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1、10申请公布号CN104109706A43申请公布日20141022CN104109706A21申请号201410354675622申请日20140724C12P21/06200601C07K1/36200601C07K1/34200601C07K1/1620060171申请人南京财经大学地址210023江苏省南京市栖霞区文苑路3号申请人南京兴东峰生物科技有限公司72发明人王立峰王玉梅谢慧慧陈静宜张晶何荣袁建鞠兴荣74专利代理机构南京钟山专利代理有限公司32252代理人戴朝荣54发明名称一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法57摘要本发明提供了一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤将菜籽脱壳，并。
2、经过索氏抽提脱油，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛；用碱提酸沉的方法制得菜籽蛋白，并冷冻干燥；用碱性蛋白酶ALCALASE24L水解；通过5K的超滤膜，收集分子量小于5K的组分；通过SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离，得到若干组分，筛选分离条件，并收集具有紫外吸收峰的组分；使用过氧自由基清除能力的测定由凝胶柱分离得到的各组分的抗氧化性，收集具有较高抗氧化性的组分，经过旋转浓缩和冷冻干燥即得到菜籽抗氧化肽。本发明以酶解菜籽蛋白水解物为原料，分离菜籽蛋白水解物以得到具有较高抗氧化活性的菜籽肽组分，提高菜籽蛋白的利用率。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局1。
3、2发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页10申请公布号CN104109706ACN104109706A1/1页21一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤A将菜籽脱壳，并经过索氏抽提脱油，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；B将步骤A得到的菜籽粉用碱提酸沉的方法制得菜籽蛋白，并冷冻干燥；C将步骤B得到菜籽蛋白用碱性蛋白酶ALCALASE24L水解，得到菜籽蛋白水解物；D将步骤C得到的菜籽蛋白水解物通过5K的超滤膜，收集分子量小于5K的组分；E将步骤D收集的分子量小于5K的组分通过SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离，得到若干组分，并收集具有紫外吸收峰的组分；F使用过。
4、氧自由基清除能力的测定由步骤E中凝胶柱分离得到的各组分的抗氧化性，收集具有较高抗氧化性的组分，经过旋转浓缩和冷冻干燥即得到菜籽抗氧化肽。2如权利要求1所述的菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于步骤B中，取菜籽粉溶于蒸馏水中，调PH为12，搅拌2H离心收集上清液，调上清液的PH为4再次离心15MIN弃上清液，得菜籽蛋白。3如权利要求1所述的菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于步骤C中，取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调PH为95，加入ALCALASE24L碱性蛋白酶，反应6H后调PH至45，离心20MIN收集上清液，PH调至70，过022M微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。4如权利要求1所述的菜籽抗氧化肽。
5、的分离纯化方法，其特征在于步骤D中，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为1的溶液后，反复几次通过5K的超滤膜，使其超滤的压力控制在05MPA1MPA范围内，收集小于5K的组分，并冷冻干燥。5如权利要求1所述的菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于步骤E中，通过反复试验选择最佳的样品浓度、上样体积、洗脱流速、洗脱液、柱高，筛选分离条件。6如权利要求1所述的菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于步骤E中，将超滤所收集的分子量小于5K的组分过SEPHACRYLS100HR凝胶柱，得到三个组分，分别为组分1、组分2、组分3，并在280NM紫外检测仪检测下由记录仪显示出吸收值，收集具有紫外吸收峰的组分。7如。
6、权利要求5所述的菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于步骤E中，凝胶过滤层析的洗脱条件为样品溶液上样体积为4ML，样品浓度为001G/ML，洗脱流速为18ML/H，洗脱液为蒸馏水，柱高为45CM。权利要求书CN104109706A1/5页3一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法技术领域0001本发明涉及菜籽肽的分离纯化，具体涉及一种凝胶柱层析分离菜籽蛋白水解物得到具有抗氧化性功能的活性肽组分。背景技术0002菜籽肽多数是一些相对分子质量小于5000DA的小肽，必须采用膜分离、色谱分离等现代分离技术才会达到较好的分离纯化的目的。目前分离菜籽肽的方法主要有膜分离技术、凝胶过滤色谱、RPHPLC和联用技术。。
7、凝胶过滤色谱是选择多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分相对分子量不同而达到物质分离的一种方法。凝胶层析中的凝胶起着分子筛的作用，所以又被称为分子筛层析或排阻层析，其突出优点是所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分的理化性质的保持有独到之处。0003HARMAN的自由基理论提出人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关。自由基是指任何能独立存在的，有一个或多个未配对价电子的原子或原子基团。自由基非常活泼、极不稳定，易与其它物质发生反应形成新的自由基或氧化物。蛋白质水解成肽后，具有抗氧化作用的基团充分暴露出来，能够。
8、更好的发挥抗氧化作用。肽类不仅在油溶体系中具有较好的增效作用，还可以在水溶性体系、乳化体系及干燥体系中也具有较高的抗氧化活性。菜籽源抗氧化活性肽是由菜籽蛋白水解得到的一种肽，其抗氧化作用机理目前没有完全清楚，有研究认为其可能富含供氢体，具有提供氢质子的能力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的。还有研究认为同为质子供体，肽的抗氧化能力要强于游离氨基酸和蛋白质，所以肽的抗氧化活性还被认为与其氨基酸序列及空间构象有关。发明内容0004本发明的目的提供一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，以酶解菜籽蛋白水解物为原料，分离菜籽蛋白水解物以得到具有较高抗氧化活性。
9、的菜籽肽组分，提高菜籽蛋白的利用率。0005为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种菜籽抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤A将菜籽脱壳，并经过索氏抽提脱油，得到的菜籽饼粕，并粉碎过筛，得到菜籽粉；B将步骤A得到的菜籽粉用碱提酸沉的方法制得菜籽蛋白，并冷冻干燥；C将步骤B得到菜籽蛋白用碱性蛋白酶ALCALASE24L水解，得到菜籽蛋白水解物；D将步骤C得到的菜籽蛋白水解物通过5K的超滤膜，收集分子量小于5K的组分；E将步骤D收集的分子量小于5K的组分通过SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离，得到若干组分，并收集具有紫外吸收峰的组分；F使用过氧自由基清除能力的测定（PEROXYLRADIC。
10、ALSCAVENGINGCAPACITYASSAY,说明书CN104109706A2/5页4PSC）由步骤E中凝胶柱分离得到的各组分的抗氧化性，收集具有较高抗氧化性的组分，经过旋转浓缩和冷冻干燥即得到菜籽抗氧化肽。0006步骤B中，取菜籽粉溶于蒸馏水中，调PH为12，搅拌2H离心收集上清液，调上清液的PH为4再次离心15MIN弃上清液，得菜籽蛋白。0007步骤C中，取菜籽蛋白溶于蒸馏水中，调PH为95，加入ALCALASE24L碱性蛋白酶，反应6H后调PH至45，离心20MIN收集上清液，PH调至70，过022M微滤膜，得到菜籽蛋白水解物。0008步骤D中，将菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为1的。
11、溶液后，反复几次通过5K的超滤膜，使其超滤的压力控制在05MPA1MPA范围内，收集小于5K的组分，并冷冻干燥。0009步骤E中，通过反复试验选择最佳的样品浓度、上样体积、洗脱流速、洗脱液、柱高，筛选分离条件。0010步骤E中，将超滤所收集的分子量小于5K的组分过SEPHACRYLS100HR凝胶柱，得到三个组分，分别为组分1、组分2、组分3，并在280NM紫外检测仪检测下由记录仪显示出吸收值，收集具有紫外吸收峰的组分。0011步骤E中，凝胶过滤层析的洗脱条件为样品溶液上样体积为4ML，样品浓度为001G/ML，洗脱流速为18ML/H，洗脱液为蒸馏水，柱高为45CM。0012本发明的有益效果是。
12、本发明与现有的技术相比，对酶解菜籽蛋白联合膜分离和SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离两种纯化手段，并通过控制凝胶过滤的上样浓度、体积、洗脱流速、洗脱液、柱高五个条件以层析分离度来判断合适的分离条件；结合过氧自由基清除能力的测定抗氧化能力的方法，快速简便准确地测得各组分的抗氧化性，得到抗氧化多肽。另外多肽样品是采用酶法水解蛋白质，此方法不仅能最大限度地保留原料的营养成分，改善其加工特性，而且最重要的是能从酶解产物中分离出一些具有生理活性的生物活性肽。附图说明0013图1为本发明的工艺流程图。具体实施方式0014下面结合附图对本发明做进一步说明。0015实施例1称50G脱壳去脂粉碎并过80目。
13、筛的菜籽粉溶于1000ML的蒸馏水，PH调至12，室温搅拌2H后3500G离心分离20MIN，收集上清液，调上清液的PH为4，静置45MIN后3800G离心分离15MIN后弃上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，冷冻干燥得菜籽蛋白。0016将上述的菜籽蛋白溶于1000ML蒸馏水中，调节PH为95，加入500L的碱性蛋白酶ALCALASE24L酶解液，控制温度为50，6H后水浴灭酶20MIN，冷却后调PH至4，45MIN后离心分离20MIN（条件4，8000G），收集上清液，PH调至70，过022M微滤膜，冷冻干燥后得菜籽蛋白水解物。0017将上述菜籽蛋白水解物配制成质量浓度为1的溶液后，通过5K的超滤膜。
14、，控制超滤的压力在05MPA1MPA范围内，收集小于5K的组分，并冷冻干燥。0018将上述小于5K的组分通过SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离，通过对不同上样浓说明书CN104109706A3/5页5度、体积、洗脱流速、洗脱液及柱高的研究，根据分离度得到合适的分离条件。最佳洗脱条件为样品溶液上样体积为4ML，样品浓度为001G/ML，洗脱流速为18ML/H，洗脱液为蒸馏水，柱高为45CM。0019将收集到的组分冷冻干燥后，用75MMOL/L磷酸缓冲液（PH74）稀释样品。1MMOL/LKOH900L和248MMOL/LDCFHDA80L于黑暗中反应5分钟后用75MMOL/L磷酸缓冲液定容。
15、到6ML。配制200MMOL/L的ABAP，保存在4条件下（须现配）。于96孔板上加入100L的样品稀释液，再加入DCFH100L，最后加入200MMOL/LABAP50L。反应在37条件下进行，于485NM的激发波长和538NM的吸收波长下监测，反应在40MIN内达到最大荧光性，并计算PSC值。0020由PSC值反映得到具有较强抗氧化性的菜籽多肽后，可进一步分析其氨基酸组成、分子量分布，由液相、质谱、红外等技术可以得菜籽抗氧化多肽的氨基酸序列，由此可分析抗氧化性与氨基酸种类、排列、疏水性等关系，也可以研究抗氧化肽保存的稳定性条件及体内的代谢分布试验，建立菜籽抗氧化活性肽的稳态化体系。0021。
16、实施例2上样浓度对SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离的影响。0022分别称取005G、01G、015G、02G、025G的实施例1得到的分子量小于5K的菜籽蛋白水解物，用蒸馏水溶解后定容至5ML。过022M滤膜除杂质，分别准确量取3ML，以蒸馏水作为洗脱液，洗脱流速为18ML/H进行洗脱，柱高45CM，每20MIN收集一管，共收集100管，在最大吸收峰值280NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。0023表1反映本实施例洗脱曲线中的紫外吸收峰的个数及相邻吸收峰间的分离度表1上样浓度（G/ML）紫外吸收峰（个）相邻峰间分离度0013114和12002309和011003。
17、3084和07700420680052061本实施例中由吸收峰的情况及分离度可以看出样品浓度为001G/ML时分离度大于1，分离效果较好。0024实施例3上样体积对SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离的影响。0025称取075G/ML的实施例1得到的分子量小于5K的菜籽蛋白水解物，溶解于15ML的蒸馏水。过022M滤膜除杂质，设计上样量分别为1ML、2ML、3ML、4ML、5ML，以蒸馏水作为洗脱液，洗脱流速为18ML/H进行洗脱，柱高45CM，每20MIN收集一管，共收集100管，在最大吸收峰值280NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。0026表2反映本实施例洗脱曲。
18、线中的紫外吸收峰的个数及相邻吸收峰间的分离度表2上样体积（ML）紫外吸收峰（个）相邻峰间分离度11/22073说明书CN104109706A4/5页63308和06643124和1453118和089本实施例中由吸收峰的情况及分离度可以看出上样体积为4ML时分离度分别达到124和14，分离效果好。0027实施例4洗脱流速对SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离的影响称取005G的实施例1得到的分子量小于5K的菜籽蛋白水解物，用蒸馏水溶解后定容至5ML。过022M滤膜除杂质，设计洗脱流速分别为9ML/H、18ML/H、27ML/H、36ML/H、45ML/H，上样体积为3ML，以蒸馏水为洗脱液。
19、，洗脱流速为18ML/H进行洗脱，柱高45CM，每20MIN收集一管，共收集100管，在最大吸收峰值280NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。0028表3反映本实施例洗脱曲线中的紫外吸收峰的个数及相邻吸收峰间的分离度表3洗脱流速（ML/H）紫外吸收峰（个）相邻峰间分离度93116和089183127和094273105和078363096和062452083本实施例中由吸收峰的情况及分离度可以看出洗脱流速为18ML/H时分离度分别为127和094，分离效果好。0029实施例5洗脱液对SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离的影响称取005G的实施例1得到的分子量小于5K的。
20、菜籽蛋白水解物，用蒸馏水溶解后定容至5ML。过022M滤膜除杂质，准确称取3ML上样，分别选取蒸馏水、2MOL/L的醋酸、001MOL/L的盐酸、02MOL/L的磷酸缓冲液（PH68）、01MOL/L的磷酸缓冲液（PH80）作为洗脱液，洗脱流速为18ML/H进行洗脱，柱高45CM，每20MIN收集一管，共收集100管，在最大吸收峰值280NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。0030表4反映本实施例洗脱曲线中的紫外吸收峰的个数及相邻吸收峰间的分离度表4洗脱液紫外吸收峰（个）相邻峰间分离度蒸馏水3136和1172MOL/L的醋酸2131001MOL/L的盐酸3109和0810。
21、2MOL/L的磷酸缓冲液（PH68）3076和07201MOL/L的磷酸缓冲液（PH80）1/本实施例中由吸收峰的情况及分离度可以看出洗脱液为蒸馏水时分离度为136和117，显示出较好的分离效果。0031实施例6柱高对SEPHACRYLS100HR凝胶柱分离的影响称取005G的实施例1得到的分子量小于5K的菜籽蛋白水解物，用蒸馏水溶解后定容至5ML。过022M滤膜除杂质，准确称取3ML上样，以蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为18说明书CN104109706A5/5页7ML/H进行洗脱，设计柱高为25CM、30CM、35CM、40CM、45CM，每20MIN收集一管，共收集100管，在最大吸收峰值28。
22、0NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。0032表5反映本实施例洗脱曲线中的紫外吸收峰的个数及相邻吸收峰间的分离度表5柱高（CM）紫外吸收峰（个）相邻峰间分离度251/302101353066和071403085和094453116和133本实施例中由吸收峰的情况及分离度可以看出柱高为45CM时分离度为116和133，显示较好的分离效果。0033验证例称取005G的实施例1得到的分子量小于5K的菜籽蛋白水解物，用蒸馏水溶解后定容至5ML。过022M滤膜除杂质，准确称取4ML上样，以蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为18ML/H进行洗脱，柱高为45CM，每20MIN收集一管，共收集1。
23、00管，在最大吸收峰值280NM的波长下测定OD值，由记录仪记录的洗脱曲线计算分离度。本案例出现三个吸收峰并且其分离度分别为123和109，分离度较好。0034由此验证案例可收集三个组分，分别为组分1、组分2、组分3，由过氧自由基清除能力的测定可以知道此三个组分的PSC值分别为组分1的PSC值为113493968MGVC/100GSAMPLES，组分2的PSC值为229745463MGVC/100GSAMPLES，组分3的PSC值为621553016MGVC/100GSAMPLES。可知组分3具有较强的抗氧化性，收集并冷冻干燥可得到菜籽抗氧化肽。说明书CN104109706A1/1页8图1说明书附图CN104109706A。