一种高容量硼亲和分离材料及其制备方法与应用.pdf

本发明公开了结构式（I）所示的硼亲和分离材料，其将表面引发原子转移自由基聚合和末端修饰技术相结合，以含苯硼酸的烯类化合物为单体，在固体基质表面聚合，然后通过点击化学利用含有炔基的苯硼酸进行聚合物链末端功能化，得到具有高密度苯硼酸基团的分离材料。本发明的制备得的分离材料吸附容量和特异性较高，用于复杂样品中顺式邻二羟基物质的分离和富集，具有材料用量少，回收率和灵敏度较高的特点。。

权利要求书
1.  结构式（I）所示的硼亲和分离材料，
。

2.  权利要求1所述的高容量硼亲和分离材料的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）3-氨基苯硼酸溶于氢氧化钠溶液，冰浴下加入丙烯酰氯反应，调节pH 1-2，过滤、洗涤、干燥，制备得3-丙烯酰胺基苯硼酸；
（2）将3-氨基苯硼酸和碳酸氢钠溶于体积比为1:1的甲醇/水溶液中，滴加炔丙基氯甲酸酯反应，过滤，有机相减压蒸馏，乙酸乙酯复溶，过滤、干燥得到3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸；
（3）将固体基质分散于甲苯中，滴加4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷，加热回流反应，抽滤、洗涤、干燥得到表面键合引发剂的固体基质，所述固体基质为硅胶或硅胶包覆的磁性纳米粒子；
（4）以N,N-亚甲基甲酰胺为溶剂，在2, 2’-联吡啶和溴化亚铜催化下，表面键合引发剂的固体基质和3-丙烯酰胺基苯硼酸单体反应，经洗涤得到表面接枝聚丙烯酰胺基苯硼酸的固体基质；
（5）将表面接枝聚丙烯酰胺基苯硼酸的固体基质分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入叠氮钠反应，经洗涤、干燥得末端叠氮基修饰的固体基质；
（6）以四氢呋喃为溶剂，2,2’-联吡啶和溴化亚铜催化下，末端叠氮基修饰的固体基质与3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸进行“点击反应”，经洗涤、干燥得硼亲和分离材料。

3.  根据权利要求2所述的硼亲和分离材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷的浓度为80-120 mM。

4.  根据权利要求2所述的硼亲和分离材料的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的3-丙烯酰胺基苯硼酸单体与表面键合引发剂的固体基质的质量比为5～10:3～6，溴化亚铜、2, 2’-联吡啶和3-丙烯酰胺基苯硼酸单体的摩尔比为0.5～1:1～3:50～100。

5.  根据权利要求2所述的硼亲和分离材料的制备方法，其特征在于：步骤（4）的反应温度为90 ℃，反应时间为8-16小时。

6.  权利要求1所述的硼亲和分离材料在分离和富集含有顺式邻二羟基结构的儿茶酚胺、核苷、糖类和糖蛋白中的应用。

说明书一种高容量硼亲和分离材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种苯硼酸功能化聚合物修饰的高容量硼亲和分离材料及其制备方法，属于新型分离材料合成技术领域。
背景技术
硼酸可以与顺式邻羟基形成可逆的、pH调控的环酯，基于这样一个特异性较高特性，硼亲和材料已经被广泛的用于对含有顺式邻二羟基物质的选择性分离与富集，例如核苷、糖类、糖蛋白和儿茶酚胺等物质。可以看到，含有顺式邻二羟基的物质多与蛋白质组学、代谢组学、糖组学等生命科学中的热点领域的研究相关，硼亲和材料的发展对生命科学领域具有重要的意义。
目前，硼亲和材料主要是通过选取合适的双官能团分子对基质进行反应，使得双官能团分子一端固定在基质表面，另外一端就可以与硼酸配体反应，将硼酸基团修饰到基质表面。但是这样得到的吸附材料表面结合位点有限，吸附容量大都不尽人意，不能达到高通量处理样品的要求，而且吸附剂用量也比较大，可能导致回收率不高。近年来，利用硼酸功能化聚合物修饰的材料很大程度上提高了硼亲和材料的吸附容量，如自由基聚合[ACS Applied Materials & Interfaces. 2013, 5(17):8351-8358]、乳液聚合[Journal of Chromatography A. 2009, 1216(44): 7558-7563]、沉淀聚合[ACS Applied Materials & Interfaces. 2014, 6(3): 2059-2066]等。尽管如此，发展高容量的硼亲和材料还需要进一步的努力。
研究表明，表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）反应可以通过控制引发剂前驱体浓度、单体浓度和聚合时间来控制固体基质表面聚合物分子刷的密度和链长；更重要的是，经聚合反应，聚合物链端仍存有活性卤素原子，该活性卤素原子的存在为聚合物链的进一步反应提供了活性位点，可以制备多功能团聚合物；也可以作为大分子引发剂继续反应[Chemical Reviews. 2001,101(9):2921-2990]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性较好、吸附容量高的高容量硼亲和分离材料及其制备方法。
本发明应用SI-ATRP的方法，以3-丙烯酰胺基苯硼酸为单体，在固体基质表面进行聚合，然后利用末端修饰技术，通过“点击反应”将带有炔基的苯硼酸配体键合到聚合物链末端。这种表面键合了末端硼酸功能化的硼酸聚合物链的材料，具有较多的苯硼酸吸附位点。本发明分离材料应用于复杂样品中痕量顺式邻二羟基物质的分离富集中，吸附材料用量较少，提高了复杂样品分析的灵敏度和准确性。
本发明的实现过程如下：
结构式（I）所示的硼亲和分离材料，
。
上述高容量硼亲和分离材料的制备方法，包含如下步骤：
（1）3-氨基苯硼酸溶于氢氧化钠溶液，冰浴下加入丙烯酰氯反应，调节pH 1-2，过滤、洗涤、干燥，制备得3-丙烯酰胺基苯硼酸；
（2）将3-氨基苯硼酸和碳酸氢钠溶于体积比为1:1的甲醇/水溶液中，滴加炔丙基氯甲酸酯反应，过滤，有机相减压蒸馏，乙酸乙酯复溶，过滤、干燥得到3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸；
（3）将固体基质分散于甲苯中，滴加4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷，加热回流反应，抽滤、洗涤、干燥得到表面键合引发剂的固体基质，所述固体基质为硅胶或硅胶包覆的磁性纳米粒子；
（4）以N,N-亚甲基甲酰胺为溶剂，在2, 2’-联吡啶和溴化亚铜催化下，表面键合引发剂的固体基质和3-丙烯酰胺基苯硼酸单体反应，经洗涤得到表面接枝聚丙烯酰胺基苯硼酸的固体基质；
（5）将表面接枝聚丙烯酰胺基苯硼酸的固体基质分散于N,N-二甲基甲酰胺中，加入叠氮钠反应，经洗涤、干燥得末端叠氮基修饰的固体基质；
（6）以四氢呋喃为溶剂，2,2’-联吡啶和溴化亚铜催化下，末端叠氮基修饰的固体基质与3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸进行“点击反应”，经洗涤、干燥得硼亲和分离材料。
 [0008] 上述步骤（3）所述的4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷的浓度为80-120 mM。
上述步骤（4）所述的3-丙烯酰胺基苯硼酸单体与表面键合引发剂的固体基质的质量比为5～10:3～6，溴化亚铜、2, 2’-联吡啶和3-丙烯酰胺基苯硼酸单体的摩尔比为0.5～1:1～3:50～100。
上述步骤（4）的反应温度为90 ℃，反应时间为8-16小时。
本发明制备的硼亲和分离材料可应用于分离和富集含有顺式邻二羟基结构的儿茶酚胺、核苷、糖类和糖蛋白。
本发明的优点如下：（1）本发明为新型高容量硼酸亲和材料的制备提供了新的方法，反应可控性较好，接枝量高，制备得到的硼亲和材料表面功能基团多，吸附容量高，特异性好；（2）本发明提供的高容量硼亲和材料可以有效地分离富集复杂生物样品中痕量的顺式邻二羟基物质，用于实际复杂样品时，用量少，回收率高，灵敏度高，该材料在复杂生物样品分析领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中各步反应所得到 silica-Cl (a), silica-pAAPBA-Cl (b), silica-pAAPBA-N3 (c)和silica-pAAPBA-PBA (d) 的红外谱图；
图2为实施例1中硅胶修饰前后的热重曲线，裸硅胶 (a)，silica-Cl (b)， silica-PAAPBA-Cl (c)-(e) 聚合反应时间分别为 1 h (c), 5 h (d), 16 h (e)，silica-PAAPBA-PBA (f)；
图3为实施例1制备的硼亲和材料分离富集血浆中痕量顺式邻二羟基药物肾上腺素和异丙肾上腺素前后对比色谱图； I. 空白血; II. 空白血加标液; III. 富集后洗脱液。色谱条件：流动相乙腈-10 mM NaH2PO4 (pH 3.0; 8:92, v/v); 流速:1.0 mL/min; 进样量: 20 mL; 检测波长: 280 nm；峰分别为: 1.肾上腺素; 2.异丙肾上腺素；
图4为实施例2制备的硼亲和吸附剂对不同浓度干扰物质混合溶液的萃取分离效果色谱图，Ⅰ未萃取混合溶液；Ⅱ萃取富集后溶液，色谱条件：流动相，乙腈-10 mM NaH2PO4 (pH 3.0; 8:92, v/v)；流速，1.0 mL/min；进样量，20 μL ；UV检测波长，280 nm；图中色谱峰分别为：1. 肾上腺素；2. 多巴胺；3.  对苯二酚；4. 5-羟色胺；5. 苯胺；6. 邻苯二酚。
具体实施方式
实施例1：以硅胶为基质的高容量硼亲和材料的制备
（1）称取5.0 克活化后的硅胶，然后将其分散在100 mL重蒸甲苯中，2.0 mL 浓度为82.5 mM 4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷（4-CPTS），110℃反应12 h，反应结束后依次用甲苯、甲醇和丙酮洗涤产物3-4次，50℃真空干燥，即得表面键合引发剂的硅胶（简称silica-Cl）；
（2）称取上述silica-Cl 1.0 克，超声分散于N,N-二甲基甲酰胺，加入1.6克3-丙烯酰胺基苯硼酸和0.20克2, 2’-联吡啶；混合物通过反复冷冻-抽真空-解冻循环，氮气保护下快速加入0.10克溴化亚铜；持续搅拌，90 ℃反应8-16小时后甲醇和水依次洗涤。为了彻底清洗残留的催化剂，得到的硅胶颗粒分散于60 mL甲醇/0.25 M EDTANa2（1:1, v/v） 溶液中，40 ℃络合4 h，然后用甲醇和水反复多次洗涤，50℃真空干燥，即得聚合物修饰的硅胶（简称silica-pAAPBA-Cl）；
（3）上述Silica-pAAPBA-Cl 0.5克和0.16克NaN3加入20 mL DMF均匀分散，80 ℃反应16 h，反应后依次用水、甲醇和丙酮洗涤，50℃真空干燥，得到末端叠氮基修饰的硅胶（简称silica-pAAPBA-N3）；
（4）称取0.5 克silica-pAAPBA-N3超声分散在25 mL 四氢呋喃，加入0.38克3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸和0.072克溴化亚铜，冷冻-抽真空-解冻两个循环，再加入0.156克2, 2’-联吡啶，40 ℃反应48 h。冰水浴冷却停止反应，并用四氢呋喃，甲醇洗涤，50 ℃真空干燥，得到高容量硼亲和分离材料（简称silica-pAAPBA-PBA）。
分别用傅里叶红外光谱法和热重分析法对吸附材料进行表征。如图1所示，与引发剂固定硅胶（谱图a）相比，silica-pAAPBA-Cl的谱图（谱图b）在1675cm-1和1555 cm-1处分别出现了酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的特征吸收，同时，1342 cm-1处出现了B-O的吸收峰，704 cm-1处苯环间位二取代的特征吸收，表明AAPBA成功地接枝到了硅胶的表面。对于silica-pAAPBA-N3（谱图c），2101 cm-1处出现的叠氮基的特征吸收峰说明聚合物链末端的氯原子成功被叠氮基取代。点击反应后，2101 cm-1处叠氮基的特征吸收峰消失（谱图d），说明叠氮基与带有炔基的苯硼酸反应得到吸附剂silica-pAAPBA-PBA。
从热重曲线（图2）中可以看到，当温度升高到700 ℃裸硅胶失重为3.0%；引发剂固定硅胶silica-Cl失重9.3%；ATRP聚合时间1 h、5 h和16 h的硅胶silica-pAAPBA-Cl分别失重15.5%、25.9%和31.2%，根据重量损失可以估算出AAPBA的含量分别为0.65 mmol/g、1.20 mmol/g和1.48 mmol/g，说明随着聚合时间的延长，接枝到硅胶表面的AAPBA逐渐增多；与silica-pAAPBA-Cl相比，末端修饰后的吸附剂silica-pAAPBA-PBA的质量损失从31.2%增加到了33.0%，说明PCAPBA成功键合到聚合物链末端。综上，可以认为3-丙烯酰胺基苯硼酸的聚合与3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸的末端修饰都是成功的。
实施例2：以硅胶包覆的磁性纳米粒子为基质的高容量硼亲和分离材料的制备
（1）称取2.0 克通过原硅酸乙酯水解包覆硅胶的四氧化三铁磁性纳米粒子，然后将其分散在100 mL重蒸甲苯中，2.0 mL 浓度为120.2 mM 4-氯甲基苯基三甲氧基硅烷（4-CPTS），110℃反应12 h，反应结束后依次用甲苯、甲醇和丙酮洗涤产物3-4次，50℃真空干燥，即得表面键合引发剂的磁性纳米粒子；
（2）称取上述磁性粒子1.0克，超声分散于N,N-二甲基甲酰胺，加入1.6克3-丙烯酰胺基苯硼酸和0.20克2, 2’-联吡啶；混合物通过反复冷冻-抽真空-解冻循环，氮气保护下快速加入0.10克溴化亚铜；持续搅拌，90 ℃反应一定的时间后甲醇和水依次洗涤。为了彻底清洗残留的催化剂，得到的硅胶颗粒分散于60 mL甲醇/0.25 M EDTANa2（1:1, v/v） 溶液中，40℃络合4 h，然后用甲醇和水反复多次洗涤，50℃真空干燥，即得聚合物修饰的磁性纳米粒子；
（3）上述磁性纳米粒子 0.5克和0.16克NaN3加入20 mL DMF均匀分散，80 ℃反应16 h，反应后依次用水、甲醇和丙酮洗涤，50 ℃真空干燥，得到末端叠氮基修饰的磁性纳米粒子；
（4）称取0.5 克叠氮基修饰的磁性纳米粒子，超声分散在25 mL 四氢呋喃，加入0.38克3-((丙基-2-炔氧基)甲酰胺)苯硼酸和0.072克溴化亚铜，冷冻-抽真空-解冻两个循环，再加入0.156克2, 2’-联吡啶，40 ℃反应48 h。冰水浴冷却停止反应，并用四氢呋喃，甲醇洗涤，50 ℃真空干燥，得到以磁性纳米粒子为基质的高容量硼亲和分离材料。
实施例3：以硅胶为基质的高容量硼亲和分离材料对邻苯二酚的吸附
称取一系列20 毫克实施例1中制备的以硅胶为基质的高容量硼亲和材料，分别加入5 mL 不同浓度邻苯二酚溶液，超声分散，25℃恒温振荡器（150 r/min）振荡10 min达到吸附平衡，离心，收集上清液，进行色谱分析。该硼亲和材料对邻苯二酚的最大吸附量为513.6 μmol/g。
实施例4：以硅胶包覆的磁性纳米粒子为基质的高容量硼亲和分离材料对果糖的吸附
称取一系列10 毫克实施例2中制备的以硅胶包覆的磁性纳米粒子为基质的高容量硼亲和材料，分别加入5 mL 不同浓度果糖溶液，超声分散，25 ℃恒温振荡器（150 r/min）振荡3小时达到吸附平衡，外加磁场收集上清液，通过三组分竞争实验荧光分光光度计检测。该硼亲和材料对果糖的最大吸附量为736.8 μmol/g。
实施例5：硅胶为基质的高容量硼亲和材料对血浆中顺式邻二羟基药物的富集
空白血浆由健康家兔心脏穿刺取血，搅拌去除纤维蛋白原，10000 rpm离心10 min收集上清液即得到空白兔血浆，-20℃冷冻保存。取0.9 mL 空白血浆，加入肾上腺素和异丙肾上腺素标准溶液，再加入100 μL 10%三氯乙酸溶液，涡旋振荡1 min，10000 rpm离心10 min 沉淀蛋白，收集上清液，调节pH为8.5后加入2.0 mg silica-pAAPBA-PBA超声分散，25 ℃恒温振荡器 150 r/min振荡10 min达到吸附平衡，弃去上清液，缓冲液淋洗三次后，加入1.0 mL 5%醋酸甲醇溶液，振荡洗脱10 min，收集洗脱液，氮气吹干，200 μL NH4Cl–NH3缓冲液复溶，取20 μL进样，HPLC-UV检测。结果如图3，表明该硼亲和材料特异性较高，可以除去复杂基质的干扰，同时，因为材料吸附容量高，萃取时材料的用量很少。
实施例6：磁性高容量硼亲和分离材料对邻二羟基物质的选择性分离
用50 mM 的NH4Cl–NH3缓冲液（pH 8.5）分别配制一系列不同浓度的六种物质的混合溶液，其中含有顺式邻二羟基的物质有邻苯二酚、多巴胺和肾上腺素，在四组溶液中浓度均为5 μg/mL；不含顺式邻二羟基的干扰物质有苯胺、对苯二酚和5-羟色胺，此三种干扰物质的浓度逐渐增大，在4组溶液中分别为5、50、250和500 μg/mL。20.0 mg 实施例2中制备的磁性硼亲和材料加入5.0 mL 上述不同混合液中，超声分散，25℃恒温振荡器 150 r/min振荡10 min达到吸附平衡，弃去上清液，缓冲液淋洗三次后，加入1.0 mL 5%醋酸甲醇溶液，振荡洗脱10 min，收集洗脱液，氮气吹干，200 μL NH4Cl–NH3缓冲液复溶，取20 μL进样，HPLC-UV检测。结果如图4，该吸附剂选择性较高，有效地分离出含有顺势邻二羟基的物质。
以上所述仅为本发明的较好实施例，凡依本发明申请专利范围同等变化的修饰，均属本发明的涵盖范围。