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一株产鼠李糖脂生物表面活性剂菌株及其生产的菌剂
    一、 技术领域
     本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂， 属于生 物高技术领域。 是利用微生物学方法， 促进土壤中多环芳烃的降解， 可以应用于多环芳烃污 染土壤的生物修复。 二、 背景技术
     多环芳烃 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons， PAHs) 是一类广泛存在于环境中 的难降解有机污染物。 近年来， 随着石油、 煤、 天然气等资源开发利用的不断加快， 环境中的 多环芳烃有不断增加的趋势。 由于多环芳烃的潜在毒性、 致癌性及致畸诱变作用， 对人类健 康和生态环境具有明显的生态风险。芘是具有四个苯环的稠环芳烃， 是检测多环芳烃污染 的指示物。 生物修复技术被认为是最具潜力去除土壤或沉积物中有机污染物经济有效的方 法。但由于 PAHs 的水溶性差， 憎水性强， 易吸附于沉积物或土壤的固体颗粒上， 生物有效性 差， 从而延缓了其生物降解的速率。添加表面活性剂可增强 PAHs 从固体颗粒释放的速率， 增大其在水中的溶解度， 并通过减小固液相之间的界面张力来促进沉积物所吸附 PAHs 的 流动， 从而提高污染物的传质速率和生物有效性。目前， 生物表面活性剂中最重要， 数量最 大， 品种最多的是糖脂类生物表面活性剂。而在糖脂中最常见， 研究最深入， 应用最广泛的 就是鼠李糖脂。鼠李糖脂在促进多环芳烃污染物的修复处理中有着显著效果。铜绿假单胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是研究的最多的鼠李糖脂产生菌。利用以铜绿假单胞菌为 生产菌株虽然可以获得较高的产量， 但铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌， 是一种人体条件致病 菌， 会带来一系列的安全问题， 不能大规模工业化应用， 这就迫使人们要寻找其它非致病菌 作为生产鼠李糖脂的主体。这方面的研究主要集中在利用基因工程的方法， 以实现鼠李糖 脂的外源生产。 目前为止， 还是通过质粒为载体构建基因工程菌， 这中方法存在质粒不稳定 和引入抗生素标记的缺陷。迫切需要开发新的方法。 三、 发明内容
     技术问题本发明的目的在于针对环境修复中的实际问题和需求， 开发研制出一种 新型鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂。 它是将铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)BSFD5 中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关的基因簇 rhlABRI， 通过无标 记同源重组的方法， 整合到恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) 的模式菌株 KT2440 的染 色体中而获得。Pseudomonas putida KT2440 是一株在全世界范围内得到详尽研究和应用 的菌株， 是第一个被美国卫生部重组 DNA 委员会 (Recombinant DNA Advisory Committee， RAC) 认定为环境安全细菌， 并许可 KT2440 作为基因工程的宿主菌。本发明构建的菌株 该菌株稳定性好， 生产过程中不需 KT2440-rhlABRI 和现有的已质粒为基础的工程菌相比， 要添加抗生素， 安全性高。菌株及其生产的菌剂可以促进土壤中多环芳烃芘的降解。
     技术方案
     本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株 KT2440-rhlABRI， 它是将铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)BSFD5 中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关 的基因簇 rhlABRI， 通过无标记同源重组的方法， 整合到恶臭假单胞菌的模式菌株 KT2440 的染色体中而获得。 使用菌株 KT2440-rhlABRI 生产菌剂的工艺为 ： 斜面种一摇瓶种一种子 罐 - 生产罐 - 产品 ( 包装剂型为液体菌剂 )。详细步骤为 ：
     1) 将菌株 KT2440-rhlABRI 接种于 LB 培养基摇瓶中， 振荡培养至对数期。LB 培养 基配方为 ： 酵母粉 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。
     2) 将上述培养好的菌种按 10％的接种量接种入 500 升种子罐， 培养至对数生长 期。种子罐所用的培养基配方为 ： NaNO3 2.5g/L， K2HPO4 4.0g/L， KH2PO4 4.0g/L， CaCl2· 2H2O 0.1g/L， MgSO4 0.2g/L， NaCl 1.0g/L， KCl 1.0g/L， 酵母粉 1.0g/L， 甘油 30g/L， 加水补足体 积， pH 值 7.0-7.2。
     3) 将种子液按生产罐培养基的 10％接种量接入生产罐培养， 生产罐所用培养基 与种子罐培养基相同。
     4) 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为 2 ∶ 0.6-1.2， 搅拌速度 为 240-300 转 / 分， 培养温度为 30-32℃， 全流程培养时间为 80-100 小时， 发酵结束后菌体 数量达到 5 亿个 /mL 以上， 发酵完成后培养液即为菌剂。 有益效果本发明的菌株 KT2440-rhlABRI 可产生鼠李糖脂生物表面活性剂， 促进 土壤中多环芳烃芘的降解。 本发明成功地解决了多环芳烃芘因水溶性差、 憎水性强、 易吸附 于沉积物或土壤的固体颗粒上而难以降解的问题。使用该菌株生产菌剂具有质量稳定， 使 用方便， 施用效果好， 安全性高的优点， 可以应用于多环芳烃污染土壤的生物修复。本发明 对于保护生态环境， 保护人民的身体健康具有重要的意义。
     四、 附图说明
     图 1， KT2440-rhlABRI 对土壤中芘降解的影响
     生物保藏
     菌 株 KT2440-rhlABRI， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏日期 ： 2010.5.28， 保藏编号 ： CGMCC No.3875， 分类命名 ： 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)。 五、 具体实施方式
     根据鼠李糖脂合成相关的基因簇 (rhlABRI) 序列设计引物， 正向引物为 5′ -AGA TGCGGCCGCTTCGACACCGGAAACC-3′ ； 反向引物为 5′ -AGATGCGGCCGCGGCATGGCGACTCCTC-3′ ， 引物两端分别各引入一个 NotI 酶切位点 ( 酶切位点以下划线标出 )。以铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa BSFD5 基因组 DNA 为模板， 扩增出鼠李糖脂合成相关的基因簇全 序列。 将其测序后在 GenBank 登陆 ( 登陆号 ： HM190303)。 并将其连接到载体 pUTTns 构建成 pUTTns-rhlABRI， 将其转化到 E.coli DH5αλpir 中得到 E.coli DH5αλpir-pUTTns-rhlABRI。 通过三亲接合的方法将 rhlABRI 基因簇整合到 Pseudomonas putida KT2440 的染色体上， 并通过将接合子在添加蔗糖 10％ (w/v) 的 LB 培养基中进行筛选， 使抗性基因丢失。 成功构 建得到可以产生鼠李糖脂物表面活性剂， 但无抗生素抗性的基因工程菌 KT2440-rhlABRI。
     将本发明的菌株 KT2440-rhlABRI 在培养皿上活化后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含 20 瓶含有 300ml LB 培养基的 1000ml 摇瓶中， LB 培养基配方为 ： 酵母粉 5g/ L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。振荡培养至对数期， 准备接种 种子罐。种子罐 1000 升， 投料量 600 升， 种子罐培养基配方为 ： NaNO32.5g/L， K2HPO44.0g/L， KH2PO44.0g/L， CaCl2·2H2O 0.1g/L， MgSO40.2g/L， NaCl 1.0g/L， KCl1.0g/L， 酵母粉 1.0g/L， 甘油 30g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。投料完毕后 121℃高压湿热灭菌 30 分钟， 冷却 至 32℃后， 将上述培养好的摇瓶菌种按 10％的接种量接种到种子罐， 培养至对数生长期， 搅拌速度为 240-300 转 / 分， 无菌空气通入量为 2 ∶ 0.6-1.2。将到达对数期的种子液按 10％的接种量接入生产罐培养， 生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量 10 吨， 投料量 6 吨。投料后的生产罐于 121℃高压湿热灭菌 30 分钟， 灭菌后冷却至 32℃以 下， 通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在 30-32℃， 生产罐的培养过 程中无菌空气的通气量为 2 ∶ 0.6-1.2， 搅拌速度为 240-300 转 / 分， 整个工艺流程培养时 间为 80-100 小时。发酵结束后菌体数量达到 5 亿个 /ml 以上。发酵完成后培养液出罐直 接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
     用上述方法所得的产品进行促进土壤中芘降解的试验。
     本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂， 属于生 物高技术领域。 是利用微生物学方法， 促进土壤中多环芳烃的降解， 可以应用于多环芳烃污 染土壤的生物修复。 二、 背景技术
     多环芳烃 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons， PAHs) 是一类广泛存在于环境中 的难降解有机污染物。 近年来， 随着石油、 煤、 天然气等资源开发利用的不断加快， 环境中的 多环芳烃有不断增加的趋势。 由于多环芳烃的潜在毒性、 致癌性及致畸诱变作用， 对人类健 康和生态环境具有明显的生态风险。芘是具有四个苯环的稠环芳烃， 是检测多环芳烃污染 的指示物。 生物修复技术被认为是最具潜力去除土壤或沉积物中有机污染物经济有效的方 法。但由于 PAHs 的水溶性差， 憎水性强， 易吸附于沉积物或土壤的固体颗粒上， 生物有效性 差， 从而延缓了其生物降解的速率。添加表面活性剂可增强 PAHs 从固体颗粒释放的速率， 增大其在水中的溶解度， 并通过减小固液相之间的界面张力来促进沉积物所吸附 PAHs 的 流动， 从而提高污染物的传质速率和生物有效性。目前， 生物表面活性剂中最重要， 数量最 大， 品种最多的是糖脂类生物表面活性剂。而在糖脂中最常见， 研究最深入， 应用最广泛的 就是鼠李糖脂。鼠李糖脂在促进多环芳烃污染物的修复处理中有着显著效果。铜绿假单胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 是研究的最多的鼠李糖脂产生菌。利用以铜绿假单胞菌为 生产菌株虽然可以获得较高的产量， 但铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌， 是一种人体条件致病 菌， 会带来一系列的安全问题， 不能大规模工业化应用， 这就迫使人们要寻找其它非致病菌 作为生产鼠李糖脂的主体。这方面的研究主要集中在利用基因工程的方法， 以实现鼠李糖 脂的外源生产。 目前为止， 还是通过质粒为载体构建基因工程菌， 这中方法存在质粒不稳定 和引入抗生素标记的缺陷。迫切需要开发新的方法。 三、 发明内容
     技术问题本发明的目的在于针对环境修复中的实际问题和需求， 开发研制出一种 新型鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株及其生产的菌剂。 它是将铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)BSFD5 中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关的基因簇 rhlABRI， 通过无标 记同源重组的方法， 整合到恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) 的模式菌株 KT2440 的染 色体中而获得。Pseudomonas putida KT2440 是一株在全世界范围内得到详尽研究和应用 的菌株， 是第一个被美国卫生部重组 DNA 委员会 (Recombinant DNA Advisory Committee， RAC) 认定为环境安全细菌， 并许可 KT2440 作为基因工程的宿主菌。本发明构建的菌株 该菌株稳定性好， 生产过程中不需 KT2440-rhlABRI 和现有的已质粒为基础的工程菌相比， 要添加抗生素， 安全性高。菌株及其生产的菌剂可以促进土壤中多环芳烃芘的降解。
     技术方案
     本发明提供一种可产生鼠李糖脂生物表面活性剂的菌株 KT2440-rhlABRI， 它是将铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)BSFD5 中和鼠李糖脂类生物表面活性剂合成相关 的基因簇 rhlABRI， 通过无标记同源重组的方法， 整合到恶臭假单胞菌的模式菌株 KT2440 的染色体中而获得。 使用菌株 KT2440-rhlABRI 生产菌剂的工艺为 ： 斜面种一摇瓶种一种子 罐 - 生产罐 - 产品 ( 包装剂型为液体菌剂 )。详细步骤为 ：
     1) 将菌株 KT2440-rhlABRI 接种于 LB 培养基摇瓶中， 振荡培养至对数期。LB 培养 基配方为 ： 酵母粉 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。
     2) 将上述培养好的菌种按 10％的接种量接种入 500 升种子罐， 培养至对数生长 期。种子罐所用的培养基配方为 ： NaNO3 2.5g/L， K2HPO4 4.0g/L， KH2PO4 4.0g/L， CaCl2· 2H2O 0.1g/L， MgSO4 0.2g/L， NaCl 1.0g/L， KCl 1.0g/L， 酵母粉 1.0g/L， 甘油 30g/L， 加水补足体 积， pH 值 7.0-7.2。
     3) 将种子液按生产罐培养基的 10％接种量接入生产罐培养， 生产罐所用培养基 与种子罐培养基相同。
     4) 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为 2 ∶ 0.6-1.2， 搅拌速度 为 240-300 转 / 分， 培养温度为 30-32℃， 全流程培养时间为 80-100 小时， 发酵结束后菌体 数量达到 5 亿个 /mL 以上， 发酵完成后培养液即为菌剂。 有益效果本发明的菌株 KT2440-rhlABRI 可产生鼠李糖脂生物表面活性剂， 促进 土壤中多环芳烃芘的降解。 本发明成功地解决了多环芳烃芘因水溶性差、 憎水性强、 易吸附 于沉积物或土壤的固体颗粒上而难以降解的问题。使用该菌株生产菌剂具有质量稳定， 使 用方便， 施用效果好， 安全性高的优点， 可以应用于多环芳烃污染土壤的生物修复。本发明 对于保护生态环境， 保护人民的身体健康具有重要的意义。
    四、 附图说明
     图 1， KT2440-rhlABRI 对土壤中芘降解的影响
     生物保藏
     菌 株 KT2440-rhlABRI， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏日期 ： 2010.5.28， 保藏编号 ： CGMCC No.3875， 分类命名 ： 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)。 五、 具体实施方式
     根据鼠李糖脂合成相关的基因簇 (rhlABRI) 序列设计引物， 正向引物为 5′ -AGA TGCGGCCGCTTCGACACCGGAAACC-3′ ； 反向引物为 5′ -AGATGCGGCCGCGGCATGGCGACTCCTC-3′ ， 引物两端分别各引入一个 NotI 酶切位点 ( 酶切位点以下划线标出 )。以铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa BSFD5 基因组 DNA 为模板， 扩增出鼠李糖脂合成相关的基因簇全 序列。 将其测序后在 GenBank 登陆 ( 登陆号 ： HM190303)。 并将其连接到载体 pUTTns 构建成 pUTTns-rhlABRI， 将其转化到 E.coli DH5αλpir 中得到 E.coli DH5αλpir-pUTTns-rhlABRI。 通过三亲接合的方法将 rhlABRI 基因簇整合到 Pseudomonas putida KT2440 的染色体上， 并通过将接合子在添加蔗糖 10％ (w/v) 的 LB 培养基中进行筛选， 使抗性基因丢失。 成功构 建得到可以产生鼠李糖脂物表面活性剂， 但无抗生素抗性的基因工程菌 KT2440-rhlABRI。
     将本发明的菌株 KT2440-rhlABRI 在培养皿上活化后接种于试管斜面上备用。试管种接种于含 20 瓶含有 300ml LB 培养基的 1000ml 摇瓶中， LB 培养基配方为 ： 酵母粉 5g/ L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。振荡培养至对数期， 准备接种 种子罐。种子罐 1000 升， 投料量 600 升， 种子罐培养基配方为 ： NaNO32.5g/L， K2HPO44.0g/L， KH2PO44.0g/L， CaCl2·2H2O 0.1g/L， MgSO40.2g/L， NaCl 1.0g/L， KCl1.0g/L， 酵母粉 1.0g/L， 甘油 30g/L， 加水补足体积， pH 值 7.0-7.2。投料完毕后 121℃高压湿热灭菌 30 分钟， 冷却 至 32℃后， 将上述培养好的摇瓶菌种按 10％的接种量接种到种子罐， 培养至对数生长期， 搅拌速度为 240-300 转 / 分， 无菌空气通入量为 2 ∶ 0.6-1.2。将到达对数期的种子液按 10％的接种量接入生产罐培养， 生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量 10 吨， 投料量 6 吨。投料后的生产罐于 121℃高压湿热灭菌 30 分钟， 灭菌后冷却至 32℃以 下， 通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在 30-32℃， 生产罐的培养过 程中无菌空气的通气量为 2 ∶ 0.6-1.2， 搅拌速度为 240-300 转 / 分， 整个工艺流程培养时 间为 80-100 小时。发酵结束后菌体数量达到 5 亿个 /ml 以上。发酵完成后培养液出罐直 接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
     用上述方法所得的产品进行促进土壤中芘降解的试验。
     将芘以 20mg·kg-1 的浓度施用于供试土壤搅拌均匀， 将菌剂按 106CFU·g-1 的接种 量接种供试土壤， 同时设置不加菌的作为对照。薄膜封口， 留有少许气孔， 以维持水分和通 气量。在不同时间取样测定土壤中芘的含量。由图 1 可见， 在对照土壤中， 30 天后芘的残留 -1 量仍为 11.43mg·kg ， 降解率仅为 42.85％。而使用 KT2440-rhlABRI 菌剂处理的土壤， 到 第 30 天时土壤中芘的降解率达到了 78.85％， 明显高于对照土壤的 42.85％， 提高了 36％。 表明菌株 KT2440-rhlABRI 可以促进土壤中芘的降解。5101948793 A CN 101948795
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