一种用于治疗胃癌的二萜化合物.pdf

本发明公开了一种用于治疗胃癌的二萜化合物。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从绞股蓝的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可以抑制胃癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势，可以用来开发成治疗胃癌的药物。

权利要求书
1.  具有下述结构式的化合物（Ⅰ），
。

2.  权利要求1所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a）将绞股蓝的干燥叶粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b）步骤（a）中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80%乙醇洗脱6个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏；（c）步骤（b）中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d）步骤（c）中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）步骤（d）中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（Ⅰ）。

3.  根据权利要求2所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

4.  根据权利要求2所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85%。

5.  一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（Ⅰ）和药学上可接受的载体。

6.  权利要求1所述的化合物（Ⅰ）在制备治疗胃癌的药物中的应用。

7.  权利要求5所述的药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

说明书一种用于治疗胃癌的二萜化合物
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从绞股蓝的干燥叶中分离得到的一种具有治疗胃癌作用的二萜类化合物及其制备方法。
背景技术
绞股蓝（Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Maki-no，GP）属葫芦科多年生蔓生草本，又名七叶胆、五叶参等。因其叶有甜味在日本被称为“甘茶蔓”。性凉、苦、微甘，归肺、脾、肾经。具有益气健脾，化痰止咳，清热解毒的功效，可用于治疗体虚乏力、虚劳失精、白细胞减少症、高脂血症、病毒性肝炎、慢性胃肠炎、慢性气管炎。该植物主要生长于亚热带，全世界约有16种和3个变种，我国有15种和3个变种，广泛分布秦岭及长江以南地区。
绞股蓝主要化学成分为绞股蓝皂苷，分布于植物营养器官包括同化组织及韧皮部薄壁细胞，其含量因植物的部位不同而有所差别，一般情况下绞股蓝叶中含量最高。目前从绞股蓝中共分离得到140多种绞股蓝皂苷，其中绞股蓝皂苷3、4、8、12分别与人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、F2结构相同，为同物异名。此外，绞股蓝还含有黄酮类、糖类、萜类等多种化学成分。
现代药理研究表明，绞股蓝是一种化学成分比较明确的植物，具有药效良好、毒副作用小等特点。绞股蓝皂苷对胃癌、宫颈癌、舌癌等培养癌细胞均具有显著的细胞毒作用。绞股蓝皂苷具有显著降低胆固醇（TCH）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、升高高密度脂蛋白（HDL）、保护血管内壁，阻止脂质在血管壁沉积，抗动脉硬化的作用。绞股蓝可以调节氧在体内分解后产生的废物——脂肪酸，达到降血脂的目的。绞股蓝皂苷具有明显降低血粘稠度、调整血压功能、同时能防止微血栓形成并增加心肌细胞对缺氧的耐力，起到保护心肌的作用。绞股蓝皂苷可提高衰老成纤维细胞增殖能力，且增殖效应呈时间和浓度依赖性，延缓细胞衰老。绞股蓝具有免疫调节作用，其活性主要体现为：增强非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫；影响淋巴细胞转化和白细胞介素2分泌；增强自然杀伤细胞（NK）的功能。此外，绞股蓝还可制成保健茶、饮料、食品添加剂等功能性食品，具有广阔的应用开发前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种从绞股蓝的干燥叶中分离得到的一种具有治疗胃癌作用的二萜类化合物及其制备方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物（Ⅰ），
。
所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，包含以下操作步骤：（a）将绞股蓝的干燥叶粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b）步骤（a）中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80%乙醇洗脱6个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏；（c）步骤（b）中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d）步骤（c）中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）步骤（d）中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（Ⅰ）。
进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85%。
一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（Ⅰ）和药学上可接受的载体。
所述的化合物（Ⅰ）在制备治疗胃癌的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（Ⅰ），其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
说明书附图
图1为化合物（Ⅰ）结构式；
图2为化合物（Ⅰ）理论ECD值与实验ECD值比较。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物（Ⅰ）分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：（a）将绞股蓝的干燥叶（10kg）粉碎，用85%乙醇热回流提取（25L×3次），合并提取液，浓缩至无醇味（3L），依次用石油醚（3L×3次）、乙酸乙酯（3L×3次）和水饱和的正丁醇（3L×3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（431g）和正丁醇萃取物；（b）步骤（a）中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用80%乙醇洗脱6个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏（157g）；（c）步骤（b）中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1（8个柱体积）、45:1（8个柱体积）、25:1（8个柱体积）、12:1（8个柱体积）和1:1（5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d）步骤（c）中组分4（49g）用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1（8个柱体积）、12:1（10个柱体积）和5:1（8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e）步骤（d）中组分2（22g）用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（Ⅰ）（33mg）。
结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z415.1412，结合核磁特征可得分子式为C20H24O8，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δH（ppm，DMSO-d6，600MHz）：H-1（1.59，td，J=13.8，5.4），H-1（1.69，m），H-2（1.45，m），H-2（1.70，m），H-3（1.36，qd，J=6.6，3.0），H-3（1.82，m），H-4（2.71，dd，J=12.6，3.0），H-6（4.46，t，J=8.8），H-7（2.17，dd，J=15.0，8.8），H-7（1.80，dd，J=15.0，8.8），H-9（2.26，d，J=4.0），H-11（4.26，d，J=4.0），H-12（5.26，s），H-14（6.23，br，s），H-15（7.38，br，s），H-16（7.34，br，s），H-17（1.64，s），H-19（1.09，s），10-OH（4.32，s），11-OH（5.02，s）；核磁共振碳谱数据δC（ppm,DMSO-d6，150Hz）：32.3（CH2，1-C），22.0（CH2，2-C），18.0（CH2，3-C），45.3（CH，4-C），43.2（C，5-C），79.3（CH，6-C），40.7（CH2，7-C），70.4（C，8-C），42.7（CH，9-C），99.9（C，10-C），75.1（CH，11-C），77.6（CH，12-C），121.1（C，13-C），107.8（CH，14-C），144.7（CH，15-C），139.6（CH，16-C），26.1（CH3，17-C），174.4（C，18-C），16.6（CH3，19-C），171.7（C，20-C）；碳原子标记参见图1。NMR谱表明，该化合物含有两个甲基[δH1.64（s，H3-17）和1.09（s，H3-19）]，三个含氧次甲基[δH4.46（t，J=8.8Hz，H-6），4.26（d，J=4.0Hz，H-11）和5.26（s，H-12）；δC79.3（C-6），75.1（C-11）和77.6（C-12）]，一个β单取代呋喃环[δC121.1（C-13），107.8（C-14），144.7（C-15），和139.6（C-16）]，以及两个内酯羰基[δC174.4（C-18）和171.7（C-20）]。根据HMBC谱中H-12与C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。该化合物存在CH-CH片段（δH4.26，d，J=4.0Hz，H-11；5.26，s，H-12）表明C-11位连有氧。NOESY谱中H-4与H3-19，H3-19与H-6，H3-19与H-11以及H-6与H-9的相关性，表明它们均为α构型。此外，H-16与H-11的相关性表明β-单取代呋喃环也为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2）。
实施例2：化合物（Ⅰ）药理作用试验
一、材料和仪器
人胃癌细胞株SGC-7901购于赛尔试剂公司。化合物（Ⅰ）自制，HPLC归一化纯度大于98%。PDTC、胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜（DMSO）、琼脂糖、冰醋酸购于美国Sigma公司。RPMI-1640培养基、PBS磷酸盐缓冲溶液购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于山东银香伟业公司。台盼蓝（北京中杉金桥生物技术有限公司），TUNEL试剂盒（凯基生物科技发展有限公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司），甲醛（美国Fisher公司），过氧化氢酶（天津市天新精细化工开发中心）。
WD-9403C紫外分析仪（德国Biometra公司），梯度PCR仪（德国Biometra公司），凝胶成像分析系统（上海天能公司），电泳仪（北京六一），电子天平（上海精密仪器仪表有限公司），RKI-1002型二氧化碳培养箱（日本Ikemoto公司），超净工作台（苏州净化实验设备有限公司），超速离心机（北京医疗器械厂），低速离心机（北京医疗器械厂），WilovertS型倒置显微镜（日本Olympus公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司），细胞计数板（上海精密仪器公司），超纯水纯水器（英国PURELABulTRAGENETIC）。
二、试验方法
1、胃癌细胞SGC-7901的培养
1.1细胞复苏
（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置于37℃~42℃，75%酒精中，然后移至同温水浴锅中；（2）轻轻晃动l-3min冻存管，使冻存液融化，迅速移至超净台中；（3）将含有细胞的冻存液吸入无菌离心管，加入适量RPIM-1640培养基；（4）吹打混匀后放入低速离心机，800rpm/min离心3分钟，去除上清液；（5）加入适量培养基吹匀，将细胞悬液依据浓度接种到10mL培养皿中；（6）置于含5%二氧化碳、37℃饱和湿度的培养箱中培养。
1.2细胞传代
（1）待培养皿中的细胞贴壁约80%时，在超净台中用移液管吸取旧的培养基吹打数次培养皿中细胞，以吹掉死亡细胞；（2）用移液管吸去旧培养基，加入适量0.25%胰酶消化细胞，置于30℃培养箱中消化；（3）约3min后将培养皿置于倒置显微镜下观察，待细胞周边发亮、回缩变圆后则说明细胞已经从壁上脱离；（4）迅速于超净台中吸去胰酶。加入适量培养基反复吹打细胞，使细胞完全脱离培养皿；（5）将细胞悬液按浓度分别接种至不同的培养皿中，补足培养基；（6）重新置于含5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养。
2、细胞计数
（1）准备好细胞计数板及盖玻片，二者均用酒精擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上；（2）待酒精挥发后，吸出适量细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，注意不要溢出盖玻片及两侧的玻璃槽，静置后计数；（3）在显微镜下找到4个大格，每个大格又分为16个小格，分别计数4个大格中的细胞数，取平均值。压线细胞计左侧和上方的，不计右侧和下方的；（4）细胞浓度（个/mL）=每个方格的平均细胞数×10000；（5）将细胞悬液稀释成实验所需浓度。
3、细胞活力测定
（1）取待测定的SGC-7901胃癌细胞悬液0.9mL；（2）向细胞悬液中加入台盼蓝吹打混匀；（3）采用细胞计数板盲法计数至少200个细胞，倒置显微镜下观察；（4）镜下观察细胞染色情况，细胞内染成淡蓝色者为死细胞，未染色者为活细胞，以活细胞所占细胞总数的百分比反映细胞的活力（%）。
4、MTT检测细胞生长抑制率
实验分组：①阴性对照组；②化合物（Ⅰ）组1，化合物（Ⅰ）（50μmol/L）；③化合物（Ⅰ）组2，化合物（Ⅰ）（100μmol/L）；④PDTC组1，PDTC（50μmol/L）；⑤PDTC组2，PDTC（100μmol/L）；⑥联合用药组1，化合物（Ⅰ）（25μmol/L）+PDTC（25μmol/L）；⑦联合用药组2，化合物（Ⅰ）（50μmol/L）+PDTC（50μmol/L）。
（1）取对数生长期的SGC-7901细胞，用细胞计数板计数，调节细胞浓度为5×l05/mL；（2）使用加样器以每孔100μL接种于96孔板。注意接种时只接种到中间的60个孔，周边36孔以PBS填充，同时铺3个96孔板；（3）将铺好的96孔板置于37°C，5%CO2细胞培养箱中，待24h细胞贴壁后取出；（4）将96孔板分为化合物（Ⅰ）组，（0、50、100μmol/L），PDTC组（0、50、100μmol/L），两药联合组（0/0、25/25、50/50μmol/L），同时设立不含细胞的空白对照组（只加培养基）分别予以不同处理；（5）各药物每个浓度设5个复孔，分别培养24、48及72h；（6）分别在特定的结束时间点取出96孔板，每孔加入MTT（5g/L）溶液20μL，放回培养箱继续培养4h，终止培养。（7）小心吸去孔内上清液，每孔加入150μLDMSO，平板摇床振荡10min使结晶充分溶解，显微镜下观察颗粒消失。（8）于酶标仪490nm波长处测定各孔的光密度（OD）值，计算各时间点的细胞生长抑制率。抑制率=[1-（加药组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%。
5、TUNEL法检测细胞调亡指数
5.1细胞爬片的制备
（1）盖玻片的处理：将盖玻片置于浓硫酸中浸泡过夜，次日先用自来水冲洗数次，再置于无水乙醇中浸泡4h，然后用去离子水冲洗干净，放在供干箱中烘干后进行高压消毒，取出直接放入超净台中备用。6孔板置于超净台内紫外线照射30min；（2）放置盖玻片：在六孔板的每孔中准备放盖玻片的位置滴入少量培养基后再放置盖玻片，使得盖玻片与孔板考培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时盖玻片飘起，造成双层细胞贴壁；（3）取对数生长期的SGC-7901细胞，消化吹打成细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度为l×106/mL。（4）用加样器在放有盖玻片的每孔分别加入1mL细胞悬液，同时铺3板，置于37°C，5%CO2培养箱中培养24h待细胞贴壁；（5）24小时细胞贴壁后在超净台中将6孔板分为阴性对照组和实验组分别予以不同处理，阴性对照组加1mL培养基，实验组再分为化合物（Ⅰ）组、PDTC组及联合用药组3个亚组，每孔加1mL药物。化合物（Ⅰ）组终浓度为100μmol/L，PDTC组终浓度为100μmol/L，两药联合组终浓度为两种药物各为50μmol/L。每组设2个复孔。（6）置于37°C，5%CO2的细胞培养箱中继续培养。
5.2TUNEL法操作步骤
（1）细胞爬片加药培养24h时取出6孔板，按照TUNEL说明书依次进行如下步骤；（2）小心吸弃每孔里的上清液；（3）每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次；（4）每孔加入1mL预冷细胞固定液，4°C冰箱固定30min。（5）吸弃固定液，每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次。（6）浸入封闭液中，室温（15°C~25°C）封闭10min。（7）每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。（8）每个样本滴加50μLTdT酶反应液，37°C，避光湿润反应60min。（9）每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次。样品周围用吸水纸吸干。（10）滴加50μLStreptavidin-HRP工作液，37°C，避光湿润反应30min。（11）每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次。（12）滴加100μLDAB工作液，室温显色反应10min。（13）每个孔加入PBS（4°C）2mL，平板摇床冲洗5min×3次。（14）光学显微镜下观察拍照：随机选取10个高倍（×100）视野，每个视野计数100个细胞，计算调亡指数的平均值。凋亡指数（AI）=（阳性细胞数/总细胞数×100%）。阳性细胞的细胞核呈棕褐色。
6、统计学分析
采用SPSS11.5进行分析，符合JH态分布的计量资料以表示，组间比较用Oneway-ANOVA法进行分析，两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。
三、结果及结论
1、MTT检测药物对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制率
经3次重复MTT，检测结果显示，单个药物作用于胃癌细胞72h后，100μmol/L的药物组较50μmol/L的药物组对胃癌细胞的生长抑制率均较高，差异有统计学意义（P<0.05）。50μmol/L的化合物（Ⅰ）对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组差异无统计学意义（P>0.05）。50μmol/L的PDTC对胃癌细胞的生长抑制作用与联合用药25/25μmol/L组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。联合用药50/50μmol/L组对胃癌细胞的生长抑制率高于各个高浓度单药组（100μmol/L）对胃癌细胞的生长抑制率，差异有统计学意义（P<0.001），见表1（*P<0.05，**P<0.01）。
2、TUNEL法检测各组凋亡指数
化合物（Ⅰ）、PDTC及联合用药组均对胃癌细胞SGC-7901有抑制生长的作用，各组与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P<0.001），阴性对照组有少量细胞的胞核被染成棕褐色，各个单药组与联合用药组凋亡细胞较阴性对照组相比均有增加，联合用药组细胞的凋亡指数最高，对胃癌细胞的抑制效果更显著。见表2（**P<0.01）。
结论，PDTC与化合物（Ⅰ）联合药单独作用于胃癌细胞均可以抑制癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，随着浓度的增大，对胃癌细胞的抑制生长作用呈增强趋势，两种药物联合应用后促进胃癌细胞的凋亡效果更显著，细胞的生长抑制率及凋亡指数均较单独用药组升高。研究发现PDTC及化合物（Ⅰ）两种药物联合应用对胃癌细胞的抑制作用更显著，且两种药物均为非传统意义的化疗药物，对机体的损害小，而且避免了肿瘤细胞对传统化疗药物的耐药性，可以为今后胃癌的临床治疗提供参考。
表1各药物组不同时间点对胃癌细胞的生长抑制率(n＝5，)组别 n 24h 48h 72h 化合物(Ⅰ)50μmol/L(1) 5 14.87±5.19 16.29±4.53 55.70±6.67 化合物(Ⅰ)50μmol/L(2) 5 31.00±6.36 59.42±7.74 74.32±5.84
PDTC50μmol/L(3) 5 24.87±9.04 36.83±5.21 40.58±7.15 PDTC100μmol/L(4) 5 42.86±6.28 44.21±8.44 50.31±4.63 联合用药25/25μmol/L(5) 5 36.43±8.13 38.76±10.87 58.55±9.53 联合用药50/50μmol/L(6) 5 49.38±2.24 74.56±10.59 96.12±2.25 F 17.918**29.646**47.625**P(1):(2) 0.001 <0.001 <0.001 (3):(4) <0.001 0.169 0.025 (5):(6) 0.005 <0.001 <0.001 (1):(5) <0.001 <0.001 0.49 (3):(5) 0.01 0.713 <0.001 (2):(6) <0.001 0.008 <0.001 (4):(6) 0.13 <0.001 <0.001
表2药物作用24h后各组细胞的凋亡指数(n＝3，)

实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（Ⅰ），以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。