说明书N-取代的二(氟烷基)-1,4-苯并二氮杂*酮化合物
技术领域
本发明大体涉及适用作Notch抑制剂的苯并二氮杂酮化合物。本发明进一步涉及药物组合物，其包含至少一种本发明化合物，适用于治疗与Notch路径有关的病症，诸如癌症和其它增殖性疾病。
背景技术
Notch信号传导牵涉在多个细胞过程中，诸如细胞命运特异化(cell fate specification)、分化、增殖、细胞凋亡和血管生成。(Bray,Nature Reviews Molecular Cell Biology,7:678-689(2006)；Fortini,Developmental Cell16:633-647(2009))。Notch蛋白为单次杂二聚跨膜分子。Notch家族包括4种受体，即Notch1至4，其在结合至DSL家族(Delta-样1、3、4和Jagged 1和2)的配体后活化。
Notch的活化和成熟需要一系列加工步骤，包括由γ分泌酶介导的蛋白水解裂解步骤，γ分泌酶为含有早老素1(Presenilin 1)或早老素2(Presenilin2)、呆蛋白(nicastrin)、APH1和PEN2的多蛋白复合物。在Notch裂解后，Notch细胞内结构域(NICD)自膜释放。释放的NICD移位至核中，在核中其与CSL家族成员(RBPSUH、“无毛抑制子(suppressor of hairless)”和LAG1)协力充当转录活化因子。Notch靶标基因包括HES家族成员，诸如HES-1。HES-1充当诸如HERP1(也称为HEY2)、HERP2(也称为HEY1)和HATH1(也称为ATOH1)的基因的转录抑制因子。
Notch路径异常活化会导致肿瘤形成。Notch信号传导活化牵涉在各种实体肿瘤(包括卵巢癌、胰腺癌以及乳腺癌)和血液肿瘤(诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的发病机理中。Notch抑制的作用和其在治疗各种实体和血液肿瘤中的效用描述于Miele,L.等人，Current Cancer Drug Targets,6:313-323(2006)；Bolos,V.等人，Endocrine Reviews,28:339-363(2007)；Shih,I.-M.等人，Cancer Research,67:1879-1882(2007)；Yamaguchi,N.等人，Cancer Research,68:1881-1888(2008)；Miele,L.,Expert Review Anti-cancer Therapy, 8:1197-1201(2008)；Purow,B.,Current Pharmaceutical Biotechnology,10:154-160(2009)；Nefedova,Y.等人，Drug Resistance Updates,11:210-218(2008)；Dufraine,J.等人，Oncogene,27:5132-5137(2008)；和Jun,H.T.等人，Drug Development Research,69:319-328(2008)中。
仍需要适用作Notch抑制剂且具有足够代谢稳定性以提供有效水平的药物暴露的化合物。此外，仍需要适用作Notch抑制剂且可口服或静脉内给予患者的化合物。
美国专利7,053,084B1披露适用于治疗神经障碍(诸如阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease))的丁二酰氨基苯并二氮杂化合物。所述参考文献披露，这些丁二酰氨基苯并二氮杂化合物抑制γ分泌酶活性和与类淀粉蛋白的神经沉积物形成有关的类淀粉前体蛋白的加工。
本发明申请人已发现具有作为Notch抑制剂的活性且在静脉内给药或口服给药后具有足够代谢稳定性以提供有效量的药物暴露的有效化合物。提供这些化合物以适用作具有对可用药性而言重要的合乎需要的稳定性、生物可用率、治疗指数和毒性值的药物。
发明内容
本发明通过提供适用作Notch信号传导路径的选择性抑制剂的二(氟烷基)1,4-苯并二氮杂酮化合物来满足上述需要。
本发明也提供药物组合物，其包含药学上可接受的载体；和至少一种式(I)化合物。
本发明也提供治疗与Notch受体的活性有关的疾病或障碍的方法，所述方法包含给予哺乳动物患者至少一种式(I)化合物。
本发明也提供制备式(I)化合物的方法和中间体。
本发明也提供用于疗法中的式(I)化合物。
本发明也提供式(I)化合物在制备用于治疗癌症的药物的用途。
式(I)化合物和包含这种化合物的组合物为Notch抑制剂，其可用于治疗、预防或治愈各种Notch受体相关病症。包含这些化合物的药物组合物适用于治疗、预防或减缓多种治疗领域中的疾病或障碍(诸如癌症)的进展。
本发明的这些和其它特征将随着披露内容继续而以展开形式阐述。
具体实施方式
本发明的第一方面提供了至少一种式(I)的化合物或其前药：
其中：
R1为-CH2CF2CH3或-CH2CH2CF3；
R2为-CH2CH2CF3、-CH2CH2CH2CF3或-CH2CF2CH3；
R3为-CH2CF3、-CH2CN、-CH2(环丙基)、吡啶基、氯吡啶基或四氢吡喃基；
环A为苯基或吡啶基；
各Ra独立地为F、Cl、Br、-CN、-OH、-CH3、环丙基、-CF3、-CH2CF3、-OCH3、-OCF3和/或-O(环丙基)；
或两个相邻的Ra与它们连接的碳原子一起形成二氧杂戊环；
各Rb独立地为F、Cl、-CH3、-CF3、-CN和/或-OCH3；
y为0、1或2；且
z为0、1或2。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R1为-CH2CF2CH3且R2、R3、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R1为-CH2CH2CF3且R2、R3、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R2为-CH2CH2CF3且R1、R3、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且R1为-CH2CH2CF3的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R2为-CH2CH2CH2CF3且R1、R3、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中 环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且R1为-CH2CH2CF3的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R2为-CH2CF2CH3且R1、R3、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且R1为-CH2CH2CF3的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R3为-CH2CF3、-CH2CN、-CH2(环丙基)；且R1、R2、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且R1为-CH2CH2CF3的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中R3为吡啶基、氯吡啶基或四氢吡喃基；且R1、R2、环A、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的式(I)化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且R1为-CH2CH2CF3的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中环A为苯基，其具有式(II)的结构：
且其中R1、R2、R3、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中：环A为吡啶基；且R1、R2、R3、Ra、Rb、y和z如第一方面所定义。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中：环A为苯基，Ra为F、Cl、-CN、-CH3、环丙基、-CF3、-OCH3、-OCF3和/或-O(环丙基)；或两个相邻的Ra与它们连接的碳原子一起形成二氧杂戊环；Rb独立地为F、Cl、-CH3、-CF3、-CN和/或-OCH3；y为0或1；z为0或1；且R1、R2和R3如第一方面所定义。其中Ra为-OCH3；Rb为-OCH3，y为0或1；且z为0或1的化合物包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中：y为0或2；z为0或1；且R1、R2、R3、环A、Ra和Rb如第一方面所定义。其中环A为苯基的化合物包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了至少一种式(I)的化合物，其中：Ra为-OCH3或两个相邻的Ra与它们连接的碳原子一起形成二氧杂戊环；Rb为-OCH3；y为0、1或2；z为0或1；且R1、R2、R3和环A如第一方面所定义。
一个实施方案提供了至少一种具有以下结构的式(I)化合物
其中R1、R2、R3、环A、Rb和z如第一方面所定义。其中环A为苯基的化合物包括在该实施方案中。其中环A为苯基且z为0或1的化合物也包括在该实施方案中。
一个实施方案提供了选自以下的式(I)化合物：(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(4,4,4-三氟丁基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(1)；(2R,3S)-N-((3S)-1-(5-氯-吡啶-2-基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(2)；(2R,3S)-N-((7S)-6-氧代-9-苯基-5-(吡啶-2-基)-6,7-二氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-h][1,4]苯并二氮杂-7-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(3)；(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(4,4,4-三氟丁基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(4)；(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(5)；(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(6)；(2R,3S)-N-((3S)-7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-1-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(7)；(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(2,2-二氟丙基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺 (8)；和(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2-(2,2-二氟丙基)-3-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺(9)。
一个实施方案提供了至少一种式(I)化合物，其代谢半衰期至少为45分钟，如本申请所述的人代谢稳定性半衰期分析中所测量。
一个实施方案提供了至少一种式(I)化合物，其代谢半衰期至少为60分钟，如本申请所述的人代谢稳定性半衰期分析中所测量。
本发明可在不背离本发明的精神或基本特性下以其它特定形式体现。本发明涵盖本申请所述的本发明的方面和/或实施方案的所有组合。应了解，本发明的任何和所有实施方案可连同任何其它实施方案一起来描述其它实施方案。也应了解，实施方案的各个别要素意欲与任何实施方案的任何和所有其它要素组合以描述其它实施方案。
定义
本发明的特征和优势可由本领域技术人员在阅读以下详细描述后更容易地了解。应了解，出于清楚原因上文和下文在各个实施方案的情况下描述的本发明的某些特征也可组合形成单一实施方案。反之，出于简洁原因在单一实施方案的情况下描述的本发明的各种特征也可组合形成其子组合。本申请确定为示例性或优选的实施方案意欲具说明性而非具限制性。
除非本申请另外特定说明，否则以单数形式提及也可包括复数。举例而言，“一(a)”和“一(an)”可指一个或一种一或多个或种。
除非另外指示，否则任何具有不饱和价数的杂原子被认为具有足以满足这种价数的氢原子。
本申请所阐述的定义优先于以引用方式并入本申请中的任何专利、专利申请和/或专利申请公开中所阐述的定义。
用于描述本发明的各种术语的定义列于下文中。当术语在整篇说明书(除非其在特定情况下另外限制)中个别地或作为较大团体的一部分使用时，这些定义均适用于这种术语。
在整篇说明书中，基团和其取代基可由本领域技术人员选择以提供稳定的部分和化合物。
本申请所用的术语“卤代”和“卤素”指F、Cl、Br或I。
本申请所用的术语“烷基”指含有例如1至12个碳原子、1至6个碳原子 和1至4个碳原子的支链的与直链的饱和脂族烃基。烷基的实施例包括(但不限于)甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)和戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、2-乙基丁基、3-甲基戊基和4-甲基戊基。当数字在符号“C”后以下标形式出现时，所述下标更特定地定义特定基团可含有的碳原子数目。举例而言，“C1-6烷基”表示具有一至六个碳原子的直链的和支链的烷基。
词组“药学上可接受”在本申请中用于指在正确医学判断范畴内适用于与人类和动物组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症且与合理效益/风险比率相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
式(I)化合物可以无定形固体或结晶固体形式提供。可使用冻干来提供呈固体状的式(I)化合物。
还应当理解式(I)化合物的溶剂化物(例如，水合物)也在本发明的范围内。术语“溶剂化物”意指式(I)化合物与一个或多个溶剂分子(无论是有机的还是无机的)的物理缔合。该物理缔合包括氢键。在一些情况中，该溶剂化物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子掺入至结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相溶剂化物和可分离的溶剂化物。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇合物、甲醇合物、异丙醇合物、乙腈溶剂化物和乙酸乙酯溶剂化物。溶剂化的方法是本领域已知的。
在本发明的范畴和精神内，任何可体内转化以提供生物活性剂(也即式(I)化合物)的化合物为前药。
各种前药形式在此项技术中为熟知的且描述于以下文献中：
a)Wermuth,C.G.等人，The Practice of Medicinal Chemistry，第31章，Academic Press(1996)；
b)Bundgaard,H.编，Design of Prodrugs,Elsevier(1985)；
c)Bundgaard,H.，第5章，“Design and Application of Prodrugs”,Krosgaard-Larsen,P.等人编，A Textbook of Drug Design and Development，第113-191页,Harwood Academic Publishers(1991)；和
d)Testa,B.等人，Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism,Wiley-VCH(2003)。
另外，式(I)化合物在制备之后可被分离和纯化，以获得含有等于或大于99重量％的量的式(I)化合物(“实质上纯”)的组合物，接着如本申请所述使用 或配制。这种“实质上纯”的式(I)化合物在本申请中也涵盖作为本发明的一部分。
“稳定化合物”和“稳定结构”意欲指示足够稳固而能够自反应混合物中分离出达适用纯度且能够配制成有效治疗剂的化合物。本发明意欲包含稳定化合物。
“治疗有效量”意欲包括有效充当Notch受体抑制剂或有效治疗或预防增殖性疾病(诸如癌症)的单独本发明化合物的量，或所主张的化合物组合的量，或与其它活性成分组合的本发明化合物的量。
本申请所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖治疗哺乳动物(尤其人类)的疾病状态，且包括：(a)预防哺乳动物出现疾病状态，尤其在所述哺乳动物易患所述疾病状态但尚未诊断为患有所述疾病状态时；(b)抑制疾病状态，也即阻止其发展；和/或(c)减轻疾病状态，也即使疾病状态消退。
本发明化合物意欲包括本发明化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。作为一般实例且非限制性地，氢的同位素包括氘(D)和氚(T)。碳的同位素包括13C和14C。通常，同位素标记的本发明化合物可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本申请所述的方法的方法，使用适当的同位素标记试剂替代否则使用的未经标记的试剂来制备。
式(I)化合物可通过任何适用于欲治疗的病症的方式给予，方式可视对部位特异性治疗的需要或欲递送的式(I)化合物的量而定。
本发明也涵盖一类药物组合物，其包含至少一种式(I)化合物；和一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或辅料(本申请统称作“载体”物质)和必要时选用的其它活性成分。式(I)化合物可通过任何适合途径，优选以适于所述途径的药物组合物形式且以有效用于预期治疗的剂量给予。本发明的化合物和组合物可以含有常规药学上可接受的载体、辅料和媒介物的剂量单位制剂形式，例如口服、经粘膜或肠胃外(包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌内和胸骨内)给予。举例而言，药物载体可含有甘露糖醇或乳糖和微晶纤维素的混合物。混合物可含有其它组分，诸如润滑剂，例如硬脂酸镁；和崩解剂，诸如交聚维酮(crospovidone)。载体混合物可填充至明胶胶囊中或压制成片剂。药物组合物可以例如口服剂型或输注剂形式给予。
对于口服给药，药物组合物可呈例如片剂、胶囊剂、液体胶囊剂、混悬 剂或液体形式。药物组合物优选以含有特定量的活性成分的剂量单位形式制成。举例而言，药物组合物可以包含约1mg至2000mg，优选约1mg至500mg，且更优选约5mg至150mg范围内的量的活性成分的片剂或胶囊剂形式提供。虽然适用于人类或其它哺乳动物的日剂量可视患者的病症和其它因素而广泛变化，但可使用常规方法确定。
本申请涵盖的任何药物组合物可例如经由任何可接受且适合的口服制剂来口服递送。示例性口服制剂包括(但不限于)例如片剂、糖衣锭(troches)、口含锭(lozenges)、水性和油性混悬剂、液体胶囊剂、可分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂和软胶囊剂、糖浆剂和酏剂。意欲口服给予的药物组合物可根据此项技术中已知用于制造意欲口服给予的药物组合物的任何方法来制备。为提供药学上可口的制剂，本发明药物组合物可含有至少一种选自甜味剂、矫味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂。
片剂可例如通过混合至少一种式(I)化合物与至少一种适用于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂来制备。示例性赋形剂包括(但不限于)例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；粒化剂和崩解剂，诸如微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶、聚乙烯-吡咯烷酮和阿拉伯胶(acacia)；和润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。另外，片剂可无包衣，或通过已知技术包覆包衣以掩蔽味道令人不悦的药物的不良味道，或延迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，从而使活性成分的作用持续较长时段。示例性水溶性味觉掩蔽物质包括(但不限于)羟基丙基甲基纤维素和羟基丙基纤维素。示例性时间延迟物质包括(但不限于)乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊剂可例如通过混合至少一种式(I)化合物与至少一种惰性固体稀释剂(诸如碳酸钙；磷酸钙；和高岭土(kaolin))来制备。
软明胶胶囊剂可例如通过混合至少一种式(I)化合物与至少一种水溶性载体(诸如聚乙二醇)；和至少一种油介质(诸如花生油、液体石蜡和橄榄油)来制备。
水性混悬剂可例如通过混合至少一种式(I)化合物与至少一种适用于制造水性混悬剂的赋形剂来制备。适用于制造水性混悬剂的示例性赋形剂包括(但不限于)例如助悬剂，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂 或湿润剂，诸如天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，诸如聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，诸如十七亚乙基-氧基十六醇；环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；和环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，诸如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂也可含有至少一种防腐剂，诸如对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种矫味剂；和/或至少一种甜味剂，包括(但不限于)例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜(aspartame)。
油性混悬剂可例如通过将至少一种式(I)化合物悬浮于植物油(诸如花生油；橄榄油；芝麻油；和椰子油)；或矿物油(诸如液体石蜡)中来制备。油性混悬剂也可含有至少一种增稠剂，诸如蜂蜡；硬石蜡；和十六醇。为提供可口的油性混悬剂，可将至少一种上文已描述的甜味剂和/或至少一种矫味剂添加至油性混悬剂中。油性混悬剂可进一步含有至少一种防腐剂，包括(但不限于)例如抗氧化剂，诸如丁基化羟基苯甲醚和α-生育酚。
可分散性散剂和颗粒剂可例如通过混合至少一种式(I)化合物与至少一种分散剂和/或湿润剂；至少一种助悬剂；和/或至少一种防腐剂来制备。适合的分散剂、湿润剂和助悬剂如上文已描述。示例性防腐剂包括(但不限于)例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。另外，可分散性散剂和颗粒剂也可含有至少一种赋形剂，包括(但不限于)例如甜味剂；矫味剂；和着色剂。
至少一种式(I)化合物的乳剂可例如制备成水包油乳剂。包含式(I)化合物的乳剂的油相可由已知成分以已知方式构成。油相可由(但不限于)例如植物油(诸如橄榄油和花生油)；矿物油(诸如液体石蜡)；和其混合物提供。虽然所述相可仅包含乳化剂，但其可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。适合的乳化剂包括(但不限于)例如天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。优选地，亲水性乳化剂连同用作稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在内。也优选包括油和脂肪两者。具有或不具有稳定剂的乳化剂一起组成所谓乳化蜡，且所述蜡与油和脂肪一起组成所谓乳化软膏基质，所述乳化软膏基质形成乳膏剂制剂的油性分散相。乳剂也可含有甜味剂、矫味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适用于本发明制剂中的乳化剂和乳剂稳定剂包括吐温(Tween)60、斯 潘(Span)80、十六醇十八醇混合物(cetostearyl alcohol)、十四烷醇、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、单独或与蜡一起的二硬脂酸甘油酯，或此项技术中熟知的其它物质。
式(I)化合物也可例如经由任何药学上可接受且适合的可注射形式静脉内、皮下和/或肌内递送。示例性可注射形式包括(但不限于)例如包含可接受的媒介物和溶剂(诸如水、林格溶液(Ringer's solution)和等张氯化钠溶液)的无菌水溶液；无菌水包油微乳剂；和水性或油性混悬剂。
用于肠胃外给予的制剂可为水性或非水性等张无菌注射溶液剂或混悬剂的形式。这种溶液剂和混悬剂可使用所提及的用于口服给予的制剂的一种或多种载体或稀释剂或通过使用其它适合的分散剂或湿润剂和助悬剂由无菌粉末或颗粒制备。这种化合物可溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、氯化钠、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它辅料和给药方式在医药技术中为广泛熟知的。活性成分也可以作为含适合载体(包括盐水、右旋糖或水)或含环糊精(也即)、共溶剂溶解(也即丙二醇)或胶束溶解(也即吐温80)的组合物形式通过注射给予。
无菌可注射制剂也可为于无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如于1,3-丁二醇中的溶液剂。可使用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格溶液和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油惯常用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，在可注射剂制备中可使用脂肪酸，诸如油酸。
无菌可注射水包油微乳剂可例如通过以下来制备：1)将至少一种式(I)化合物溶解于油相(诸如大豆油与卵磷脂的混合物)中；2)组合含有式(I)的油相与水和甘油混合物；和3)加工所述组合，形成微乳剂。
无菌水性或油性混悬剂可根据此项技术早已已知的方法来制备。举例而言，无菌水溶液剂或混悬剂可用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂来制备，诸如1,3-丁二醇；且无菌油性混悬剂可用无菌无毒可接受的溶剂或悬浮介质来制备，诸如无菌不挥发性油，例如合成单酸甘油酯或二酸甘油酯；和脂肪酸，诸如油酸。
可用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体、辅料和媒介物包括(但不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂；自乳化药物递送系统 (SEDDS)，诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯；用于药物剂型中的表面活性剂，诸如吐温、聚乙氧基蓖麻油，诸如表面活性剂(BASF)，或其它类似聚合递送基质；血清蛋白，诸如人血清白蛋白；缓冲物质，诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精(诸如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精)或经化学修饰的衍生物(诸如羟基烷基环糊精，包括2-羟基丙基-环糊精和3-羟基丙基-环糊精)或其它溶解的衍生物也宜用于增强本申请所述式的化合物的递送。
本发明的药物活性化合物可根据常规药学方法加工以产生用于向患者(包括人类和其它哺乳动物)给予的医药药剂。药物组合物可经受常规医药操作(诸如杀菌)和/或可含有常规辅料，诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。片剂和丸剂可另外用肠溶包衣制备。这些组合物也可包含辅料，诸如湿润剂、甜味剂、矫味剂和香化剂。
所给予的化合物的量和以本发明的化合物和/或组合物治疗疾病病症的给药方案视多种因素而定，包括个体的年龄、体重、性别、医学病症、疾病类型、疾病严重度、给药途径和频率和所采用的特定化合物。因此，给药方案可广泛不同，但可常规地使用标准方法来确定。每公斤体重约0.001mg至100mg，优选每公斤体重约0.005mg至约50mg和最优选每公斤体重约0.01mg至10mg的日剂量可为适当的。日剂量可以每天一至四次给药给予。
为达治疗目的，通常将本发明的活性化合物与适用于所示给药途径的一种或多种辅料组合。若口服给予，则可将化合物与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，接着制成片剂或胶囊剂以方便给予。这些胶囊剂或片剂可含有控制释放制剂，如可以活性化合物于羟基丙基甲基纤维素中的分散液的形式提供。
本发明的药物组合物包含式(I)化合物和视情况选用的其它选自任何药学上可接受的载体、辅料和媒介物的试剂。本发明的替代组合物包含本申请 所述的式(I)化合物和药学上可接受的载体、辅料或媒介物。
效用
式(I)化合物适用于治疗癌症，例如依赖于Notch活化的癌症。Notch活化牵涉在各种实体肿瘤(包括卵巢癌、胰腺癌以及乳腺癌)和血液肿瘤(诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的发病机理中。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予式(I)化合物。此实施方案的方法可用于治疗多种癌症，包括(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、纤维肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和间皮瘤。举例而言，此实施方案的方法用于治疗乳腺癌、结肠癌或胰腺癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为结肠直肠癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为三阴性乳腺癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为非小细胞肺癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为胰腺癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实 施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为卵巢癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物，其中所述癌症为黑色素瘤。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。本实施方案中的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在一个实施方案中，提供式至少一种(I)化合物的用途，其用于制造用于治疗癌症的药物。优选地，在本实施方案中，进行治疗的癌症包括膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、纤维肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和间皮瘤中的一种或多种。本实施方案的适合的药物包括用于肠胃外给予的药物，诸如溶液剂和混悬剂；和用于口服给予的药物，诸如片剂、胶囊剂、溶液剂和混悬剂。
一个实施方案提供用于治疗癌症的疗法中的至少一种式(I)化合物。在本实施方案中，进行治疗的癌症包括膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、纤维肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和间皮瘤中的一种或多种。
在一个实施方案中，提供治疗哺乳动物的癌症的方法，其中所述癌症依赖于Notch活化，所述方法包含给予所述患者至少一种式(I)化合物。此实施方案的方法可用于治疗多种癌症，包括(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、纤维肉瘤、胶质母细胞瘤/星形细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)和间皮瘤。优选地， 此实施方案的方法用于治疗乳腺癌、结肠癌或胰腺癌。优选地，哺乳动物为人类。举例而言，可在本实施方案的方法中给予治疗癌症的治疗有效量。适合的给药途径包括肠胃外给予和口服给予。
在治疗癌症中，化学治疗剂和/或其它治疗(例如放射疗法)的组合常有利。第二(或第三)药剂的作用机理可与第一治疗剂相同或不同。举例而言，可使用药物组合，其中所给予的两种或两种以上药物以不同方式或在细胞周期的不同阶段中起作用，和/或其中两种或两种以上药物具有不重叠的毒性或副作用，和/或其中所组合的药物各自在治疗由患者表现的特定疾病状态方面具有证实的功效。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；和给予一种或多种其它抗癌剂。
词组“其它抗癌剂”指选自以下任意一种或多种的药物：烷基化剂(包括氮芥(nitrogen mustard)、烷基磺酸盐、亚硝基脲、亚乙基亚胺衍生物和三氮烯)；抗血管生成剂(包括基质金属蛋白酶抑制剂)；抗代谢物(包括腺苷脱胺酶抑制剂、叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物)；抗生素或抗体(包括单株抗体、CTLA-4抗体、蒽环霉素(anthracycline))；芳香酶抑制剂；细胞周期反应调节剂；酶；法呢基蛋白质转移酶抑制剂(farnesyl-protein transferase inhibitor)；激素和抗激素剂和类固醇(包括合成类似物、糖皮质激素、雌激素/抗雌激素[例如SERM]、雄激素/抗雄激素、孕酮、孕酮受体激动剂和促黄体素释放[LHRH]激动剂和拮抗剂)；胰岛素样生长因子(IGF)/胰岛素样生长因子受体(IGFR)系统调节剂(包括IGFR1抑制剂)；整合素信号传导抑制剂；激酶抑制剂(包括多激酶抑制剂和/或Src激酶或Src/abl抑制剂、细胞周期素依赖性激酶[CDK]抑制剂、panHer、Her-1和Her-2抗体、VEGF抑制剂(包括抗VEGF抗体)、EGFR抑制剂、有丝分裂原活化蛋白[MAP]抑制剂、MET抑制剂、MEK抑制剂、极光激酶(Aurora kinase)抑制剂、PDGF抑制剂和其它酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；微管破裂剂，诸如海鞘素或其类似物和衍生物；微管稳定剂，诸如紫杉烷(taxane)和天然存在的埃坡霉素(epothilone)以及其合成和半合成类似物；微管结合、去稳定剂(包括长春花生物碱)；拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白质转移酶抑制剂；铂配位络合物；信号转导抑制剂；和其它用作抗癌剂和细胞毒性剂的药剂，诸如生物反应调节物、生长因子和免疫调节剂。
因此，本发明化合物可与其它适用于治疗癌症或其它增殖性疾病的抗癌治疗组合给予。本发明在本申请中进一步包含式至少一种(I)化合物的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物，和/或本发明包含本申请中的式(I)化合物连同关于所述化合物与其它抗癌剂或细胞毒性剂和用于治疗癌症的治疗组合使用的说明书一起的封装。本发明进一步包含至少一种式(I)化合物与一种或多种其它药剂的呈试剂盒形式的组合，例如其中将它们封装在一起或置放于各个封装中以便一起以试剂盒形式出售，或其中将它们封装以一起配制。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；给予达沙替尼(dasatinib)；和视情况给予一种或多种其它抗癌剂。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；给予紫杉醇(paclitaxel)；和视情况给予一种或多种其它抗癌剂。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；给予他莫西芬(Tamoxifen)；和视情况给予一种或多种其它抗癌剂。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；给予糖皮质激素；和视情况给予一种或多种其它抗癌剂。合适的糖皮质激素实例为地塞米松(dexamethasone)。
在一个实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括为有需要的哺乳动物给予至少一种式(I)化合物；给予卡铂(carboplatin)；和视情况给予一种或多种其它抗癌剂。
本发明化合物可与针对与上述病症有关的副作用的特定适用性而选用的其它治疗剂一起配制或共给予。举例而言，本发明化合物可与防止恶心、过敏和胃刺激的药剂一起配制，诸如止吐药和H1和H2抗组织胺剂。
在一个实施方案中，提供药物组合物，其包含至少一种式(I)化合物；一种或多种选自以下的其它药剂：激酶抑制剂(小分子、多肽和抗体)、免疫抑制剂、抗癌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗真菌剂、抗生素或抗血管过度增殖化合物；和任何药学上可接受的载体、辅料或媒介物。
上述其它治疗剂在与本发明化合物组合使用时，可例如依医师参考手册(Physicians'Desk Reference，PDR)中所指示，或如由本领域技术人员以其它 方式所确定的量使用。在本发明方法中，可在给予本发明化合物之前、同时或之后给予所述其它治疗剂。
然而，用于任何特定个体的特定剂量和给药频率可不同且一般视多种因素而定，包括(但不限于)例如所给予形式的特定式(I)化合物的生物可用率、特定式(I)化合物的代谢稳定性和作用时间、个体的物种、体重、一般健康、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速率、药物组合和特定病症的严重度。举例而言，每公斤体重约0.001mg至100mg，优选每公斤体重约0.005mg至约50mg和最优选每公斤体重约0.01mg至10mg的日剂量可为适当的。日剂量可以每天一至四次给药给予。
给药可为连续的(也即每日给予)或间歇进行。本申请所用的术语“间歇的”或“间歇地”意思是以有规则时间间隔或无规则时间间隔停止和开始。举例而言，间歇给药包括每周给药1至6天；以循环形式给药(例如连续2至8周每日给药，然后是至多一周不给药的中止期)；或隔日给药。
在一个实施方案中，每天一次或多次连续地将至少一种式(I)化合物给予有需要的患者。举例而言，每天一次或多次给予有需要的患者治疗有效量的式(I)化合物并维持连续数天。
在一个实施方案中，每天一次或多次间歇地将至少一种式(I)化合物给予有需要的患者。举例而言，根据间歇方案每天一次或多次给予有需要的患者治疗有效量的式(I)化合物。
在一个实施方案中，每天一次或多次将至少一种式(I)化合物给予有需要的患者并维持连续数天，继而一天或多天不给药。优选地，给予治疗有效量的式(I)化合物。具有药物间歇期的连续给药的实例为以下循环：治疗7天，继而7天不治疗；治疗14天，继而7天不治疗；和治疗7天，继而14天不治疗。治疗/不治疗的循环可根据治疗患者的需要重复多次。
在一个实施方案中，根据间歇给药方案，给予有需要的患者至少一种式(I)化合物。间歇给药方案为重复方案，其包括给予患者式(I)化合物数天以及不给予患者式(I)化合物数天。间歇给药方案的实例为：每周给药四天并维持连续三周，继而一周不给药，且按四周时间间隔重复；每周给药五天并维持连续两周，继而一周不给药，且按三周时间间隔重复；和每周给药四天并维持一周，继而两周不给药，且按三周时间间隔重复。优选地，给予治疗有效量的式(I)化合物。
在一个实施方案中，在某一天给予至少一种式(I)化合物，继而中止6天，且按每周方案重复。
在一个实施方案中，在某一天给药至少一种式(I)化合物，继而中止6天，且按每周方案重复1至4周，然后继续一周或中止。例如，在某一天给药(I)化合物，继而中止6天，持续三周，然后中止一周。所述四周循环可重复一次或多次。
在一个实施方案中，连续两天给予至少一种式(I)化合物，继而中止5天，且按每周方案重复。
在一个实施方案中，连续三天给予至少一种式(I)化合物，继而中止四天，且按每周方案重复。
在一个实施方案中，在某一天给予至少一种式(I)化合物，继而中止10至13天。
在一个实施方案中，每天一次(QD)给药至少一种式(I)化合物。该实施方案包括一天一次口服给药。
在一个实施方案中，每天两次(BID)给药至少一种式(I)化合物。该实施方案包括每天两次口服给药。
在一个实施方案中，隔日给药至少一种式(I)化合物：给药一天然后中止一天。该两天循环可重复一次或多次。
制备方法
可以有机合成领域技术人员熟知的多种方式制备本发明化合物。本发明化合物可使用下文所述的方法，以及合成有机化学的技术中已知的合成方法，或如本领域技术人员所了解的其变体来合成。优选方法包括(但不限于)下文所述的方法。本申请引用的所有参考文献以全文引用的方式并入本申请中。
本发明的化合物可使用本章节所述的反应和技术来制备。反应是在适于所采用的试剂和物质的溶剂中进行且适于所达成的转化。同样，在下文所述的对合成方法的描述中，应了解所有建议的反应条件，包括溶剂的选择、反应氛围、反应温度、实验持续时间和处理操作是选择为所述反应的标准条件，其应由本领域技术人员轻易地识别。有机合成领域技术人员应了解，存在于分子的各种部分上的官能团应与所建议的试剂和反应相容。这种对与反应条 件相容的取代基的限制对本领域技术人员而言应显而易见，且因而应使用替代方法。这有时需要判断修改合成步骤顺序或选择一个特定方法方案而非另一个以获得所需的本发明化合物。也应了解，此领域中设计任一合成途径的另一主要考虑事项为正确选择用于保护本发明中所述化合物中存在的反应性官能团的保护基。向经专门训练的专业人员描述许多替代方案的权威性说明为Greene等人(Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley and Sons(1999))。
可通过参考以下方案中所说明的方法来制备式(I)化合物。如其中所示，最终产物为与式(I)具有相同结构式的化合物。应了解，任何式(I)化合物均可由这种方案通过适当选择具有适当取代的试剂来制备。溶剂、温度、压力和其它反应条件可由本领域技术人员轻易地选择。起始物质为市售的或由本领域技术人员轻易地制备。化合物的组分如此处或说明书中别处所定义。
可使用方案1至4中所概述的方法来合成式(I)化合物。
方案1
可以本领域技术人员所知的多种方法来制备苯并二氮杂酮(iv)。举例而言，如方案1所示，可根据文献中所概述的操作(例如Sherrill,R.G.等人，J.Org.Chem.,60:730(1995)；或本领域技术人员所知的其它途径)使经适当取代的2-氨基二苯酮(i)(例如来自Walsh,D.A.,Synthesis,677(1980)；和其中引用的参考文献，或本领域技术人员所知的其它方法)偶合至经保护的甘氨酸衍生物(ii)(PG＝保护基，例如PG＝CBz，参见Katritzky,A.R.et al,J.Org.Chem., 55:2206-2214(1990))，用诸如氨的试剂处理，且进行环化，得到苯并二氮杂酮(iii)。所得外消旋混合物可分离(使用本领域技术人员所知的操作)，得到各个对映异构体，或以外消旋物形式使用。而且，如果R3为H，则(iii)可以例如在溶剂如DMF中在碱如K2CO3或Cs2CO3存在下经芳基或烷基卤化物处理，得到其它R3取代。
步骤2：可以本领域技术人员所知的若干方式来脱除(iii)的保护基。举例而言，在PG＝CBz的情况下，可用诸如HBr的试剂在诸如AcOH的溶剂中处理化合物(iii)。化合物(iv)可以外消旋物形式使用。或者，可使用标准方法(例如手性制备性色谱)对化合物(iv)进行对映异构拆分。
方案2
可通过方案2所列的合成顺序制备化合物(xii)。
步骤1：可以本领域技术人员已知的多种方法将酸(v)转化为化合物(vii)。例如，将酸(v)在溶剂如DCM中用试剂如草酰氯处理，得到酰氯(vi)。化合物(vi)可在标准条件下经噁唑烷酮(a)处理，得到化合物(vii)(Evans,D.A.et al.,J.Am.Chem.Soc.,112:4011(1990))。
步骤2：方案2的第二步可通过将化合物(vii)在低温如-78℃在惰性气氛下在溶剂如THF中用碱如二(三甲基硅烷基)氨基钠或二异丙基氨基锂处理实现。所得的烯醇化物(vii)经试剂如溴乙酸叔丁酯处理，得到化合物(viii，Ry＝叔丁基)。
步骤3：化合物(viii)转化为(ix)可通过将化合物(viii)在适当温度使用溶剂的混合物如THF/水经过氧化氢和氢氧化锂处理实现。
步骤4：化合物(ix)可通过以下操作转化为化合物(x)和化合物(xi)的混合物：将烯醇化物(ix)与碱如LDA在低温如-78℃在惰性气氛下在溶剂如THF中反应并进一步经携带有适当离去基(例如，LG＝三氟甲磺酸酯基)的试剂(R2-LG)处理。然后，所得非对映异构体的混合物(x/xi)可用于后续合成步骤中。
步骤5：或者，混合物(x/xi)可经受差向异构化条件，例如通过用LDA和二乙基氯化铝处理，随后用甲醇或乙酸淬灭以富集所需非对映异构体。然后，将所得的化合物(x/xi)的非对映异构体富集混合物可用于后续合成步骤中或者如果需要，可采用合适的条件如制备型HPLC、制备型手性HPLC或硅胶色谱将该非对映异构体混合物分离，且所得的纯的所需非对映异构体(xi)用于后续步骤中。
步骤6：或者，可通过例如在碱如K2CO3存在下在溶剂如DMF中用溴苄处理来保护非对映异构体酸(x)和(xi)的混合物。如果需要，可采用合适的条件如制备型HPLC、制备型手性HPLC或硅胶色谱将所得非对映异构体混合物分离，且所得的纯的所需非对映异构体(xii)用于后续步骤中。
步骤7：方案2的最后一步为脱保护步骤，且可以本领域技术人员已知的多种方法实现。例如，对于化合物(xii)中的Rw＝苄基，在氢气氛下在溶剂如MeOH中在氢化条件下使用催化剂如钯/碳处理可得到化合物(xi)，其可后续使用。
或者，化合物(xi)可根据方案3的步骤顺序制备。
方案3
步骤1：方案3的第一步通过以下操作实现：使用本领域技术人员所知的多种方式中的一种，诸如在诸如醚合三氟化硼的试剂的存在下，于适当温度，在诸如THF的溶剂中用经取代的亚酰亚氨酸酯如化合物(xiv)处理，使化合物(xiii)转化成酯(xv)。
步骤2：可以本领域技术人员所知的多种方式使酸(v)转化成化合物(vi)。举例而言，在诸如DCM的溶剂中用诸如草酰氯的试剂处理酸(v)，得到酰氯(vi,X＝Cl)。可在标准条件下用噁唑烷酮(a)处理化合物(vi)，得到化合物(vii)(Evans,D.A.等人，J.Am.Chem Soc.,112:4011(1990))。
步骤3：可以多种方式使化合物(vii)转化成非对映异构体的混合物(xvi)(Baran,P.等人，J.Am.Chem.Soc.,130(34):11546(2008))。举例而言，在 诸如甲苯的溶剂中，在诸如-78℃的低温，于诸如N2的惰性氛围下用诸如LDA的碱处理化合物(xv)。将所得混合物添加至在诸如N2的惰性氛围下于诸如甲苯的溶剂中用氯化锂和诸如LDA的碱处理的化合物(vii)的溶液中。在诸如-78℃的低温，于诸如N2的惰性氛围下向化合物(xv)和(vii)的烯醇化物的所得混合物中添加化合物二(2-乙基己酰氧基)铜，且升温至室温，得到化合物(xvi)。
步骤4：可通过在适当温度，使用诸如THF/水的溶剂混合物，用过氧化氢和氢氧化锂处理化合物(xvi)来使其转化成化合物(x)和化合物(xi)的混合物。然后，所得非对映异构体的混合物可用于后续合成步骤中。必要时，在此时可经由硅胶色谱或制备性HPLC分离非对映异构体。
步骤5：或者，混合物(x/xi)可经受差向异构化条件，例如通过用LDA和二乙基氯化铝处理，继而用甲醇或乙酸淬灭，以富集所要的非对映异构体。然后，所得的化合物的非对映异构体富集混合物可用于后续合成步骤中，或者如果需要，可采用合适的条件如制备型HPLC、制备型手性HPLC或硅胶色谱分离非对映异构体的混合物，且所得的纯的所需非对映异构体(xi)用于后续步骤中。
步骤6：或者，可通过例如在碱如K2CO3存在下在溶剂如DMF中用溴苄处理来保护非对映异构体酸(x)和(xi)的混合物。如果需要，可使用适合的条件如制备型HPLC、制备型手性HPLC或硅胶色谱分离所得的非对映异构体的混合物，且所得的纯的所需非对映异构体化合物(xii)用于后续步骤中。
步骤7：方案3的最后一步为脱保护步骤，且可以本领域技术人员已知的多种方法实现。例如，对于化合物(xii)中的Rw＝苄基，在氢气氛下在溶剂如MeOH中在氢化条件下使用催化剂如钯/碳处理可得到化合物(xi)，其可后续用于例如方案4的步骤1中。
方案4
步骤1：在适当的情况下，结构(iv)的化合物可在偶联试剂如TBTU和碱如TFA存在下，在溶剂如DMF中偶联至纯非对映异构体化合物(xi)或化合物的非对映异构体混合物(x/xi)以得到化合物(xiii)，为非对映异构体纯的化合物或非对映异构体的混合物，取决于配偶体的对映异构体纯度或非对映异构体纯度。该混合物可原样用于后续步骤，或者如果需要，可使用适当的分离技术如手性制备型色谱纯化，得到非对映异构体纯的化合物。
步骤2：将化合物(xiii)在适当的温度如0℃在溶剂如DCM中经酸如TFA处理，得到化合物(xiv)，为非对映异构体纯的化合物或非对映异构体混合物。该混合物可原样用于后续步骤，或者如果需要，可使用适当的分离技术如手性制备型色谱纯化，得到非对映异构体纯的化合物。
步骤3：化合物(xiv)转化为化合物(xv)可通过将化合物(xiv)在溶剂如DMF中与适当的胺源如氯化铵或氨、碳二亚胺如EDC、HOBT和碱如TEA偶联实现。如果需要，该非对映异构体混合物可使用适当的分离技术如手性制备型色谱分离。而且，如果R3为H，则(xv)可以例如在溶剂如DMF中在碱如K2CO3或Cs2CO3存在下经芳基或烷基卤化物处理，得到其它R3取代。
实施例
在以下实施例中进一步定义本发明。应理解的是，实施例仅以示例方式给出。从上述讨论和实施例，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，且在不背离本发明精神和范畴的情况下，可作出各种变化和修饰以使本发明适用于各种用途和情况。因而，本发明不受以下阐述的示例性实施例的限制，而是由所附的权利要求所限定。
缩写
ACN 乙腈
AcOH 乙酸
Bn 苄基
Boc 叔丁氧基羰基
CBz 苄基氧基羰基
DAST (二乙基氨基)三氟化硫
DCC 1,3-二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DEA 二乙胺
DIPEA 二异丙基乙胺
DME 甲醚
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐
Et2AlCl 二乙基氯化铝
Et3N 三乙胺
Et2O 乙醚
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
equiv. 当量
g 克
h或hr 小时
HOAc 乙酸
HOBT 羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
LCMS 液相色谱-质谱
LDA 二异丙基氨化锂
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
min 分钟
mL 毫升
mmol 毫摩尔
MTBE 甲基叔丁基醚
NaHMDS 二(三甲基甲硅烷基)氨化钠
n-BuLi 正丁基锂
NH4OAc 乙酸铵
NMM N-甲基吗啉
pyBOP 三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐
RT 保留时间
t-Bu 叔丁基
tBuOH 叔丁醇
TBTU 四氟硼酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
Tf2O 三氟甲磺酸酐
THF 四氢呋喃
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
中间体S-1A：三氟甲磺酸3,3,3-三氟丙基酯
历时3min向2,6-二甲基吡啶(18.38mL,158mmol)于DCM(120mL)中的冷的(-25℃)、搅拌的溶液中添加Tf2O(24.88mL,147mmol)，并将混合物搅拌5min。历时3min间隔向反应混合物中添加3,3,3-三氟丙-1-醇(12g,105mmol)。在2h后，将反应混合物温热至室温并搅拌1h。将反应混合物浓缩至其一半体积，然后通过直接上样至硅胶柱(330g ISCO)纯化并将产物用DCM洗脱，得到中间体S-1A(13.74g,53％)，为无色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.71(2H,t,J＝6.15Hz),2.49-2.86(2H,m)。
中间体S-1B：(4S)-4-苄基-3-(5,5,5-三氟戊酰基)-1,3-噁唑烷-2-酮
向5,5,5-三氟戊酸(14.76g,95mmol)和DMF(0.146mL)于DCM(50mL)中的搅拌溶液中缓慢添加草酰氯(8.27mL,95mmol)。在2h后，将混合物浓缩至干。将单独的烧瓶填充于THF(100mL)中的(S)-4-苄基噁唑烷-2-酮(16.75g,95mmol)，然后冷却至-78℃。历时10min向该溶液中缓慢添加n-BuLi(2.5M,37.8mL,95mmol)，搅拌10min，然后历时5min缓慢添加上述酰氯于THF(50mL)中的溶液。将混合物搅拌30min，然后温热至室温。将混合物用饱和NH4Cl水溶液淬灭，然后添加10％LiCl水溶液，并将混合物用Et2O萃取。将有机层先后用饱和NaHCO3和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩至干。将残余物通过SiO2色谱(ISCO,330g柱,用100％己烷至100％EtOAc梯度洗脱)纯化，得到产物中间体S-1B；(25.25g,85％):1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.32-7.39(2H,m),7.30(1H,d,J＝7.05Hz),7.18-7.25(2H,m),4.64-4.74(1H,m),4.17-4.27(2H,m),3.31(1H,dd,J＝13.35,3.27Hz),3.00-3.11(2H,m),2.79(1H,dd,J＝13.35,9.57Hz),2.16-2.28(2H,m),1.93-2.04(2H,m)。
中间体S-1C：(3R)-3-(((4S)-4-苄基-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基)羰基)-6,6,6-三氟己酸叔丁酯
在氮气氛下向中间体S-1B(3.03g,9.61mmol)于THF(20mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中添加NaHMDS(1.0M于THF中)(10.6mL,10.60mmol)。在2小时后，在-78℃经由注射器添加无溶剂(neat)的2-溴乙酸叔丁酯(5.62g,28.8mmol)，并在相同的温度维持搅拌。在6小时后，将反应混合物温热至室温。将反应混合物在饱和NH4Cl和EtOAc之间分配。将有机相分离，并将水相用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,5％至100％溶剂A/B＝己烷/EtOAc,SiO2120g)纯化。适当级份的浓缩，得到中间体S-1C(2.79g,67.6％)，为无色粘性油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.34(2H,d,J＝7.30Hz),7.24-7.32(3H,m),4.62-4.75(1H,m,J＝10.17,6.89,3.43,3.43Hz),4.15-4.25(3H,m),3.35(1H,dd,J＝13.60,3.27Hz),2.84(1H,dd,J＝16.62,9.57Hz),2.75(1H,dd,J＝13.35,10.07Hz),2.47(1H,dd,J＝16.62,4.78Hz),2.11-2.23(2H,m),1.90-2.02(1H,m),1.72-1.84(1H,m),1.44(9H,s)。
中间体S-1D：(2R)-2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-5,5,5-三氟戊酸
向中间体S-1C(2.17g,5.05mmol)于THF(50mL)和水(15mL)中的冷却的(0℃)、搅拌的溶液中添加LiOH(0.242g,10.11mmol)和H2O2(2.065mL,20.21mmol)于H2O(2mL)中的溶液。在10min后，将反应混合物从冰浴中移出，搅拌1h，然后再冷却至0℃。向反应混合物中添加饱和NaHCO3水溶液(25mL)和饱和Na2SO3水溶液(25mL)。将反应混合物搅拌10min，然后 部分地浓缩。将所得混合物用DCM(2x)萃取，用冰冷却并用浓盐酸使之呈酸性pH 3。将混合物用固体NaCl饱和，用EtOAc(3x)萃取，然后经MgSO4干燥，过滤并浓缩成无色油状物，得到中间体S-1D,1.2514g,92％):1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 2.83-2.95(1H,m),2.62-2.74(1H,m),2.45(1H,dd,J＝16.62,5.79Hz),2.15-2.27(2H,m),1.88-2.00(1H,m),1.75-1.88(1H,m),1.45(9H,s)。
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸，和
中间体S-1E：(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
历时7min向中间体S-1D(5g,18.50mmol)于THF(60mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中缓慢添加LDA(22.2mL,44.4mmol,2.0M)。在搅拌2h后，历时3min向反应混合物中添加中间体S-1A(6.38g,25.9mmol)。在60min后，将反应混合物温热至-25℃(冰/MeOH/干冰)并再搅拌60min，此时添加饱和NH4Cl水溶液。将分离的水相用1N HCl水溶液酸化至pH 3，然后用Et2O萃取，将合并的有机层用盐水(x2)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到中间体S-1和中间体S-1E的1:4(S1:S1E)混合物(6.00g,89％)(通过1H NMR测定)，为淡黄色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δppm 2.81(1H,ddd,J＝10.17,6.32,3.85Hz),2.63-2.76(1H,m),2.02-2.33(4H,m),1.86-1.99(2H,m),1.68-1.85(2H,m),1.47(9H,s)。
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸，和
中间体S-1E：(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
历时10min经由注射器向中间体S-1和中间体S-1E的混合物(5.97g,16.30mmol)于THF(91mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中滴加LDA(19mL,38.0mmol,2.0M于THF/己烷/乙苯)(内部温度从不超过-65℃，探针于反应溶液中)。将反应混合物搅拌15min，温热至室温(24℃水浴)，搅拌15min，并冷却至-78℃持续15min。经由注射器向反应混合物中添加Et2AlCl(41mL,41.0mmol,1M于己烷中)(内部温度从不超过-55℃)。将反应混合物搅拌10min，温热至室温(24℃水浴)持续15min，然后冷却至-78℃持续15min。同时，将1000mL圆底烧瓶填充MeOH(145mL)并预冷却至-78℃。在剧烈搅拌下，历时5min经由套管将反应混合物转移至MeOH中。将烧瓶从水浴移除，添加冰，然后缓慢添加1N HCl(147mL,147mmol)。随着添加HCl观测到气体逸出。将反应混合物温热至室温，在此过程中气体气体逸出消退。将反应混合物用EtOAc(750mL)稀释，用NaCl饱和，将有机相分离，用氟化钾(8.52g,147mmol)和1N HCl(41mL,41.0mmol)于水(291mL)中的溶液、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，然后真空干燥。1H NMR显示产物为中间体S-1和中间体S-1E的9:1混合物。获得中间体S-1和中间体S-1E的富集混合物(6.12g,>99％收率)，为深琥珀色固体：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 2.64-2.76(2H,m),2.04-2.35(4H,m),1.88-2.00(2H,m),1.71-1.83(2H,m),1.48(9H,s)。
制备中间体S-1的替代方法：
中间体S-1F:(2R,3S)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酸1-苄基·4-叔丁基酯
向中间体S-1和中间体S-1E的9:1富集混合物(5.98g,16.33mmol)于DMF(63ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(4.06g,29.4mmol)和溴苄(2.9ml,24.38mmol)。将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc(1000mL)稀释，用10％LiCl(3x200mL)、盐水(200mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，然后真空干燥。将残余物通过SiO2色谱使用甲苯:己烷梯度纯化。获得对映异构体纯的中间体S-1F(4.81g,65％)，为无色固体：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.32-7.43(m,5H),5.19(d,J＝12.10Hz,1H),5.15(d,J＝12.10Hz,1H),2.71(dt,J＝3.52,9.20Hz,1H),2.61(dt,J＝3.63,9.63Hz,1H),1.96-2.21(m,4H),1.69-1.96(m,3H),1.56-1.67(m,1H),1.45(s,9H)。
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
在H2压烧瓶中向中间体S-1F(4.81g,10.54mmol)于MeOH(100mL)中的溶液中添加10％钯/碳(润湿的,Degussa型,568.0mg,0.534mmol)。将容器用N2(4x)排气，然后用H2(2x)排气，然后加压至50psi并振荡过夜。将反应混合物减压并排气，将混合物通过过滤，用MeOH洗涤，然后浓缩并真空干燥。获得中间体S-1(3.81g,99％收率))，为无色固体：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ2.62-2.79(m,2H),2.02-2.40(m,4H),1.87-2.00(m,2H),1.67-1.84(m,2H),1.48(s,9H)。
制备中间体S-1的替代方法：
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
将中间体S-1与中间体S-1E的混合物以与上文中间体S-1D相同的操作制备得到中间体S-1和中间体S-1E的1:2.2混合物(8.60g,23.48mmol)，其使用LDA(2.0M于THF中的溶液,乙苯和庚烷,28.2mL,56.4mmol)和二乙基氯化铝(1.0M于己烷中的溶液,59mL,59.0mmol)在THF(91mL)中富集。在如上文所述的后处理后，发现所得残余物为中间体S-1和中间体S-1的13.2:1混合物(通过1H NMR)，其处理如下：将粗物质溶于MTBE(43mL)中。向反应混合物中缓慢添加己烷(26mL)同时维持温度低于30℃。将反应混合物搅拌10min。接下来历时20min缓慢添加叔丁胺(2.7mL,1.1当量)同时维持温度低于30℃。观测到该添加放热。将反应混合物在30℃下搅拌2h并过滤。将粗物质用5:3MTBE:己烷(80mL)洗涤，将滤液浓缩并放置一旁。将过滤的固体溶解于二氯甲烷(300mL)中，用1N HCl(100mL)处理，将有机层用盐水(100mL x2)洗涤，然后在减压在低于45℃浓缩。获得中间体S-1(5.46g,64％)。
制备中间体S-1的第二替代方法：
中间体S-1G:5,5,5-三氟戊酸叔丁酯
在0℃向5,5,5-三氟戊酸(5g,32.0mmol)于THF(30mL)和己烷(30mL)中的搅拌溶液中添加2,2,2-三氯乙酰亚氨酸叔丁酯(11.46mL,64.1mmol)。.将混合物在0℃搅拌15min。添加醚合三氟化硼(0.406mL,3.20mmol)并将反应混合物温热至室温过夜。向澄清的反应混合物中添加固体NaHCO3(5g)并搅拌30min。将混合物通过MgSO4过滤并用己烷(200mL)洗涤。将溶液静置45min，并通过在相同的MgSO4过滤器上再次过滤除去所得的固体物质，用己烷(100mL)洗涤并在减压在未加热下浓缩。将体积减少至约30mL，通过干净的多孔漏斗过滤，用己烷(5mL)洗涤，然后在减压在未加热下浓缩。将所得的无溶剂油状物通过0.45μm尼龙膜滤板过滤得到中间体S-1G(6.6g,31.4mmol 98％收率)，为无色油状物：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm1.38(s,9H)1.74-1.83(m,2H)2.00-2.13(m,2H)2.24(t,J＝7.28Hz,2H)。
中间体S-1H:(4S)-4-(丙-2-基)-3-(5,5,5-三氟戊酰基)-1,3-噁唑烷-2-酮
历时5min向5,5,5-三氟戊酸(5.04g,32.3mmol)于DCM(50mL)和DMF(3滴)中的搅拌溶液中滴加草酰氯(3.4mL,38.8mmol)，并搅拌溶液直至所有气泡消退。将反应混合物减压浓缩，得到淡黄色油状物。在-78℃历时5min经由注射器向填充有(4S)-4-(丙-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮(4.18g,32.4mmol)于THF(100mL)中的溶液的单独烧瓶中滴加n-BuLi(2.5M于己烷中)(13.0mL,32.5mmol)。在搅拌10min后，历时15min经套管添加上述溶于THF(20mL)中的酰氯。将反应混合物温热至0℃，随浴器升温温热至室温，并搅拌过夜。向反应混合物中添加饱和NH4Cl，然后用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。将粗物质通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,5％至60％溶剂A/B＝己烷/EtOAc,SiO2120g)纯化。适当级份的浓缩，得到中间体S-1H(7.39g,86％)，为无色油状物：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.44(1H,dt,J＝8.31,3.53Hz),4.30(1H,t,J＝8.69Hz),4.23(1H,dd,J＝9.06,3.02Hz),2.98-3.08(2H,m),2.32-2.44(1H,m,J＝13.91,7.02,7.02,4.03Hz),2.13-2.25(2H,m),1.88-2.00(2H,m),0.93(3H,d,J＝7.05Hz),0.88(3H,d,J＝6.80Hz)。
中间体S-1I:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-((S)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸叔丁酯和
中间体S-1J:(2R,3R)-6,6,6-三氟-3-((S)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸叔丁酯
在氮气氛下向二异丙胺(5.3mL,37.2mmol)于THF(59mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中添加n-BuLi(2.5M于己烷中)(14.7mL,36.8mmol)。将反 应混合物温热至0℃得到0.5M LDA溶液。将单独的容器填充中间体S-1H(2.45g,9.17mmol)，将物质与苯(RotoVap空气进口安装有氮气进口以完全排除湿气)共沸两次，然后添加甲苯(15.3mL)。将该溶液添加至含有无水氯化锂(1.96g,46.2mmol)的烧瓶中。向冷却至-78℃的所得的混合物中添加LDA溶液(21.0mL,10.5mmol)并在-78℃搅拌10min，温热至0℃持续10min，然后再冷却至-78℃。向含有中间体S-1G(3.41g,16.07mmol)、还经苯共沸两次的单独反应容器中添加冷却至-78℃的甲苯(15.3mL)并添加LDA(37.0mL,18.5mmol)，将所得溶液在-78℃搅拌25min。此时经由套管将衍生自酯的烯醇化物转移至噁唑烷酮烯醇化物的溶液中，在-78℃再搅拌5min，此时除去瓶塞并向反应容器中快速添加固体粉末状二(2-乙基己酰基氧基)铜(9.02g,25.8mmol)，并将瓶塞恢复原位。即刻将容器从冷浴中移除并在快速涡旋下浸没至热水浴中，同时颜色从最初的蓝绿色变成棕色。将反应混合物搅拌20min，倾倒至5％NH4OH水溶液(360mL)中并用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,0％至60％溶剂A/B＝己烷/EtOAc,SiO2120g)纯化。适当的级份浓缩，得到中间体S-1I和S-1J的混合物(2.87g,66％)，为淡黄色粘性油状物。1H NMR显示产物为非对映异构体S-1I:S-1J的1.6:1混合物，通过在2.74和2.84ppm处的多重峰的积分测定:1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.43-4.54(2H,m),4.23-4.35(5H,m),4.01(1H,ddd,J＝9.54,6.27,3.51Hz),2.84(1H,ddd,J＝9.41,7.28,3.64Hz),2.74(1H,ddd,J＝10.29,6.27,4.02Hz),2.37-2.48(2H,m,J＝10.38,6.98,6.98,3.51,3.51Hz),2.20-2.37(3H,m),1.92-2.20(8H,m),1.64-1.91(5H,m),1.47(18H,s),0.88-0.98(12H,m)。
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸，和
中间体S-1E：(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
向中间体S-1I和中间体S-1J(4.54g,9.51mmol)于THF(140mL)和水(42mL)中的冷却的(0℃)、搅拌的溶液中添加过氧化氢(30％于水中)(10.3g,91mmol)和LiOH(685.3mg,28.6mmol)，并将混合物搅拌1h。此时，将反应容器从冷浴中移除，然后搅拌1.5h。通过HPLC判断反应完全。向该反应混合物中添加饱和NaHCO3(45mL)和饱和Na2SO3(15mL)，然后在减压部分地浓缩。将所得粗溶液用(3x)萃取。将水相用1N HCl酸化至pH～1-2，用DCM(3x)和EtOAc(1x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到中间体S-1和S-1E的混合物(3.00g,86％)，为无色油状物：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 2.76-2.84(1H,m,非对映异构体2),2.64-2.76(3H,m),2.04-2.35(8H,m),1.88-2.00(4H,m),1.71-1.83(4H,m),1.48(9H,s,非对映异构体1),1.46(9H,s,非对映异构体2)；1H NMR显示为S-1E:S-1F的1.7:1混合物，通过叔丁基基团峰的积分进行。
中间体S-1：(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸，和
中间体S-1F:(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
在氮气氛下向二异丙胺(1.7mL,11.93mmol)于THF(19mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中添加n-BuLi(2.5M于己烷中)(4.8mL,12.00mmol)。将混合物搅拌5min，然后温热至0℃。在单独的容器中，经由套管向中间体S-1和S-1E的混合物(1.99g,5.43mmol)于THF(18mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中缓慢地添加上文制备的LDA溶液。将混合物搅拌15min，然后温热至室温(放置于24℃水浴中)持续15min，然后再次冷却至-78 ℃持续15min。经由注射器向反应混合物中添加Et2AlCl(1M于己烷中)(11.4mL,11.40mmol)，搅拌10min，温热至室温持续15min，然后再冷却至-78℃持续15min。快速添加甲醇(25mL)，剧烈涡旋同时温热至室温，然后浓缩至～1/4初始体积。将混合物溶解于EtOAc中并用1N HCl(50mL)和冰(75g)洗涤。将水相分离，用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机物用KF(2.85g于75mL水中)和1N HCl(13mL)的混合物[所得溶液pH 3-4]洗涤,然后用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到中间体S-1和中间体S-1E的9:1(S-1:S-1E)富集的非对映异构体混合物(通过1H NMR测定)(2.13g,>99％)，为淡黄色粘性油状物：1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 2.64-2.76(2H,m),2.04-2.35(4H,m),1.88-2.00(2H,m),1.71-1.83(2H,m),1.48(9H,s)。
中间体S-2:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3-氟丙基)己酸
中间体S-2:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-7,7,7-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)庚酸，和
中间体S-2A:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-7,7,7-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)庚酸
历时7min向S-1D(1.72g,6.36mmol)于THF(30mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中缓慢添加LDA(7.32mL,14.6mmol)。在搅拌1h后，历时2min向反应混合物中添加三氟甲磺酸4,4,4-三氟丁基酯(2.11g,8.11mmol)。在15min后，将反应混合物温热至-25℃(冰/MeOH/干冰)持续1h，然后冷却至-78℃。在80min后，将反应用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。 将反应混合物再次用盐水稀释并将溶液用1N HCl调整至pH 3。将水层用醚萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，并减压浓缩，得到中间体S-2和S-2A的混合物(2.29g,95％)，为无色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ2.83-2.75(m,1H),2.64(ddd,J＝9.9,6.7,3.6Hz,1H),2.32-2.03(m,5H),1.98-1.70(m,3H),1.69-1.52(m,3H),1.50-1.42(m,9H)1H NMR显示为非对映异构体的1:4.5混合物(S-2:S-2A)，通过对叔丁基基团的峰积分进行。
中间体S-2:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-7,7,7-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)庚酸，和
中间体S-2A:(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-7,7,7-三氟-2-(3,3,3-三氟丙基)庚酸
将中间体S-2和中间体S-2A(2.29g,6.02mmol)的混合物溶于THF(38mL)中得到无色溶液，将其冷却至-78℃。然后，历时3min将LDA(7.23mL,14.5mmol)(2M于庚烷/THF/乙苯中)缓慢添加至反应混合物中。在搅拌15min后，将反应混合物放置于室温水浴中。在15min后，将反应混合物放置回-78℃浴中，然后历时5min缓慢添加二乙基氯化铝(14.5mL,14.5mmol)(1M于己烷中)。将反应混合物在-78℃搅拌。在15min后，将反应混合物放置于室温水浴中，持续10min，然后冷却回至-78℃浴。在15min后，将反应用MeOH(30.0mL,741mmol)淬灭，自-78℃浴移除，并浓缩。向反应混合物中添加冰和HCl(60.8mL,60.8mmol)，然后用EtOAc(2x200mL)萃取。将有机层用于55mL H2O中的氟化钾(3.50g,60.3mmol)和17.0mL1N HCl洗涤。将有机物经无水硫酸镁干燥并减压浓缩，得到中间体S-2和中间体S-2A的富集混合物(2.25g,98％收率)，为浅黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ2.83-2.75(m,1H),2.64(ddd,J＝9.9,6.7,3.6Hz,1H),2.32-2.03(m,5H),1.98-1.70(m,3H),1.69-1.52(m,3H),1.50-1.42(m,9H).1H NMR显示9:1比例，主要为所需非对映异构体中间体S-2。
中间体S-2B:(2R,3S)-2,3-二(4,4,4-三氟丁基)琥珀酸1-苄基·4-叔丁基酯
向中间体S-2和中间体S-2A的9:1搅拌的混合物(2.24g,5.89mmol)和碳酸钾(1.60g,11.58mmol)于DMF(30mL)中添加溴苄(1.20mL,10.1mmol))。将反应混合物在室温搅拌19h。将反应混合物用乙酸乙酯(400mL)稀释，并用10％LiCl溶液(3x100mL)、盐水(50mL)洗涤，然后经无水硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩至干。将残余物通过快速色谱纯化(Teledyne ISCO CombiFlash 0％至100％溶剂A/B＝己烷/EtOAc,SiO2220g,在254nm处检测,并在220nm处监测)。适当的级份的浓缩，得到中间体S-2B(1.59g,57.5％)。HPLC:RT＝3.863min(SpeedROD柱4.6x50mm,历时4min 10-90％含有0.1％TFA的甲醇水溶液，4mL/min,在220nm处监测)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.40-7.34(m,5H),5.17(d,J＝1.8Hz,2H),2.73-2.64(m,1H),2.55(td,J＝10.0,3.9Hz,1H),2.16-1.82(m,5H),1.79-1.57(m,3H),1.53-1.49(m,1H),1.45(s,9H),1.37-1.24(m,1H)。
中间体S-2:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(4,4,4-三氟丁基)己酸
在氮气下向中间体S-2B(1.59g,3.37mmol)于MeOH(10mL)和EtOAc(10mL)中的搅拌溶液中添加10％Pd/C(510mg)。将气氛替换为氢气氛并将反应混合物在室温搅拌2.5h。将钯催化剂通过4μM聚碳酸酯膜滤除并用MeOH淋洗。将滤液减压浓缩，得到中间体S-2(1.28g,99％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ2.76-2.67(m,1H),2.65-2.56(m,1H),2.33-2.21(m,1H), 2.17-2.08(m,3H),1.93(dtd,J＝14.5,9.9,5.2Hz,1H),1.84-1.74(m,2H),1.70-1.52(m,3H),1.48(s,9H)。
中间体S-3:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3-氟丙基)己酸
中间体S-3A:三氟甲磺酸3-氟丙基酯
历时3min向2,6-二甲基吡啶(4.60mL,39.5mmol)于DCM(30mL)中的冷的(-25℃)、搅拌的溶液中添加三氟甲磺酸酐(6.00mL,35.5mmol)。然后添加3-氟丙-1-醇(1.61g,20.6mmol)。将反应混合物温热至室温，持续2.5h。然后将反应混合物浓缩至其一半体积并通过快速色谱纯化(Teledyne ISCO CombiFlash,等度DCM,SiO2120g,在254nM检测,并在220nM监测)。适当的级份的浓缩，得到中间体S-3A(2.92g,67.4％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 4.69(2H,t,J＝6.16Hz),4.65(1H,t,J＝5.50Hz),4.54(1H,t,J＝5.61Hz),2.25(1H,dt,J＝11.39,5.86Hz),2.19(1H,dt,J＝11.44,5.94Hz)
中间体S-3:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6-氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸,和
中间体S-3B:(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6-氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
历时5min向中间体S-1D(1.01g,3.73mmol)于THF(15mL)中的冷的(-78℃)、搅拌的溶液中缓慢添加LDA(4.56mL,8.21mmol)。在搅拌1.5h 后，历时3min向该反应混合物中添加中间体S-3A(1.02g,4.85mmol)。在17min后，将反应混合物温热至-25℃浴(冰/MeOH/干冰)，持续1.5h。将反应用水(15mL)淬灭，然后用CH2Cl2(3x20mL)萃取。将有机层再次用1NNaOH(3x20mL)萃取，并将水层合并。将水层在冰/水浴中冷却，然后用6NHCl酸化至pH 1。接着，将水层用固体NaCl饱和并用EtOAc(2x85mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，并减压浓缩，得到中间体S-3和中间体S-3B的混合物(0.96g,78％)，为油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 4.48-4.56(1H,m),4.36-4.44(1H,m),2.75-2.83(1H,m),2.61-2.72(1H,m),2.08-2.34(2H,m),1.83-1.98(3H,m),1.66-1.82(4H,m),1.44-1.51(9H,m).1H NMR显示非对映异构体(中间体S-3:中间体S-3B)的1:6.4混合物，通过积分t-Bu基团的峰。
中间体S-3:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-6,6,6-三氟-2-(3-氟丙基)己酸，和
中间体S-3B:(2R,3R)-3-(叔丁氧基羰基)-6-氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
将中间体S-3和中间体S-3B的混合物(0.30g,0.91mmol)溶于THF(5mL)中得到无色溶液，将其冷却至-78℃。然后，历时3min将LDA(1.11mL,2.00mmol)(1.8M于庚烷/THF/乙苯中)缓慢添加至反应混合物中。在搅拌15min后，将反应混合物放置于室温水浴中。在15min后，将反应混合物放置回-78℃浴中，然后历时5min缓慢添加二乙基氯化铝(1.91mL,1.91mmol)(1M于己烷中)。将反应混合物在-78℃搅拌。在15min后，将反应混合物放置于室温水浴中，持续10min，然后冷却回至-78℃浴。在15min后，将反应用MeOH(5.51mL,136mmol)淬灭，自-78℃浴移除，并浓缩。向反应混合物中添加冰和HCl(8.17mL,8.17mmol)，然后用EtOAc(2x)萃取。将有机层用于16mL H2O中的氟化钾(0.48g,8.26mmol)和10.0mL 1N HCl洗涤。将有机物经无水硫酸镁干燥并减压浓缩，得到中间体S-3和中间体S-3B的混合物(0.20g,65％收率)，为浅黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 4.47-4.56(1H,m),4.33-4.43(1H,m),2.59-2.76(2H,m),2.21-2.35(1H,m),2.06-2.19(1H,m),1.88-2.00(1H,m),1.59-1.85(6H,m),1.47(9H,s).1H NMR显示9:1比例，主要为所需非对映异构体中间体S-3。
中间体S-4:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-5,5-二氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
中间体S-4A:4,4-二氟戊酸苄酯
将DAST(19.22mL,145mmol)滴加至4-氧代戊酸苄酯(20g,97mmol)于DCM(120mL)中的冷的(0℃)溶液中。将混合物温热至室温，然后在40℃加热72小时。将混合物缓慢地倾倒至冰和饱和碳酸氢钠的混合物中。将混合物搅拌30min直至再无气体从溶液中产生。将有机层分离并将水溶液用DCM(2x240mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，并在减压小心地除去溶剂。将粗物质通过ISCO(120g柱)纯化用100％己烷至40％EtOAc/己烷洗脱，得到产物中间体S-4A(7.87g,34.5mmol,35.6％yield)，为黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.29-7.51(5H,m),5.17(2H,s),2.53-2.67(2H,m),2.14-2.36(2H,m),1.63(3H,t,J＝18.38Hz)。
中间体S-4B:4-二氟戊酸
向中间体S-4A(5000mg,21.91mmol)于THF(45mL)和MeOH(15mL)中的溶液中添加LiOH(32.9mL,32.9mmol)，然后将混合物在室温搅拌1h。将反应混合物浓缩以除去有机物，用水(10mL)稀释，并用DCM(20mL)萃 取。将水层用1N HCl酸化至pH 1，然后用3x20mL DCM萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，然后减压浓缩，得到中间体S-4B(2062mg,14.93mmol,68.2％收率)，为黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm11.20-11.61(1H,m),2.58(2H,t,J＝7.81Hz),2.10-2.32(2H,m,J＝16.18,16.18,8.03,7.81Hz),1.63(3H,t,J＝18.38Hz)。
中间体S-4C:4-二氟戊酸
在N2下历时5min向中间体S-4B(700mg,5.07mmol)于己烷(6mL)和THF(6mL)中的冷却的(0℃，预冷却至少15min)、搅拌的溶液中分批添加2,2,2-三氯乙酰亚胺酸叔丁酯(1.814mL,10.14mmol)，并搅拌15min。添加醚合三氟化硼(0.065mL,0.512mmol)并随浴器温热过夜将反应混合物温热至室温。向澄清的反应混合物中添加NaHCO3(3g)并将悬浮液搅拌60min。将悬浮液通过MgSO4过滤并用300mL己烷洗涤。将滤液静置30min，将所得固体通过相同的MgSO4过滤器过滤，并用己烷(100mL)洗涤。将滤液浓缩并将粗物质通过ISCO(40g柱)纯化用100％己烷至50％EtOAc/己烷洗脱，得到产物中间体S-4C(519mg,2.67mmol,52.7％收率)，为浅黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 2.34(2H,d,J＝8.14Hz),2.01-2.16(2H,m),1.53(3H,t,J＝18.38Hz),1.38(9H,s)。
中间体S-4D:(3R)-2-(2,2-二氟丙基)-6,6,6-三氟-3-((S)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)己酸叔丁酯
中间体S-4D(279mg,0.607mmol,45.3％收率)通过中间体S-1H所述的方法自中间体S-4C(455mg,2.343mmol)和中间体S-1G(358mg,1.339mmol) 制备得到非对映异构体的1.2:1混合物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm4.43-4.53(2H,m),4.22-4.36(4H,m),4.03-4.11(1H,m),3.02-3.10(1H,m),2.93-3.02(1H,m),2.48-2.65(1H,m),2.35-2.49(2H,m),2.23-2.35(1H,m),1.91-2.23(3H,m),1.74-1.89(2H,m),1.53-1.70(3H,m),1.42-1.51(9H,m)。
中间体S-4:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-5,5-二氟-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
向中间体S-4D(279mg,0.607mmol)于THF(9mL)和水(3mL)中的冷却的(0℃)、搅拌的溶液中添加H2O2(0.375mL,6.12mmol)，然后添加LiOH(44.1mg,1.840mmol)。将反应混合物逐渐温热至室温并搅拌3h。添加饱和Na2SO3(5mL)水溶液和10mL饱和NaHCO3的溶液。将混合物搅拌5min，然后将反应混合物部分地浓缩。将混合物用DCM(15mL)萃取并将水相酸化至pH～2，用NaCl饱和，并用DCM(2x30mL)萃取。将合并的萃取物经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到产物，为中间体S-4的非对映异构体的1.2:1混合物(169mg,0.485mmol,80％收率)，为浅黄色油状物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 2.89-3.04(1H,m),2.68-2.86(1H,m),2.38-2.60(2H,m),2.19-2.38(1H,m),2.07-2.20(1H,m),1.87-2.03(2H,m),1.73-1.88(1H,m),1.63(3H,t,J＝18.49Hz),1.37-1.53(9H,m)。
中间体S-5:(2R)-3-(叔丁氧基羰基)-2-(2,2-二氟丙基)-6,6,6-三氟己酸
中间体S-5A:(S)-4-苄基-3-(4,4-二氟戊酰基)噁唑烷-2-酮
在100圆底烧瓶中在DCM(9mL)中添加4,4-二氟戊酸(1.7g,12.31mmol)和DMF(0.019mL,0.246mmol)，得到无色溶液。缓慢添加草酰氯(1.077mL,12.31mmol)并将所得混合物在室温搅拌3小时。将所得混合物浓缩至干。将单独的100mL圆底烧瓶填充于THF(23mL)中的(S)-4-苄基噁唑烷-2-酮(2.181g,12.31mmol)，然后冷却至-78℃。接着，历时5min缓慢添加n-BuLi(4.92mL,12.31mmol)。在-78℃将上述于THF(10mL)中的酰氯溶液缓慢添加至反应中。将反应混合物在-78℃搅拌约1h，然后温热至室温并在氮气下搅拌过夜。将反应混合物用约60mL饱和NH4Cl水溶液淬灭。将所得混合物用200mL EtOAc和约60mL水稀释。分离各层并将水层用250mL EtOAc萃取。将合并的EtOAc萃取物干燥(MgSO4)，过滤并在真空中浓缩，得到深黄色油状物。将粗物质通过硅胶色谱(80g ISCO柱,A:己烷,B:DCM,20％至100％洗脱)纯化，得到中间体S-5A(1.65g,5.55mmol,45.1％收率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.23-7.39(3H,m),7.17-7.24(2H,m),4.67(1H,ddd,J＝9.85,3.69,3.41Hz),4.13-4.26(2H,m),3.29(1H,dd,J＝13.42,3.30Hz),3.16(2H,ddd,J＝13.98,8.47,6.82Hz),2.77(1H,dd,J＝13.31,9.57Hz),2.19-2.41(2H,m),1.53-1.75(3H,m)。
中间体S-5B:(S)-3-((S)-4-苄基-2-氧代噁唑烷-3-羰基)-5,5-二氟己酸叔丁酯
在200mL圆底烧瓶中在THF(20mL)中添加中间体S-5A(1.67g,5.62mmol)，得到无色溶液。将溶液冷却至-78℃，然后在-78℃历时8min向反应混合物中缓慢添加NaHMDS(6.74mL,6.74mmol)的1M THF溶液。将反 应混合物在-78℃搅拌20min，然后历时5min添加2-溴乙酸叔丁酯(1.648mL,11.23mmol)。将混合物在-78℃搅拌同时将浴器缓慢温热至室温，然后继续搅拌过夜。将反应用饱和NH4Cl水溶液淬灭并用EtOAc萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶色谱(330g柱,ISCO)纯化，用从5％EtOAc/己烷至50％EtOAc/己烷的梯度洗脱。合并级份并在真空中浓缩，得到中间体S-5B(1.73g,4.20mmol,74.9％收率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.30-7.39(2H,m),7.26(3H,d,J＝1.98Hz),4.60-4.73(1H,m),4.42-4.55(1H,m),4.16(2H,s),3.26-3.39(1H,m),2.68-2.86(2H,m),2.51-2.62(1H,m),2.32-2.51(1H,m),2.04(1H,s),1.66(3H,t,J＝18.60Hz),1.44(9H,s)。
中间体S-5C:(S)-2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-4,4-二氟戊酸
将中间体S-5C(1.5g,3.65mmol)于THF(15mL)中的溶液冷却至0℃。制备LiOH(0.262g,10.94mmol)和H2O2(2.011mL,32.8mmol)于水(5mL)中的单独的溶液。将LiOH/H2O2溶液添加至THF混合物中，并在冰/水浴中搅拌30min。将反应混合物从冰浴中移除并温热至室温。将反应混合物搅拌额外2h，然后在冰/水浴中冷却。向混合物中添加饱和的NaHCO3水溶液(30mL)和饱和的Na2SO3水溶液(30mL)，并将反应混合物在冰浴中搅拌1h。在减压除去THF，并将水层用DCM萃取。将水层用浓HCl酸化至pH 2，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，然后经MgSO4干燥。然后将悬浮液过滤并浓缩，得到稠厚无色油状物，并真空干燥得到产物中间体S-5C(837mg,3.32mmol,91％收率)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 3.01-3.14(1H,m),2.55-2.74(2H,m),2.33-2.51(1H,m),2.05(1H,s),1.64(3H,t,J＝18.49Hz),1.44(9H,s)。
中间体S-5D:三氟甲磺酸3,3,3-三氟丙基酯
历时3min向2,6-二甲基吡啶(18.38mL,158mmol)于DCM(120mL)中的冷的(-25℃)、搅拌的溶液中添加Tf2O(24.88mL,147mmol)，并将混合物搅拌5min。历时3min间隔向反应混合物中添加3,3,3-三氟丙-1-醇(12g,105mmol)。在2h后，将反应混合物温热至室温并搅拌1h。将反应混合物浓缩至其一半体积，然后通过直接上样至硅胶柱(330g ISCO)纯化并将产物用DCM洗脱，得到中间体S-5D(13.74g,53％)，为无色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.71(2H,t,J＝6.15Hz),2.49-2.86(2H,m)。
中间体S-5:(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基)-2-(2,2-二氟丙基)-6,6,6-三氟己酸
向50mL圆底烧瓶中在THF(10mL)中添加中间体S-5C(500mg,1.982mmol)，得到无色溶液，然后将其冷却至-78℃。历时5min向反应中缓慢添加LDA(2.423mL,4.36mmol)。然后将反应混合物在-78℃搅拌3h。历时3min向反应中滴加中间体S-5D(634mg,2.58mmol)，并在-78℃继续搅拌30min。然后将反应混合物温热至-15℃(冰/甲醇浴)并在-15℃维持1h。然后将反应混合物用20mL水淬灭。接着，在减压除去大部分THF，然后添加1N NaOH(1mL)并将水相用DCM萃取。将DCM层用1N NaOH(2x20mL)萃取。将合并的水相冷却至0℃并用6M HCl酸化，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，然后过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱(ISCO)80g柱并用10％EtOAc/己烷至100％EtOAc于23min内洗脱，得到中间体S-5，为非对映异构体的1.2:1混合物(213mg,0.612mmol,30.9％收率)。
实施例1
(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(4,4,4-三氟丁基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体1A:2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基氨甲酸苄基酯
在氮气下向2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基氨甲酸苄基酯(1.20g,3.11mmol,根据J.Med.Chem.,49:2311-2319(2006),化合物#4a制备)、2-碘吡啶(1.00g,4.88mmol)、碘化亚铜(0.15g,0.788mmol)和Cs2CO3(3.05g,9.36mmol)于二噁烷(25mL)中的搅拌的混合物中添加(+/-)-反式-1,2-二氨基环己烷(0.19mL,1.58mmol)。然后将反应混合物加热至120℃并温和地回流10min。然后将其在氮气下冷却至室温。将该混合物用100mL EtOAc、40mL pH 4磷酸盐缓冲液和40mL饱和NaHCO3溶液稀释。通过2英寸垫过滤除去不溶性物质，并用EtOAc(2x30mL)淋洗。将水相分离并用160mL EtOAc萃取。将合并的EtOAc萃取物用饱和NaHCO3溶液(1x30mL)和盐水(1x20mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(己烷/EtOAc)，得到中间体1A(0.88g,61％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(1H,d,J＝8.14Hz),8.47(1H,dd,J＝4.73,1.21Hz),7.94-8.03(1H,m),7.64(2H,d,J＝7.92Hz),7.47-7.60(4H,m),7.27-7.44(9H,m),6.97(1H,d,J＝8.14Hz),5.39(1H,d,J＝8.36Hz),5.10(2H,s)；HPLC:RT＝2.930min(ODS 4.6x50mm(4min grad)历时4min用含有0.％TFA的10-90％MeOH水溶液洗脱,4mL/min,在220nm处监测)；MS(ES):m/z＝463.3[M+H]+。
中间体1B:(S)-3-氨基-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
将中间体1A(5.24g,11.33mmol)和33％HBr/HOAc(50mL,11.33mmol)合并并在室温搅拌2h。将反应混合物用300mL醚稀释。通过过滤收集所得沉淀，用醚(2x50mL)淋洗，然后真空干燥。将固体溶于100mL水中并通过添加固体NaHCO3使其呈碱性。将混合物用EtOAc(2x200mL)萃取，并将合并的有机萃取物用水(1x40mL)和盐水(1x50mL)洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并在真空中浓缩，得到粗外消旋胺。将固体通过制备型SFC色谱(Berger SFC MGII,AD-H 250x30mm ID,5μm,78/22CO2/MeOH,含有0.1％DEA，85mL/min)纯化。在将含有产物的级份浓缩并真空干燥过夜后，获得中间体1B(1.576g,42.4％)，为无色固体:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.47(1H,dd,J＝4.73,1.65Hz),7.98(1H,td,J＝7.70,1.98Hz),7.62(3H,dd,J＝14.75,7.48Hz),7.45-7.57(5H,m),7.26-7.43(3H,m),6.92(1H,d,J＝8.14Hz),4.57(1H,br.s.),2.67(1H,br.s.)；手性HPLC:RT＝5.160min(Berger SFC,AD-H 250x4.6mm ID,5μm,75/25CO2/MeOH,含有0.1％DEA，2.0mL/min)；HPLC:RT＝1.290min(ODS 4.6x50mm(4min grad)历时4min用含有0.％TFA的10-90％MeOH水溶液洗脱,4mL/min,在220nm处监测)；MS(ES):m/z＝329.0[M+H]+。
中间体1C:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-(((S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(4,4,4-三氟丁基)己酸叔丁酯
将中间体1B(60mg,0.183mmol)、中间体S-2(90mg,0.238mmol)和Et3N(0.033mL,0.238mmol)于DMF(1mL)中的溶液用o-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐(64.5mg,0.201mmol)。将混合物在室温搅拌3h，然后添加水和一些饱和NaHCO3水溶液。将所得混合物用EtOAc(2x)萃取并将合并的有机层浓缩至干。将粗产物通过硅胶柱色谱(40g ISCO柱)纯化用从100％DCM至40％EtOAc/DCM梯度洗脱，得到中间体1C(63mg,50％)。HPLC:RT＝3.531min(ODS 4.6x50mm(3min grad)历时4min用含有0.％TFA的10-90％MeOH水溶液洗脱,4mL/min,在220nm处监测)；MS(ES):m/z＝691[M+H]+。
中间体1D:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-(((S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-2-基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(4,4,4-三氟丁基)己酸
将中间体1C(62mg,0.090mmol)于DCM(1mL)中的溶液用TFA(1mL)处理.将反应混合物在室温搅拌1.5h,然后浓缩至干得到中间体1D(67mg,100％).HPLC:RT＝3.011min(ODS 4.6x50mm(3min grad)历时4min用含有0.％TFA的10-90％MeOH水溶液洗脱,4mL/min,在220nm处监测)；MS(ES):m/z＝634[M+H]+。
实施例1
将中间体1D(67mg,0.090mmol)/HOBT(20.62mg,0.135mmol)/EDC(25.8mg,0.135mmol)和氯化铵(28.8mg,0.539mmol)于DMF(1mL)中的溶液用(0.141mL,0.808mmol)处理并将混合物在室温搅拌过夜。向反应混合物中添加水并形成灰白色沉淀。通过过滤收集固体，用水淋洗，并真空干燥。将粗物质通过制备型HPLC(柱:AD 4.6x250mm,13％(1:1,MeOH/EtOH)/庚烷,流速＝1mL/min)纯化，得到实施例1(39mg,68％)。HPLC:RT＝10.001min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C18 3.5μm,4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝634[M+H+]；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.55(1H,d,J＝6.94Hz),8.44-8.52(1H,m),8.00(1H,td,J＝7.77,1.94Hz),7.65-7.72(2H,m),7.48-7.64(6H,m),7.32-7.45(3H,m),6.95-7.10(2H,m),5.55(1H,d,J＝7.21Hz),2.78(1H,td,J＝9.92,4.86Hz),2.44(1H,td,J＝10.61,2.91Hz),2.07-2.34(3H,m),1.29-1.71(7H,m)。
实施例2
(2R,3S)-N-((3S)-1-(5-氯-吡啶-2-基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体2A:3-氨基-1-(5-氯吡啶-2-基)-5-苯基-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
中间体2A如中间体1A所述使用5-氯-2-碘吡啶制备。将外消旋体通过制备型SFC色谱(Berger SFC MGII,OJ-H 250x30mm ID,5μm,80/20 CO2/MeOH,85mL/min)纯化，得到中间体3A。RT＝3.44min(H2O/CH3OH,含有TFA，ODS S5 4.6x50mm,梯度＝3min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝497[M+H+]。
中间体2B:3-氨基-1-(5-氯吡啶-2-基)-5-苯基-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
中间体2B根据中间体中间体1B所述的操作自中间体2A(0.78g,1.56mmol)和33％HBr在乙酸(15mL)中制备得到中间体2B(0.56g,99％)。RT＝2.43min(H2O/CH3OH,含有TFA，ODS S5 4.6x50mm,梯度＝3min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝363[M+H+]。
实施例2
实施例2自中间体2B和中间体S-1根据实施例1所示的一般操作制备。HPLC:RT＝10.96min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C18 3.5μm,4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝654.4[M+H+]；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.61(d,J＝7.5Hz,1H),8.54(d,J＝2.5 Hz,1H),8.14(dd,J＝8.6,2.8Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H),7.66-7.63(m,3H),7.62-7.56(m,2H),7.53-7.47(m,2H),7.45-7.35(m,2H),7.13(br.s.,1H),7.04(d,J＝8.0Hz,1H),5.60(d,J＝7.2Hz,1H),2.85(td,J＝10.3,4.0Hz,1H),2.54(br.s.,1H),2.46-2.38(m,1H),2.29-2.21(m,1H),2.17(dd,J＝19.7,8.6Hz,3H),1.80-1.70(m,1H),1.68-1.56(m,2H)。
实施例3
(2R,3S)-N-((7S)-6-氧代-9-苯基-5-(吡啶-2-基)-6,7-二氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-h][1,4]苯并二氮杂-7-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体3A:6,7-二苯基-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4,5-f]吲哚
将配备有Dean-Stark装置的烧瓶填充3,4-(亚甲二氧基)苯胺(5.0g,36.4mmol)、对甲苯磺酸(245mg,1.2mmol)、二苯乙醇酮(5.20g,24.4mmol)和二甲苯(30mL)。将混合物加热至回流持续10h，然后冷却至室温。将反应混合物用氯仿稀释，然后用10％硫酸洗涤两次，用水洗涤一次，并用盐水洗涤一次。将有机层浓缩至最小体积并添加石油醚。将混合物充分搅拌，然后将沉淀的固体滤出并干燥得到中间体3A(7.0g,92％)。HPLC:RT＝2.261min(H2O/MeCN,含有NH4OAc，Star RP-18 3μM,4x55mm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES,负离子化):m/z＝312[M-H]-。
中间体3B:N-(6-苯甲酰基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)苯甲酰胺
向中间体3A(7.0g,22mmol)于AcOH(140mL)中的溶液中添加钼酸铵(67mg,0.054mmol)于水(6.7mL)中的溶液。将混合物加热至65℃，然后历时约15min添加H2O2(30％于H2O中,8.93mL,78.8mmol)。在2h后，将反应混合物冷却至室温并用水稀释。将固体滤出，用水洗涤，并干燥得到中间体3B(6.0g,79％):1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 12.56(s,1H),8.59(s,1H),8.10-8.08(m,2H),7.67-7.60(m,2H),7.59-7.50(m,6H),7.06(s,1H),6.07(s,2H)。
中间体3C:6-氨基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)(苯基)甲酮
将中间体3B(73g,0.211mol)溶于EtOH(292mL)中。添加NaOH(50％于水中,182.5mL,2.28mol)，然后将溶液加热至回流持续2h。将反应混合物冷却至室温，然后用水稀释。将固体滤出，用水洗涤，并干燥得到中间体3C(42g,95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.57-7.55(m,2H),7.49-7.42(m,3H),6.85(s,1H),6.39(br s,2H),6.23(s,1H),5.89(s,2H)。
中间体3D:(6-氧代-9-苯基-6,7-二氢-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4′,5′:4,5]苯并[1,2-e][1,4]二氮杂-7-基)氨甲酸苄基酯
在0℃向中间体3C(7.0g,30mmol)和2-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-2-(苄基氧基羰基氨基)乙酸(J.Org.Chem.,55:2206-2214(1990))(12.06g,37mmol)于DCM(70mL)中的溶液中添加二环己基碳二亚胺(9.16g,66mmol)于DCM(70mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后添加饱和NaHCO3水溶液。分离各层，并将水层用DCM洗涤两次。将合并的有机层连续地用水和盐水洗涤，然后经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干。将该物质溶于MeOH(140mL)中并冷却至0℃。滴加氢氧化铵(28-30％于水中,140mL)。将反应混合物逐渐地温热至室温。在3小时后，将反应混合物冷却至0℃，然后添加乙酸(140mL)和NH4OAc(14.25g,184mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后添加10％NaOH水溶液。将固体滤出，用水洗涤，并干燥得到中间体3D(3.5g,27％)。HPLC:RT＝1.856min(H2O/MeCN,含有NH4OAc，Ascentis Express C-18 2.7μM,2.1x50mm,梯度＝4min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝430[M+H]+。
中间体3E:(S)-7-氨基-9-苯基-5-(吡啶-2-基)-5H-[1,3]二氧杂环戊并[4′,5′:4,5]苯并[1,2-e][1,4]二氮杂-6(7H)-酮
中间体3E根据实施例1所述的操作自中间体3D和2-碘吡啶制备。将外消旋体通过制备型SFC色谱(Berger SFC MGII,OD-H 250x30mm ID,5μm,73/17 CO2/MeOH,85mL/min)纯化，得到中间体4E。RT＝1.668min(H2O/CH3OH,含有TFA，ODS S5 4.6x50mm,梯度＝3min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝373.2[M+H+]。
实施例3
实施例3自中间体3E和中间体S-1根据实施例1所示的一般操作制备。HPLC:RT＝9.70min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C18 3.5μm, 4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝572.2[M+H+]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.57(d,J＝7.3Hz,1H),8.52-8.43(m,1H),7.98(td,J＝7.8,2.0Hz,1H),7.70-7.63(m,3H),7.61-7.46(m,4H),7.40(ddd,J＝7.4,4.8,1.0Hz,1H),7.15(s,1H),6.83(s,1H),6.56(s,1H),6.14(dd,J＝5.5,0.9Hz,2H),5.63(d,J＝7.3Hz,1H),2.84(td,J＝10.3,3.9Hz,1H),2.46-2.37(m,1H),2.35-2.24(m,1H),2.17(dd,J＝19.3,8.9Hz,3H),1.81-1.69(m,2H),1.66-1.54(m,2H)。
实施例4
(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(4,4,4-三氟丁基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体4A:(S)-3-氨基-5-苯基-1-(吡啶-3-基)-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
中间体4A根据实施例1所述的操作使用3-碘吡啶制备。将外消旋体通过制备型手性色谱(OJ 250x30mm ID,5μm,等梯度,30％1:1EtOH:MeOH/庚烷)纯化，得到中间体4A。RT＝1.338min(H2O/CH3OH,含有TFA，ODS S5 4.6x50mm,梯度＝3min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝329.2[M+H+]。
实施例4
实施例4自中间体4A和中间体S-2根据实施例1所示的一般操作制备。HPLC:RT＝8.14min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C18 3.5μm,4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝634.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.55(1H,d,J＝7.04Hz),8.56(1H,dd,J＝4.73,1.43Hz),8.47(1H,d,J＝2.20Hz),7.69-7.77(3H,m),7.56-7.65(3H,m),7.47-7.56(3H,m),7.35-7.43(2H,m),7.07(2H,d,J＝8.14Hz),5.55(1H,d,J＝7.26Hz),2.74-2.84(1H,m),2.52-2.58(1H,m),2.40-2.48(1H,m),2.08-2.35(3H,m),1.54-1.69(3H,m),1.27-1.52(3H,m)。
实施例5
(2R,3S)-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-1-(吡啶-3-基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
实施例5自中间体4A和中间体S-1根据实施例1所示的一般操作制备。HPLC:RT＝7.97min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C18 3.5μm,4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝620.3[M+H+]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.60(1H,d,J＝7.48Hz),8.56(1H,dd,J＝4.73,1.43Hz),8.49(1H,d,J＝2.20Hz),7.73-7.78(1H,m),7.68-7.72(1H,m),7.66(1H,br.s.),7.53-7.64(4H,m),7.51(2H,d,J＝8.14Hz),7.35-7.44(2H,m),7.15(1H,s),7.05(1H,d,J＝8.14Hz),5.59(1H,d,J＝7.70Hz),2.86(1H,td,J＝10.29,4.07Hz),2.50-2.55(1H,m),2.32-2.46(1H,m),2.09-2.29(3H,m),1.71-1.82(1H,m),1.55-1.68(3H,m)。
实施例6
(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体6A:(2-氨基苯基)(4-甲氧基苯基)甲酮
向有镁(1.646g,67.7mmol)和乙醚(47.0ml)的250mL圆底烧瓶中添加两滴二溴甲烷，并将混合物加热至回流持续15min。通过加液漏斗缓慢添加对溴苯甲醚(6.35ml,50.8mmol)于乙醚(47.0ml)中的溶液同时维持回流温度。将所得混合物加热3h，然后冷却至室温。历时15min滴加2-氨基苯甲腈(2g,16.93mmol)于乙醚(47.0ml)中的溶液。在添加后，将混合物回流16h。然后在减压将体积减少一半，并将混合物用冰(100g)缓慢淬灭。接着，添加6N HCl(10mL)并将混合物在室温搅拌16h。将pH用5N NaOH调整至pH 8，并用饱和NaHCO3(50ml)稀释。分离各相并将水层用乙酸乙酯(2x200mL)反萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。将粗物质通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,0％至70％溶剂A/B＝庚烷/EtOAc,SiO2120g)纯化。适当的级份的浓缩，得到中间体6A(3.13g,81％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.62-7.55(m,2H),7.34-7.22(m,2H),7.09-7.01(m,2H),6.87-6.78(m,3H),6.53(ddd,J＝8.0,7.0,1.1Hz,1H),3.85(s,3H)。
中间体6B:(5-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酸苄基酯
在100mL圆底烧瓶中放置中间体6A(3.1g,13.64mmol)和2-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-2-(苄基氧基羰基氨基)乙酸(5.34g,16.37mmol)和DCM(50mL)，得到悬浮液。然后将混合物冷却至0℃并添加DCC(3.94g,19.10mmol)于DCM(5mL)中的溶液。将反应混合物温热至室温并在室温搅拌16h。添加饱和的NaHCO3(50mL)并将固体过滤并弃除。将有机相分离，经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将粗反应混合物用甲醇(100mL)稀释并添加氨(2N于甲醇中,100mL,200mmol)，将混合物在室温搅拌4h。然后添加AcOH(50mL,873mmol)并在氮气下在室温继续搅拌过夜。将粗反应混合物浓缩并在高真空下干燥。将粗产物用乙酸乙酯(50mL)稀释，然后再用乙醚(300mL)缓慢稀释。将所得固体过滤并空气干燥。将粗物质通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,0％至50％溶剂A/B＝庚烷/EtOAc,SiO2120g)纯化。适当的级份的浓缩，得到中间体6B(1.32g,23％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.35(d,J＝8.6Hz,1H),7.69-7.58(m,1H),7.49-7.21(m,10H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),5.08(s,2H),5.02(d,J＝8.6Hz,1H),3.82(s,3H)。
中间体6C:3-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
将中间体6B(1000mg,2.407mmol)用33％HBr的乙酸溶液(5mL)处理，得到悬浮液。然后在搅拌下将反应混合物加热至70℃持续3h。然后将反应混合物倾倒至醚(100mL)中。将所得固体过滤，然后在DCM(100mL)/饱和NaHCO3(100mL)之间分配。将水相用DCM(3x100mL)反萃取。将合并的 有机相用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到中间体6C(0.608g,90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.61(br.s.,1H),7.62-7.53(m,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,2H),7.34-7.23(m,2H),7.23-7.17(m,1H),6.99(d,J＝9.0Hz,2H),4.20(s,1H),3.81(s,3H)。
中间体6D:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-((5-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸叔丁酯
将中间体6C(309mg,1.100mmol)、中间体S-1(375mg,1.024mmol)和TEA(0.595mL,4.27mmol)于DMF(5mL)中的溶液用o-苯并三唑-1-基-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐(329mg,1.024mmol)处理，得到溶液。在氮气下在室温将混合物搅拌过夜。然后将反应混合物用水(50mL)稀释。通过过滤收集所得固体并干燥得到中间体6D(0.500g,93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(d,J＝6.6Hz,1H),9.48(d,J＝5.5Hz,1H),7.64(t,J＝6.4Hz,1H),7.46(dd,J＝8.7,4.1Hz,2H),7.39-7.21(m,3H),7.00(dd,J＝8.8,3.3Hz,2H),5.22(dd,J＝9.4,7.6Hz,1H),3.82(s,3H),2.96-2.83(m,1H),2.39-2.11(m,4H),1.91(s,1H),1.86-1.54(m,4H),1.44(s,9H),1.42-1.37(m,1H)。
中间体6E:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-((5-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
将中间体6D(350mg,0.556mmol)于DCM(10mL)中的溶液用TFA(2mL,26.0mmol)处理。将反应混合物在室温搅拌16h。然后将反应混合物浓缩并在高真空下干燥。将粗反应混合物用(6mL)稀释并用EDC(150mg,0.785mmol)、HOBT(120mg,0.785mmol)、DIPEA(1.096mL,6.28mmol)和氯化铵(336mg,6.28mmol)处理。在氮气下将混合物在室温搅拌16h。然后添加额外的EDC(150mg,0.785mmol)、HOBT(120mg,0.785mmol)和DIPEA(1.096mL,6.28mmol)并继续再搅拌16h。然后将反应混合物用水(75mL)稀释，并将所得固体过滤并空气干燥。将粗非对映异构体通过制备型手性HPLC(AD 5cmx50cm 10μM等梯度30％-异丙醇:庚烷100ml/min)分离得到中间体6E(0.085g,56％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H),9.43(d,J＝7.5Hz,1H),7.64(td,J＝7.7,1.5Hz,2H),7.52-7.41(m,2H),7.38-7.22(m,3H),7.13(s,1H),7.04-6.93(m,2H),5.25(d,J＝7.5Hz,1H),3.82(s,3H),2.80(td,J＝10.0,4.2Hz,1H),2.47(br.s.,1H),2.32-2.08(m,4H),1.84-1.57(m,4H)。
实施例6
将中间体6E(48mg,0.084mmol)、(溴甲基)环丙烷(0.040mL,0.419mmol)和氟化钾(40％于氧化铝上)(170mg,1.170mmol)于DMF(2mL)中的混合物在室温搅拌24h。添加额外的(溴甲基)环丙烷(0.040mL,0.419mmol)并继续搅拌24h。将反应混合物用水(50mL)稀释并将所得固体过滤并空气干燥。将粗物质通过快速色谱(Teledyne ISCO CombiFlash Rf,0％至60％溶剂A/B＝DCM/EtOAc,SiO24g)纯化。适当级份的浓缩，得到实施例6(0.014g,26％)。HPLC:RT＝10.42min(H2O/CH3CN,含有TFA，SunFire C183.5μm,4.6x150mm,梯度＝15min,波长＝220和254nm)；MS(ES):m/z＝627[M+H+]；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(d,J＝7.3Hz,1H),7.79-7.63(m, 3H),7.56-7.48(m,2H),7.42-7.32(m,2H),7.13(s,1H),7.06-6.98(m,2H),5.27(d,J＝7.3Hz,1H),4.17(dd,J＝14.4,7.4Hz,1H),3.83(s,3H),3.66(dd,J＝14.3,7.0Hz,1H),2.85-2.72(m,1H),2.47-2.42(m,1H),2.31-2.06(m,3H),1.76-1.47(m,4H),1.23-1.15(m,1H),0.73(t,J＝7.5Hz,1H),0.29-0.19(m,1H),0.14(tt,J＝8.6,4.5Hz,1H),0.04(dq,J＝9.2,4.7Hz,1H),-0.02--0.11(m,1H)。
实施例7
(2R,3S)-N-((3S)-7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-1-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体7A:(2-氨基-5-甲氧基苯基)(苯基)甲酮
在0℃在氮气氛下历时25min向BCl3(4.5mL,1M于DCM中,4.47mmol)的搅拌溶液中缓慢添加4-甲氧基苯胺(0.5g,4.06mmol)和苯甲腈(0.837g,8.12mmol)于甲苯(5mL)中的混合物。将混合物在0℃搅拌5min，然后在0℃历时2min分批添加AlCl3(0.595g,4.47mmol)。将反应混合物温热至室温，然后在115℃加热72小时。将反应混合物冷却至室温，历时30min连续地用冰冷水(1mL)和1.5N HCl水溶液(5mL)淬灭。将反应混合物进一步在100℃回流2h，冷却至0℃，并历时15min滴加10％NaHCO3水溶液(20mL)直至pH为～8.5。将水层用EtOAc(3x25mL)萃取。将有机层合并，用盐水(2x10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空中浓缩。将粗产物通过ISCO硅胶色谱纯化使用EtOAc/己烷(1:12)作为洗脱液得到中间体7A。(0.25g,27％).HPLC:RT＝1.37min(MeOH/H2O,含有TFA，speed ROD C18 5μm,4.6x30mm,梯度＝3min,流速＝5mL/min；流动相A:10％MeOH-90％H2O-0.1％TFA；流动相B:90％MeOH-10％H2O-0.1％TFA；波长＝220)；MS(ES):m/z＝228[M+H]+。
中间体7B:(7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酸苄基酯
将2-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-2-(苄基氧基羰基氨基)乙酸(0.446g,1.965mmol)于5mL无水THF中的溶液冷却至0℃，然后用草酰氯(0.171mL,1.34mmol)处理。将混合物在0℃搅拌30min。将中间体7A(0.235g,1.034mmol)和NMM(0.237mL,2.59mmol)于DCM(3mL)中的混合物添加至上述混合物中。将所得混合物在室温搅拌2h，然后过滤。将滤液用2M甲醇氨(10mL)处理并在室温搅拌12h。然后将混合物蒸发至干，将残余物用AcOH(5mL)处理并在室温搅拌2h。然后将反应混合物通过快速柱色谱纯化，得到中间体7B，为白色固体:70mg(16.29％)。HPLC:RT＝1.908min(ACN/H2O,含有TFA，UPLC R BEH C18,1.7μm,2.1x50mm,梯度＝4min,流速＝1.8mL/min；流动相A:含0.1％TFA的水；流动相B:乙腈；波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝416[M+H]+；1H NMR(CDCl3)δ8.681(brs,1H),7.565-7.583(d,J＝7.2Hz,1H),7.30-7.50(m,7H),7.097(brs,2H),6.80(brs,1H),6.22(d,J＝8.4Hz,1H),5.34(d,J＝7.2Hz,1H),5.17(s,2H),3.72(s,3H)。
中间体7C:3-氨基-7-甲氧基-5-苯基-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-2(3H)-酮
将中间体7B(0.5g,1.2mmol)用3.5mL(7倍体积)33％HBr的AcOH溶液处理并在室温搅拌2h。向反应混合物中添加乙醚(25mL)并通过过滤收集 沉淀的固体。将固体溶于水(3mL)中，并添加10％碳酸氢钠溶液直至溶液呈碱性。将产物用2x25mL乙酸乙酯萃取，并将有机层经无水硫酸钠干燥。将溶剂真空除去得到中间体7C，为白色固体：收率0.32g(98％)。HPLC:RT＝1.228(H2O/ACN,含有NH4OAc，Star RP-18(4x55)mm,3μm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝282[M+H+]；1H NMR(DMSO-d6:δ10.46(brs,1H),7.42-7.53(m,5H),7.19-7.25(m,2H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),4.25(s,1H),3.39(s,3H)。
中间体7D:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-((7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸叔丁酯
在氮气氛下将中间体7C(330mg,1.173mol)和中间体S-1(366mg,1.173mmol)于DMF(5mL)中的溶液冷却至0℃，然后用TBTU(490mg,1.525mmol)处理，随后历时3min滴加三乙胺(0.40mL,2.34mmol)。将反应混合物在室温再搅拌16h，然后冷却至0℃。添加水(10mL)，通过过滤收集所得固体，用水(5mL)洗涤并干燥得到中间体7D:收率650mg(89％)；HPLC:RT＝2.282(H2O/ACN with NH4OAc,Star RP-18(4x55)mm,3μm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝630[M+H+]；1H NMR(DMSO-d6:为非对映异构体混合物)δ10.66(s,1H),9.50-9.52(dd,J＝9.6,2.0Hz,1H),7.5-7.6(m,3H),7.5(m,2H),7.2-7.3(m,2H),6.76-6.70(d,J＝2.4,1H),5.25-5.29(t,8.8Hz,1H),3.7(s,3H),2.90-2.91(m,1H),2.50(m,1H),2.10-2.34(m,4H),1.48-1.90(m,4H),1.43(s,9H)。
中间体7E:(2S,3R)-6,6,6-三氟-3-((7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)氨甲酰基)-2-(3,3,3-三氟丙基)己酸
在0℃在氮气氛下历时2min向中间体7D(1.03mg,0.836mmol)于CH2Cl2(8mL)中的搅拌溶液中滴加三氟乙酸(3mL)。将反应混合物在0℃搅拌1h，然后在室温搅拌5h。然后将反应混合物浓缩并用冰冷水(50g)处理。在搅拌15min后，将灰白色沉淀过滤，用水(5mL)洗涤并干燥得到中间体7E，为白色固体:收率＝500mg(84％)；HPLC:RT＝2.282(H2O/AcCN,含有NH4OAc，Star RP-18(4x55)mm,3μm,梯度＝3min,波长＝220nm)；MS(ES):m/z＝572[M-H+]；1H NMR(DMSO-d6:为非对映异构体的混合物)δ10.67(s,1H),9.51-9.54(t,J＝7.2Hz,1H),7.5-7.6(m,3H),7.5(m,2H),7.1-7.3(m,4H),6.771(s,1H),5.29(t,J＝8.0Hz,1H),3.7(s,3H),2.80-2.91(m,1H),2.70(m,1H),2.50(m,1H),2.10-2.34(m,3H),1.50-1.90(m,3H)。
中间体7F:(2R,3S)-N1-((S)-7-甲氧基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)-2,3-二(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
在0℃在氮气氛下历时2min向中间体7E(500mg,1.047mmol)、pyBOP(0.65mg,1.25mmol)和氯化铵(0.28mg,5.23mmol)于DMSO(6mL)中的搅拌溶液中滴加N,N′-二异丙基乙胺(0.36mL,2.09mmol)。移除冰浴并将反应混合物在室温搅拌16h。然后将混合物倾倒至冰冷却水(20g)中并搅拌1h，然后过滤。将粗残余物经受制备型HPLC纯化/分离(ODH(250x4.6)mm 5micron,流动相A:0.2％二乙胺-己烷(80％),流动相B:乙醇(20％),@220和250nm流速-1ml/Min,运行-20min)，得到中间体7F，为白色固体:收率180mg(10％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.67(s,1H),9.444-9.463(d,J＝7.6Hz,1H),7.60-7.7(brs,1H),7.51-7.54(m,3H), 7.44-7.47(m,2H),7.24-7.28(m,2H),7.14-7.19(brs,1H),6.77-6.78(d,J＝4Hz,1H),5.3-5.31(d,J＝4Hz,1H),3.71(s,3H),2.78-2.84(m,1H),2.2.11-2.31(m,4H),1.60-1.74(m,4H),MS(M-1)＝571.HPLC RT＝9.31min(Xbridge苯基(4.6x150mm),3.5micron；1mL/min流速；梯度10％B-100％B历时12min(A:含0.05％TFA的水/CH3CN(95:5),B:含0.05％TFA的水/CH3CN(5:95)@220和250nm,15min运行)。
实施例7
在0℃在氮气氛下历时1min向中间体7F(30mg,0.052mol)和碳酸铯(34mg,0.1mmol)于DMF(2.5mL)中的搅拌溶液中滴加三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙基酯(24.3mg,0.10mm)。将反应混合物在室温再搅拌16h，然后冷却至0℃。然后将反应混合物用水(10mL)淬灭。将所得沉淀过滤，用水(5mL)洗涤并干燥得到实施例7。将粗物质通过制备型HPLC(Shield RP18(250x4.6)mm 5micron,流动相A:含0.05％TFA的水,流动相B:ACN@220和250nm流速-1ml/Min,梯度40％B-100％B历时25min)纯化，得到实施例7:收率17mg(50％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.55-7.60(m,3H),7.48-7.52(m,4H),7.329-7.351(d,J＝8.8Hz,1H),7.149-7.179(dd,J＝4Hz和12Hz 1H),6.805-6.812(d,J＝2.8Hz,1H),5.92(brs,1H),5.63(brs,1H)5.605-5.625(d,J＝8Hz,1H),5.14-5.22(m,1H),4.05-4.13(m,1H),3.76(s,3H),2.56-2.65(m,2H),2.09-2.30(m,5H),1.80-2.0(m,3H),MS(M+H+)＝655.HPLC RT＝11.17min(SunFire C18(4.6x150mm),3.5micron；1mL/min流速；梯度10％B-100％B历时12min(A:含0.05％TFA的水/CH3CN(95:5),B:含0.05％TFA的水/CH3CN(5:95)@220和250nm,15min运行)。
实施例8
(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-3-(2,2-二氟丙基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体8A:(3S)-3-氨基-5-苯基-1,3-二氢-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮
根据文献操作制备外消旋3-氨基-5-苯基-1,3-二氢-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮(J.Med.Chem.,49:2311-2319(2006),化合物#5)。将对映异构体分离(Berger SFC MGIII柱:Lux 25x3cm,5cm；流动相:30％MeOH+0.1％DEA于CO2中；流速:150mL/min；温度:40℃；检测器波长:250nm)，获得S-对映异构体中间体8A，为白色固体:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.67(1H,br.s.),7.58(1H,td,J＝7.65,1.76Hz),7.37-7.53(5H,m),7.23-7.30(2H,m),7.14-7.22(1H,m),4.23(1H,s),2.60(2H,br.s.)；HPLC:RT＝3.0625min(30％MeOH+0.1％DEA/CO2于OD-H柱上,3mL/min,35℃,96巴,230nm,10μl)；[α]D＝-208.3°(5.05mg/mL,MeOH)。
中间体8B:(2R)-3-(2,2-二氟丙基)-N1-((S)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)-2-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体8根据实施例1所示的一般操作自中间体8A和中间体S-4制备，为非对映异构体的1:1混合物。MS(ES):m/z 525.1(M+H+).HPLC RT＝0.85 min。(BEH C18 2.1x50mm,1.7μ,在1min内0至100B，维持时间0.5min,流速＝1ml/min,在254nm处检测,溶剂A:100％水/0.1％TFA；溶剂B:100％ACN/0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,MeOD)δppm 7.58-7.66(1H,m),7.54(3H,d,J＝1.54Hz),7.41(4H,s),7.19-7.29(1H,m),5.39(1H,s),2.78-2.92(1H,m),2.64-2.78(1H,m),2.34-2.59(2H,m),2.13-2.31(1H,m),1.95-2.14(1H,m),1.73-1.92(2H,m),1.47-1.69(3H,m)。
实施例8
向中间体8B(22mg,0.042mmol)和(溴甲基)环丙烷(28.3mg,0.210mmol)于DMF(1mL)中的搅拌混合物中添加氟化钾(40％于氧化铝上)(85mg,0.585mmol)。将反应混合物在室温搅拌16h。通过过滤除去固体物质并将滤液在真空中浓缩。将粗产物通过手性SFC(Berger SFC MGIII,柱:IC 25x15mm ID,0.5μm；流动相:80/20 CO2/EtOH,含有0.1％DEA，流速:50mL/min；在220nm处检测)纯化，得到实施例8(12mg,0.020mmol,48.5％收率),为白色固体.MS(ES):m/z 579.2(M+H+).HPLC RT＝0.97min。(BEH C182.1x50mm,1.7μ,在1min内0至100B，维持时间0.5min,流速＝1ml/min,在254nm处检测,溶剂A:100％水/0.1％TFA；溶剂B:100％ACN/0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.53-7.65(4H,m),7.49(2H,s),7.41(3H,d,J＝7.70Hz),5.92-6.10(1H,m),5.51(2H,d,J＝7.70Hz),4.21-4.38(1H,m),3.49-3.65(1H,m),2.79-2.98(1H,m),2.45-2.72(2H,m),2.07-2.33(3H,m),1.89-2.03(1H,m),1.76-1.89(1H,m),1.67(3H,t,J＝18.60Hz),0.82-1.00(2H,m),0.34-0.43(1H,m),0.17-0.33(1H,m),0.11(2H,br.s.)。
实施例9
(2R,3S)-N-((3S)-1-(环丙基甲基)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基)-2-(2,2-二氟丙基)-3-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体9A:(3S)-2-(2,2-二氟丙基)-N1-((S)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)-3-(3,3,3-三氟丙基)琥珀酰胺
中间体9A根据实施例1所示的一般操作自中间体8A和中间体S-5(为非对映异构体的1:1混合物)制备。HPLC RT＝0.84min。(BEH C18 2.1x50mm,1.7μ,在1min内0至100B，维持时间0.5min,流速＝1ml/min,在254nm处检测,溶剂A:100％水/0.1％TFA；溶剂B:100％ACN/0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,MeOD)δppm 7.55-7.68(1H,m),7.43-7.57(3H,m),7.33-7.44(3H,m),7.19-7.34(2H,m),5.32-5.49(1H,m),2.96-3.13(1H,m),2.48-2.62(1H,m),2.30-2.48(1H,m),2.11-2.29(2H,m),1.84-2.06(3H,m),1.50-1.71(3H,m).MS(ES):m/z＝525.2[M+H+]。
实施例9
实施例9根据实施例8所述相同的方式自中间体9A制备。将非对映异构体通过制备型SFC(Berger SFC MGIII,柱:IC 25x15mmID,0.5μm；流动相:80/20 CO2/EtOH,含有0.1％DEA，流速:50mL/min；在220nm处检测)分离得到标题化合物。MS(ES):m/z 579.2(M+H+).HPLC RT＝0.97min。(BEH C18 2.1x50mm,1.7μ,在1min内0至100B，维持时间0.5min,流速＝1ml/min,在254nm处检测,溶剂A:100％水/0.1％TFA；溶剂B:100％ACN/0.1％TFA)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 7.77-7.86(1H,m),7.50-7.66(3H,m),7.32-7.51(5H,m),6.36-6.50(1H,m),5.48(2H,d,J＝7.26Hz),4.18-4.39(1H,m),3.50-3.66(1H,m),2.82-2.99(1H,m),2.65-2.83(1H,m),2.35-2.59(1H,m),2.20-2.36(1H,m),2.01-2.24(3H,m),1.84-2.02(1H,m),1.59-1.71(3H,m),0.74-0.98(2H,m),0.33-0.44(1H,m),0.21-0.33(1H,m),0.10(2H,d,J＝4.62Hz)。
对比化合物10-13
对比化合物10-13可分别根据美国专利7,053,084实施例8、12a、38和45a所述的操作制备。
表1
生物分析
本发明化合物的药理学特性可通过多种生物分析来确定。已经对本发明化合物进行了下文所例示的生物分析。
Notch-CBF1转活化分析
基于Notch-CBF1(C启动子结合因子I)细胞的转活化分析是基于所释放的Notch细胞内结构域片段(NICD)连同CBF1和其它核因子一起作为转录因子的能力。使用荧光素酶分析法测量对Notch-CBF1转录活性的拮抗作用。用含有截短型Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受体的pCDNA3.1/Hygro质粒和含有4个CBF1结合位点复本的PGL3荧光素酶报导子载体短暂共转染HeLa子宫颈癌细胞。接着在不存在或存在测试化合物下测试细胞的Notch-CBF1活性。在T175烧瓶(4.5×106个细胞/烧瓶)中，使用Monster转染试剂盒(Mirus编号MIR2906)，根据制造商说明书瞬时转染维持于DMEM(含HEPES的高葡萄糖)、1×谷氨酰胺/青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)和10％胎牛血清中的HeLa细胞。表2表示了用于转染的各个DNA量。
表2
DNA(μg)CBF1(μg)载体(μg)总DNA(μg)
人类Notch1614.415.636.0
人类Notch2214.419.636.0
人类Notch30.314.421.336.0
人类Notch4414.417.636.0
转染后6小时，以胰蛋白酶处理细胞且95μL分析培养基(DMEM(含HEPES的高葡萄糖)、1×谷氨酰胺/青霉素/链霉素、0.0125％BSA、1×非必需氨基酸)中，以5×103个细胞/孔的密度涂布于已涂覆聚D-赖氨酸的384孔黑色组织培养板中。将含有最终浓度处于5μM至8.4×10-5μM(3倍连续稀释)范围内的测试化合物的分析培养基(5μL)添加至细胞中，接着在37℃和5％CO2下孵育细胞培养板18小时。对照孔含有DMSO媒介物(总计数)或0.5μM内部(in-house)小分子抑制剂(背景计数)。一式两份使用各样品。在与50μl荧光素酶试剂一起孵育20分钟后，根据制造商说明书(Promega，目录号：E2550)测量荧光素酶活性，且通过Envision培养板读取器(PerkinElmer,Boston,MA)分析。
化合物的拮抗剂作用是以100×[1-(平均样品-平均背景)/(平均总数-平均背景)]表示，其中样品为在测试化合物存在下的荧光素酶活性，背景等于在小分子抑制剂对照物存在下的荧光素酶活性，且总数为在DMSO孔中所诱导的信号。使用四参数逻辑拟合方程式将数据绘制成图，且IC50值定义为抑制50％荧光素酶活性时的化合物浓度。
下表3列出在上文Notch-CBF1转活化分析中所测量的本发明实施例1至9和对比化合物10-13的Notch1和Notch3 IC50值。在一些情况中，该值为多个实验的平均值，其中N为实验进行的次数。如由实施例1至9所例示的本发明化合物展示26.8nM或26.8nM以下的Notch1 IC50值和22.6nM或22.6nM以下的Notch3 IC50值。
表3
高通量(HT)代谢稳定性组
肠胃外给予的化合物进入血流且一次或多次穿过肝脏。不容易被肝脏代谢的化合物可以治疗有效的血浆含量给予并维持治疗有效的期限。
口服给予的化合物通常经由肠壁吸收进入血流中且首次穿过肝脏。在此首次穿过肝脏时不轻易地代谢的化合物可以以治疗有效量分布至身体的其它区域。
代谢稳定性分析使用人类、大鼠、小鼠、狗和/或猴微粒体在孵育10分钟后体外评估CYP介导的代谢稳定性。一式两份测试各化合物。
这些分析的结果表示为在孵育10分钟后反应混合物中残留的母体化合物的份数(残留百分比)。一般而言，这些结果仅用于评估测试化合物的由CYP介导的或NADPH依赖性的代谢程度。当化合物被显著代谢(残留<40％至50％)时，这表明因CYP介导的代谢作用而引起化合物的高体内清除率。然而，若化合物在这些体外分析中展现中(50％-80％)或低(>85％)代谢，则仍有可能经其它代谢和消除路径而引起高体内清除率。
假设CYP介导的代谢作用为主要消除路径，则这些分析的残留百分比结果预示着化合物体内清除率。在不同微粒体物种中，结果范围大致如表4所示。
表4
代谢稳定性-结果解释准则
方法与材料
与肝脏微粒体一起孵育
测试化合物以于100％DMSO中的3.5mM储备溶液形式得到。稀释测试化合物，得到含有1.4％DMSO的50μM乙腈(ACN)溶液，接着将其用作用于与微粒体一起孵育的100×储液。在代谢稳定性-人类、大鼠和小鼠分析组中对三个物种中的每一种或在代谢稳定性-狗或代谢稳定性-猴组中对个别物种分别地一式两份测试各化合物。在三步骤中组合化合物、NADPH和肝脏微粒体溶液进行孵育：
1.在37℃使于100mM NaPi(pH 7.4)、5mM MgCl2缓冲液中蛋白质浓度为1.1mg/ml的152μl肝脏微粒体悬浮液预升温。
2.将1.7μl的50μM化合物(98.6％ACN，1.4％DMSO)添加至同一管中且在37℃预先孵育5分钟。
3.通过添加17μl预升温的于100mM NaPi(pH 7.4)中的10mM NADPH 溶液引发反应。
充分混合反应组分，且将75μl反应混合物立即转移至150μl淬灭/停止溶液中(零时间点，T0)。在37℃孵育反应物10分钟，接着再将75μl等分试样转移至150μl淬灭溶液中。使用含有100μM DMN(注射品质对照的UV标准品)的乙腈作为淬灭溶液以终止代谢反应。
在X-12离心机SX4750转子(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,CA)中以1500rpm(约500×g)离心淬灭的混合物15分钟以使变性微粒体形成沉淀。接着将体积为90μl的含有母体化合物与其代谢物的混合物的上清液萃取物转移至另一96孔培养板中以进行UV-LC/MS-MS分析，从而测定混合物中残留的母体化合物的百分比。
表5
代谢稳定性分析-反应组分
样品分析-仪器
HPLC：泵：Thermo Surveyor；自动取样器：CTC/LEAP HTS；UV检测器：Thermo Surveyor PDAplus；柱：C18，3μm，2×20mm，具有0.5μm线内过滤器；用于结构完整性预分析的流动相：(A)含10mM乙酸铵的98％水、2％乙腈；(B)含10mM乙酸铵的10％水、90％乙腈；用于反应样品分析的流动相：(A)含0.1％甲酸的98％水、2％乙腈；(B)含0.1％甲酸的2％水、98％乙腈；(C)含0.1％氢氧化铵的水；(D)含0.1％氢氧化铵的乙腈。
质谱仪：Thermo TSQUltra三重四极杆质谱仪(triple-quadrapole mass spectrometer)；
样品分析：结构完整性预分析。
使用代谢稳定性结构完整性预分析以评定所分析的化合物的纯度。将57μl 3.5mM化合物的DMSO溶液容纳于96孔培养板中。用含有等体积乙腈、异丙醇和MilliQ-H2O的溶液18倍稀释3.5mM化合物DMSO储备溶液。通过在Thermo LCQ Deca XP Plus离子阱质谱仪上，使用具有Waters Sentry2.1mm保护柱的Waters XBridge C18，5μm，2×50mm柱和下表中所述的LC条件，以5μl进样和1毫升/分钟的流速进行LC-UV/MS来分析所得溶液(200μM)的结构完整性。所获得的数据由220nm的UV吸光度反映纯度。仅报导那些纯度大于50％的化合物的结果。
表6
代谢稳定性-结构完整性梯度
梯度时间(分钟)A％B％
0.001000
4.000100
5.000100
5.101000
6.001000
样品分析-孵育样品
在装备有加热电喷雾(H-ESI)源的Thermo TSQ三重四极杆质谱仪上，通过自动注入进行MS/MS条件优化，以获得SRM跃迁和其相应碰撞能量值。以90微升/分钟的流速注入于1:1甲醇:水中浓度为20μM的化合物溶液，接着与流速为50微升/分钟的流动相组合，之后引入加热电喷雾源中。首先使用流动相A和B(50％A和50％B)，且必要时使用流动相C和D(也具有50:50组成)优化所有化合物。将优化参数(包括极性、SRM跃迁和碰撞能量)储存于MICROSOFT数据库中。
使用由自动注入获得的质谱条件来分析来自代谢稳定性分析的孵育样品。进样体积为5μl且流速为0.8毫升/分钟。所用梯度展示于下表中。首先使用流动相A和B以一定梯度进样所有样品。必要时(例如，出于色谱原因)，以相同梯度，但使用流动相C和D再进样样品。所有LC-MS/MS分析参数以电子方式记录于原始数据文件中。
表7
代谢稳定性-样品分析梯度
梯度时间(分钟)A％(或C％)B％(或D％)
0.00955
0.20955
0.300100
1.050100
1.10955
1.50955
数据分析
用软件进行峰积分。通过比较各化合物的T10分钟样品的LC-MS/MS峰面积与T0分钟样品的LC-MS/MS峰面积来进行残留百分比计算。
品质对照
在各分析培养板中连同测试化合物一起测试一组三种化合物。只有当这些对照化合物的结果处于下文所示的预期范围内时才接受并上传数据。
表8
代谢稳定性分析-各微粒体物种的对照化合物值
SD＝标准偏差
代谢稳定性半衰期组
使用在人类或动物肝脏微粒体中体外测定的代谢速率和半衰期来确定化合物的固有清除率(CLint)和肝脏清除率(CLh,b)。这些参数适用于预测体内人类清除率，所述清除率定义体内药物暴露量(Obach等人，1997，1999)。
代谢稳定性半衰期分析组评估体外人类、大鼠、小鼠、狗和猴微粒体中CYP介导(NADPH依赖)的代谢的时程和速率。时程跨越45分钟孵育，且包括第0分钟、第5分钟、第10分钟、第15分钟、第30分钟和第45分钟时间点，在各时间点测量混合物中残留的测试化合物的量。
结果解释准则
代谢稳定性半衰期分析的结果表示为半衰期(T1/2，分钟)。一般而言，这 些结果仅用于评估测试化合物的由CYP介导或NADPH依赖性代谢的程度。当化合物显著代谢(T1/2<14分钟)时，这表明因CYP介导的代谢作用而引起高体内清除率。然而，若化合物在这些体外分析中展现中(14-70分钟)或低(>70分钟)代谢，则仍有可能经其它代谢和消除路径而引起高体内清除率。
在假定CYP介导的代谢作用为主要消除路径下，这些分析的结果预示化合物体内清除率。在人微粒体中，结果的范围大致如下表所示：
表9
代谢稳定性半衰期-结果解释准则
方法与材料
肝脏微粒体是购自BD-Biosciences(Woburn,MA)且NADPH是购自AppliChem Inc；所有其它试剂自Sigma获得。
与肝脏微粒体一起孵育
测试化合物以于100％DMSO中的3.5mM储备溶液形式得到。稀释测试化合物，得到含有1.4％DMSO的50μM乙腈(ACN)溶液，接着将其用作用于与微粒体一起孵育的100倍储液。在人类、大鼠、小鼠、狗和猴肝脏微粒体中测试各化合物。在三步骤中组合化合物、NADPH和肝脏微粒体溶液进行孵育：
1.在37℃使于100mM NaPi(pH 7.4)、5mM MgCl2缓冲液中蛋白质浓度为1.1mg/ml的450μl肝脏微粒体悬浮液预升温。
2.将5μl的50μM化合物(98.6％ACN，1.4％DMSO)添加至同一管中且在37℃预先孵育5分钟。
3.通过添加50μl预升温的于100mM NaPi(pH 7.4)中的10mM NADPH溶液引发反应。
充分混合反应组分，且将65μl立即转移至130μl淬灭/停止溶液中(零时间点，T0)。在37℃孵育反应物5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和45分钟且在各时间点将65μl等分试样转移至130μl淬灭溶液中。使用含有内 标物(100ng/ml)的乙腈作为淬灭溶液以终止代谢反应。
在X-12离心机SX4750转子(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,CA)中以1500rpm(约500×g)离心淬灭的混合物15分钟以使变性微粒体形成沉淀。接着将体积为90μl的含有母体化合物与其代谢物的混合物的上清液萃取物转移至另一96孔培养板中以进行LC/MS-MS分析，从而测定混合物中残留的母体化合物的百分比。
表10
代谢稳定性半衰期分析-反应组分
样品分析-仪器
HPLC：泵：Shimadzu LC-20AD系列二元泵；自动取样器：CTC/LEAPHTS。
下表11列出了本发明实施例1-9和对比化合物10-13在人代谢稳定性半衰期分析中测定的代谢半衰期值。在一些情况中，该值为多个实验的平均值，其中N为实验进行的次数。本发明的化合物，如实施例1-9所例证，具有67min或更长的代谢稳定性半衰期。相反，对比化合物10-13具有8min或更短的代谢稳定性半衰期。
表11
实施例HLM(t1/2,min.)N
1>1201
实施例HLM(t1/2,min.)N
2>1201
3772
41031
5>1201
6671
7>1201
8>1201
9>1201
对比化合物1081
对比化合物1161
对比化合物1261
对比化合物1331
由于在人代谢稳定性半衰期分析中的CYP介导代谢，本发明的示例化合物显示出令人惊讶的低清除率优势。本发明的化合物，如实施例1-9所例证，在人代谢稳定性半衰期分析中具有67min或更长的代谢半衰期。相反，对比化合物10-13在人代谢半衰期分析中具有8min或更短的代谢稳定性半衰期值。对比化合物10-13在人代谢稳定性分析中显示出高清除率，表明这些化合物通过肝微粒体除去。
将本发明化合物(实施例1-9)与美国专利7,456,172公开的对比化合物10-13相比，发现本发明的化合物是尤其有优势的。本发明化合物作为Notch1和Notch 3抑制剂的活性和对肝微粒体优良的代谢稳定性的组合具有令人惊讶的优势。如表3和11所示，在所报告的测试中，本发明的实施例1-9的Notch 1 IC50值为26.8nM或更低并且Notch 3 IC50值为22.6nM或更低；在人代谢稳定性半衰期分析中，人代谢稳定性半衰期为37min或更长。相反，在类似的测试中，对比化合物10-13的Notch 1 IC50值的范围为5.1nM至64.1nM并且Notch 3 IC50值的范围为12.5nM至74.5nM；且人代谢稳定性半衰期为8min或更短。