茋类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了茋类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用，属于药物技术领域，具体涉及从重楼中分离得到的一种茋类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，可以从重楼中提取、分离纯化得到，纯度高。体外试验证明该化合物能够抑制黑色素瘤细胞的增殖，可以用来开发成治疗黑色素瘤的药物。

权利要求书
1.  具有下述结构式的化合物（Ⅰ）：
。

2.   药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（Ⅰ）和药学上可接受的载体。

3.  根据权利要求1所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a）重楼药材粉碎，用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b）将步骤（a）中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除糖，依次用10%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%洗脱液，减压浓缩；（c）将步骤（b）中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d）将步骤（c）中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）将步骤（d）中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为55%的甲醇水溶液等度洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩；（f）浓缩物用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化，甲醇洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

4.  根据权利要求1所述的化合物（Ⅰ）在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

5.  根据权利要求2所述的组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

说明书茋类化合物,含其的药物组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从重楼中分离得到的一种茋类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
重楼属植物是一类极具药用价值的植物，全世界共有24种，我国拥有19种，其中西南各省区种类和资源极为丰富。国内外学者很重视对重楼的研究，其具有较强的生理活性及独特的药用价值。重楼在李时珍所著的《本草纲目》中以蚤休之名收载，为下品；并以重台根等异名被历代本草古籍记载。《中华人民共和国药典》收载该药为云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.或七叶一枝花P. polyphylla Simth var. chinensis (F.) Hara的干燥根茎。又名蚤休、七叶一枝花、草河车。主产于长江流域及南方各省。秋季采挖，除去须根，洗净，晒干。切片生用。
重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症。现已从该属植物中分离鉴定了50余种化合物，主要有C27甾体皂苷、C21孕甾烷苷、脂肪酸酯、甾醇及其苷、黄酮苷、Β2蜕皮激素及多糖。其中甾体皂苷44种，占总化合物的80%以上，甾体皂苷元为螺甾烷醇类、异螺甾烷醇类、味甾烷醇类以及变形螺甾类，均有很强的生理和药理活性。现代药理研究重楼有止血、祛痰和抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀灭精子、抗细胞毒等作用，临床用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及肿瘤等，都有显著的疗效。在我国，重楼是著名的中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊等的主要组成药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种从重楼中分离得到的一种茋类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物（Ⅰ）：

所述的药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（Ⅰ）和药学上可接受的载体。
所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，包含以下操作步骤：（a）重楼药材粉碎，用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b）将步骤（a）中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除糖，依次用10%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%洗脱液，减压浓缩；（c）将步骤（b）中的70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d）将步骤（c）中的组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）将步骤（d）中的组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为55%的甲醇水溶液等度洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩；（f）浓缩物用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化，甲醇洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
所述的化合物（Ⅰ）在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
所述的组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物Ⅰ，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
说明书附图
图1为化合物(Ⅰ)结构式。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.主要试剂：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
2.材料和仪器
人A375 黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物Ⅰ，纯度 99%，为自制。DMEM 培养基、0.25%胰酶购自美国 Gibco公司；MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝、DMSO（二甲基亚砜）、BrdU购自美国Sigma公司；鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司；山羊抗鼠二抗购自美国Cell signaling公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。
恒温CO2培养箱，普通冰箱，-80℃冰箱均为美国Forma公司；超净工作台购自中国苏州净化工程公司；倒置显微镜，倒置荧光显微镜购自olympus公司；电热恒温培养箱购自中国上海跃进医疗器械厂；自动酶标仪购自日本Wako公司；紫外分光光度仪购自美国Beckman公司；J6-HC高速离心机购自美国Beckman公司；低温微量离心机购自德国Eppendorf公司；振荡摇床购自美国Forma公司。
实施例1
（a）重楼药材粉碎（10kg），用75%乙醇热回流提取,30L×3次，每次2小时，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚（2L×3）、乙酸乙酯（2L×3）和水饱和的正丁醇（2L×3）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（242g）和正丁醇萃取物；（b）步骤（a）中的乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除糖，依次用10%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%洗脱液，减压浓缩（135g）；（c）步骤（b）中的70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d）步骤（c）中的组分4（34g）用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）步骤（d）中的组分2（12g）用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为55%的甲醇水溶液等度洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩；（f）浓缩物（5g）用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化，甲醇洗脱，根据薄层板收集馏分，减压浓缩得到纯的化合物Ⅰ（22mg）。
结构确证：白色针状的结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 291.1046，结合核磁特征可得分子式为C17H16O3。核磁共振氢谱数据δH（ppm, CDCl3, 600MHz）：7.50（1H，s，1-H），7.18（1H，s，3-H），7.14（1H，s，7-H），6.65（1H，s，10-H），6.65（1H，s，14-H），2.36（1H，s，15-H），2.33（1H，s，16-H），2.16（2H，s，17-H），9.68（2H，s，11-OH），9.68（1H，s，13-OH）；核磁共振碳谱数据δC（ppm, CDCl3, 150MHz）：117.2（CH，1-C），131.4（C，2-C），126.3（CH，3-C），119.9（C，4-C），152.1（C，5-C），123.6（C，6-C），102.7（CH，7-C），157.0（C，8-C），130.1（C，9-C），104.0（CH，10-C），158.0（C，11-C），110.1（C，12-C），158.0（C，13-C），104.0（CH，14-C），22.0（CH3，15-C），15.8（CH3，16-C），8.9（CH3，17-C）；碳原子标记参见附图1。
实施例2
一、试验方法
1、细胞培养
1.1细胞复苏
将冻存在液氮罐中的A375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37℃的温水中，轻轻摇动使其尽快融化（大约lmin)。然后吸出细胞悬液，加入到已加有2mL培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，800r/min，离心5min，弃去上层培养基。用含有 10%FBS和1%的青霉G/链霉素的DMEM培养基8mL制成细胞悬液后，接种至10cm培养盘中。然后置于5% CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。
1.2细胞传代
显微镜下观察细胞融合度达80%-90%时即可进行传代。先用2mLPBS洗涤细胞2次，然后加入0.25%的胰酶lmL。轻轻水平摇动培养盘，使消化液能覆盖细胞的表面，然后置于37℃温箱中消化约lmin。置于显微镜下见细胞变圆回缩，然后迅速加入1mL 含有FBS的培养基终止消化。轻轻吹打至细胞分散均匀，然后根据细胞密度按照1:2或1:3传代，重新接种于新的培养盘，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。
1.3细胞冻存
取1盘处于对数生长期的细胞，胰酶消化并收集到离心管中，1000r/min离心5min,弃上清。然后加入lmL冻存液，轻轻吹散细胞制成细胞悬液，将细胞悬液加入到1.5mL的冻存管中。在冻存管上标明细胞的名称，保存时间，保存者的姓名。先将冻存管放入4℃冰箱，放置约30min。接着置于-20℃冰箱，放置约2h。然后放于-80℃超低温冰箱中放置过夜。第二天将冻存的细胞置于液氮罐中长期保存。
2、细胞计数法绘制细胞生长曲线
（1）取对数生长期A375黑色素瘤细胞，计数，调整细胞密度为2×104/mL。
（2）将细胞悬液接种于12孔板中，1.5mL/孔。
（3）12h后,待细胞贴壁，换1mL无血清DMEM 培养基，并分别用5μmol/L化合物Ⅰ和DMSO(对于DMSO稀释的化合物Ⅰ控DMSO浓度在1/1000以下，确保对细胞无害)处理，每组细胞设3个平行孔，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。
（4）分别于0h、24h、48h、72h、96h终止培养，收集各组细胞, 加入0.25%胰蛋白酶消化，离心，重悬。
（5）细胞计数：吸取细胞混悬液10μl,加入等体积的台酚蓝区分活细胞，吸取10μL混合液轻轻加入细胞计数板凹槽中，保证无空隙和气泡。倒置显微镜下，计数周边四个大方格内的细胞数，代入公式：原细胞混悬液浓度(细胞数/mL)=(4个大方格的细胞数/4)×104×稀释倍数。
（6）计算活细胞数目，绘制细胞生长曲线。
3、MTT 法检测细胞增殖
（1）取对数生长期的 A375 细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞悬液中细胞的密度为 2×104/mL。
（2）将各组细胞悬液接种于 96 孔培养板中，200μL每孔，每组细胞3个平行孔，同时设空白对照孔（只加入培养基）。
（3）12h 待细胞贴壁后，换 200μL 无血清 DMEM 培养基，并分别用 5μmol/L化合物Ⅰ和 DMSO 处理。
（4）分别于 0、1、2、3、4天终止培养。
（5）每孔加入浓度为 5mg/mL 的四甲基偶氮唑蓝20μL继续培养细胞4h。
（6）吸弃各小孔内的培养基，加入 200μLDMSO，在微振荡器上振荡 10min，使结晶物充分溶解。
（7）以空白对照孔调零，采用自动酶标仪测定各孔 570 nm 处的吸光光度值（OD 值)，以对应的 OD 值表示细胞增殖能力，各组取3个平行孔的平均值，以时间为横轴，以各吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。
4、BrdU免疫荧光检测细胞增殖
（1）准备爬片：将爬片放入75%酒精中浸泡24h消毒处理。
（2）将无菌爬片放置24孔培养板内，取对数生长期的A375黑色素瘤细胞，消化，离心，制成细胞悬液，2×104cell/孔，接种于放有爬片的孔中。
（3）12h待细胞贴壁后，换1mL无血清DMEM培养基，并分别用5μmol/L化合物Ⅰ和DMSO处理。
（4）72h后，在培养基中加入10μlBrdU(1mg/mL), 37℃培养1h。
（5）取出24孔板，冷PBS洗5min×2次，4%多聚甲醛固定细胞，室温30min。
（6）PBS洗5min×3次。
（7）2mol/L HCl处理，室温10min后，37℃ 20min。
（8）细胞用 1%Triton×-100通透处理，洗5min×3次。
（9）10%山羊血清封闭，室温，lh。
（10）加入BrdU单克隆抗体(1:300 稀释)，37℃ 1.5h。
（11） l×PBST摇洗5min×3次。
（12）加 BrdU二抗(1:300)，室温避光 1h 后，l×PBST 洗 3 次。
（13）DAPI 染色液染细胞核 15min。
（14）PBS 洗 5min×3 次。
（15）加 1滴抗荧光淬灭封片液，中性树胶封片，荧光显微镜观察、照相。
5、统计分析
应用 SPSS 17.0 统计分析软件，采用两独立样本 t 检验及单因素方差分析进行数据分析，数据用 X ±S 表示，P<0.05为有统计学意义。
二、数据分析
细胞形态观察及计数显示，与DMSO对照组相比，化合物Ⅰ处理A375细胞 24h、48h、72h后，活细胞数显著降低达44.5%。结果见表1（*P <0.05, ** P <0.01 versus DMSO group）。
MTT结果显示，化合物Ⅰ能显著抑制 A375 细胞增殖，OD 值呈浓度（5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）依赖性下降达 27.3%，差异有统计学意义。结果见表2（*P <0.05, ** P <0.01 versus DMSO group）。
通过 BrdU免疫荧光染色进一步证实化合物Ⅰ能抑制黑色素瘤细胞增殖，5μmol/L化合物Ⅰ处理 A375 细胞3天后，与对照（26.07±2.59%）相比，实验组 BrdU阳性细胞百分比（7.55±2.76%）显著降低（P=0.000）。
本实验检测了化合物Ⅰ对黑色素瘤细胞增殖的影响，细胞计数和 MTT分析结果均证明化合物Ⅰ可显著抑制黑色素瘤细胞生长，且细胞数与化合物Ⅰ浓度呈依赖性下降。BrdU免疫荧光染色也显示化合物Ⅰ处理后BrdU阳性细胞百分比显著低于对照组，说明化合物Ⅰ可抑制 A375 黑色素瘤细胞增殖。化合物Ⅰ可能是黑色素瘤的有效靶向治疗药物。
表1 细胞计数法测定化合物Ⅰ对A375黑色素瘤细胞的抑制（×l04/ml）

表2 MTT法测定化合物Ⅰ对A375黑色素瘤细胞活力的抑制

      实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。