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1、(10)申请公布号 CN 103344723 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344723 A *CN103344723A* (21)申请号 201310303877.3 (22)申请日 2013.07.19 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 青岛日辰食品有限公司 地址 266200 山东省青岛市即墨市青岛环保 产业园 （即发龙山路 20 号） (72)发明人 纪春雨 郭春生 崔宝军 (74)专利代理机构 山东清泰律师事务所 37222 代理人 朱兵 (54) 发明名称 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测。
2、前处 理方法 (57) 摘要 本发明属于食品检测技术领域， 具体涉及一 种在进行高效液相色谱检测苯甲酸、 山梨酸和糖 精钠前的处理方法 ； 其包括如下步骤 ： 步骤一 ： 粉 碎， 将固体样品和半固体样品粉碎成小块， 液体样 品直接取用 ； 步骤二 ： 称取， 于下端封闭的透析袋 中， 称取一定量的待测样品 ； 步骤三 ： 透析， 在装 有样品的透析袋中， 加入氢氧化钠水溶液， 然后将 透析袋上端扎紧， 置于量筒中用水定容， 静置透 析 ； 步骤四 ： 过滤， 取一定量的透析袋外的液体， 调节 pH 值至酸性， 用水定容， 然后用滤膜过滤， 取 滤液进行检测 ； 其具有排除干扰、 保护色谱柱、。
3、 使 用化学试剂少、 安全可靠、 降低检测成本、 操作简 单等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103344723 A CN 103344723 A *CN103344723A* 1/1 页 2 1. 一种食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其特征在于 ： 包括如下步 骤 ： 步骤一 ： 粉碎， 将固体样品和半固体样品粉碎成小块， 液体样品直接取用 ； 步骤二 ： 称取， 于下端封闭的透析袋中， 称取一定量的待测样品 ； 步骤三 ： 。
4、透析， 在装有样品的透析袋中， 加入氢氧化钠水溶液， 然后将透析袋上端扎紧， 置于量筒中用水定容， 静置透析 ； 步骤四 ： 过滤， 取一定量的透析袋外的液体， 调节 pH 值至酸性， 用水定容， 然后用微孔 滤膜过滤， 取滤液进行检测。 2. 根据权利要求 1 所述的食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其特征 在于 ： 采用截留分子量为 6000-8000 道尔顿的透析袋。 3. 根据权利要求 2 所述的食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其特征 在于 ： 采用直径为 36mm 的透析袋， 采用孔径为 0.45um 的微孔滤膜。 4. 根据权利要求 3 所述的食品。
5、中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其特征 在于 ： 采用 pH=10 的氢氧化钠水溶液， 步骤四中调节 pH 值至 3。 5. 根据权利要求 4 所述的食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其特征 在于 ： 步骤三中静置透析 10h 以上。 6. 根据权利要求 1 5 所述的任何一种食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理 方法， 其特征在于 ： 步骤二中称取 10g 的待测样品 ； 步骤三中加入 10ml 氢氧化钠水溶液， 并 定容至 80mL ； 步骤四中取 40ml 透析袋外的液体， 并定容至 50mL。 权 利 要 求 书 CN 103344723 A 2 1。
6、/5 页 3 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法 技术领域 0001 本发明属于食品检测技术领域， 具体涉及一种在用高效液相色谱法检测食品中的 苯甲酸、 山梨酸和糖精钠前进行的前处理方法， 其能够有效的去除粘稠的液体样品、 半固体 样品、 固体粉末样品中的蛋白质、 淀粉、 多糖、 胶体、 颗粒杂质、 菌体等物质的干扰。 背景技术 0002 “民以食为天” ， 食品是人类赖以生存的物质基础， 是人类维持生长与健康的第一 需要。食品安全也越来越引起人们的重视， 其中食品检测技术的发展是确保食品安全的技 术支撑。 0003 完整的食品检测过程包括样品采集、 样品前处理、 分析测定、 数据。
7、处理、 结果表达。 其中食品检测的前处理方法是指对样品进行纯化和浓缩， 使被分析物适于分析。对样品进 行纯化的目的是提取样品中的待检测成分同时去除其他成分的干扰。 0004 尤其是在进行高效液相色谱检测时， 对样品的前处理更为重要。例如， 依据 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法 ， 对食品进行 检测前就必须对食品进行处理， 目的是去除样品中蛋白质、 脂肪、 淀粉等样品基质的干扰， 因为高效液相色谱只能检测液体样品， 如果样品中存在蛋白质、 脂肪、 淀粉等物质不但会对 目标物质的检测带来干扰， 而且不容易找到合适的溶剂， 严重时还可能污染色谱柱。
8、， 最终导 致色谱柱失效。 0005 在标准 GB/T 23495-2009 中， 对乳饮料、 植物蛋白饮料等含蛋白质较多的粘稠液 体样品以及肉制品、 饼干、 糕点类固体样品， 采用先用亚铁氰化钾和乙酸锌结合沉淀蛋白， 后用微孔滤膜过滤的方法进行前处理 ； 对含有胶基的果冻类半固体样品以及凝胶糖果、 胶 基糖果等固体样品， 采用先调节 PH 值， 后用微孔滤膜过滤的方法进行前处理 ； 对油脂或奶 油类半固体样品以及油脂含量高的火锅底料、 调料等固体样品， 采用先提取， 再通过两步萃 取， 后用微孔滤膜过滤的方法进行前处理。 0006 但是在食品检测的实际操作中， 还有很多不规则样品， 其中粘稠。
9、的液体样品如调 味汁、 芝麻酱等， 半固体样品如火锅调料、 酱腌菜等， 固体样品如牛肉粉、 烧烤腌料等， 由于 含有成千上万种性质、 状态各异的化学成分， 上述调节 pH 值、 亚铁氰化钾和乙酸锌结合沉 淀蛋白以及提取、 萃取的方法， 均不能有效的去除蛋白质、 脂肪、 淀粉等物质， 而最后的微孔 滤膜过滤法只能去除大的杂质颗粒， 所以对目标物质的检测结果带来很大干扰， 而且对检 测色谱柱的污染严重， 导致色谱柱的使用寿命短。 0007 现在还没有将透析法应用到高效液相色谱法检测苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的食品 前处理技术中的报道。 发明内容 0008 为解决现有技术中存在的上述问题， 本发明的目。
10、的在于提供一种食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 其能够有效去除粘稠的液体样品、 半固体样品、 固体样 说 明 书 CN 103344723 A 3 2/5 页 4 品中的蛋白质、 脂肪、 淀粉、 多糖、 胶体、 颗粒杂质、 菌体等物质的干扰， 并且具有防止污染色 谱柱、 延长色谱柱使用寿命、 使用化学试剂少、 安全可靠、 降低检测成本、 操作简单等特点。 本发明提供的技术方案为 ： 一种食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的检测前处理方法， 包 括如下步骤 ： 步骤一 ： 粉碎， 将固体样品和半固体样品粉碎成小块， 液体样品直接取用 ； 步骤二 ： 称取， 于下端封闭的透析袋中， 称。
11、取一定量的待测样品 ； 步骤三 ： 透析， 在装有样品的透析袋中， 加入氢氧化钠水溶液， 然后将透析袋上端扎紧， 置于量筒中用水定容， 静置透析 ； 步骤四 ： 过滤， 取一定量的透析袋外的液体， 调节 pH 值至酸性， 用水定容， 然后用微孔 滤膜过滤， 取滤液进行检测。 0009 优化的， 采用截留分子量为 6000-8000 道尔顿的透析袋。 0010 优化的， 采用直径为 36mm 的透析袋， 采用孔径为 0.45um 的微孔滤膜。 0011 优化的， 采用 pH=10 的氢氧化钠水溶液， 步骤四中调节 pH 值至 3。 0012 优化的， 步骤三中静置透析 10h 以上。 0013 。
12、优化的， 步骤二中称取10g的待测样品 ； 步骤三中加入10ml氢氧化钠水溶液， 并定 容至 80mL ； 步骤四中取 40ml 透析袋外的液体， 并定容至 50mL。 0014 半透膜是一种只允许离子和小分子自由通过的膜结构， 生物大分子不能自由通过 半透膜， 其原因是因为半透膜的孔隙的大小比离子和小分子大但比生物大分子如蛋白质和 淀粉小。半透膜在化学中只允许溶液通过， 胶体和浊液均不能通过。 0015 不同类型的半透膜的孔径是不同的。本实验采用了截留范围 6000-8000 道尔顿的 D36mm 透析袋， 即分子量小于 6000-8000 道尔顿的分子如苯甲酸钠、 山梨酸钾、 脱氢乙酸钠、。
13、 糖精钠、 安赛蜜等小分子可自由进出半透膜， 静置一定时间后透析袋内外的溶液小分子达 到平衡， 即内外小分子浓度相同。而大分子的如蛋白质 （分子量在 3-26 万） ， 淀粉 （分子量在 1 万以上） 等被阻挡在透析袋内， 脂肪虽然不是生物大分子 , 但脂肪本无法进出细胞 , 只有 转化为甘油、 脂肪酸才能自由出入细胞膜。 同理其他大分子也无法自由进出透析袋， 这样就 有效的阻断了食品中生物大分子如 ： 多糖、 胶体、 颗粒杂质、 菌体等， 取透析袋外液进行分析 检测苯甲酸、 山梨酸、 糖精钠等的含量， 可计算出样品中的含量。 同样， 本发明的方法也适用 于高效液相色谱法检测脱氢乙酸、 安赛蜜。
14、等物质的前处理。 0016 本发明的技术方案中， 通过步骤一粉碎， 能够将固体样品、 半固体样品粉碎成小 块， 使其更利于溶解和目标物质的提取 ； 步骤三透析中， 通过加入氢氧化钠水溶液， 使溶液 偏碱性， 提高了样品的溶解度， 有利于促进目标物质在透析袋内外快速达到平衡 ； 步骤四中 用微孔滤膜过滤， 保证了高效液相进样中不含有不溶物。 0017 本发明的有益效果在于 ： 1、 能够有效去除粘稠的液体样品、 半固体样品、 固体粉末 样品中的蛋白质、 淀粉、 多糖、 胶体、 颗粒杂质、 菌体等物质的干扰， 是一种使用化学试剂少、 安全可靠、 成本低、 操作简单的前处理方法 ； 2、 本发明的方。
15、法通过有效去除大分子物质防止 了对检测色谱柱的污染， 延长了色谱柱的使用寿命 ； 3、 采用截留分子量为 6000-8000 道尔 顿、 直径为 D36mm 的透析袋， 适合用作检测苯甲酸、 山梨酸、 脱氢乙酸、 糖精钠、 安赛蜜的前 处理方法， 并且可以根据检测目标， 选择透析袋的规格， 来进行农药残留检测、 兽药残留检 测、 及其他一些食品添加剂如脱氢乙酸、 安赛蜜的检测前处理 ； 4、 由于本发明的方法能够将 说 明 书 CN 103344723 A 4 3/5 页 5 目标物质提取在溶液中， 所以特别适合用作高效液相色谱检测的前处理方法 ； 3、 本方法也 可用于不同的检测领域， 如化。
16、工、 医药等， 尤其是固体中药中有效成分分离和检测。 具体实施方式 0018 下面结合实施例具体说明本发明。 0019 取芝麻酱代表粘稠的液体样品， 取火锅调料代表半固体样品， 取牛肉粉代表固体 样品。 分别采用实施例1和对比例1、 对比例2的方法分别对同一包装内的三种食品进行苯 甲酸、 山梨酸和糖精钠的高效液相色谱的检测前处理。高效液相色谱的检测条件为 色谱柱 ： C-18 柱 150mm*4.6mm(I.D) 流动相 ： 甲醇 ： 乙腈 ： 柠檬酸缓冲溶液 =1 ： 2 ： 7 流速 ： 1.0ml/min 检测器 ： 230nm 柱温箱 ： 40 进样体积 ： 20ul 检测样品的同时，。
17、 进行添加回收试验， 样品 （与所取样品同） ， 称取完毕后， 添加浓度为 1000ug/ml 的标准储备液 250ul， 以同样的方法进行处理测定其回收率。 0020 实施例 1 分别对芝麻酱、 火锅调料和牛肉粉进行食品检测的前处理， 步骤一 ： 粉碎， 芝麻酱和牛肉粉均直接取用 （因为这里的牛肉粉本身就是粉状物， 所以 不必再进行粉碎） ， 将火锅调料中的固体物质进行粉碎处理 ； 步骤二 ： 称取， 于下端封闭的透析袋中， 称取一定量的待测样品 ； 步骤三 ： 透析， 在装有样品的透析袋中， 加入氢氧化钠水溶液， 然后将透析袋上端扎紧， 置于量筒中用水定容， 静置透析 ； 步骤四 ： 过滤。
18、， 取一定量的透析袋外的液体， 调节 pH 值至酸性， 用水定容， 然后用微孔 滤膜过滤， 取滤液进行高效液相色谱的检测。 0021 进一步说明 ： 本实例采用截留分子量为 6000-8000 道尔顿的透析袋。采用直径为 36mm的透析袋， 采用孔径为0.45um的微孔滤膜。 采用pH=10的氢氧化钠水溶液， 步骤四中调 节 pH 值至 3。步骤三中静置透析 16h。步骤二中称取 10g 的待测样品 ； 步骤三中加入 10ml 氢氧化钠水溶液， 并定容至 80mL ； 步骤四中取 40ml 透析袋外的液体， 并定容至 50mL。 0022 观察到经过步骤三静置透析后， 原来浅色的芝麻酱样品在透。
19、析袋内溶解为乳白色 的悬浮液， 透析袋外为白色溶液 ； 原来含有固体的油状火锅调料在透析袋内溶解为含有固 体的红色溶液， 透析袋外为红色溶液 ； 原来红色的牛肉粉在透析袋内溶解为红色的悬浮液， 透析袋外为红色溶液。 0023 进一步采用本方法进行高效液相色谱检测， 打进色谱柱内的样品， 都是透明均一 的液体， 都能够通过色谱柱， 最后排出色谱柱， 防止了对色谱柱的污染， 因此色谱柱能够进 行 9000 10000 次检测， 其使用寿命为 32 35 个月。 0024 通过添加回收试验测得回收率如下表 1 所示。 0025 表 1 回收率苯甲酸 山梨酸 糖精钠 说 明 书 CN 10334472。
20、3 A 5 4/5 页 6 芝麻酱85%86%90% 火锅调料90%92%93% 牛肉粉90%82%92% 对比例 1 依据 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱 法 ， 采用亚铁氰化钾和乙酸锌结合沉淀蛋白的方法， 分别对芝麻酱、 火锅调料和牛肉粉进 行苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的高效液相色谱的检测前处理， 并进行高效液相色谱的检测和 添加回收试验。 0026 具体的前处理方法为芝麻酱和牛肉粉均直接取用， 将火锅调料中的固体物质进行 粉碎处理， 然后分别称取样品3g与小烧杯中， 用20mL水分数次清洗小烧杯将样品移入25mL 容量瓶中， 超声振荡提取。
21、 5min， 取出后加 2mL 亚铁氰化钾溶液， 摇匀， 再加入 2mL 乙酸锌溶 液， 摇匀， 用水定容至刻度。移入离心管中， 4000r/min 离心 5min， 吸出上清液， 用 0.45um 的 微孔滤膜过滤。 0027 虽然是取上层清液进行过滤后检测， 但原来浅色的芝麻酱样品的检测进样仍然是 浑浊的乳白色液体 ； 原来含有固体的油状火锅调料样品的检测进样为红色半透明的溶液 ； 原来红色的牛肉粉样品的进样为红色的悬浮液。 0028 进一步采用本方法进行高效液相色谱检测， 打进色谱柱内的进样中不溶的物质中 的大部分停留在色谱柱中， 污染色谱柱 ； 小部分通过色谱柱， 造成对检测结果的干扰。
22、。因 此在其他使用条件、 维护方法与实施例相同的情况下， 采用本方法的色谱柱仅能够进行 3000 4000 次检测， 其使用寿命为 11 15 个月。 0029 通过添加回收试验测得回收率如下表 2 所示。 0030 表 2 回收率苯甲酸 山梨酸 糖精钠 芝麻酱84%87%108% 火锅调料86%85%105% 牛肉粉92%79%104% 对比例 2 依据 GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、 山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱 法 ， 采用提取、 萃取的方法， 分别对芝麻酱、 火锅调料和牛肉粉进行苯甲酸、 山梨酸和糖精 钠的高效液相色谱的检测前处理， 并进行高效液相色谱的检测和添加。
23、回收试验。 0031 具体的前处理方法为芝麻酱和牛肉粉均直接取用， 将火锅调料中的固体物质进行 粉碎处理， 然后分别称取样品 3g 于 50mL 具塞离心管中， 加入 10mL 正己烷， 用漩涡混合器使 其充分溶解， 4000r/min 离心 3min， 吸出正己烷提取液转移至 250mL 分液漏斗中， 在向 50mL 具塞离心管中加入 10mL 正己烷重复上述步骤， 合并正己烷提取液于 250mL 分液漏斗中。于 分液漏斗中加入 20mLpH4.4 乙酸盐缓冲溶液加塞后剧烈振摇分液漏斗约 30s， 静置分层后， 将水层转移至50mL容量瓶中， 再加入20mLpH4.4乙酸盐缓冲溶液， 重复上。
24、述步骤， 合并水层 并用乙酸盐缓冲溶液定容至刻度， 用 0.45um 的微孔滤膜过滤。 0032 此方法是用正己烷萃取去除样品中脂肪的方法， 此方法原理为采用两次液液萃取 的方法， 先用正已烷将苯甲酸等目标物及脂肪等提取至正已烷中， 然后用乙酸盐缓冲液将 苯甲酸等目标物反萃取至乙酸盐缓冲液中。 此方法两步萃取均不同程度的造成目标物的损 失， 回收率偏低。同时此方法对食品中蛋白质和糖类的干扰去除有限。还存在大分子物质 说 明 书 CN 103344723 A 6 5/5 页 7 的干扰。 0033 进一步采用本方法进行高效液相色谱检测， 打进色谱柱内的进样中不溶的物质中 的大部分停留在色谱柱中，。
25、 污染色谱柱 ； 小部分通过色谱柱， 造成对检测结果的干扰。因 此在其他使用条件、 维护方法与实施例相同的情况下， 采用本方法的色谱柱仅能够进行 3000 4000 次检测， 其使用寿命为 11 15 个月。 0034 通过添加回收试验测得回收率如下表所示 表 3 回收率苯甲酸 山梨酸 糖精钠 芝麻酱80%82%92% 火锅调料76%78%85% 牛肉粉89%86%106% 通过以上对比可知， 采用亚铁氰化钾和乙酸锌结合沉淀蛋白的方法， 以及提取、 萃取的 前处理方法， 都不能有效去除糖类、 淀粉等的干扰， 使得高效液相的检测的进样为浑浊的样 品， 这点可以从对比例 2 中的糖精钠的检测结果和。
26、对比例 3 中牛肉粉的糖精钠检测结果看 出， 因为这四项检测结果均大于 1， 可见是由于其他物质的存在， 干扰了检测结果。 0035 除上述四项检测结果外， 本发明的实施例方法与对比例 1 的检测方法， 得到的回 收率相差不大， 对比例的检测方法， 得到的回收率相对偏低， 而本发明的实施例在检测芝 麻酱中的苯甲酸、 火锅调料中的苯甲酸和山梨酸时的回收率高于对比例 1 和 2， 说明其不但 能够除去蛋白质、 淀粉、 多糖、 胶体、 颗粒杂质、 菌体等物质的干扰， 而且还能够有效的保留 目标物质， 使检测结果准确性高， 检测效果好。 0036 另外， 通过上述对实施例、 对比例 1 和 2 中对进样状态和色谱柱使用寿命的说明， 可知本发明提供的方法能够防止对检测色谱柱的污染， 延长色谱柱的使用寿命。 0037 同时， 本发明的方法还具有使用化学试剂少、 安全可靠、 降低检测成本、 操作简单 等特点， 所以综上所述本发明提供的前处理方法优于对比例。 0038 因为高效液相检测方法对进样的要求较高， 本发明的方法适用于高效液相检测， 自然也适用于其他检测方法的前处理。 说 明 书 CN 103344723 A 7 。