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1、(10)申请公布号 CN 103529213 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103529213 A (21)申请号 201310484924.9 (22)申请日 2013.10.16 G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 北京华卫骥生物医药有限公司 地址 100054 北京市西城区白纸坊东街 10 号泰然居 B 座 11 层 (72)发明人 文德敏 申有长 于晓永 (74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有 限公司 11335 代理人 吴甘棠 (54) 发明名称 检测戊型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫 层析试纸及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉。
2、及医学免疫检测方法， 特别是涉及 使用量子点标记免疫层析试纸， 以免疫学的方法 检测戊型肝炎病毒的方法。一种量子点标记免疫 层析试纸， 在塑料板上从下到上依次粘贴有玻璃 纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗 体的玻璃纤维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 其 中， 所述硝酸纤维素膜一端有戊型肝炎病毒多克 隆抗体和兔抗鼠二抗， 以此形成检测带 T 和质控 带 C ； 所述量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗 体位于玻璃纤维素膜B的一端， 与检测带T和质控 带 C 相对应。本发明将免疫反应的高特异性和量 子点的荧光特性相结合， 该方法的检测灵敏度比 目前常用的一种检测方法的检测灵敏度高 。
3、1000 倍左右。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103529213 A CN 103529213 A 1/2 页 2 1. 一种量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 设有塑料板、 硝酸纤维素膜、 玻璃纤维 素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻璃纤维素膜 B、 吸水纸 ； 其中， 所述塑料板上从下到上依次粘贴有玻璃纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单 克隆抗体的玻璃纤维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 其。
4、中， 所述硝酸纤维素膜一端有戊型肝炎病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗， 以此形成检 测带 T 和质控带 C ； 其中， 所述量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体位于玻璃纤维素膜 B 的一端， 与检 测带 T 和质控带 C 相对应， 并且量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体位于进样点一端。 2. 如权利要求 1 所述的量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 所述量子点为 CdTe/ ZnSe 核壳量子点。 3.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 所述塑料板为粘性PVC 底板。 4. 如权利要求 1 所述的量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 所述戊型肝炎病毒多 克隆抗体的浓度为 0。
5、.5g/L。 5. 如权利要求 1 所述的量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 所述兔抗鼠二抗的浓 度为 1.0g/L。 6.如权利要求1所述的量子点标记免疫层析试纸， 其特征在于， 所述检测带T和质控带 C 间距不少于 5mm。 7. 如上任意一项权利要求所述的量子点标记免疫层析试纸的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 量子点与戊型肝炎病毒单克隆抗体的偶联 ： 取 0.01M 的 PBS 缓冲液 100 200uL 与 5 20uL 表面连有羧基的量子点 ； 选取偶联试剂 ； 加入戊型肝炎病毒单克隆抗体 150 200uL ； 摇床反应 1 4 小时 ； 层析柱过滤， 离心。
6、纯化 ； 用 1% 5% 的牛血清白蛋白封闭 ； 4保存 ； （2） 试纸的制备 ： 用 0.05 0.15M 的 PBS 缓冲液稀释戊型肝炎病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗， 将 0.5g/ L 戊型肝炎病毒多克隆抗体和 1.0g/L 兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端， 形成检测带 T 和 质控带 C， T 带和 C 带间隔 5mm, 室温晾干， 将硝酸纤维素膜放入 PBS 缓冲液中， 37封闭待 用， 或者干燥后 4保存 ； 将量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜 B 一端， 与检测带 T 和质控带 C 相对应， 室温干燥， 4保存 ； 在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜 A、 量子。
7、点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻璃纤 维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 用试纸切刀切割成试纸， 干燥后密封保存。 8. 如权利要求 7 所述的量子点标记免疫层析试纸的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中 权 利 要 求 书 CN 103529213 A 2 2/2 页 3 的偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、 1-（3- 二甲基氨丙基） -3 乙基碳二胺盐酸盐。 9. 用权利要求 1-6 任意一项所述的试纸检测戊型肝炎病毒， 其特征在于， 包括如下步 骤 ： 将样品点样在组装好的试纸上接近戊型肝炎病毒单克隆抗体的一端， 反应 5min 后， 在 紫外分析仪中观察结果。 权 利 要 。
8、求 书 CN 103529213 A 3 1/4 页 4 检测戊型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其 制备方法 技术领域 0001 本发明涉及医学免疫检测方法， 特别是涉及使用量子点标记免疫层析试纸， 以免 疫学的方法检测戊型肝炎病毒的方法。 背景技术 0002 戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一种人和多种动物的人兽共患病。 主要经粪便 途径传播， 常因饮用水源被污染导致暴发流行， 且散发病例呈全球分布。 戊型肝炎约占我国 急型肝炎的 15% 20%。患戊肝的成年人的死亡率达 0.5% 3%， 而孕妇则高达 15% 20%。 因此， 戊肝的筛查和确诊尤为重要。 0003 目前， 常用的检。
9、测方法为胶体金法， 此法虽然检测快速简便， 容易操作， 但是准确 率较低， 灵敏度也较低。因此寻求一种价格便宜、 操作简便、 灵敏度和特异性都较高的检测 方法是迫切需要解决的问题。 发明内容 0004 针对上述技术的不足之处， 本发明提供一种价格便宜、 操作简便、 灵敏度和特异性 都较高的检测试纸以及用该试纸检测戊型肝炎病毒的方法。 0005 一种量子点标记免疫层析试纸， 设有塑料板、 硝酸纤维素膜、 玻璃纤维素膜 A、 量子 点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻璃纤维素膜 B、 吸水纸 ； 0006 其中， 所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆 抗体的玻璃纤维素。
10、膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 0007 其中， 所述硝酸纤维素膜一端有戊型肝炎病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗， 以此形 成检测带 T 和质控带 C ； 0008 其中， 所述量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体位于玻璃纤维素膜 B 的一端， 与检测带 T 和质控带 C 相对应， 并且量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体位于进样点一 端。 0009 优选的， 所述量子点为 CdTe/ZnSe 核壳量子点。 0010 优选的， 所述塑料板为粘性 PVC 底板。 0011 优选的， 所述戊型肝炎病毒多克隆抗体的浓度为 0.5g/L。 0012 优选的， 所述兔抗鼠二抗的浓度为 1.0g/L。 001。
11、3 优选的， 所述检测带 T 和质控带 C 间距不少于 5mm。 0014 如上所述的试纸的制备方法， 包括如下步骤 ： 0015 （1） 量子点与戊型肝炎病毒单克隆抗体的偶联 ： 0016 取 0.01M 的 PBS 缓冲液 100 200uL 与 5 20uL 表面连有羧基的量子点 ； 0017 选取偶联试剂， 偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、 1-（3- 二甲基氨丙基） -3 乙基 碳二胺盐酸盐 ； 说 明 书 CN 103529213 A 4 2/4 页 5 0018 加入戊型肝炎病毒单克隆抗体 150 200uL ； 0019 摇床反应 1 4 小时 ； 0020 层析柱过滤， 离心。
12、纯化 ； 0021 用 1% 5% 的牛血清白蛋白封闭 ； 0022 4保存 ； 0023 （2） 试纸的制备 ： 0024 用 0.05 0.15M 的 PBS 缓冲液稀释戊型肝炎病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗， 将 0.5g/L 戊型肝炎病毒多克隆抗体和 1.0g/L 兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端， 形成检测 带 T 和质控带 C， T 带和 C 带间隔 5mm, 室温晾干， 将硝酸纤维素膜放入 PBS 缓冲液中， 37 封闭待用， 或者干燥后 4保存 ； 0025 将量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜 B 一端， 与形成的 T 带和 C 带相对应， 室温干燥， 4保存 ；。
13、 0026 在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻 璃纤维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 0027 用试纸切刀切割成试纸， 干燥后密封保存。 0028 用所述的试纸检测戊型肝炎病毒， 包括如下步骤 ： 将样品点样在组装好的试纸上 接近戊型肝炎病毒单克隆抗体的一端， 反应 5min 后， 在紫外分析仪中观察结果。 0029 与现有技术相比， 本发明具有以下优点 ： 由于在所制备的试纸中加入了核壳量子 点， 特别是采用了 CdTe/ZnSe 水溶性核壳量子点， 将水溶性的量子点与特异性的通过共价 偶联， 然后利用双抗夹心原理结合量子点的荧光性质检测样品中。
14、是否含有目标物。在紫外 灯的照射下， 通过观察免疫层析试纸条上检测带和质控带的荧光线， 判断检测结果。 本发明 将免疫反应的高特异性和量子点的荧光特性相结合， 利用量子点多波长激发， 高强度荧光 发射， 发射峰窄， 峰形对称， 发光稳定性好的荧光特性， 建立了快速， 特异， 简便， 灵敏的免疫 层析检测方法。通过观察荧光信号达到了定量检测的目的。该方法的检测灵敏度比目前常 用的一种快速检测方法 - 胶体金的检测灵敏度高约 1000 倍左右。 附图说明 0030 图 1 为试纸制备的工艺流程图。 具体实施方式 0031 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。 0032 实施例 1 ： 一。
15、种量子点标记免疫层析试纸， 设有塑料板、 硝酸纤维素膜、 玻璃纤维 素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻璃纤维素膜 B、 吸水纸， 所述玻璃纤维素 膜 A 为没有点样的市场上购买的玻璃纤维素膜 ； 0033 其中， 所述塑料板上依次粘贴有玻璃纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆 抗体的玻璃纤维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 0034 其中， 所述硝酸纤维素膜一端有戊型肝炎病毒多克隆抗体和兔抗鼠二抗， 以此形 成检测带 T 和质控带 C ； 0035 其中， 所述量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体位于玻璃纤维素膜 B 的一端， 说 明 书 CN 103529213 A。
16、 5 3/4 页 6 与检测带 T 和质控带 C 相对应。 0036 优选的， 所述量子点为 CdTe/ZnSe 核壳量子点。 0037 优选的， 所述塑料板为粘性 PVC 底板。 0038 优选的， 所述戊型肝炎病毒多克隆抗体的浓度为 0.5g/L。 0039 优选的， 所述兔抗鼠二抗的浓度为 1.0g/L。 0040 优选的， 所述检测带 T 和质控带 C 间距不少于 5mm。 0041 实施例 2 ： 如上所述的试纸的制备方法， 如图 1 所示， 包括如下步骤 ： 0042 （1） 量子点与戊型肝炎病毒单克隆抗体的偶联 ： 0043 取 0.01M 的 PBS 缓冲液 100 200uL。
17、 与 5 20uL 表面连有羧基的量子点 ； 0044 选取偶联试剂， 偶联试剂选自羟基硫代琥珀酸亚胺、 1-（3- 二甲基氨丙基） -3 乙基 碳二胺盐酸盐 ； 0045 加入戊型肝炎病毒单克隆抗体 150 200uL ； 0046 摇床反应 1 4 小时 ； 0047 层析柱过滤， 离心纯化 ； 0048 用 1% 5% 的牛血清白蛋白封闭 ； 0049 4保存 ； 0050 （2） 试纸的制备 ： 0051 用 0.05 0.15M 的 PBS 缓冲液稀释戊型肝炎病毒多克隆抗体及兔抗鼠二抗， 将 0.5g/L 戊型肝炎病毒多克隆抗体和 1.0g/L 兔抗鼠二抗喷在硝酸纤维素膜一端， 形成。
18、检测 带 T 和质控带 C， T 带和 C 带间隔 5mm, 室温晾干， 将硝酸纤维素膜放入 PBS 缓冲液中， 37 封闭待用， 或者干燥后 4保存 ； 0052 将量子点标记的戊型肝炎病毒单克隆抗体均匀喷覆于玻璃纤维膜 B 一端， 与 T 带 和 C 带相对应， 室温干燥， 4保存 ； 0053 在塑料板上依次粘帖玻璃纤维素膜 A、 量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体的玻 璃纤维素膜 B、 硝酸纤维素膜、 吸水纸 ； 0054 用试纸切刀切割成试纸， 干燥后密封保存。 0055 其中， 步骤 （1） 中偶联效果的检测方法如下 ： 0056 凝胶电泳法 ： 采用 0.8 琼脂糖凝胶， 电压为 。
19、80V， 电泳 15min 后， 在紫外分析仪中观 察电泳结果。 0057 斑点印迹法 ： 将0.3g/L戊型肝炎病毒-BSA液点在硝酸纤维素膜上， 晾干后浸泡于 含 5%BSA 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 （PBS， 10nmol/L， PH=7.4， 含 NaCl8.5g/L） 中， 封闭膜上 剩余的蛋白结合位点， 于 37孵育 1h， 封闭后取出， PBS 洗涤。制备三个完全相同的戊型肝 炎病毒印迹膜， 晾干后分别放入量子点标记戊型肝炎病毒单克隆抗体， 量子点 -BSA 及量子 点溶液， 于 37摇床反应 30min， PBS 洗涤。紫外分析仪中观察结果。 0058 实施例 3。
20、 ： 用所述的试纸检测戊型肝炎病毒， 包括如下步骤 ： 将样品点样在组装好 的试纸上接近戊型肝炎病毒单克隆抗体的一端， 反应 5min 后， 在紫外分析仪中观察结果。 用 PBS 缓冲液及正常人的血液设为空白对照。 0059 结果判定 ： 在C带显现红色荧光带的前提下， 目视T带的荧光带强度， 与空白对照， 荧光越弱， 代表待测液中含被检物的浓度越低。 说 明 书 CN 103529213 A 6 4/4 页 7 0060 实施例 4 ： 试纸检测有效性验证， 配制四种浓度的戊型肝炎病毒溶液， 浓度分别为 0.5， 1.0， 2.0， 5.0ug/L。利用检测试纸和化学发光试纸盒对样本进行检测， 每个浓度检测 6 次， 测定试纸检出结果的有效性。 如表一所示， 结果表明用本发明制备的试纸检测出来的呈 现阳性， 并且溶液浓度越大荧光强度越大。 0061 表一 ： 各种浓度戊型肝炎病毒的试纸条检测结果 0062 0063 以上所述， 仅为本发明的较佳实施例而已， 举凡熟悉此项技艺的专业人士在了解 本发明的技术手段之后， 自然能依据实际的需要， 在本发明的教导下加以变化。 因此凡依本 发明申请专利范围所作的同等变化与修饰， 曾应仍属本发明专利涵盖的范围内。 说 明 书 CN 103529213 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103529213 A 8 。