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1、(10)申请公布号 CN 103308686 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103308686 A *CN103308686A* (21)申请号 201310263605.5 (22)申请日 2013.06.28 G01N 33/577(2006.01) G01N 33/545(2006.01) (71)申请人 武汉优尔生科技股份有限公司 地址 430056 湖北省武汉经济技术开发区出 口加工区8MC地块F栋(武汉优尔生科 技股份有限公司 ) (72)发明人 彭夫望 何峰容 杨娟 汪景 孙颖 高强 李庆 万定一 (54) 发明名称 脂多糖酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法 。
2、(57) 摘要 本发明公开了一种脂多糖 (LPS) 酶联免疫 吸附测定 (ELISA) 试剂盒的制备方法， 本发明利 用化学反应原理对LPS进行改造， 将LPS于BSA进 行偶联， 赋予 LPS 更好的免疫原性， 促进小鼠体内 特异性针对LPS的B细胞的增殖， 进而提高单克隆 抗体制备时的融合效率， 最终获得高特异性， 高亲 和力， 高灵敏度的抗 LPS 的抗体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103308686 A CN 103308686 A *C。
3、N103308686A* 1/1 页 2 1.一种脂多糖(LPS)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒的制备方法， 所述的方法包括 如下步骤 ： a、 LPS 与载体蛋白 BSA 偶联复合物的制备 ： 取 LPS 和 N- 羟基硫代琥珀酰亚胺 ( 质量比 6-4 2) 溶解在 PBS 溶液中 ； 搅拌状态下 反应液里滴加含有碳二亚胺的PBS溶液中， 室温反应过夜 ； 将上清液逐滴加到含有BSA的磷 酸盐缓冲液中 ； 室温搅拌反应 5h ； 装入透析袋透析、 浓缩、 干燥保存 ； b、 抗 LPS 抗体的制备 ： 选用 BALB/C 小鼠， 将 LPS-BSA 蛋白浓度调整为 1mg/mL， 然。
4、后取 0.4ml 蛋白与等量完全 弗氏佐剂混合、 乳化， 每只 100ul， 皮下多点及四脚掌初次免疫， 14d 后相同剂量腹腔加强免 疫， 每 2 周加强 1 次， 加强后每隔 7d 眼眶采血， 分别测定针对 LPS 和载体蛋白的抗体效价， 于细胞融合前 3d 尾静脉加强免疫 ； 用 PEG 融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和 BALB/C 小 鼠脾细胞， 制备杂交瘤细胞 ； 2 周后用间接 ELISA 法检测细胞上清液， 选取 P/N 值最高的采 用有限稀释法进行 3-4 次克隆 ； 每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法粗 提单抗， 用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗 LPS 。
5、的抗体 ； c、 试剂盒的制备 试剂盒的主要组分包括 ： 包被抗体、 LPS 标准品、 生物素标记的 LPS、 HRP 标记的亲和素、 5， 5 - 四甲基联苯胺 (TMB) 和终止液 ( 硫酸 ) ； 使用 96 孔聚苯乙烯试剂板 (PS) 作为固相 载体， 先将其置于紫外光下辐照2小时， 使PS板活化 ； 在试剂板微孔条上预先包被一定浓度 的抗 LPS 抗体， 4过夜， 经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。 权 利 要 求 书 CN 103308686 A 2 1/5 页 3 脂多糖酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体而言， 涉。
6、及脂多糖 (LPS) 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒的制备方法。 背景技术 0002 脂多糖 (LPS) 是革兰氏阴性菌的内毒素， 由特异性多糖、 核心多糖和脂类 A 组成， 借疏水键与外膜相连。做为细胞壁的组成成份， LPS 仅在细菌自溶或人工裂解后才释放出 来。脂类 A 是 LPS 的毒性中心， 也是内毒素的主要成份。脂类 A 无种属特异性， 故各种不同 革兰氏阴性菌感染， 由内毒素产生的毒性作用大致相似。 0003 LPS 的生物学活性多种多样， 尤其在机体内的表现， 错综复杂， 各单项活性之间常 相互联系， 相互促进或制约。 LPS具有激活生物体内巨噬细胞等效应靶细胞诱导产生。
7、多种活 性因子的作用。LPS 作用于机体后可以刺激机体产生肿瘤坏死因子、 IL-1、 IL-6、 干扰素、 集 落刺激因子等多种细胞因子， 刺激产生大量活性氧， 引起机体发热、 弥散性血管内凝血、 多 脏器衰竭及休克等临床综合征。有实验证明给动物注射少量的 LPS， 早期白细胞数量减少， 后期白细胞数量明显增加 ； 另外 LPS 还具有激活补体活化的经典途径和旁路途径。活化过 程中产生的 C3a、 C5a 具有过敏性毒素作用 ； 内毒素可导致动物发生什瓦茨曼 (shwartzman) 现象 ； LPS 具有免疫佐剂活性 ； 内毒素注射入实验动物， 常可导致动物死亡等作用。 0004 因此， 制。
8、备一种能特异、 灵敏、 快速的检测 LPS 的工具是非常有需要的而且有意义 的。它可以用来检测生物重组药物、 食物、 科学研究蛋白中 LPS 的残留。而酶联免疫吸附测 定 (ELISA) 检测技术正好可以满足这些要求。ELISA 检测技术是利用抗原 - 抗体之间特异 性的免疫反应识别生物液体中的靶分子， 并利用酶 - 底物的显色反应定量的反应待测样本 中靶分子的含量。由于其特异性强、 灵敏度、 操作简便及不需大型仪器等优点， 现广泛用于 生物样本的定量检测实验中。实现该测定的重要环节是针对待测分子的高特异性、 高亲和 力抗体的制备。 0005 LPS 是一种结构十分复杂、 具有多种异质性的生物。
9、大分子， 而且属于胸腺非依赖抗 原 (TI 抗原 )。与蛋白质等胸腺依赖性抗原 (TD 抗原 ) 不同， TI 抗原不能诱导抗体亲和成 熟， 也不能诱导免疫记忆， 所以按常规的免疫方法很难产生高亲和力、 交叉反应性抗 LPS 的 mAb。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 提供一种脂多糖 (LPS) 酶联免疫吸附 测定 (ELISA) 试剂盒的制备方法。为了实现本发明的目的， 拟采用如下技术方案 ： 0007 本发明一方面涉及一种脂多糖 (LPS) 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒的制备 方法， 所述的方法包括如下步骤 ： 0008 a、 LPS 与载体蛋白 B。
10、SA 偶联复合物的制备 ： 0009 取 LPS 和 N- 羟基硫代琥珀酰亚胺 ( 质量比 4-6 2) 溶解在 PBS 溶液中 ； 搅拌状 说 明 书 CN 103308686 A 3 2/5 页 4 态下反应液里滴加含有碳二亚胺的 PBS 溶液中， 室温反应过夜 ； 将上清液逐滴加到含有 BSA 的磷酸盐缓冲液中 ； 室温搅拌反应 5h ； 装入透析袋透析、 浓缩、 干燥保存 ； 0010 b、 抗 LPS 抗体的制备 ： 0011 选用 BALB/C 小鼠， 将 LPS-BSA 蛋白浓度调整为 1mg/mL， 然后取 0.4ml 蛋白与等量 完全弗氏佐剂混合、 乳化， 每只 100ul，。
11、 皮下多点及四脚掌初次免疫， 14d 后相同剂量腹腔加 强免疫， 每 2 周加强 1 次， 加强后每隔 7d 眼眶采血， 分别测定针对 LPS 和载体蛋白的抗体效 价， 于细胞融合前 3d 尾静脉加强免疫 ； 用 PEG 融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和 BALB/C 小鼠脾细胞， 制备杂交瘤细胞 ； 2 周后用间接 ELISA 法检测细胞上清液， 选取 P/N 值最高的 采用有限稀释法进行 3-4 次克隆 ； 每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法 粗提单抗， 用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗 LPS 的抗体 ； 0012 c、 试剂盒的制备 0013 使用 96 孔聚苯乙烯试。
12、剂板 (PS) 作为固相载体， 先将其置于紫外光下辐照 2 小时， 使 PS 板活化 ； 在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗 LPS 抗体， 4过夜， 经洗板及牛血 清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板 ； 配制以生物素化的 LPS 为活性成分的检测液 A。 具体实施方式 0014 下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容 ： 0015 1.LPS 酶联免疫试剂盒的制备方法， 其具体步骤为 0016 a、 LPS 与载体蛋白 BSA 偶联复合物的制备 ： 0017 采用碳二亚胺法制备LPS-BSA.取LPS50mg和20mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS(质 量比 5 2) 溶解在 2ml0.0。
13、1M PBS 溶液中 ； 搅拌状态下反应液里滴加 1.0ml 含有 20mg 碳 二亚胺 EDC 的 0.01M PBS 溶液中， 室温反应过夜 ； 将上清液逐滴加到 10ml 含有 20mgBSA 的 0.01M 磷酸盐缓冲液中 ； 室温搅拌反应 5h ； 装入透析袋透析、 浓缩、 干燥保存。 0018 b、 抗 LPS 抗体的制备 ： 0019 选用 BALB/C 小鼠， 将 LPS-BSA 蛋白浓度调整为 1mg/mL， 然后取 0.4ml 蛋白与等量 完全弗氏佐剂混合、 乳化， 每只 100ul， 皮下多点及四脚掌初次免疫， 14d 后相同剂量腹腔加 强免疫， 每 2 周加强 1 次，。
14、 加强后每隔 7d 眼眶采血， 分别测定针对 LPS 和载体蛋白的抗体效 价， 于细胞融合前 3d 尾静脉加强免疫。用 PEG 融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和 BALB/ C 小鼠脾细胞， 制备杂交瘤细胞。2 周后用间接 ELISA 法检测细胞上清液， 选取 P/N 值最高 的采用有限稀释法进行 3-4 次克隆。每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。 0020 用硫酸铵沉淀法粗提单抗， 用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗 LPS 的抗 体。 将200-300ml细胞培养上清样本直接从LPS抗原偶联的层析柱进样口上样， 流速为1ml/ min。用 0.1mol/L pH8.0 磷酸缓冲液 (30。
15、-40ml) 洗脱杂蛋白后， 再用 0.01mol/L pH8.0 磷 酸缓冲液(20-30ml)洗脱， 流速为2ml/min。 最后用0.1mol/L Gly-HCl洗脱缓冲液洗脱， 流 速为1.5ml/min， 收集样本洗脱液， 透析浓缩后备用。 采用间接ELISA法进行鉴定， 抗体效价 为 1 100000-1 300000。 0021 c、 ELISA 试剂盒的制备 ： 0022 本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清、 血浆、 组织裂解液、 细胞裂解液 和细胞培养上清等样本中LPS的水平。 试剂盒的主要组分包括 ： 包被抗体、 LPS标准品、 生物 说 明 书 CN 103308。
16、686 A 4 3/5 页 5 素标记的 LPS、 HRP 标记的亲和素、 5， 5 - 四甲基联苯胺 (TMB) 和终止液 ( 硫酸 )。制备过 程如下 ： 使用 96 孔聚苯乙烯试剂板 (PS) 作为固相载体， 先将其置于紫外光下辐照 2 小时， 使 PS 板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗 LPS 抗体， 4过夜， 经洗板及牛血 清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时， 依次加入不同浓度的标准品 / 待测标 本及生物素化的 LPS， 形成标准品 / 待测标本中的 LPS 和生物素化的 LPS 竞争结合酶标板 上包被的抗体的局面， 未结合的 LPS 经过洗涤去除 ； 再通过。
17、亲和素化辣根过氧化物酶 (HRP) 放大信号， 加入催化底物 5， 5 - 四甲基联苯胺 (TMB) 产生蓝色可溶性物质， 最后加入硫酸 终止后呈黄色， 于 450nm 检测标准品孔及样本孔 O.D. 值。在试剂盒的检测范围内， 待测物 浓度越高， 样本 O.D. 值则越低， 样本浓度值与 OD 值呈现负相关系。 0023 2. 为验证试剂盒的各项性能， 分别检测了试剂盒的标准曲线、 特异性、 精密度、 回 收率及样本稀释的线性， 具体实验方法和结果如表 1 所示， 从检测结果可知该标准曲线具 有良好的线性关系。 0024 a. 标准曲线 ( 表 1) 0025 0026 表 1 ： LPS 。
18、试剂盒标准曲线测值 0027 b. 灵敏度 ： LPS ELISA 法检测血清标本时最低检测限为 4.44pg/ml ； 0028 c. 特异性检测 ： 0029 检测该试剂盒能否与 LPS 的结构类似物或相关蛋白反应， 所测值用交叉反应率来 表示， 即类似物的测定浓度与实际添加值的比值。 具体测定方法如下， 在阴性血清中添加下 述物质， 使其终浓度为 100ng/ml， 使用该试剂盒检测并计算交叉反应率。 0030 表 2 ： LPS ELISA 试剂盒交叉反应率测试 0031 类似物交叉反应率 人 HSA0.1 人载脂蛋白 A0.1 人载脂蛋白 B1.1 牛 BSA0.1 鸡 OVA0.1。
19、 0032 d. 回收率 ： 用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品， 作回收试验 (n 5)。 平均回收率 98 ( 表 3)。 说 明 书 CN 103308686 A 5 4/5 页 6 0033 表 3ELISA 法测定 LPS 的回收试验 0034 定值标准品 (pg/ml)回收率 ( ) 80091 300104 5098 平均回收率98 0035 e. 0036 精密度实验 ： 0037 用该方法对高、 中、 低值质控品分别进行精密度实验， 每个样本重复测定 20 次， 表 4 中结果可见 ELISA 方法精密度较好。 0038 表 4ELISA 试剂盒精密度测试 0039 批。
20、内差 CV( ) 批间差 CV( ) 高5.77.2 中5.56.9 低5.26.4 0040 0041 3、 本发明将目的蛋白 LPS 与另一个大分子蛋白进行偶联， 赋予 LPS 一定的特性， 促使其能更好的刺激小鼠 B 细胞产生特异性， 稳定性强的抗体原料 ； 同时我们采用了生物 素和亲和素级联放大系统， 增加了试剂盒的灵敏性， 比常规的检测方法灵敏度更高、 特异性 好。采用本发明所生产的 ELISA 试剂盒和目前革兰氏阴性细菌检测方法， 可见 ELISA 试剂 盒较培养涂片法检测 LPS 有很多优势。 0042 表 5ELISA 试剂盒和细菌培养涂片法的比较 0043 ELSIA 试剂盒。
21、细菌培养涂片检测 样本前处理无需需要先培养细胞， 再进行细胞染色处理 检测限12.35-1,000pg/ml无， 定性检测 灵敏度4.44pg/ml低 仪器酶标仪 ( 价格较低 )显微镜 ( 价格较低 ) 说 明 书 CN 103308686 A 6 5/5 页 7 操作简单， 无需特殊培训繁琐， 对操作人员技术要求较高 检测时间5 小时根据细胞特性， 时间 1-4 天 检测成本大批量检测成本较低成本不高 0044 结论 ： 0045 本专利改变传统的直接拿 LPS 免疫动物制备抗体的方法， 利用化学反应原理对 LPS 进行改造， 将 LPS 于 BSA 进行偶联， 赋予 LPS 更好的免疫原。
22、性， 促进小鼠体内特异性针 对 LPS 的 B 细胞的增殖， 进而提高单克隆抗体制备时的融合效率， 最终获得高特异性， 高亲 和力， 高灵敏度的抗 LPS 的抗体。有了高质量的原料， 我们成功的制备了检测 LPS 的 ELISA 试剂盒， 该试剂盒能特异性的检测血清、 血浆、 组织、 细胞中的 LPS 含量。该试剂盒较平时常 用的细菌培养涂片法诸多优势 ： 1. 涂片法只能做定性检测， 而 ELISA 可以精准定量 ； 2. 涂 片法耗时长， 一般细菌培养就需要1-4天， 而ELISA只需要5小时 ； 3.涂片法要先取样培养， 才能检测 ； 而 ELSIA 试剂盒可以直接检测， 无需样本前处理。 0046 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 不经过创造性劳动想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的 保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 说 明 书 CN 103308686 A 7 。