一株Diaphorobacter菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株Diaphorobacter菌株及其应用。
背景技术
吡啶、苯酚、甲酚及其衍生物是重要的化工原料，也是煤炭焦化、汽化过程中产生的焦化废水和汽化废水的主要成分，研究发现这些化合物对人类和环境生物均具有较大的危害。传统的废水治理难以使含有上述成分的废水达标排放。微生物因具有强大的降解功能和较强的适应性，而经常被用做环境污染修复的重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一株Diaphorobacter菌株及其应用。
本发明提供的菌株(Diaphorobacter sp.)，分离自焦化废水处理装置中，菌株名称为SG-51，已于2009年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3511。
本发明还保护一种菌剂，它的活性成分为菌株(Diaphorobacter sp.)SG-51CGMCC No.3511。
所述菌株和/或所述菌剂在降解有毒物质中的应用也属于本发明的保护范围；所述有毒物质为苯酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、3-羟基吡啶、喹啉和吡啶中的至少一种。
本发明还保护一种降解有毒物质的方法，是所述菌株和/或所述菌剂降解有毒物质；所述有毒物质为苯酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚、3-羟基吡啶、喹啉和吡啶中的至少一种。
本发明同时保护所述菌株和/或所述菌剂在废水处理中的应用。
所述废水具体可为现代焦化、汽化过程所产生的废水、以及其它石油化工生产过程中产生的含有苯酚、甲酚、对氯苯酚和吡啶的有机废水等。
本发明同时保护一种处理废水的方法，是将所述菌株和/或所述菌剂加入所述废水中。
所述废水具体可为现代焦化、汽化过程所产生的废水、以及其它石油化工生产过程中产生的含有苯酚、甲酚(邻甲基苯酚、间甲基苯酚和对甲基苯酚)、对氯苯酚、苯和吡啶的有机废水等。
用所述菌株制备所述菌剂可采用如下流程：
生产菌剂的工艺为：斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
用所述菌株制备所述菌剂具体可采用如下步骤：
1、将菌株SG-51(原种)在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。
2、将试管种接种于1000ml摇瓶(含200ml肉汤培养基)中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。
3、配制发酵培养基(葡萄糖0.8％、(NH4)2SO41％、K2HPO40.2％、MgSO40.05％、NaCl 0.01％、CaCO30.3％、酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5)，将400L发酵培养基加入500L种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将摇瓶菌种按10％(体积百分含量)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8(体积比)。
4、生产罐(生产罐容量5吨)所用培养基成分与发酵培养基相同(投料量4.5吨)，投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用；将到达对数期的种子液按10％(体积百分含量)的接种量接入生产罐，接种后的生产罐温度控制在30-35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶(0.6-1.2)，搅拌速度为180-240转/分(如240转/分)，整个工艺流程培养时间为48-60小时；发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
5、发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
本发明提供的菌株SG-51对焦化废水中的有毒有害物质具有较强的抗性和适应性，在焦化废水中的存活时间、作用时间较长，具有较广的降解谱，能够同时降解吡啶、3-羟基吡啶、喹啉、苯酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚等化合物，能使吡啶、苯酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚等化合物的降解率达到90％以上，3-羟基吡啶和喹啉的降解率达到50％以上。本发明的菌剂为新型的芳香族有机污染物降解菌剂，具有生产使用成本低、使用方便、较广的降解谱、去除效果好的优点，可以使焦化废水等有机废水中的苯酚、甲酚的降解率为95％以上。本发明提供的菌株和菌剂可用于降解焦化废水中的有机有毒成分，适用于现代焦化、汽化过程所产生的废水、以及其它石油化工生产过程中产生的含有苯酚、甲酚、对氯苯酚、苯和吡啶的有机废水的处理，可以保证焦化废水中的苯酚、甲酚和吡啶等有机物残留含量符合废水排放标准。本发明成功地解决了焦化废水处理过程中的苯酚及其衍生物、苯或其它杂环化合物去除效果不高的问题，降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本，对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实验均设置三次重复，结果取平均值。以下实施例中的“％”，如无特殊说明，均为质量百分含量。
降解率＝(1-反应结束时化合物的量/反应起始时化合物的量)×100％。
基础盐培养基中各个有机物的浓度测定方法：取0.5ml液体，加入等体积的甲醇(充分振荡，使化合物溶解)，用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测；检测条件如下：色谱柱，C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相，甲醇∶水＝5∶2，体积比；流速为0.7ml/min；上样量为20μl；各化合物的检测(定量)波长：吡啶，257nm；3-羟基吡啶，276nm；苯酚，271nm；甲酚(间甲基苯酚、邻甲基苯酚、对甲基苯酚)，276nm；对氯苯酚，281nm；喹啉，280nm。浓度定量采用外标法。
焦化废水中苯酚和甲酚(间甲基苯酚、邻甲基苯酚、对甲基苯酚)的浓度测定方法：取0.5ml液体，加入等体积的甲醇(充分振荡)，用0.22μm的微孔滤膜过滤后使用配备有紫外检测器的高效液相色谱进行检测；检测条件如下；色谱柱，C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相，甲醇∶水，初始体积比为2∶5，在15min内匀速调整为5∶2，维持2min后调整到初始比；流速为0.7ml/min；上样量为20μl；各化合物的检测(定量)波长如下：苯酚，271nm；甲酚，276nm。浓度定量采用外标法。
实施例1、菌株SG-51的获得和鉴定
一、菌株SG-51的获得
2008年4月从广东韶关取焦化废水活性污泥2g加入到含有吡啶、苯酚的基础盐培养基中培养7天，稀释后在含吡啶、苯酚的基础盐培养基平板上涂布，再培养7天后，挑取单菌落划线纯化后保存。
二、菌株SG-51的鉴定
形态特征：菌体为短杆状。
生理生化特征：革兰氏染色阳性菌(革兰氏染色阳性)；过氧化氢酶、硝酸盐还原反应为阳性；明胶水解、亚硝酸还原反应、甲基红反应、葡萄糖发酵产酸、氧化酶、V.P.反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉，不能利用柠檬酸和酒石酸；
分子鉴定结果：16S rDNA的部分序列见序列表的序列1。
三、菌株SG-51的保藏
通过以上鉴定结果，确认菌株SG-51为来自于Diaphorobacter(Diaphorobacter sp.)的新菌，将其命名为SG-51，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3511。
实施例2、菌株SG-51在基础盐液体培养基对不同化合物的降解
基础盐液体培养基：将1.0g NaCl、1.0g NH4NO3、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4和0.2g MgSO4·7H2O用水定容至1L。
挑取SG-51单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。
在100ml溶液A(或溶液B或溶液C或溶液D或溶液E或溶液F或溶液G或溶液H)中，接入2ml新鲜菌液，30℃摇床培养(170转/分)，3天后(72小时)取样测定化合物的降解率。降解率＝(1-反应结束时化合物的量/反应起始时化合物的量)×100％。
溶液A的制备方法：将苯酚加入基础盐液体培养基中，苯酚的终浓度为100mg/L。
溶液B的制备方法：将邻甲基苯酚加入基础盐液体培养基中，邻甲基苯酚的终浓度为100mg/L。
溶液C的制备方法：将间甲基苯酚加入基础盐液体培养基中，间甲基苯酚的终浓度为100mg/L。
溶液D的制备方法：将对甲基苯酚加入基础盐液体培养基中，对甲基苯酚的终浓度为100mg/L。
溶液E的制备方法：将对氯苯酚加入基础盐液体培养基中，对氯苯酚的终浓度为100mg/L。
溶液F的制备方法：将3-羟基吡啶加入基础盐液体培养基中，3-羟基吡啶的终浓度为100mg/L。
溶液G的制备方法：将喹啉加入基础盐液体培养基中，喹啉的终浓度为100mg/L。
溶液H的制备方法：将吡啶加入基础盐液体培养基中，吡啶的终浓度为100mg/L。
结果见表1。
表1菌株SG-51在基础盐液体培养基对不同化合物的降解率(3天)
底物
苯酚
邻甲
基
苯酚
间甲
基
苯酚
对甲
基
苯酚
吡啶
喹啉
3-羟基
吡啶
对氯
苯酚
|
降解率(％)
100
100
100
＞90
100
50
50
＞90
实施例3、菌株SG-51在焦化废水中对不同化合物的降解
挑取SG-51单菌落于3ml LB液体培养基中，30℃、165转/分振荡培养24小时，获得新鲜菌液。
量取100ml焦化废水，检测其中苯酚和甲酚的浓度(初始浓度)。苯酚的浓度为400mg/L；甲酚的浓度为100mg/L。
接入2ml新鲜菌液，混匀，置于30℃，165转/分的摇床培养，4天后(96小时)取样测定化合物的降解率。结果见表2。
表2菌株SG-51在焦化废水中对不同化合物的降解特性(4天)
底物
苯酚
甲酚
(包括邻、间、对甲基苯酚)
|
降解率(％)
＞99
＞95
序列表
<110>北京大学
<120>一株Diaphorobacter菌株及其应用
<130>CCGNARY102056
<160>1
<210>1
<211>1288
<212>DNA
<213>Diaphorobacter
<400>1
ttagagtttg atcctggctc agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga 60
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