含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物及其制备方法和用 途 技术领域 本发明涉及一种从维药一枝蒿中分离得到的单体化合物一枝蒿酮酸及以它为母 体化合物合成三个系列 21 个一枝蒿酮酸酯类衍生物， 生物活性测试结果表明， 部分衍生物 具有抗甲型 (H3N2， H1N1) 和乙型流感病毒感染的药物的用途。
背景技术 菊科植物新疆一枝蒿 (Artemisia rupestris L.) 在新疆民间用药历史悠久， 具 有抗炎、 抗过敏、 抗菌、 抗癌、 增强免疫力、 解蛇毒、 保肝、 抗氧化等活性。目前对新疆一枝蒿 的研究主要侧重于其化学成分的鉴定， 而且有几种以一枝蒿为主要成分的复方药品已经上 市。下面是已上市的代表性复方药品 ：
药品名称 ： 复方一枝蒿颗粒
生产企业 ： 新疆西域药业有限公司批准文号 ： 国药准字 Z20026711
成份 ： 一枝蒿， 大青叶， 板蓝根
用途 ： 解毒利咽， 用于感冒， 发烧， 咽喉肿痛
一枝蒿酮酸是从新疆一枝蒿中分离出的一种含多官能团的倍半萜类化合物， 本发 明对此单体化合物进行了初步的抗甲、 乙型流感病毒和单纯 I、 II 型疱疹病毒活性研究， 结 果表明此母体化合物对乙型流感病毒具有一定的抑制活性。
哌嗪环是药物化学研究中常用的一类碱性基团， 较难发生亲电取代反应， 但对亲 核试剂比较活泼， 其中 2 个 N 原子上的活泼氢均可被亲核试剂所取代 ； 同时哌嗪环具有毒性 小， 易形成多个氢键或离子键， 可以有效地调节药物的脂水分配系数和酸碱平衡常数， 能有 效地增加分子的碱性和水溶性等特点， 因此， 在许多药物的设计和开发中经常会引入哌嗪 基团。同时， 哌嗪是很多药物的重要组成部分， 是富氮杂环化合物的理想结构单元， 研究表 明， 含哌嗪且 N- 取代的化合物常显示出广泛的生物活性， 如抗微生物、 抗高血压、 抗癌、 消 炎和止痛等， 目前有些已经开发为临床药物， 例如 ： 用于抗菌的环丙沙星 (ciprofloxacin， 1986 年 )， 洛美沙星 (lomefloxacin， 1989 年 ) 和诺氟沙星 (norfloxacin， 1983 年 ) 等。
在前期工作的基础上， 本发明将溴和哌嗪环引入到一枝蒿酮酸分子中， 设计合成 了三个系列 21 个一枝蒿酮酸酯类衍生物， 反应条件温和， 实验步骤简捷。
发明内容 本发明的目的在于， 提供含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物及其制备方法和 用途， 是以一枝蒿酮酸和 1， ω- 二溴代烃为原料， 在相转移催化剂四丁基溴化铵的作用下， 合成中间体 ω- 溴烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g ； 衍生物 2a-2g 在无水碳酸钾的作 用下， 乙腈为溶剂， 与 1- 甲基哌嗪反应后得到 ω-(4- 甲基哌嗪基 )- 烷氧基一枝蒿酮酸酯 类衍生物 3a-3g ； 或将衍生物 2a-2g 与 1- 苯基哌嗪反应后得到 ω-(4- 苯基哌嗪基 )- 烷氧 基一枝蒿酮酸酯类衍生物 4a-4g ； 共得到三个系列 21 个一枝蒿酮酸酯类衍生物， 该方法反
应条件温和， 实验步骤简捷。本发明所述的三个系列的一枝蒿酮酸酯类衍生物作为制备治 疗抗甲型或乙型流感病毒的药物的用途。
本发明所述的一种含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物， 该衍生物的反应式 为：
其中 ： n ＝ 2， 3， 4， 5， 6， 8， 10 所述的含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物的制备方法， 按下列步骤进行 ： a、 将一枝蒿酮酸溶于三氯甲烷中， 室温搅拌下加入氢氧化钠溶液和四丁基溴化铵； b、 当固体物完全溶解后， 再加入溶有 1， ω- 二溴代烃的三氯甲烷溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
c、 将分出的有机相用氢氧化钠溶液洗涤， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 所得粗产物柱层析纯化， 即可得到 ω- 溴烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g ；
d、 将步骤 c 中所得的 ω- 溴烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g 溶于无水乙腈 中， 搅拌下加入 1- 甲基哌嗪， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏得粗 品， 柱层析分离得 ω-(4- 甲基哌嗪基 )- 烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 3a-3g ；
或将步骤 c 中所得的 ω- 溴烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g 溶于无水乙腈 中， 搅拌下加入 1- 苯基哌嗪， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏得粗 品， 柱层析分离得 ω-(4- 苯基哌嗪基 )- 烷氧基一枝蒿酮酸酯类衍生物 4a-4g。
步骤 a 和 c 中所述氢氧化钠浓度均为 5％。
步骤 b 中 1， ω- 二溴代烃为 1， 2- 二溴乙烷、 1， 3- 二溴丙烷、 1， 4- 二溴丁烷、 1， 5- 二
溴戊烷、 1， 6- 二溴己烷、 1， 8- 二溴辛烷、 1， 10- 二溴癸烷。
步骤 c 中所述柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石油醚∶乙酸乙酯＝ 5 ∶ 1-2 ∶ 1。
步骤 d 中所述柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1。
所述含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g， 3a-3g， 4a-4g 三个系列作为 制备治疗抗甲型 H3N2， H1N1 或乙型流感病毒的药物的用途。
本发明所述的含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物的制备方法及其抗甲 (H3N2， H1N1) 和乙型流感病毒活性筛选， 是将溴和哌嗪环引入到一枝蒿酮酸分子中， 合成三 个系列 21 个一枝蒿酮酸酯类衍生物， 反应式如下 ：
本发明所述的三个系列含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物的制备方法及抗 甲型 (H3N2， H1N1) 和乙型流感病毒活性研究， 反应条件温和， 实验步骤简捷。对所合成的 衍生物进行了初步的体外抗甲型 (H3N2， H1N1) 和乙型流感病毒活性测试， 实验结果表明， 化合物 3c， 3d， 3g， 4g 对甲型 (H3N2， H1N1) 流感病毒有较好的抑制作用， 化合物 2g 对甲型 (H1N1) 流感病毒有较好的抑制作用， 化合物 3d 对乙型流感病毒有较好的抑制作用。
具体实施方式
依据实施例对本发明进一步说明， 但本发明不仅限于这些实施例。仪器与试剂 ：
Varian 600 核 磁 共 振 仪 (CDCl3， TMS 为 内 标 )， HP 1100LC/MS 液 质 联 用 仪， Shimadzu FTIR-8400S， Yanaco MP-S3 熔点测定仪 ( 温度未经校正 )。
一枝蒿酮酸按常规方法分离， 纯度 ： 98％， HPLC 检测， 其余的试剂均为市售的分析 纯。
实施例 1 ： 2- 溴乙氧基一枝蒿酮酸酯 (2a) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后， 再加入 10mL 溶有 1， 2- 二溴乙烷 (1.6mmol， 300mg) 的三氯甲 烷溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 5 ∶ 1， 即得 2- 溴乙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 2 ： 3- 溴丙氧基一枝蒿酮酸酯 (2b) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 3- 二溴丙烷 (1.6mmol， 323mg) 的三氯甲烷 溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 4 ∶ 1， 即得 3- 溴丙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 3 ： 4- 溴丁氧基一枝蒿酮酸酯 (2c) 的制备 将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 4- 二溴丁烷 (1.6mmol， 346mg) 的三氯甲烷 溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 3 ∶ 1， 即得 4- 溴丁氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 4 ： 5- 溴戊氧基一枝蒿酮酸酯 (2d) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 5- 二溴戊烷 (1.6mmol， 365mg) 的三氯甲烷 溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 2 ∶ 1， 即得 5- 溴戊氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 5 ： 6- 溴己氧基一枝蒿酮酸酯 (2e) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 6- 二溴己烷 (1.6mmol， 390mg) 的三氯甲烷 溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 5 ∶ 1， 即得 6- 溴己氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 6 ： 8- 溴辛氧基一枝蒿酮酸酯 (2f) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 8- 二溴辛烷 (1.6mmol， 435mg) 的三氯甲烷 溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 4 ∶ 1， 即得 8- 溴辛氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 7 ： 10- 溴癸氧基一枝蒿酮酸酯 (2g) 的制备
将一枝蒿酮酸 (0.4mmol， 100mg) 溶于 10mL 三氯甲烷中， 室温搅拌下加入 5％氢氧 化钠溶液 (1mL) 和四丁基溴化铵 (128mg) ；
当固体完全溶解后再加入 10mL 溶有 1， 10- 二溴癸烷 (1.6mmol， 498mg) 的三氯甲 烷溶液， 加热回流， TLC 检测反应完全后， 分出有机相 ；
将分出的有机相用 15mL 浓度为 5％的氢氧化钠溶液洗涤 2 次， 然后用水洗至中性， 用无水 Na2SO4 干燥， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 采用梯度洗脱， 洗脱剂为体积比石 油醚∶乙酸乙酯＝ 2 ∶ 1， 即得 10- 溴癸氧基一枝蒿酮酸酯。 实施例 8 ： 2-(4- 甲基哌嗪基 ) 乙氧基一枝蒿酮酸酯 (3a) 的制备
将 2- 溴乙氧基一枝蒿酮酸酯 (2a)(0.2mmol， 71mg) 溶于 15mL 的无水乙腈中， 搅 拌下加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压 蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 2-(4- 甲基哌嗪 基 ) 乙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 9 ： 3-(4- 甲基哌嗪基 ) 丙氧基一枝蒿酮酸酯 (3b) 的制备
将 3- 溴丙氧基一枝蒿酮酸酯 (2b)(0.2mmol， 74mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 3-(4- 甲基哌嗪基 ) 丙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 10 ： 4-(4- 甲基哌嗪基 ) 丁氧基一枝蒿酮酸酯 (3c) 的制备
将 4- 溴丁氧基一枝蒿酮酸酯 (2c)(0.2mmol， 76mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 4-(4- 甲基哌嗪基 ) 丁氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 11 ： 5-(4- 甲基哌嗪基 ) 戊氧基一枝蒿酮酸酯 (3d) 的制备
将 5- 溴戊氧基一枝蒿酮酸酯 (2d)(0.2mmol， 79mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 5-(4- 甲基哌嗪基 ) 戊氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 12 ： 6-(4- 甲基哌嗪基 ) 己氧基一枝蒿酮酸酯 (3e) 的制备
将 6- 溴己氧基一枝蒿酮酸酯 (2e)(0.2mmol， 82mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 6-(4- 甲基哌嗪基 )
己氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 13 ： 8-(4- 甲基哌嗪基 ) 辛氧基一枝蒿酮酸酯 (3f) 的制备
将 8- 溴辛氧基一枝蒿酮酸酯 (2f)(0.2mmol， 87mg) 溶于 15mL 的无水乙腈中， 搅 拌下加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压 蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 8-(4- 甲基哌嗪 基 ) 辛氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 14 ： 10-(4- 甲基哌嗪基 )- 癸氧基一枝蒿酮酸酯 (3g) 的制备
将 10- 溴癸氧基一枝蒿酮酸酯 (2g)(0.2mmol， 93mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌 下加入 1- 甲基哌嗪 (0.2mmol， 20mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸 馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 10-(4- 甲基哌嗪 基 )- 癸氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 15 ： 2-(4- 苯基哌嗪基 ) 乙氧基一枝蒿酮酸酯 (4a) 的制备
将 2- 溴乙氧基一枝蒿酮酸酯 (2a)(0.2mmol， 70mg) 溶于 15mL 的无水乙腈中， 搅 拌下加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压 蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 2-(4- 苯基哌嗪 基 ) 乙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 16 ： 3-(4- 苯基哌嗪基 ) 丙氧基一枝蒿酮酸酯 (4b) 的制备
将 3- 溴丙氧基一枝蒿酮酸酯 (2b)(0.2mmol， 74mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 3-(4- 苯基哌嗪基 ) 丙氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 17 ： 4-(4- 苯基哌嗪基 ) 丁氧基一枝蒿酮酸酯 (4c) 的制备
将 4- 溴丁氧基一枝蒿酮酸酯 (2c)(0.2mmol， 76mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 4-(4- 苯基哌嗪基 ) 丁氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 18 ： 5-(4- 苯基哌嗪基 )- 戊氧基一枝蒿酮酸酯 (4d) 的制备
将 5- 溴戊氧基一枝蒿酮酸酯 (2d)(0.2mmol， 78mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 5-(4- 苯基哌嗪基 ) 戊氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 19 ： 6-(4- 苯基哌嗪基 ) 己氧基一枝蒿酮酸酯 (4e) 的制备
将 6- 溴己氧基一枝蒿酮酸酯 (2e)(0.2mmol， 82mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏 得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 6-(4- 苯基哌嗪基 ) 己氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 20 ： 8-(4- 苯基哌嗪基 ) 辛氧基一枝蒿酮酸酯 (4f) 的制备
将 8- 溴辛氧基一枝蒿酮酸酯 (2f)(0.2mmol， 87mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌下 加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 8-(4- 苯基哌嗪基 ) 辛氧基一枝蒿酮酸酯。
实施例 21 ： 10-(4- 苯基哌嗪基 ) 癸氧基一枝蒿酮酸酯 (3g) 的制备
将 10- 溴癸氧基一枝蒿酮酸酯 (2g)(0.2mmol， 93mg) 溶于 15mL 无水乙腈中， 搅拌 下加入 1- 苯基哌嗪 (0.2mmol， 32mg)， 加热回流， TCL 检测反应完全后， 冷却至室温， 减压蒸 馏得粗品， 再用柱层析纯化， 洗脱剂为体积比氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1， 即得 10-(4- 苯基哌嗪 基 ) 癸氧基一枝蒿酮酸酯。
将所合成的 2a-2g、 3a-3g、 4a-4g 三个系列一枝蒿酮酸酯类衍生物进行了初步的 体外抗流感病毒活性测试。
本发明所述衍生物作为制备治疗抗甲 H3N2， H1N1 或乙型流感病毒的药物的用途 的生物活性测定 ：
测试原理 ： 以 MDCK( 狗肾 ) 细胞为病毒宿主细胞， 测定样品抑制病毒引起细胞病变 程度 (CPE)。
测试的材料 ：
(1) 病毒株 ： 甲型流感病毒 [312-2006(H3N2)， 219-2006(H1N1)]， 乙型流感病毒 ( 济防 97-13)， 2006 年 9 月在鸡胚尿囊腔内培养传代， -80℃保存。 (2) 样品处理 ： 样品溶于 DMSO， 再用培养液配成适宜的初始浓度， 用培养液做 3 倍 稀释， 各 8 个稀释度。
(3) 阳性对照药 ： 病毒唑 (RBV)， 浙江康裕药业有限公司生产 ( 批号 20050612)。
方法 ：
( 一 ) 测试样品溶液的配制
将各样品溶于适量的 DMSO， 再用培养液配制成 1000μg/mL 的初始浓度， 然后用 培养液依次做 3 倍稀释， 各 8 个稀释度 ( 浓度依次为 250， 62.5， 15.6， 3.9， 1.0， 0.2， 0.06， 0.02μg/mL)。
( 二 ) 抗流感病毒活性测试
将狗肾 (MDCK) 细胞接种于 96 孔培养板， 置于 5％ CO2， 37℃培养 24 小时， MDCK 细 -3 -2 胞分别加入流感甲型病毒 10 (316 倍 TCID50)、 流感乙型病毒 ( 济防 97-13)1/210 (158 倍 TCID50)， 37℃吸附 2 小时后移出病毒液， 分别加入不同稀释度的药物。 设病毒对照和细胞对 照， 37℃培养待病毒对照组病变程度 (CPE) 达 4+ 时观察各组细胞病变程度 (CPE)( 约 36 小 时 )， 计算各样品对流感病毒半数抑制浓度 (IC50) 值。结果如表 1、 表 2 所示
表 1 一枝蒿酮酸酯类衍生物 2a-2g、 3a-3g、 4a-4g 抗甲型 (H3N2、 H1N1) 流感病毒活 性数据
表 2 一枝蒿酮酸衍生物 2a-2g、 3a-3g、 4a-4g 抗乙型流感病毒活性数据
TC50 ： 半数有毒浓度。
-： 样品在最大无毒计量时无抗流感病毒活性。
SI ： 选择指数。
SI ＝ TC50/IC50。
1 母体化合物 ( 一枝蒿酮酸 )。
结论 ： 本发明所述的含溴和哌嗪环的一枝蒿酮酸酯类衍生物经活性实验结果表 明， 化合物 2g 对甲型 (H1N1) 流感病毒有较好的抑制作用， 化合物 3c， 3d， 3g， 4g 对甲型 (H3N2， H1N1) 流感病毒有较好的抑制作用， 化合物 3d 对乙型流感病毒有较好的抑制作用。13