA2 ： HS-5 -TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3 ； DNA3 ： HS-5 -T。
28、TT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3 ； DNA4 ： HS-5 -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3 ； 序 列 表 CN 103411889 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103411889 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103411889 A 9 。