说明书(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯的盐形式
技术领域
本发明涉及新颖的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯的盐形式，其可用作葡萄糖基神经酰胺合酶(glucosylceramidesynthase)(GCS)的抑制剂且可单独或与酶替代疗法一起用于治疗代谢性疾病例如溶酶体贮积病(lysosomalstoragedisease)并可用于治疗癌症。
背景技术
葡萄糖基神经酰胺合酶(GCS)是在以葡萄糖基神经酰胺为基础的糖鞘脂(GSL)的生物合成中催化初始糖基化步骤的关键酶，所述初始糖基化步骤即经由UDP-葡萄糖(UDP-Glc)将葡萄糖转移至神经酰胺以形成葡萄糖基神经酰胺的关键转移。GCS是位于高尔基体顺面膜囊/中间膜囊中的跨膜III型整合蛋白。据信糖鞘脂(GSL)是多种细胞膜事件的动力学所不可或缺的，所述细胞膜事件包括细胞相互作用、信号传导和运输。已显示GSL结构的合成(参见Yamashita等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96(16),9142-9147)是胚胎发育和一些组织的分化所需要的。神经酰胺在鞘脂代谢中发挥重要作用且已显示GCS活性的下调对鞘脂模式具有显著影响，其中糖鞘脂的表达是减少的。鞘脂(SL)在生理学及病理学心血管状况中具有生物调节作用。具体地，鞘脂及其调节酶就在新生大鼠心脏中对慢性缺氧的适应性响应而言似乎发挥作用(参见ElAlwanit等人,Prostaglandins&OtherLipidMediators2005,78(1-4),249-263)。
已提出将GCS抑制剂用于治疗多种疾病(参见例如WO2005068426)。所述治疗包括治疗糖脂贮积病(例如泰-萨克斯病(Tay-Sachs)、桑德霍夫病(Sandhoff)、GM2活化因子缺乏症(GM2Activatordeficiency)、GM1神经节苷脂贮积病(GM1-gangliosidosis)和法布里病(Fabry))、与糖脂蓄积相关的疾病(例如戈谢病(Gaucher)；美格鲁特(Zavesca)作为GCS抑制剂已被批准用于治疗1型戈谢病患者，参见Treiber等人,Xenobiotica2007,37(3),298-314)、引起肾脏肥大或增生的疾病例如糖尿病性肾病；引起高血糖症或高胰岛素血症的疾 病；其中糖脂合成异常的癌症、由使用细胞表面糖脂作为受体的生物体引起的感染性疾病、其中葡萄糖基神经酰胺的合成是必要或重要的感染性疾病、其中葡萄糖基神经酰胺的合成是必要或重要的疾病、其中发生过度糖脂合成的疾病(例如动脉粥样硬化、多囊性肾病和肾脏肥大)、神经元障碍、神经元损伤、与巨噬细胞募集和活化相关的炎性疾病或障碍(例如类风湿性关节炎、克罗恩病、哮喘和脓毒症)及糖尿病和肥胖症(参见WO2006053043)。
具体地，已显示GCS的过度表达参与多重抗药性并破坏由神经酰胺诱导的凋亡。例如，Turzanski等人,ExperimentalHematology2005,33(1),62-72已显示神经酰胺在急性骨髓性白血病(AML)细胞中诱导凋亡且P-糖蛋白(p-gp)赋予对由神经酰胺诱导的凋亡的抗性，其中对神经酰胺-葡萄糖基神经酰胺途径的调节对TF-1细胞中的该种抗性具有显著贡献。因此，GCS抑制剂可通过在患病细胞中诱导凋亡来用于治疗增殖性障碍。
发明内容
本发明涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.095。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.095和17.493。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.095和19.516。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.095、17.493和19.516。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.095、17.493、19.516和20.088。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα 辐射测量的2θ峰：18.095、17.493、19.516和20.088和17.125。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355和21.167。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355、21.167和27.343。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355、21.167、27.343和16.111。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355、21.167、27.343、16.111和17.185。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：24.355、21.167、27.343、16.111、17.185和20.243。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162和18.028。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162和14.280。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162、18.028和14.280。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162、18.028、14.280和18.153。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：17.162、18.028、14.280、18.153和23.422。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：18.087。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：12.818。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：25.722。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：12.818和25.722。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：12.818、25.722和13.040。
本发明还涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式A，其中所述x射线粉末衍射图含有下列使用CuKα辐射测量的2θ峰：12.818、25.722、13.040和28.910。
附图简述
图1
在BrukerD8-Advance衍射仪上进行的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A的衍射图。
图2
在BrukerD8-Advance衍射仪上进行的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙 -2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B的衍射图。
图3
在BrukerD8-Advance衍射仪上进行的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶的衍射图。
图4
在BrukerD8-Advance衍射仪上进行的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式的衍射图。
具体实施方式
本发明的第一个方面涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A，其特征在于下列用2θ和相对强度(其中相对强度>0.52％)表示的x射线粉末衍射图(表1)。所述测量如下进行：仪器：BrukerD8-Advance衍射仪，类型：Bragg-Brentano；源CuKα1,发生器：35kV–40mA；检测器：PSD/Vantec；AntonPaarTTK450室；Si样品架；角范围：2°至40°以2-θBragg计；可变分光夹缝：4mm(V4)；步长：0.033°；步时间：1s。
表1
按2θ位置和晶面间距(d-spacing)的顺序
本发明的第二个方面涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式B，其特征在于下列用2θ和相对强度(其中相对强度>8％)表示的x射线粉末衍射图(表2)。所述测量如下进行：仪器：BrukerD8-Advance衍射仪，类型：Bragg-Brentano；源CuKα1,发生器：35kV–40mA；检测器：PSD/Vantec；AntonPaarTTK450室；Si样品架；角范围：2°至40°以2-θBragg计；可变分光夹缝：4mm(V4)；步长：0.033°；步时间：1s。
表2
角-2θ°相对强度％
3,95715,7
7,98132,0
10,50810,5
12,76817,7
14,19523,3
14,57028,5
16,11153,7
16,98213,5
17,18546,0
17,69111,6
18,74410,6
19,05522,9
19,31510,0
19,45412,8
20,24341,3
20,72213,7
21,16786,1
21,51611,4
21,61011,3
22,46620,3
23,62616,6
23,76521,5
24,09720,2
24,355100,0
24,82310,0
25,24313,4
25,33713,9
25,63718,2
25,80912,2
26,68115,7
26,80118,9
27,34357,6
27,76512,3
28,67012,1
28,86117,6
29,51634,8
30,74512,8
31,28514,3
31,47015,5
31,80318,1
32,02315,2
32,15114,7
32,49115,7
32,60915,9
33,30315,3
33,52014,1
33,79116,9
34,10115,7
34,21917,4
34,38018,7
34,46018,9
34,94224,6
35,56613,9
35,73014,0
35,96514,7
36,91316,2
37,71214,0
38,12016,5
38,26817,7
38,73118,7
39,04216,5
39,25716,4
本发明的第三个方面涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐的结晶形式，其特征在于下列用2θ和相对强度(其中相对强度>8％)表示的x射线粉末衍射图(表3)。所述测量如下进 行：仪器：BrukerD8-Advance衍射仪，类型：Bragg-Brentano；源CuKα1,发生器：35kV–40mA；检测器：PSD/Vantec；AntonPaarTTK450室；Si样品架；角范围：2°至40°以2-θBragg计；可变分光夹缝：4mm(V4)；步长：0.033°；步时间：1s。
表3
按2θ位置和晶面间距的顺序
本发明的第四个方面涉及(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐的结晶形式，其特征在于下列用2θ和相对强度(其中相对强度>0.96％)表示的x射线粉末衍射图(表4)。所述测量如下进行：仪器：BrukerD8-Advance衍射仪，类型：Bragg-Brentano；源CuKα1,发生器：35kV–40mA；检测器：PSD/Vantec；AntonPaarTTK450室；Si样品架；角范围：2°至40°以2-θBragg计；可变分光夹缝：4mm(V4)；步长：0.033°；步时间：1s。
表4
按2θ位置和晶面间距的顺序
正在使用或探寻几种措施以治疗LSD，所述措施中的大多数集中于在 疾病管控中单独使用的酶替代疗法。所批准的多种酶替代疗法是可商购的以治疗LSD(例如针对蓬佩病的针对I型粘多糖贮积病的针对戈谢病的和针对法布里病的)。另外，发明人已鉴定用于在LSD控制中单独使用的多种小分子。如以下所详细描述的那样，本申请描述的本发明的治疗方法为面对各种溶酶体贮积病管控的从业者提供了治疗选择。
在本发明某些方面，本发明化合物可单独或以与酶替代疗法的联合疗法形式用于治疗代谢性疾病例如溶酶体贮积病(LSD)。在本发明其它方面，本发明化合物可单独或以与酶替代疗法的联合疗法形式用于在被诊断患有代谢性疾病例如LSD的受试者中抑制或降低GCS活性。在本发明其它方面，本发明化合物可用于在被诊断患有代谢性疾病例如LSD的受试者中减少和/或抑制贮积物质(例如溶酶体底物)的蓄积。在上述方面的某些实施方案中，所述LSD为戈谢病(1型、2型或3型)、法布里病、GM1神经节苷脂贮积病或GM2神经节苷脂贮积病(例如GM2活化因子缺乏、泰-萨克斯病和桑德霍夫病)。表1列举了多种LSD并鉴定了所缺乏的相应酶，所述酶可在本发明上述方面用于ERT。
在其它方案中，可能必需要向以下患者提供SMT，所述患者的病症需要减少脑中的底物且因此不能通过全身性给药ERT来治疗。尽管直接的脑室内或鞘内给药可降低脑中的底物水平，但是全身性给药的ERT由于ERT不能穿过血脑屏障(BBB)而不适于涉及中枢神经系统(CNS)的LSD且在具有CNS中的残留酶活性的患者中可证实SMT是有益的。
根据本发明，向患者提供SMT以治疗癌症和/或代谢性疾病例如溶酶体贮积病。所述SMT可包括一种或多种小分子。所述SMT包括向患者给药本发明化合物。在具体实施方案中，所述化合物为(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯或(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯或其组合。
在某些实施方案中，本发明化合物例如(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯和(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯可用于治疗实际上由于糖鞘脂途径缺陷而引起的任意贮积病(例如戈谢病(即1型、2型或3型)、法布里病、GM1神经节苷脂贮积病或GM2神经节苷脂贮积病(例如GM2活化因子缺乏、泰-萨克斯病和桑德霍夫 病))。在特别优选的实施方案中，(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯或其药用盐或前药单独或以与酶替代疗法的联合疗法形式用于在患有法布里病的患者中抑制和/或减少Gb3和/或lyso-Gb3的蓄积(参见实施例)。在优选的实施方案中，所述酶替代疗法包括向法布里病患者给药α-半乳糖苷酶A。实际上，以下实施例表明本发明GCS抑制剂可在法布里病小鼠模型中有效减少Gb3和lyso-Gb3的贮积，因此支持了其可用作治疗法布里病的可行措施。另外，实施例提供的体内联合疗法数据强烈提示联合疗法措施既可为累加的也可为互补的。
在某些实施方案中，本发明化合物例如(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯和(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯可单独或以与ERT(例如给药葡萄糖脑苷脂酶)的组合形式用于在被诊断患有神经病性戈谢病的受试者的脑中降低GluCer和GluSph的水平。
本发明联合疗法中小分子疗法组分的剂量方案通常由专业医生来确定且预期随所治疗的具体贮积病和具体患病个体的临床情况而显著变化。确定所给定的本发明SMT用于治疗任意贮积病的剂量方案的一般原则是本领域技术人员熟知的。关于剂量方案的指导可由任意本领域公知的多种关于该主题的参考文献得到。也有其它指导可用，尤其是由本申请引用的一系列具体参考文献得到。在某些实施方案中，所述剂量可为约0.5mg/kg至约300mg/kg，优选约5mg/kg至约60mg/kg(例如5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg和60mg/kg)，其中每天一次至五次腹膜内、口服或等效给药。所述剂量可为约5mg/kg至约5g/kg，优选约10mg/kg至约1g/kg，其中每天一次至五次口服、腹膜内或等效给药。在一个实施方案中，剂量范围为约10mg/天至约500mg/天(例如10mg/天、20mg/天、30mg/天、40mg/天、50mg/天、60mg/天、70mg/天、80mg/天、90mg/天、100mg/天、110mg/天、120mg/天、130mg/天、140mg/天、150mg/天、160mg/天、170mg/天、180mg/天、190mg/天、200mg/天、210mg/天、220mg/天、230mg/天、240mg/天、250mg/天、260mg/天、270mg/天、280mg/天、290mg/天和300mg/天)。特别优选的口服剂量范围为约50mg至约100mg，其中所述剂量每天给药两次。本发明化合物的具体口服剂量范围为约5mg/kg/天至约600mg/kg/天。本发明化合物的具体口服 剂量范围为约1mg/kg/天至约120mg/kg/天例如1mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天、45mg/kg/天、50mg/kg/天、55mg/kg/天、60mg/kg/天、65mg/kg/天、70mg/kg/天、75mg/kg/天、80mg/kg/天、85mg/kg/天、90mg/kg/天、95mg/kg/天、100mg/kg/天、105mg/kg/天、110mg/kg/天、115mg/kg/天或120mg/kg/天。
在某些实施方案中，本发明涉及使用本发明化合物的SMT和ERT疗法的联合疗法以治疗溶酶体贮积病。可根据本发明来治疗的已知溶酶体贮积病的部分列表参见表5，其包括常见疾病名称、所贮积的物质和相应的酶缺乏(改编自上述Kolodny等人,1998中的表38-4)。
表5
*Davidson等人,TheNeuronalCeroidLipofuscinosis,ClinicalFeaturesandMolecularBasisofDisease.InBarrangerJAandCabrera-SalazarMA(Eds)LysosomalStorageDisorders.2007.pp.371-388.Springer,NewYork,U.S.A.
本领域技术人员已知的任意方法可用于监测疾病状态和本发明联合疗法的有效性。对疾病状态的临床监测对象(monitor)可包括但不限于器官体积(例如肝、脾)、血红蛋白、红细胞计数、血细胞比容、血小板减少、恶病质(消瘦)和血浆壳多糖酶水平(例如壳三糖苷酶)。已知壳三糖苷酶(壳多糖酶家族中的一种酶)在患有溶酶体贮积病的受试者中由巨噬细胞以高水平产生(参见Guo等人,1995,J.Inherit.Metab.Dis.18,717-722；denTandt等人,1996,J.Inherit.Metab.Dis.19,344-350；DodelsondeKremer等人,1997,Medicina (BuenosAires)57,677-684；Czartoryska等人,2000,Clin.Biochem.33,147-149；Czartoryska等人,1998,Clin.Biochem.31,417-420；Mistry等人,1997,BaillieresClin.Haematol.10,817-838；Young等人,1997,J.Inherit.Metab.Dis.20,595-602；Hollak等人,1994,J.Clin.Invest.93,1288-1292)。壳三糖苷酶优选与血管紧张素转化酶和非酒石酸抗性的酸性磷酸酶一起测量以监测戈谢病患者对治疗的响应。
给药本发明联合疗法的方法和制剂包括本领域公知的所有方法和制剂(参见例如Remington’sPharmaceuticalSciences,1980及随后几年,第16版及随后版本,A.Osloeditor,EastonPa.；ControlledDrugDelivery,1987,2ndrev.,JosephR.Robinson&VincentH.L.Lee编辑,MarcelDekker,ISBN:0824775880；EncyclopediaofControlledDrugDelivery,1999,EdithMathiowitz,JohnWiley&Sons,ISBN:0471148288；美国专利6,066,626及其中引用的参考文献；还参见以下章节引用的参考文献)。
根据本发明，为治疗溶酶体贮积病的联合疗法提供以下通用措施。每种通用措施涉及按以下方式将酶替代疗法与小分子疗法组合，所述方式使临床益处最优化同时使与单独使用每种疗法相关的缺点最小化。
在本发明一个实施方案中，给药酶替代疗法(单独或与小分子疗法组合)以开始治疗(即将受试者减积(debulk))并在减积期后给药小分子疗法以实现并保持稳定的长期的治疗作用而不需要频繁的静脉内注射ERT。例如，可每周一次、每两周一次或每两个月一次静脉内给药(例如历时一至两小时的时间段)酶替代疗法且持续数周或数月或更长时间(例如直到所涉及的指标器官例如脾或肝显示出体积减小)。另外，初始减积治疗的ERT期可单独进行或与小分子疗法组合进行。其中小分子适于口服的小分子疗法组分是特别优选的，这由此进一步免除了频繁的静脉内介入。
按需在ERT和SMT之间交替或用ERT补充SMT，这提供了以下策略：利用强度的优点同时解决与单独使用每种疗法相关的缺点。无论是用于减积和/或还是用于较长期的护理，ERT的优点都可作为从业人员作出决定所广泛需要的临床经验。另外，在减积期可例如通过对尿或其它身体样品中的生物化学代谢物进行监测或通过对受影响的器官体积进行测量而用ERT对受试者进行有效滴定。然而，ERT的缺点是所需要的给药频率，其由于底物的不断重新蓄积而通常涉及每周一次或每两周一次的静脉内注射。使用小分子 疗法以在患者中减少底物蓄积量或抑制底物蓄积，这可随后降低ERT的给药频率。例如，可为每两周一次的酶替代疗法给药方案提供“ERT假日”(例如使用SMT)，从而使频繁的酶注射不是所需要的疗法。另外，用联合疗法对溶酶体贮积病进行的治疗可提供互补的治疗措施。实际上，如以下实施例所示，与任一单独治疗平台相比，SMT和ERT的联合疗法可提供显著的改善。这些数据提示使用SMT和ERT的联合疗法可为累加和互补的。在一个实施方案中，ERT可用作减积策略(即用以起始治疗)，然后或同时用使用本发明化合物的SMT进行补充。在另一个实施方案中，患者首先用使用本发明化合物的SMT进行治疗，然后或同时用ERT进行补充。在其它实施方案中，SMT用于在患有溶酶体贮积病的患者中抑制或减少底物的进一步蓄积(或底物的重新蓄积(若在用ERT减积后使用))且按需任选提供的ERT用于减少底物的任何进一步蓄积。在一个实施方案中，本发明提供对被诊断患有溶酶体贮积病的受试者进行治疗的联合疗法，其包括在给药酶替代疗法和给药小分子疗法之间交替。在另一个实施方案中，本发明提供对被诊断患有溶酶体贮积病的受试者进行治疗的联合疗法，其包括同时给药酶替代疗法和小分子疗法。在本发明各种联合疗法中，应当理解的是，小分子疗法的给药可在给药酶替代疗法前、与给药酶替代疗法同时或在给药酶替代疗法后进行。类似地，酶替代疗法的给药可在给药小分子疗法前、与给药小分子疗法同时或在给药小分子疗法后进行。
在本发明任意一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自戈谢病(1型、2型和3型)、尼-皮病、法伯病、GM1神经节苷脂贮积病、GM2神经节苷脂贮积病(例如GM2活化因子缺乏、泰-萨克斯病和桑德霍夫病)、克拉伯病、胡-沙综合征(MPSI)、亨特病(MPSII)、A型桑菲列普病(MPSIII)、B型桑菲列普病(MPSIII)、C型桑菲列普病(MPSIII)、D型桑菲列普病(MPSIII)、A型Marquio综合征(MPSIV)、B型Marquio综合征(MPSIV)、马-拉病(MPSVI)、Sly综合征(MPSVII)、粘硫脂病、唾液酸贮积病、粘脂贮积病II、粘脂贮积病III、粘脂贮积病IV、法布里病、欣德勒病、蓬佩病、唾液酸贮积病、岩藻糖苷贮积病、甘露糖苷贮积病、天冬氨酰葡糖胺尿症、沃尔曼病和神经元蜡样脂褐质贮积病。
另外，所述ERT提供有效量的至少一种以下酶：葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、神经酰胺酶、GM1神经节苷脂-β-半乳糖苷酶、己糖胺酶A、己糖胺 酶B、β-半乳糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰辅酶A:α-氨基葡萄糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰基-α-葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖胺-4-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶B)、β-葡萄糖醛酸苷酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶C、α-神经氨酸酶、N-乙酰基-葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-半乳糖苷酶A、α-N-乙酰基氨基半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-甘露糖苷酶、天冬氨酰基氨基葡萄糖酰胺酶、酸性脂肪酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶(CLN-1)、PPT1、TPP1、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、NPC1或NPC2。
根据本发明，所述SMT和/或ERT使以下所贮积的物质中的至少一种减少：葡萄糖脑苷脂、鞘磷脂、神经酰胺、GM1神经节苷脂、GM2神经节苷脂、红细胞糖苷脂、半乳糖基神经酰胺、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫苷脂、粘多糖、唾液酸寡糖、糖蛋白、唾液酸寡糖、糖脂、神经酰胺三己糖苷、经O连接的糖肽、糖原、游离唾液酸、岩藻糖脂、岩藻糖基寡糖、甘露糖基寡糖、天冬氨酰基氨基葡萄糖、胆固醇酯、甘油三酯、颗粒状嗜渗性沉积物–鞘脂激活蛋白A和D(SaposinsAandD)、ATP合酶亚基c、NPC1或NPC2。
在本发明某些实施方案中，所述小分子疗法包括向受试者给药有效量的(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(参见图2A)。在其它实施方案中，所述小分子疗法包括向受试者给药有效量的(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(参见图2B)。所述小分子疗法可包括向受试者给药一种或多种化合物。在某些实施方案中，至少一种所述化合物为本发明化合物例如图2A和/或2B所示的化合物。
酶替代疗法可刺激不需要的免疫响应。因此，免疫抑制剂可与本发明联合疗法中的酶替代疗法组分一起使用。所述药物还可与小分子疗法组分一起使用，但是通常在此不大可能需要介入。本领域技术人员已知的任意免疫抑制剂可与本发明联合疗法一起使用。所述免疫抑制剂包括但不限于环孢菌素、FK506、雷帕霉素、CTLA4-Ig和抗TNF药物例如伊那西普(参见例如Moder,2000,Ann.AllergyAsthmaImmunol.84,280-284；Nevins,2000,Curr.Opin.Pediatr.12,146-150；Kurlberg等人,2000,Scand.J.Immunol.51,224-230；Ideguchi等人,2000,Neuroscience95,217-226；Potter等人,1999,Ann. N.Y.Acad.Sci.875,159-174；Slavik等人,1999,Immunol.Res.19,1-24；Gaziev等人,1999,BoneMarrowTransplant.25,689-696；Henry,1999,Clin.Transplant.13,209-220；Gummert等人,1999,J.Am.Soc.Nephrol.10,1366-1380；Qi等人,2000,Transplantation69,1275-1283)。已在移植患者中证实有效的抗IL2受体(α-亚基)抗体达克珠单抗(例如ZenapaxTM)也可用作免疫抑制剂(参见例如Wiseman等人,1999,Drugs58,1029-1042；Beniaminovitz等人,2000,N.EnglJ.Med.342,613-619；Ponticelli等人,1999,DrugsR.D.1,55-60；Berard等人,1999,Pharmacotherapy19,1127-1137；Eckhoff等人,2000,Transplantation69,1867-1872；Ekberg等人,2000,Transpl.Int.13,151-159)。其它免疫抑制剂包括但不限于抗CD2(Branco等人,1999,Transplantation68,1588-1596；Przepiorka等人,1998,Blood92,4066-4071)、抗CD4(Marinova-Mutafchieva等人,2000,ArthritisRheum.43,638-644；Fishwild等人,1999,Clin.Immunol.92,138-152)和抗CD40配体(Hong等人,2000,Semin.Nephrol.20,108-125；Chirmule等人,2000,J.Virol.74,3345-3352；Ito等人,2000,J.Immunol.164,1230-1235)。
本领域技术人员已知的免疫抑制剂的任意组合可与本发明联合疗法一起使用。一种特别有用的免疫抑制剂组合是他克莫司(FK506)+西罗莫司(雷帕霉素)+达克珠单抗(抗IL2受体α-亚基抗体)。该组合被证实可有效代替类固醇和环孢菌素且是特异性靶向于肝的。另外，最近已显示该组合使胰岛细胞移植得以成功。参见DeniseGrady,TheNewYorkTimes,Saturday,May27,2000,第A1和A11页。还参见A.M.Shapiro等人,Jul.27,2000,“IsletTransplantationInSevenPatientsWithType1DiabetesMellitusUsingAGlucocorticoid-FreeImmunosuppressiveRegimen”,N.Engl.J.Med.343,230-238；Ryan等人,2001,Diabetes50,710-719。通过本领域已知的任意方法进行的血浆去除术也可用于除去或排除可能针对联合疗法中的各个组分形成的抗体。
与本发明一起使用的免疫状态指示物包括但不限于本领域技术人员已知的抗体和任意细胞因子例如白介素、CSF和干扰素(一般参见Leonard等人,2000,J.AllergyClin.Immunol.105,877-888；Oberholzer等人,2000,Crit.CareMed.28(4Suppl.),N3-N12；Rubinstein等人,1998,CytokineGrowthFactorRev.9,175-181)。例如，可监测对替代酶具有特异性免疫反应的抗体以确定 受试者的免疫状态。在约24种已知的白介素中，特别优选的免疫状态指示物为IL-1α、IL-2、IL-4、IL-8和IL-10。在集落刺激因子(CSF)中，特别优选的免疫状态指示物为G-CSF、GM-CSF和M-CSF。在干扰素中，α-、β-或γ-干扰素中的一种或多种优选作为免疫状态指示物。
以下章节提供的各种组分可用于8种具体的溶酶体贮积病(即戈谢病(包括1型、2型和3型)、法布里病、B型尼-皮病、亨特病、莫尔基奥综合征、马-拉病、蓬佩病和胡-沙综合征)。以下章节进一步提供了关于本发明联合疗法中的酶替代疗法组分和小分子疗法组分的公开。
戈谢病
如上所述，戈谢病由于葡萄糖脑苷脂酶(β-D-葡萄糖基-N-酰基鞘氨醇葡萄糖水解酶,EC3.2.1.45)的缺乏和葡萄糖脑苷脂(葡萄糖基神经酰胺)的蓄积而引起。对于本发明治疗戈谢病的联合疗法中的酶替代疗法组分，可参见多份参考文献，其公开了令人满意的剂量方案和与治疗相关的其它有用信息(参见Morales,1996,Gaucher’sDisease:AReview,TheAnnalsofPharmacotherapy30,381-388；Rosenthal等人,1995,EnzymeReplacementTherapyforGaucherDisease:SkeletalResponsestoMacrophage-targetedGlucocerebrosidase,Pediatrics96,629-637；Barton等人,1991,ReplacementTherapyforInheritedEnzymeDeficiency-Macrophage-targetedGlucocerebrosidaseforGaucher’sDisease,NewEnglandJournalofMedicine324,1464-1470；Grabowski等人,1995,EnzymeTherapyinType1GaucherDisease:ComparativeEfficacyofMannose-terminatedGlucocerebrosidasefromNaturalandRecombinantSources,AnnalsofInternalMedicine122,33-39；Pastores等人,1993,EnzymeTherapyinGaucherDiseaseType1:DosageEfficacyandAdverseEffectsin33Patientstreatedfor6to24Months,Blood82,408-416；和Weinreb等人,Am.J.Med.,113(2):112-9(2002)。
一个实施方案提供了每周三次2.5单位/千克(U/kg)至每两周一次60U/kg的ERT剂量方案，其中酶通过历时1-2小时静脉内输注来给药。葡萄糖脑苷脂酶的单位被定义为在37℃每分钟催化1微摩尔合成底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷发生水解的酶量。另一个实施方案提供了每周三次1U/kg至每两周一次120U/kg的剂量方案。另一个实施方案提供了每天一次或每周三次 0.25U/kg至每二至六周一次600U/kg的剂量方案。
阿糖脑苷酶自1991年以来可由建新公司(GenzymeCorporation)得到。阿糖脑苷酶为由胎盘衍生的葡萄糖脑苷脂酶的改良形式。在1994年，伊米苷酶(imiglucerase)也可由建新公司得到。伊米苷酶为葡萄糖脑苷脂酶的改良形式，其衍生自重组DNA在哺乳动物细胞培养系统(中华仓鼠卵巢细胞)中的表达。伊米苷酶为由497个氨基酸组成且含有四个N联糖基化位点的单体糖蛋白。伊米苷酶具有以下优点：与由胎盘衍生的阿糖脑苷酶相比理论上无限的供应和降低生物污染物的可能性。这些酶在其糖基化位点被修饰以暴露甘露糖残基，该策略经由甘露糖-6-磷酸受体而改善了对溶酶体的靶向性。伊米苷酶与胎盘葡萄糖脑苷脂酶的不同在于495位的一个氨基酸，其中组氨酸代替精氨酸。已知这些产品的几种剂量方案是有效的(参见上述Morales,1996；上述Rosenthal等人,1995；上述Barton等人,1991；上述Grabowski等人,1995；上述Pastores等人,1993)。例如，每两周一次60U/kg的剂量方案在患有中度至重度疾病的受试者中具有临床益处。对于其它剂量方案和给药信息，从业人员应该查询以上引用的参考文献和上述产品的包装说明书。还参见授予建新公司的美国专利5,236,838和5,549,892。
如上所述，戈谢病由于溶酶体酶葡萄糖脑苷脂酶(GC)的缺乏而引起。在戈谢病的最常见表型(1型)中，病理学限于网状内皮组织系统和骨骼系统且没有神经病症状。参见Barranger,Glucosylceramidelipidosis:Gaucherdisease.In:ScriverCRBA,SlyWS,ValleD,editor.TheMetabolicBasisofInheritedDisease.NewYork:McGraw-Hill.pp.3635-3668(2001)。在神经病性戈谢病(nGD)(细分为2型和3型戈谢病)中，葡萄糖脑苷脂酶(GC)的缺乏引起葡萄糖基神经酰胺(GluCer；GL-1)和葡萄糖基鞘氨醇(GluSph)在脑中的蓄积，这导致神经损伤。2型戈谢病的特征在于发病早、进展快、内脏和中枢神经系统中的广泛病理学及通常在2岁前死亡。3型戈谢病(也称为亚急性nGD)是一种中间表型，其具有各种发病年龄及不同的严重度和进展速率。Goker-Alpan等人,TheJournalofPediatrics143:273-276(2003)。最近的进展是已生成了2型戈谢病的K14lnl/lnl小鼠模型(以下称为“K14小鼠”)；该小鼠模型非常接近地再现了所述人类疾病，其表现出共济失调、癫痫发作、痉挛状态和减少的中位寿命(仅14天)。Enquist等人,PNAS104:17483-17488(2007)。
如在患有nGD的患者中那样，所述疾病的几种小鼠模型由于GC活性的缺乏而在脑中具有提高的GluCer和GluSph水平。Liu等人,PNAS95:2503-2508(1998)和Nilsson,J.Neurochem39:709-718(1982)。“K14”小鼠显示出神经病表型，其与2型戈谢病共有多种病理学特征例如神经变性、星形胶质细胞增生、小神经胶质细胞增殖及特定脑区域中提高的GluCer和GluSph水平。Enquist等人(2007)。
由于2型病的严重度及当前疗法不能穿过血脑屏障(BBB)，因此进行治疗的医生面临对受nGD影响的患者进行临床控制的挑战。对非nGD的当前治疗基于重组人葡萄糖脑苷脂酶(Imiglucerase；CerezymeTM)的静脉内给药以代替缺失的酶或基于葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂的给药以减少底物(GL-1)的产生。然而，这些药物不能穿过血脑屏障且因此预期不能为nGD患者提供治疗益处。当前临床中的小分子葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂不可能解决nGD的神经病表型。在2型戈谢病的K14小鼠模型中对本发明化合物(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(以下称为“GZ161”)进行的评价表明其确实能够减少脑GluCer和GluSph(参见实施例122-125)。其还减少脑神经病并延长该模型的寿命。另外，使用酶替代疗法和小分子底物减少的组合措施可代表对2型戈谢病的优秀疗法。
法布里病
如上所述，法布里病由于溶酶体酶α-半乳糖苷酶A的缺乏而引起。所述酶的缺乏导致具有末端α-半乳糖基的糖鞘脂的全身性沉积，所述具有末端α-半乳糖基的糖鞘脂主要为神经酰胺三己糖苷(GL3或Gb3)且在较小程度上为半乳糖二糖基神经酰胺和B血型糖鞘脂。
几种测定可用于监测疾病进展和确定何时由一种治疗模式转换至另一种治疗模式。在一个实施方案中，可使用以下测定，其确定组织样品中α-半乳糖苷酶A的特异性活性。在另一个实施方案中，可使用以下测定，其确定Gb3的蓄积。在另一个实施方案中，从业人员可测定糖鞘脂底物在体液中及在血管内皮细胞、周皮细胞和血管平滑肌细胞的溶酶体中的沉积。可作为有用的疾病控制指示物的其它临床表现包括蛋白尿或肾损伤的其它指征例如尿中的红细胞和脂质小球及升高的红细胞沉降率。从业人员还可监测贫血、降低的血清铁浓度、高浓度的β-血小板球蛋白及升高的网织红细胞计数或血小板聚集。实际上，可使用本领域技术人员已知用于监测疾病进展的 任意措施(一般参见DesnickRJ等人,1995,alpha-GalactosidaseADeficiency:FabryDisease,In:TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,Scriver等人编辑,McGraw-Hill,N.Y.,7.sup.thed.,第2741-2784页)。优选的代替标志物为用于对法布里病控制进行监测的疼痛。其它优选的方法包括对来自体液或活检标本的酶和/或底物的总清除率进行测量。法布里病酶替代疗法的优选剂量方案为每隔一天一次1-10mg/kgi.v.。可使用每隔一天一次至每周一次或每两周一次0.1-100mg/kgi.v.的剂量方案。
B型尼-皮病
如上所述，B型尼-皮病由于溶酶体酶酸性鞘磷脂酶的活性降低和膜脂质(主要为鞘磷脂)的蓄积而引起。待递送的代替用酸性鞘磷脂酶的有效剂量可为约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重，其频率为每隔一天一次至每周一次、每两周一次或每两个月一次。在其它实施方案中，有效剂量可为约0.03mg/kg至约1mg/kg、约0.03mg/kg至约0.1mg/kg和/或约0.3mg/kg至约0.6mg/kg。在具体实施方案中，在递增的剂量方案中按以下先后剂量向患者给药酸性鞘磷脂酶：0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg和1.0mg/kg，其中每种剂量的酸性鞘磷脂酶至少给药两次且每种剂量的给药间隔两周且其中在将剂量提高至下一个水平前监测患者中的毒副作用(参见美国专利申请公开文本2011/0052559)。
胡-沙综合征(MPSI)
胡尔勒病、沙伊病和胡-沙病(也称为MPSI)由于α-艾杜糖醛酸酶的失活及硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的蓄积而引起。几种测定可用于监测MPSI疾病进展。例如，可监测组织活检标本或由外周血得到的培养细胞中α-艾杜糖醛酸酶的酶活性。另外，MPSI及其它粘多糖贮积病中疾病进展的方便测量指标是糖胺聚糖硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的尿排泄(参见上述Neufeld等人,1995)。在具体实施方案中，以0.58mg/kg体重的剂量每周一次静脉内输注给药α-艾杜糖醛酸酶。
亨特病(MPSII)
亨特病(也称为MPSII)由于艾杜糖醛酸硫酸酯酶的失活及硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的蓄积而引起。亨特病在临床上呈现为重度和中度形式。治疗用酶的剂量方案为每两周1.5mg/kg至每周50mg/kg是优选的。
莫尔基奥综合征(MPSIV)
莫尔基奥综合征(也称为MPSIV)由于硫酸角质素的蓄积而引起，而硫酸角质素的蓄积是由于两种酶中的任意一种的失活。MPSIVA中失活的酶为半乳糖胺-6-硫酸酯酶且MPSIVB中失活的酶为β-半乳糖苷酶。治疗用酶的剂量方案为每两周1.5mg/kg至每周50mg/kg是优选的。
马-拉病(MPSVI)
马-拉病(也称为MPSVI)由于半乳糖胺-4-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶B)的失活和硫酸皮肤素的蓄积而引起。每两周1.5mg/kg至每周50mg/kg的剂量方案为ERT所提供的有效治疗用酶的优选范围。最优化地，所使用的剂量小于或等于每周10mg/kg。MPSVI疾病进展的优选代替标志物为蛋白聚糖(roteoglycan)的水平。
蓬佩病
蓬佩病由于酸性α-葡萄糖苷酶的失活和糖原的蓄积而引起。酸性α-葡萄糖苷酶的基因位于人染色体17上并被命名为GAA。H.G.Hers基于他对该疾病的研究而首次提出了先天性溶酶体疾病的概念，所述先天性溶酶体疾病被他称为II型糖原贮积病(GSDII)且现也称为酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD)(参见Hers,1965,Gastroenterology48,625)。在具体实施方案中，以20mg/kg体重的剂量每两周静脉内输注给药GAA。
几种测定可用于监测蓬佩病进展。可使用本领域技术人员已知的任意测定。例如，本领域技术人员可测定糖原颗粒在溶酶体中的蓄积，特别是在从活检获得的心肌膜、肝和骨骼肌纤维中。还可监测活检标本或由外周血得到的培养细胞中α-葡萄糖苷酶的酶活性。可监测肌酸激酶(CK)的血清升高作为疾病进展的指征。血清CK在婴儿发病患者中可升高十倍且在成人发病患者中通常升高较小的程度。参见HirschhornR,1995,GlycogenStorageDiseaseTypeII:Acidalpha-Gluocosidase(AcidMaltase)Deficiency,In:TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,Scriver等人编辑,McGraw-Hill,N.Y.,7.sup.thed.,第2443-2464页。
酶替代疗法
以下章节提供了关于本发明联合疗法中酶替代疗法组分的具体公开和可选实施方案。本发明联合疗法中酶替代疗法组分的剂量方案通常由专业医生确定。以上提供了用葡萄糖脑苷脂酶治疗戈谢病的剂量方案的几个实例。基于公众可得到的信息例如在相关章节中就每种具体LSD所引用的具体参 考文献，本发明联合疗法中的任意给定ERT组分在治疗任意LSD中的剂量方案的一般确定原则对于本领域技术人员将是显而易见的。可通过静脉内输注向患者给药ERT。脑室内和/或鞘内输注(例如除静脉内输注外)可用于向被诊断患有具有CNS表现的溶酶体贮积病的患者给药ERT。
本领域已知的任意方法可用于制备在本发明联合疗法的酶替代疗法组分中使用的酶。多种这样的方法是已知的且包括但不限于由Shireplc开发的基因活化技术(参见美国专利5,968,502和5,272,071)。
小分子疗法
以下章节提供了关于本发明联合疗法中小分子疗法组分的具体公开和可选实施方案。本发明联合疗法中小分子疗法组分的剂量方案通常由专业医生确定且预期随所治疗的具体贮积病和具体患病个体的临床情况而显著变化。本发明任意联合疗法中给定的SMT组分在治疗任意贮积病中的剂量方案的一般确定原则是本领域技术人员熟知的。关于剂量方案的指导可由就此而言任意本领域公知的多种参考文献得到。其它指导可尤其由参阅本申请引用的一系列具体参考文献得到。
通常，本发明化合物例如(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯和(2-(4’-氟-[1,1’-联苯]-3-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯可用于本发明联合疗法以治疗实际上由于糖鞘脂途径损害而引起的任意贮积病(例如戈谢病、法布里病、GM1神经节苷脂贮积病和GM2神经节苷脂贮积病(例如GM2活化因子缺乏症、泰-萨克斯病和桑德霍夫病))。类似地，氨基糖苷(例如庆大霉素、G418)可在本发明联合疗法中使用以用于具有早熟终止密码子突变(即无义突变)的任意贮积病个体。上述突变在胡尔勒综合征中是特别普遍的。当与其它疗法相比时，本发明联合疗法中的小分子疗法组分在所治疗的贮积病具有中枢神经系统表现的情况下(例如桑德霍夫病、泰-萨克斯病、A型尼-皮病及2型和3型戈谢病)是特别优选的，这是因为小分子通常可容易地穿过血脑屏障。
本领域技术人员可容易地确定本发明联合疗法所使用的底物抑制剂的优选剂量。在某些实施方案中，所述剂量可为约0.5mg/kg至约300mg/kg，优选约5mg/kg至约60mg/kg(例如5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg和60mg/kg)，其中每天一次至五次腹膜内、口服或等效给药。所述剂量可为约 5mg/kg至约5g/kg，优选约10mg/kg至约1g/kg，其中每天一次至五次口服、腹膜内或等效给药。在一个实施方案中，剂量范围为约10mg/天至约500mg/天(例如10mg/天、20mg/天、30mg/天、40mg/天、50mg/天、60mg/天、70mg/天、80mg/天、90mg/天、100mg/天、110mg/天、120mg/天、130mg/天、140mg/天、150mg/天、160mg/天、170mg/天、180mg/天、190mg/天、200mg/天、210mg/天、220mg/天、230mg/天、240mg/天、250mg/天、260mg/天、270mg/天、280mg/天、290mg/天和300mg/天)。特别优选的口服剂量范围为约50mg至约100mg，其中所述剂量每天给药两次。本发明化合物的具体口服剂量范围为约5mg/kg/天至约600mg/kg/天。本发明化合物的具体口服剂量范围为约1mg/kg/天至约100mg/kg/天例如1mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天、45mg/kg/天、50mg/kg/天、55mg/kg/天、60mg/kg/天、65mg/kg/天、70mg/kg/天、75mg/kg/天、80mg/kg/天、85mg/kg/天、90mg/kg/天、95mg/kg/天或100mg/kg/天。
治疗平台(即酶替代疗法和小分子疗法)的轮换组合是优选的。然而，受试者还可按需通过这两种措施的重叠来治疗，这由本领域技术人员确定。治疗安排的实例可包括但不限于：(1)进行SMT，然后进行ERT；(2)进行ERT，然后进行SMT；及(3)在大约相同的时间提供ERT和SMT。如上所述，还可按需进行治疗平台的暂时重叠，这取决于给定的贮积病在给定的受试者中的临床病程。
各种联合疗法的治疗间隔可变化很大且在不同的贮积病和不同的个体之间通常可为不同的，这取决于贮积产物蓄积的激进程度。例如，与蓬佩病中贮积产物的快速蓄积相比，法布里病中贮积产物的蓄积可为缓慢的。本领域技术人员通过监测疾病进展和治疗成功的临床指征而对具体个体中的具体贮积病进行滴定。
在溶酶体贮积病中蓄积的各种大分子不是均匀分布的，而是沉积在就每种疾病而言某些优选的解剖学位点。然而，外源性提供的酶通常被网状内皮系统中的细胞所吸收并被分类到溶酶体隔室中，其中它的作用是水解所蓄积的底物。另外，治疗性酶的细胞摄取可通过某些措施来加强以提高对溶酶体的靶向性(参见例如Friedman等人转让给建新公司的美国专利5,549,892，所述专利描述了以下重组葡萄糖脑苷脂酶，其借助被细胞表面的甘露糖受体所识别并被胞吞和运输至溶酶体的改造寡糖侧链而具有改善的药物代谢动力 学)。
与其它器官相比，一些治疗模式较好地靶向于一些受影响的器官。在法布里病中，例如若ERT到达肾的充分程度不足以产生令人满意的临床效果，则SMT可用于降低肾中的底物水平。如实施例112和图6B所示，与ERT相比，SMT以更大的程度有效地降低法布里病小鼠模型的尿中的Gb3水平(即法布里病患者中蓄积的底物)。据信肾为尿Gb3的主要来源。相反地，图6B显示，与SMT相比，ERT以更大的程度有效地降低血浆中的Gb3水平。这些结果表明ERT和SMT的联合疗法提供互补的治疗策略，其利用强度的优点且解决与单独使用每种疗法相关的缺点。SMT能够穿过BBB，当与ERT组合时这提供了有力的措施来治疗具有CNS表现的LSD例如A型尼-皮病和神经病性戈谢病(nGD)。另外，SMT与酶替代疗法的组合所实现的底物减少在单独和不同的介入点解决贮积问题，这可加强临床效果。
应当理解的是，所提及的两种或更多种疗法的同时或并行给药不需要它们在同一时间给药，而仅需要它们在受试者中在同一时间发挥作用。
实施例1
(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯
步骤1：用碘甲烷进行二甲基化
程序：3N圆底烧瓶(RBflask)装配有温度计、滴液漏斗(additionfunnel)和氮气进口。将烧瓶用氮气吹扫，称出叔丁醇钾(MW112.21,75.4mmol,8.46g,4.0当量,白色粉末)并经由加料漏斗(powderfunnel)加至烧瓶中，接着加入THF(60mL)。大部分叔丁醇钾溶解，得到混浊的溶液。将这种混合物在冰-水浴中冷却至0-2℃(内温)。在另一烧瓶中，将起始的酯(MW265.3,18.85mmol,5.0g,1.0当量)溶于THF(18mL+2mL用作淋洗)中并转移至滴液漏斗中。历时25-30min将该溶液逐滴添加至经冷却的混合物中，添加过程中保持内温低于5℃。将反应混合物冷却回至0-2℃。在单独烧瓶中，制备碘甲烷(MW141.94,47.13mmol,6.7g,2.5当量)在THF(6mL)中的溶液并转移至滴液漏斗中。然后将含碘甲烷溶液的烧瓶用THF(1.5mL)淋洗，然后将其 转移至已含有碘甲烷在THF中的透明无色溶液的滴液漏斗中。历时30-40min将该溶液小心地逐滴添加至暗棕色反应混合物中，添加过程中总是保持内温低于10℃。加入完成后，将微浑浊的混合物再搅拌1h，在该时间期间内温降至0-5℃。在0-5℃搅拌1h后，历时5-7min慢慢逐滴添加5.0MHCl水溶液(8mL)，将反应混合物淬灭。该逐滴添加过程中应当保持内温低于20℃。添加完毕后，加入水(14mL)并将混合物搅拌2-3min。停止搅拌并允许两层分开。然后将两层转移至250mL1N圆底烧瓶中并尽可能真空蒸发THF，得到THF/产物和水的双相层。允许两层分开。将步骤1产物的THF溶液用于下一反应中。
步骤2：用LiOH一水合物水解乙酯
程序：将在THF中的粗酯加至反应烧瓶中。在100mL烧杯中单独称出LiOH.H2O(MW41.96,75.0mmol,3.15克,2.2当量)，向其中加入搅拌棒。加入水(40mL)并将混合物搅拌直至全部固体溶解得到透明的无色溶液。然后将该水溶液加至含有该酯在四氢呋喃(THF)中的溶液的250mL圆底烧瓶中。将冷凝器连接至烧瓶的颈并将氮气进口连接至冷凝器的顶部。将混合物回流加热16小时。16小时后，停止加热并将混合物冷却至室温。真空蒸发THF，得到棕色溶液。通过HPLC和LC/MS分析棕色水溶液的等分试样，乙酯完全水解。加入水(15mL)并将该碱性水溶液用TBME(2x40mL)萃取除去叔丁酯。将碱性水层在冰-水浴中冷却至0-10℃并伴随搅拌逐滴添加浓HCl至pH约1。向在酸性水溶液中的该胶粘性固体中加入TBME(60mL)，振摇混合物，然后剧烈搅拌使全部算溶解至TBME层中。将两层转移至分液漏斗中并分出TBME层。将淡黄色酸性水溶液用TBME(40mL)再萃取且分出TBME层并与先前的TBME层合并。弃去酸性水层。将合并的TBME层以无水Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发，除去TBME并得到呈橙色/暗黄色油状物的粗酸，其在高真空下固化，得到脏黄色(dirtyyellowcolored)固体。称出粗酸并通过在庚烷/TBME(3:1,5mL/g粗品)中加热进行结晶，得到呈黄色固体的酸。
步骤3：与NH2OH.HCl形成羟肟酸
程序：在氮气下称量羧酸(MW265.3,18.85mmol,5.0g,1.0当量)并转移至25mL1N圆底烧瓶中。加入THF(5.0mL)且该酸容易溶解得到透明的暗黄色至棕色溶液。将溶液在冰浴中冷却至0-2℃(浴温)并历时10-15min以小份慢慢加入N,N’-羰基二咪唑(CDI；MW162.15,20.74mmol,3.36g,1.1当量)。移开冰浴并将溶液在室温搅拌1h。搅拌1h后，将溶液在冰浴中再次冷却至0-2℃(浴温)。由于加入是放热的，所以历时3-5min以小份固体形式缓慢加入盐酸羟胺(NH2OH.HCl；MW69.49,37.7mmol,2.62g,2.0当量)。加入完成后，历时2min将水(1.0mL)逐滴添加至非均质混合物中并将反应混合物在冰-水浴中在0-10℃搅拌5min。移开冷却浴并将反应混合物在氮气下在室温搅拌过夜20-22h。由于全部NH2OH.HCl溶液，所以溶液变透明。20-22h后，通过高压液相色谱(HPLC)分析反应混合物的等分试样。然后真空蒸发THF并将残余物吸收在二氯甲烷(120mL)和水(60mL)中。将混合物转移至分液漏斗(separatoryfunnel)中，在分液漏斗中振摇混合物并允许两层分开。弃去水层并将二氯甲烷层用1N盐酸(HCl；60mL)洗涤。弃去酸层。将二氯甲烷层以无水Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发溶剂，得到呈淡黄色固体形式的粗羟肟酸，将其在高真空下干燥过夜。
步骤3续：羟肟酸转化成环状中间体(未分离)
程序：将粗羟肟酸(MW280.32,5.1g)转移至250mL具有氮气进口的1N圆底烧瓶中。先后加入搅拌棒和乙腈(50mL)。固体在乙腈中不可溶。在氮气下将黄色非均质混合物搅拌2-3min并在室温以单份加入CDI(MW162.15,20.74mmol,3.36g,1.1当量)。未观察到放热。固体立即溶解并将透明的黄色溶液在室温搅拌2-2.5h。2-2.5h后，通过HPLC和LC/MS分析等分试样， 其显示羟肟酸转化成所期望的环状中间体。
然后真空蒸发乙腈，得到粗的环状中间体，其为淡红色粘稠油状物。将油状物吸收在甲苯(60mL)中并将淡红色混合物加热至回流且保持2小时，在此期间环状中间体释放CO2并重排至异氰酸酯(参见下文)。
步骤3续：异氰酸酯转化成游离碱
将反应混合物冷却至50-60℃并以固体形式以单份向混合物中加入(S)-(+)-奎宁环醇(quinuclidinol)(MW127.18,28.28mmol,3.6g,1.5当量)。将混合物再加热至回流且保持18h。18h后，通过HPLC和LC/MS分析等分试样，其显示异氰酸酯完全转化成所期望的产物。将反应混合物转移至分液漏斗中并加入甲苯(25mL)。将混合物用水(2x40mL)洗涤并分出水层。将合并的水层用甲苯(30mL)再萃取并弃去水层。将合并的甲苯层用1NHCl(2x60mL)萃取并弃去甲苯层(含有O-酰基杂质)。将合并的HCl层转移至500mL装配有搅拌棒的锥形瓶中。通过逐滴添加50％w/wNaOH水溶液将该正在搅拌的黄色/淡红橙色溶液碱化至pH10-12。所期望的游离碱以脏黄色胶粘性固体形式从溶液中析出，其可能困住搅拌棒。向该混合物中加入乙酸异丙酯(100mL)并将混合物剧烈搅拌5min，此时胶粘性固体进入乙酸异丙酯。停止搅拌并允许两层分开。分出黄色乙酸异丙酯层并将碱性水层用乙酸异丙酯(30mL)再萃取。弃去碱性水层并将合并的乙酸异丙酯层以无水Na2SO4干燥，过滤至预称重的圆底烧瓶中并真空蒸发溶剂，得到呈米黄色至黄褐色固体形式的粗游离碱，将其在高真空下干燥过夜。
步骤3续：粗游离碱的重结晶
称量米黄色至黄褐色的粗游离碱并从庚烷/乙酸异丙酯(3:1,9.0mL溶剂 /g粗游离碱)中重结晶。将适量庚烷/乙酸异丙酯与搅拌棒一起加至粗游离碱中并将混合物(游离碱开始部分可溶但当加热至回流时溶解得到透明的淡红橙色溶液)加热至回流且保持10min。移开热源并伴随搅拌将混合物冷却至室温，此时形成白色析出物。在室温搅拌3-4h后，在软管真空(hosevacuum)下使用布氏漏斗滤出析出物，用庚烷(20mL)洗涤并在软管真空下在布氏漏斗上干燥过夜。将析出物转移至结晶皿上并在55℃在真空烘箱中干燥过夜。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.04–7.83(m,2H),7.20–6.99(m,3H),5.53(s,1H),4.73–4.55(m,1H),3.18(dd,J＝14.5,8.4Hz,1H),3.05–2.19(m,5H),2.0–1.76(m,11H)。13CNMR(100MHz,CDCl3)δ166.38,165.02,162.54,162.8-155.0(d,C-F),130.06,128.43,128.34,116.01,115.79,112.46,71.18,55.70,54.13,47.42,46.52,27.94,25.41,24.67,19.58。
实施例2
(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯苹果酸盐的结晶形式A
在室温将(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯的游离碱(20g)溶于IPA(140ml)中并过滤。将滤液加至装配有顶置搅拌器和氮气进/出口的1L圆底烧瓶中。在室温将L-苹果酸(6.89g)溶于IPA(100+30ml)中并过滤。将滤液加至上述1升烧瓶中。将所得溶液在室温在氮气下搅拌(进行或不进行种晶)4-24小时。在该时间段内出现晶体。经由过滤收集产物并用少量IPA(30ml)洗涤。将固体在真空烘箱中在55℃干燥72小时(23g,产率：)。
H1NMRCDCl3
δ(ppm)裂分积分归属
7.9m2Ha
7.1m3Hb,Hc
5.9br s1NH
4.9m1Hd
4.2m1Ha’
3.1-3.6m6He
2.7m2Hb’
1.6-2.4m11Hf,(CH3)2
实施例3
(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯HCl盐
将(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(0.78g,2mmole)在IPA(8ml)中的溶液在室温搅拌。加入HCl(2M在IPA中的溶液,1ml)。将溶液进行种晶并在室温搅拌18h。经由过滤收集产物并真空干燥得到产物(0.7g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ12.(br,s,1H),7.9–8.0(m,2H),7.1–7.2(m,3H),5.9(br,s,1H),4.9–5.0(m,1H),3.2–3.6(m,6H),1.7–2.4(m,11H)。
实施例3
(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(S)-2-羟基琥珀酸盐
将琥珀酸(0.15g)溶于IPA(5ml)中并在50℃搅拌。加入(S)-(2-(2-(4-氟苯基)噻唑-4-基)丙-2-基)氨基甲酸奎宁环-3-基酯(0.5g)在IPA(8ml)中的溶液。将溶液进行种晶并在室温搅拌20h。经由过滤收集产物并真空干燥得到产物(0.4g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.9(m,2H),7.1–7.2(m,3H),5.8(br,s,1H),4.9(m,1H),3.1–3.5(m,6H),2.6(s,4H),1.7–2.4(m,11H)。