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重组多顺反子核酸分子
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背景
病原体可导致个体的实质性发病和死亡。例如，疱疹病毒广泛传播并造成大范围的人类疾病，最严重的情况可导致实质性发病和死亡，这主要发生在免疫力低下的个体中(例如，移植物受者和HIV感染的个体)。人容易被至少8种疱疹病毒感染。单纯性疱疹病毒-1((HSV-1、HHV-1)、单纯性疱疹病毒-2(HSV-2、HHV-2)和水痘-带状疱疹病毒(VZV、HHV-3)是α-亚家族病毒，巨细胞病毒(CMV,HHV-5)和玫瑰疹病毒(HHV-6和HHV-7)是β-亚家族病毒，EB(Epstein-Barr)病毒(EBV、HHV-4)和卡波西(Kaposi)肉瘤相关疱疹病毒(KSHV、HHV-8)是感染人的γ-亚家族病毒。
CMV感染导致免疫力低下的个体(移植物受者和HIV感染的个体)中的实质性发病和死亡，并且先天性的感染可导致新生儿神经发育的破坏性缺陷。CMV包膜糖蛋白gB、gH、gL、gM和gN代表具有吸引力的候选疫苗，因为它们在病毒表面上表达并可引起保护性的病毒中和体液免疫应答。已有一些CMV疫苗策略靶向主要表面糖蛋白B(gB)，这可诱导主要抗体应答。(Go和Pollard,JID197:1631-1633(2008))。CMV糖蛋白gB可诱导中和抗体应答，而中和CMV阳性患者的血清中的成纤维细胞感染的抗体的大部分是针对gB的(Britt1990)。类似地，据报道gH和gM/gN是对自然感染的免疫应答的靶标(Urban等(1996)J.Gen.Virol.77(Pt.7):1537-47；Mach等(2000)J.Virol.74(24):11881-92)。
CMV蛋白的复合物也是具有吸引力的候选疫苗，因为它们似乎涉及所述病毒生命周期的重要过程。例如，gH/gL/gO复合物似乎对进入成纤维细胞和上皮/内皮细胞起重要作用。普遍认同模型表明，gH/gL/gO复合物介导成纤维细胞的感染。hCMV gO-缺失突变体在成纤维细胞上产生小斑块并且病毒效价很低， 这指示其对进入具有作用(Dunn(2003),Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:14223-28;Hobom(2000)J.Virol.74:7720-29)。近期研究表明，gO并没有纳入含gH/gL的病毒粒，而是可能作为分子伴侣起作用，使gH/gL从ER向高尔基体的输出增加并纳入病毒粒(Ryckman(2009)J.Virol82:60-70)。通过脉冲追踪实验，显示少量的gO与gH/gL的长期保持结合，但大多数gO从gH/gL/gO复合物解离或降解，因为并未发现其存在于胞外病毒粒中或由细胞分泌。当从CMV(TR)临床毒株剔除gO时，那些病毒颗粒显著减少了gH/gL纳入病毒粒中的量。此外，从TR病毒剔除gO还抑制进入上皮细胞和内皮细胞，表明gH/gL也是进入上皮/内皮细胞所需的(Wille(2010)J.Virol.84(5):2585-96)。
CMV gH/gL也可与UL128、UL130和UL131A(本文称为UL131)相关联，并且形成进入若干细胞类型所需的五聚体复合物，所述细胞类型包括上皮细胞、内皮细胞和树突细胞(Hahn等(2004)J.Virol.78(18):10023-33;Wang和Shenk(2005)Proc.Natl.Acad.Sci USA102(50):18153-8;Gerna等(2005).J.Gen.Virol.84(Pt6):1431-6;Ryckman等(2008)J.Virol.82:60-70)。相反，成纤维细胞的感染不需要该复合物。实验室hCMV分离物在UL128-UL131基因座上携带突变，并且突变仅在培养成纤维细胞中传代数次后在临床分离物中发生(Akter等(2003)J.Gen.Virol.84(Pt5):1117-22)。自然感染过程中，所述五聚体复合物引发以极高效力中和上皮细胞、内皮细胞(以及其中五聚体复合物介导病毒进入的可能的任何其它细胞类型)感染的抗体(Macagno等(2010)J.Virol.84(2):1005-13)。并且，似乎针对该复合物的抗体显著有助于人血清中和上皮细胞感染的能力(Genini等(2011)J.Clin.Virol.52(2):113-8)。
US5,767,250公开了含有gH和gL的某些CMV蛋白质复合物的制备方法。通过将编码gH的DNA构建体和编码gL的DNA构建体引入细胞从而使gH和gL共表达来产生所述复合物。
WO2004/076645描述了编码CMV蛋白的重组DNA分子。根据该文献，可将编码不同CMV蛋白的不同DNA分子的组合引入细胞，以获得经编码的CMV蛋白的共表达。当gM和gN通过该方式共表达时，其形成二硫键连接的复合物。用产生gM/gN复合物的DNA构建体或编码gB的DNA构建体免疫兔子，产生等同的中和抗体应答。
需要编码四种或更多种蛋白质的多顺反子核酸，在相同细胞中表达四种或更多种蛋白质的方法，和产生更强免疫应答的免疫方法。
发明内容
本发明涉及用于共同递送4种或更多种蛋白质(例如，病原体蛋白如疱疹病毒(例如，CMV)蛋白，尤其是在体内形成复合物的蛋白质)至细胞的重组多顺反子核酸分子，例如多顺反子自复制RNA分子。
一方面，所述重组多顺反子核酸分子，例如多顺反子自复制RNA分子，包含：a)编码第一蛋白质或其片段的第一核苷酸序列，该序列操作性连接至第一亚基因组启动子(SGP)；b)编码第二蛋白质或其片段的第二核苷酸序列，该序列操作性连接至第二SGP；c)编码第三蛋白质或其片段的第三核苷酸序列，该序列操作性连接至第三SGP；和d)编码第四蛋白质或其片段的第四核苷酸序列，该序列操作性连接至第四SGP；其中，当将所述自复制RNA分子引入合适的细胞时，产生所述第一和第二蛋白质或其片段。任选地，所述重组多顺反子核酸分子，例如多顺反子自复制RNA分子，还包含编码第五蛋白质或其片段的第五核苷酸序列，该序列操作性连接至第五SGP。优选地，所述第一蛋白质或其片段、第二蛋白质或其片段、第三蛋白质或其片段和第四蛋白质或其片段，以及(若存在)第五蛋白质或其片段形成蛋白质复合物。
在一个实施方式中，所述第一蛋白质或其片段和第二蛋白质或其片段，所述第三蛋白质或其片段、所述第四蛋白质或其片段，以及(若存在)所述第五蛋白质或其片段各来自疱疹病毒，例如，HHV-1、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-5、HHV-6、HHV-7、HHV-8或HHV-9。
在一些实施方式中，所述第一蛋白质或其片段和第二蛋白质或其片段、所述第三蛋白质或其片段、所述第四蛋白质或其片段，以及(若存在)所述第五蛋白质或其片段各来自HHV-5(CMV)。在此类实施方式中，所述第一蛋白质或片段、所述第二蛋白质或片段、所述第三蛋白质或片段、所述第四蛋白质或片段和所述第五蛋白质或片段独立地选自下组：gB、gH、gL、gO、gM、gN、UL128、UL130、UL131及前述任何一种的片段。例如，所述第一蛋白质或片段可以是gH或其片段，且所述第二蛋白质或片段可以是gL或其片段，所述第三蛋白质或片段可以是UL128或其片段，所述第四蛋白质或片段可以是UL130或其片段，且所述第五蛋白质或片段可以是UL131或其片段。
在一些实施方式中，所述第一蛋白质或其片段和第二蛋白质或其片段、所述第三蛋白质或其片段、所述第四蛋白质或其片段，以及(若存在)所述第五蛋 白质或其片段各来自HHV-3(VZV)。在此类实施方式中，所述第一蛋白质或片段、所述第二蛋白质或片段、所述第三蛋白质或片段、所述第四蛋白质或片段和所述第五蛋白质或片段独立地选自下组：gB、gE、gH、gI、gL及前述任何一种的片段。
所述重组多顺反子核酸分子可以是多顺反子自复制RNA分子。自复制RNA分子可以是α病毒复制子。在该情况下，可以α病毒复制子颗粒(VRP)的形式递送所述α病毒复制子。自复制RNA分子也可以是“裸”RNA分子的形式。
本发明还涉及编码如本文所述的自复制RNA分子的重组DNA分子。在一些实施方式中，所述重组DNA分子是质粒。在一些实施方式中，所述重组DNA分子包括驱动编码的自复制RNA分子转录的哺乳动物启动子。
本发明还涉及包含如本文所述自复制RNA分子和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含编码CMV蛋白(例如五聚体复合物gH/gL/UL128/UL130/UL131)的自复制RNA分子。所述组合物还可包含RNA递送系统，例如脂质体、聚合纳米颗粒、水包油阳离子纳米乳液或其组合。例如，自复制RNA分子可包封在脂质体中。
在某些实施方式中，所述组合物包含VRP，所述VRP含有编码CMV蛋白的α病毒复制子。在一些实施方式中，所述VRP包含编码五聚体复合物gH/gL/UL128/UL130/UL131的复制子。所述组合物还可包含佐剂。
本发明还涉及一种形成CMV蛋白质复合物的方法。在一些实施方式中，向细胞递送编码四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA，使所述细胞维持在适于表达CMV蛋白的条件下，其中形成CMV蛋白质复合物。在其它实施方式中，向细胞递送包含编码四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA的VRP，使所述细胞维持在适于表达CMV蛋白的条件下，其中形成CMV蛋白质复合物。所述方法可用于在体内细胞中形成CMV蛋白质复合物。
本发明还涉及通过向个体给予重组多顺反子核酸分子(例如自复制RNA分子)来诱导个体内的免疫应答的方法。在一些实施方式中，向个体给予编码四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA。所述自复制RNA分子可以包含RNA递送系统(如脂质体)的组合物形式递送。在其它实施方式中，向个体给予包含编码四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA的VRP。优选地，诱导的免疫应答包括产生中和抗CMV抗体。更优选地，所述中和抗体是补体非依赖性的。
本发明还涉及抑制CMV进入细胞的方法，所述方法包括：使细胞接触编码 四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA分子。所述细胞可选自下组：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞及其组合。在一些实施方式中，使所述细胞接触包含编码四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA的VRP。
本发明还涉及编码来自细胞中CMV蛋白质复合物的四种或更多种CMV蛋白的自复制RNA分子(例如，VRP、包含自复制RNA分子的组合物和脂质体)在诱导免疫应答或抑制CMV进入细胞中的应用。
附图简述
图1是编码5种CMV蛋白的五顺反子RNA复制子A526、A527、A554、A555和A556的示意图。亚基因组启动子用箭头表示，标记了其它控制元件。“NSP1”、“NSP2”、“NSP3”和“NSP4”分别是α病毒非结构蛋白1～4，其是病毒复制所需的。示意图中显示NSP4，NSP1、NSP2和NSP3在NSP4上游。
图2是显示用A527RNA复制子转染的BHKV细胞表达gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物的荧光直方图。用抗体进行细胞染色，所述抗体结合五聚体复合物上所呈递的构象表位。
详细描述
本发明提供用于向细胞共同递送蛋白质(例如，蛋白质抗原)的平台，所述蛋白质例如疱疹病毒蛋白质(例如CMV蛋白)，尤其是在体内形成复合物的蛋白质。本文所述的重组多顺反子核酸分子具有向细胞递送编码四种或更多种蛋白质的序列以及驱动所述蛋白质表达的优势。采用该方法，所述四种或更多种经编码的蛋白质可以充足的胞内水平表达，以供体内形成包含所述四种或更多种蛋白质的蛋白质复合物。例如，通过选择合适的表达控制序列，所述经编码的蛋白质或其片段可以基本相同的水平，或必要时以不同水平表达。相较于通过向细胞共同递送编码不同蛋白质的两种或更多种个体DNA分子的方法(其可能具有低效率和高可变性)而言，在体内产生蛋白质复合物是一种显著更有效的方法。参见例如，WO2004/076645。
优选地，所述重组多顺反子核酸分子是本文所述的自复制RNA分子，其中编码蛋白质的各核苷酸序列操作性连接至其自身的α病毒亚基因组启动子(SGP)。这些自复制RNA分子小于其它表达控制序列(例如，其它启动子)中所用的对应分子。不希望受任何具体理论的限制，据信可更有效地将这种类型的自复制RNA分子包装进入VRP，并且获得比包含其它表达控制序列(例如IRES) 的对应分子更高的产量。还相信，本文所述的自复制RNA分子和包含它们的VRP能比包含其它表达控制序列(例如IRES)的对应分子产生更好的免疫应答。
在一些实施方式中，所述经递送的蛋白质或其形成的复合物引发强效的中和抗体。通过共同递送蛋白质(尤其是在体内形成复合物的那些蛋白质)产生的免疫应答可强于采用其它方式产生的免疫应答。例如，可使编码CMV gH、gL、UL128、UL130和UL131的RNA分子表达以产生gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物，从而相较于编码单一CMV蛋白(例如，gB、gH、gL等)的RNA分子或甚至独立编码gH、gL、UL128、UL130和UL131的RNA分子的混合物而言，能够诱导更高的中和效价和/或保护性免疫。
在一个广义方面，本发明涉及重组多顺反子核酸分子，例如，自复制RNA分子，用于向细胞递送四种或更多种蛋白质。所述重组多顺反子核酸分子(例如，自复制RNA分子)包含：操作性连接至第一SGP的编码第一蛋白质或其片段的第一序列，操作性连接至第二SGP的编码第二蛋白质或其片段的第二序列，操作性连接至第三SGP的编码第三蛋白质或其片段的第三序列，和操作性连接至第四SGP的编码第四蛋白质或其片段的第四序列。必要时，所述自复制RNA分子中可具有操作性连接至第五SGP的编码第五蛋白质或其片段的第五序列，和可任选的编码其它蛋白质或其片段的其它序列。在一些实施方式中，编码所述第一、第二、第三、第四和第五蛋白质的序列编码α病毒(例如，CMV)蛋白或其片段。
在本文所述的多顺反子核酸中，经编码的第一、第二、第三和第四蛋白质或片段以及(若存在)经编码的第五蛋白质或片段，一般且优选来自相同生物，例如病原体(例如病毒、细菌、真菌、寄生虫、古细菌)。在某些示例中，由多顺反子自复制RNA分子编码的蛋白质或片段全部是疱疹病毒蛋白，例如CMV蛋白或VZV蛋白。
所述重组多顺反子核酸分子可基于任何所需的核酸，例如DNA(例如质粒或病毒DNA)或RNA。可采用任何合适的DNA或RNA作为携带编码疱疹病毒(例如CMV)蛋白或其片段的开放阅读框的核酸载体。合适的核酸载体具有携带并驱动表达多于一种蛋白质基因的能力。此类核酸载体为本领域已知，并且包括，例如，质粒、获自DNA病毒(例如牛痘病毒载体(如，NYVAC，参见US5,494,807)和痘病毒载体(如，ALVAC金丝雀痘载体，赛诺菲巴斯德公司(Sanofi Pasteur)))的DNA，以及获自合适RNA病毒(例如α病毒)的RNA。若需要，可以修饰所述 重组多顺反子核酸分子，例如包含经修饰的核碱基和或如本文进一步所述的连接。优选地，所述多顺反子核酸分子是RNA分子。
在一些方面，本发明是含有编码疱疹病毒gH或其片段和疱疹病毒gL或其片段的序列的多顺反子核酸分子。所述gH和gL蛋白或其片段可来自任何所需的疱疹病毒，例如HSV-1、HSV-2、VZV、1型EBV、2型EBV、CMV、A型HHV-6、B型HHV-6、HHV-7、KSHV等。优选地，所述疱疹病毒是VZV、HSV-2、HSV-1、EBV(1型或2型)或CMV。更优选地，所述疱疹病毒是VZV、HSV-2或CMV。甚至更优选地，所述疱疹病毒是CMV。本领域技术人员熟知gH和gL蛋白的序列以及编码这些病毒蛋白的核酸序列。示例性序列见表1。所述多顺反子核酸分子可包含编码表1公开的gH蛋白或其片段的第一序列，或与其具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的序列。所述多顺反子核酸分子还可包含编码表1公开的gL蛋白或其片段的第二序列，或与其具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的序列。

为便于清楚地描述核酸，在本发明说明书中将具体的序列组成称为“第一序列”，“第二序列”等。应理解，所述第一和第二序列可以任何所需顺序或方向出现，且“第一”，“第二”等并非意指具体的顺序或方向。相似地，蛋白质复合物通过列举复合物中存在的蛋白质来命名，例如gH/gL。其旨在通过 复合物中所存在的蛋白质描述所述复合物，并不表示所述蛋白质的相对量或重组核酸上编码所述蛋白质的序列的顺序或方向。
本文进一步描述了某些优选的实施方式，例如包含编码CMV蛋白的序列的α病毒VRP和自复制RNA。其旨在表示所述优选实施方式中的编码CMV蛋白的序列可用编码来自其它病原体的蛋白质(例如来自其它疱疹病毒的gH和gL)的序列来替代。
α病毒VRP平台
在一些实施方式中，使用α病毒复制子颗粒(VRP)向细胞递送CMV蛋白，所述α病毒复制子颗粒采用下文所述的多顺反子复制子(或载体)。本文中所用的“多顺反子”包括含有四个或更多个顺反子的载体。多顺反子载体中的顺反子可编码来自相同CMV毒株或来自不同CMV毒株的CMV蛋白。所述顺反子可以任何5′–3′顺序定向。可使用任何编码CMV蛋白的核苷酸序列来产生蛋白质。本文描述了用于制备编码两种或更多种CMV蛋白或其片段的多顺反子核酸的示例性序列。
本文所用的术语α病毒摗具有本领域的常规含义，并包括多个种类例如委内瑞拉马脑炎病毒(VEE；例如特立尼达(Trinidad)驴、TC83CR等)、西门利克森林病毒(SFV)、辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、西部马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、切昆贡亚病毒、S.A.AR86病毒、沼泽病毒、穆坎布病毒、巴马森林病毒、米德尔堡病毒、皮春纳病毒、奥尼永尼永病毒、盖塔病毒、鹭山病毒、贝巴鲁病毒、马亚罗病毒、乌纳病毒、奥拉病毒、沃达罗河病毒、Banbanki病毒、克泽拉格齐病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜茂病毒和Buggy Creek病毒。
“α复制子颗粒”(VRP)或“复制子颗粒”是用α病毒结构蛋白包装的α病毒复制子。
“α病毒复制子”(或“复制子”)是可在靶细胞中指导体内自身扩增的RNA分子。复制子编码催化RNA扩增的聚合酶(nsPl、nsP2、nsP3、nsP4)并含有被所编码聚合酶识别和利用的复制所需的顺式RNA序列。α病毒复制子通常包含如下安排的元件：就复制而言顺式所需的5′病毒序列，编码生物活性α病毒非结构蛋白(nsPl、nsP2、nsP3、nsP4)的序列、就复制而言顺式所需的3′病毒序列，以及多腺苷酸序列。α病毒复制子还可包含指导异源核苷酸序列表达的一种或多种病毒亚基因组“结合区”启动子，在一些实施方式中，可进行修饰以增加或减少待表达亚基因组片段和异源序列的病毒转录。如下文所述可使用其它控制元 件。
可使用编码CMV蛋白的α病毒复制子来产生VRP。该α病毒复制子包含编码至少两种CMV蛋白或其片段的序列。这些序列操作性连接至一个或多个合适的控制元件，例如亚基因组启动子、IRES(例如，EMCV、EV71)和病毒2A位点，所述控制元件可以相同也可以不同。采用本文所述的多顺反子载体递送这些复合物的组成成分是一种有效的方式，该方式提供以所需相对量编码两种或更多种CMV蛋白的核酸序列；然而，如果采用多种α病毒构建体来递送个体CMV蛋白供于复合物形成，则需要有效的VRP共同递送。
可以任何顺序使用合适的控制元件的任何组合。优选地，各个编码CMV蛋白的序列操作性连接至单独启动子，例如亚基因组启动子。
亚基因组启动子
亚基因组启动子也称为结合区启动子，可用于调节蛋白质表达。α病毒亚基因组启动子调节α病毒结构蛋白的表达。参见Strauss和Strauss,“The alphaviruses:gene expression,replication,and evolution(α病毒：基因表达、复制和演化)”Microbiol Rev.1994Sep;58(3):491-562。多顺反子多核苷酸可包含来自任何α病毒的亚基因组启动子。当多顺反子多核苷酸中存在两个或更多个亚基因组启动子时，所述启动子可以相同或不同。例如，所述亚基因组启动子可具有序列Ctctctacggctaacctgaatgga(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，可修饰亚基因组启动子以增加或减少蛋白质的病毒转录。参见美国专利号6,592,874。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施方式中，一个或多个控制元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES允许从单一mRNA转录本生成多种蛋白质，因为核糖体结合各IRES并在无5’帽的情况下起始翻译，而这是起始翻译通常所需的。例如，所述IRES可以是EV71或EMCV。
病毒2A位点
FMDV2A蛋白是用来分隔FMDV结构蛋白和非结构蛋白(FMDV2B)的短肽。对该肽的早期研究表明，该肽起着自动催化蛋白酶的作用，但其它研究(例如，Donnelly等(2001),J.Gen.Virol.82,1013-1025)表明该短序列和随后的FMDV2B的单一氨基酸(Gly)起着翻译起止点的作用。与确切的作用模式无关，所述序列可插在两个多肽之间，从而影响由单一开放阅读框生成多种个体多肽。本发明中，FMDV2A序列可插在编码至少两种CMV蛋白的序列之间，以使它们 作为单一开放阅读框的部分合成。例如，所述开放阅读框可编码由病毒2A位点编码序列分隔的gH蛋白和gL蛋白。然后转录单一mRNA，在翻译期间，根据所述病毒2A位点的活性而分开产生gH和gL肽。可使用任何合适的病毒2A序列。通常，病毒2A位点包含共有序列Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:2)。例如，口蹄疫病毒2A肽序列是DVESNPGP(SEQ ID NO:3)。参见Trichas等“Use of the viral2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice(病毒2A肽在转基因小鼠内双顺反子表达中的应用)”BMC Biol.2008Sep15;6:40，和Halpin等“Self-processing2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteins in transgenic plants(自加工2A聚蛋白－协调转基因植物中多蛋白表达的系统)”Plant J.1999Feb;17(4):453-9。
在一些实施方式中，α病毒复制子是嵌合复制子，例如VEE-辛德毕斯嵌合复制子(VCR)或VDRL ELISA毒株TC83复制子(TC83R)或TC83-辛德毕斯嵌合复制子(TC83CR)。在一些实施方式中，VCR包含来自辛德毕斯复制子的包装信号和3′UTR以替代在VEE复制子的nsP3中和3′末端处的序列；参见Perri等,J.Virol.77,10394-403,2003。在一些实施方式中，TC83CR包含来自辛德毕斯复制子的包装信号和3′UTR以替代VEE毒株TC83复制子的nsP3中和3′末端处的序列。
VRP的产生
制备VRP的方法为本领域熟知。在一些实施方式中，使用包装细胞将α病毒组装成VRP。“α病毒包装细胞”(或“包装细胞”)是包含一种或多种α病毒结构蛋白表达盒，并在引入α病毒复制子、真核分层载体起始系统(例如美国专利5,814,482)或重组α病毒颗粒之后产生重组α病毒颗粒的细胞。可通过提供α病毒结构蛋白来使一种或多种不同α病毒结构蛋白表达盒起“辅助物(helper)”作用。“α病毒结构蛋白表达盒”是编码一种或多种α病毒结构蛋白并包含至少一个且至多5个拷贝(即1、2、3、4或5个)的α病毒复制酶识别序列的表达盒。结构蛋白表达盒一般从5′～3′包含起始α病毒转录的5′序列、任选的α病毒亚基因组区启动子、编码α病毒结构蛋白的核苷酸序列、3′非翻译区(其也指导RNA转录)和聚A序列。参见例如，WO2010/019437。
在优选实施方式中，在包装细胞中使用两种不同的α病毒结构蛋白盒(“分裂”缺陷型辅助物)以使能够产生复制型病毒的重组事件最少化。在一些实施方式中，α病毒结构蛋白盒编码衣壳蛋白(C)但不编码任一种糖蛋白(E2和E1)。 在一些实施方式中，α病毒结构蛋白盒编码衣壳蛋白和E1或E2糖蛋白(但不同时编码E2和E1)。在一些实施方式中，α病毒结构蛋白盒编码E2和E1糖蛋白但不编码衣壳蛋白。在一些实施方式中，α病毒结构蛋白盒编码E1或E2糖蛋白(但不同时编码两者)但不编码衣壳蛋白。
在一些实施方式中，通过向各种来源的细胞同时导入复制子和辅助RNA来产生VRP。例如在这些条件下对BHKV细胞(1x10⁷)进行电穿孔(例如在220伏、1000F下)，用10g复制子RNA:6g缺陷性辅助物Cap RNA:10g缺陷性辅助物GlyRNA手动脉冲两次，大约24小时后收集含α病毒的上清液。复制子和/或辅助物也可以DNA形式导入，所述DNA在感染细胞中产生合适的RNA。
包装细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞，例如昆虫(例如SF9)或禽类细胞(例如原代鸡或鸭成纤维细胞或成纤维细胞系)。参见美国专利7,445,924。禽类来源的细胞包括但不限于禽胚胎干细胞，例如(VIVALIS)；鸡细胞，包括鸡胚胎干细胞(例如细胞)、鸡胚胎成纤维细胞和鸡胚胎生殖细胞；鸭细胞，例如AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系(ProBioGen)(例如描述于Vaccine27:4975-4982(2009)和WO2005/042728)；和鹅细胞。在一些实施方式中，包装细胞是原代鸭成纤维细胞或鸭视网膜细胞系，例如AGE.CR(PROBIOGEN)。
用于同步核酸导入和/或包装细胞的哺乳动物来源细胞包括但不限于：人或非人原代细胞，包括PerC6(PER.C6)细胞(CRUCELL N.V.)，例如描述于WO01/38362和WO02/40665中，以及以ECACC保藏号96022940所保藏；MRC-5(ATCC CCL-171)；WI-38(ATCC CCL-75)；胎猴肺细胞(ATCC CL-160)；人胚胎肾细胞(例如293细胞，一般由剪切的腺病毒5型DNA转化)；来自猴肾的VERO细胞；马细胞、牛细胞(例如MDBK细胞)、羊细胞、狗细胞(例如，来自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK33016，保藏号DSM ACC2219，如WO97/37001所述)；猫细胞和啮齿动物细胞(例如，仓鼠细胞如BHK21-F、HKCC细胞，或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，并可从各种发育阶段(包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎)获得。
在一些实施方式中，包装细胞用一种或多种结构蛋白表达盒稳定转化。可使用标准的重组DNA技术将结构蛋白表达盒引入细胞，所述技术包括运铁蛋白-聚阳离子介导的DNA转移、用裸露或包封核酸转染、脂质体介导的细胞融合、DNA包衣胶乳珠的胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、“基因枪” 法和DEAE或磷酸钙介导的转染。结构蛋白表达盒一般作为DNA分子导入宿主细胞，但也可作为体外转录的RNA引入。可单独或基本上同时引入各表达盒。
在一些实施方式中，使用稳定的α病毒包装细胞系产生重组α病毒颗粒。这些是包含DNA盒的允许α病毒的细胞，所述DNA盒表达稳定整合进入其基因组的缺陷性辅助RNA。参见Polo等Proc.Natl.Acad.Sci.USA96,4598-603,1999。辅助RNA组成型表达，但α病毒结构蛋白并非如此，因为所述基因受到α病毒亚基因组启动子的控制(Polo等1999)。α病毒复制子通过转染或VRP感染引入包装细胞的基因组后，产生复制酶且触发衣壳和辅助RNA上糖蛋白基因的表达，并产生输出VRP。可通过各种方法实现复制子的引入，包括用α病毒复制子颗粒的种子储液转染和感染。然后以培养上清液中以足以产生经包装α病毒复制子颗粒的条件和时间赋予所述包装细胞。
因此，包装细胞使VRP能够起自我繁殖病毒的作用。该技术能通过与活减毒疫苗或其它具有可用生产细胞系(例如在表达腺病毒E1A和E1B基因的细胞中生长的非复制型腺病毒载体)的病毒载体所用相同的方法并使用相同设备产生VRP。
在一些实施方式中，采用两步法：第一步包括通过用复制子RNA或基于质粒DNA的复制子转染包装细胞来产生α病毒复制子颗粒的种子储液。然后，在第二步中，通过用所述种子储液感染新鲜的包装细胞培养物来产生多很多的复制子颗粒储液。所述感染可通过不同的感染复数(MOI)进行，所述感染复数包括MOI=0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、3、5、10或20。在一些实施方式中，在低MOI下进行感染(例如，低于1)。一段时间后，可从经种子储液感染的包装细胞中收集复制子颗粒。在一些实施方式中，随后，复制子颗粒可以通过重复的低复合感染在更多的原初包装细胞培养物中传代，得到具有相同高效价的市售规格制品。
自复制RNA平台
可通过在对象细胞中表达编码所述蛋白质的重组核酸来生成四种或更多种CMV蛋白。优选地，所述重组核酸分子编码四种或更多种CMV蛋白，例如多顺反子。可被给予对象以引起CMV蛋白产生的优选的核酸是自复制RNA分子。本发明的自复制RNA分子是基于RNA病毒的基因组RNA，但缺失编码一种或多种结构蛋白的基因。所述自复制RNA分子能经翻译生成所述RNA病毒的非结构蛋白和自复制RNA编码的CMV蛋白。
所述自复制RNA通常包含选自下组的至少一种或多种基因：病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非结构病毒蛋白质，还包含5’-和3’-末端顺式激活复制序列和编码两种或多种所需CMV蛋白的异源序列。引导一种或多种异源序列表达的亚基因组启动子可包括在所述自复制RNA中。必要时，异源序列可与所述自复制RNA中的其他编码区在框内融合和/或可受内部核糖体进入位点(IRES)的控制。
可将本发明的自复制RNA分子设计成使所述自复制RNA分子无法诱导感染性病毒颗粒生成。这可通过例如在所述自复制RNA中省去病毒颗粒生成所必需的一种或多种结构蛋白编码病毒基因来实现。例如，所述自复制RNA分子基于α病毒如辛德毕斯(Sinbis)病毒(SIN)、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)时，可省去一种或多种编码病毒结构蛋白(例如衣壳或包膜糖蛋白)的基因。必要时，本发明的自复制RNA分子可设计成诱导减毒或强毒的感染性病毒颗粒生成，或生成能进行单轮后续感染的病毒颗粒。
在甚至没有任何蛋白质的情况下被递送至脊椎动物细胞时，自复制RNA分子可通过其自身(或其自身的反义拷贝)转录导致多种子RNA的生成。所述自复制RNA在被递送至细胞后可直接翻译，并且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，该酶随后从该递送RNA产生转录本。因此，所述经递送的RNA导致多种子RNA的生成。这些转录本相对所递送RNA为反义，并且可自我翻译以提供经编码的CMV蛋白的原位表达，或可被转录以提供与该递送RNA同义的更多转录本，所述转录本经翻译以提供经编码的一种或多种CMV蛋白的原位表达。
用于实现自复制的一种合适系统采用基于α病毒的RNA复制子，例如本文所述的α病毒复制子。这些+链复制子在递送至细胞后被翻译以得到复制酶(或复制酶-逆转录酶)。所述复制酶被翻译成多聚蛋白，所述多聚蛋白自动切割以提供生成正链(＋strand)递送RNA的基因组负链(－strand)拷贝的复制复合物。这些－链转录本可自我转录以获得所述＋链亲本RNA的更多拷贝，并且也产生编码两种或更多种CMV蛋白的亚基因组转录本。因此，所述亚基因组转录本的翻译导致所述受感染细胞中一种或多种CMV蛋白的原位表达。合适的α病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。
因此，优选的自复制RNA分子编码(i)可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶，和(ii)两种或更多种CMV蛋白或其片段。所述聚合酶 可为α病毒复制酶，例如，包括α病毒蛋白nsP4。
尽管除了编码非结构复制酶多聚蛋白以外，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白质，但本发明的基于α病毒的自复制RNA分子优选不编码所有α病毒结构蛋白。因此，所述自复制RNA可导致细胞中基因组RNA拷贝的自我生成，但不导致含RNA的α病毒病毒体的生成。无法生成这些病毒体说明不同于野生型α病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。本发明的自复制RNA中缺失野生型病毒永存所必需的α病毒结构蛋白，且其位置被编码所需基因产物(CMV蛋白或其片段)的基因占据，从而所述亚基因组转录本编码所需的基因产物而不是所述结构α病毒病毒体蛋白。
因此，本发明所用的自复制RNA分子具有编码不同CMV蛋白或其片段的四个或更多个序列。所述编码CMV蛋白或片段的序列可取任何所需方向，并操作性连接至相同或不同的启动子。在一些实施方式中，所述RNA可具有一个或多个额外的(下游)序列或开放阅读框，例如编码其它CMV蛋白或其片段的那些。自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相容的5'序列。
一方面，所述自复制RNA分子源自或基于α病毒，例如本文所述的α病毒复制子。在其它方面，所述自复制RNA分子源自或基于非α病毒的病毒，优选正链RNA病毒，更优选小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。合适的野生型α病毒序列为人熟知且可从序列保藏机构如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。合适α病毒的代表性示例包括奥拉病毒(ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒(ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus)(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCC VR-924)、格塔病毒(ATCC VR-369、ATCC VR-1243)、克泽拉格齐病毒(ATCC VR-927)、马亚罗(Mayaro)(ATCC VR-66)、马亚罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒(Middleburg)(ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu)(ATCC VR-371)、皮春纳病毒(ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特(ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(ATCC VR-469)、乌纳病毒(ATCC VR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-69、ATCC VR-923、 ATCC VR-1250ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃达罗河病毒(ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。
本发明所述的自复制RNA分子可包含一个或多个经修饰的核苷酸，并因此具有改善的稳定性，且在体内耐降解和清除，以及其它优点。不希望受任何具体理论限制，据信在所述自复制RNA被递送至细胞中时，包含经修饰核苷酸的自复制RNA分子应避免或减少对内体和胞质免疫受体的刺激。这允许发生自复制、扩增和蛋白质表达。这相较于不含经修饰核苷酸的自复制RNA而言减少了安全性问题，因为包含经修饰核苷酸的自复制RNA减少了对先天免疫系统的激活和后续不希望的后果(例如，注射位点的炎症、注射位点的刺激、疼痛等)。还认为自复制所产生的RNA分子被胞质免疫受体识别为外来核酸。因此，含有经修饰核苷酸的自复制RNA分子提供了RNA在宿主细胞内的有效扩增和CMV蛋白表达以及佐剂作用。
RNA序列可根据其密码子用途而被修饰，例如用于增加RNA的翻译效力和半衰期。可在RNA的3'末端连接聚A尾(如具有约30个或更多个腺嘌呤残基)(SEQ ID NO:46)以提高其半衰期。RNA的5'末端可用修饰的核糖核苷酸加帽，所述修饰的核糖核苷酸具有结构m7G(5')ppp(5')N(帽0结构)或其衍生物，其可在RNA合成中纳入或可在RNA转录后用酶促方法工程改造(如通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酰基-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的痘苗病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构可提供RNA分子的稳定性和翻译效力。RNA分子的5'帽还可由2'-O-甲基转移酶修饰，该修饰生成帽1结构(m7Gppp[m2'-O]N)，其可进一步提高翻译效力。
本文所用的“经修饰的核苷酸”指在核苷的含氮碱基(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或其上含有一种或多种化学修饰(如取代)的核苷酸。必要时，自复制RNA分子可在核苷的糖部分(如核糖、去氧核糖、修饰的核糖、修饰的去氧核醣、6元糖类似物或开链糖类似物)、或磷酸盐中或其上含化学修饰。
所述自复制RNA分子可包含至少一个经修饰的核苷酸，其优选不是5’帽的部分。因此，所述自复制RNA分子可在单一位置包含经修饰的核苷酸，可在两个或更多个位置包含经特定修饰的核苷酸(例如，假尿苷、N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)，或可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多修饰的核苷 酸(例如，各在一个或多个位置)。优选地，所述自复制RNA分子包含经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸在含氮碱基上或其内具有修饰但不包含经修饰的糖或磷酸部分。
在一些示例中，自复制RNA分子中0.001%～99%或100%的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些示例中，自复制RNA分子中0.001%～25%、0.01%～25%、0.1%～25%或1%～25%的核苷酸是经修饰的核苷酸。
在其他示例中，自复制RNA分子中0.001%～99%或100%的特定未修饰的核苷酸被经修饰的核苷酸取代。例如，可对含尿苷的自复制RNA分子中约1%的核苷酸进行修饰，例如通过假尿苷取代尿苷。在其它示例中，自复制RNA分子中所需量(百分数)的2、3或4个特定核苷酸(含有尿苷、胞苷、鸟苷或腺嘌呤的核苷酸)是经修饰的核苷酸。例如，自复制RNA分子中0.001%～25%、0.01%～25%、0.1%～25%或1%～25%的特定核苷酸是经修饰的核苷酸。在其它示例中，自复制RNA分子中0.001%～20%、0.001%～15%、0.001%～10%、0.01%～20%、0.01%～15%、0.1%～25、0.01%～10%、1%～20%、1%～15%、1%～10%、或约5%、约10%、约15%、约20%的特定核苷酸是经修饰的核苷酸。
优选自复制RNA分子中少于100%的核苷酸是经修饰的核苷酸。也优选自复制RNA分子中少于100%的特定核苷酸是经修饰的核苷酸。因此，优选自复制RNA分子包含至少一些未修饰的核苷酸。
发现哺乳动物RNA上有超过96种天然产生的核苷酸修饰。参见例如，Limbach等，Nucleic Acids Research,22(12):2183-2196(1994)。核苷酸和经修饰的核苷酸及核苷的制备为本领域熟知，例如美国专利号4373071、4458066、4500707、4668777、4973679、5047524、5132418、5153319、5262530、5700642，其都通过引用全文纳入本文，并且许多修饰的核苷和修饰的核苷酸市售可得。
可被纳入经修饰的核苷和核苷酸并存在于所述RNA分子中的经修饰的核碱基包括：m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(l-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰(norvalyl)氨甲酰基腺苷)；ms2hn6A (2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷)；Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸盐))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2T-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫胞苷)；ac4C(N4-乙酰胞苷)；f5C(5-甲酰基(fonnyl)胞苷)；m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4乙酰基2TO甲基胞苷)；k2C(赖西丁)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2'-O-甲基鸟苷)；m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2'-O-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧化怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(改性不足的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基鸟苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖-辫苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮(deaza)鸟苷)；preQi(7-氨甲基-7-脱氮鸟苷)；G*(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-氧乙酸)；mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨甲基-2硒基尿苷)；ncm5U(5-氨甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧基甲基氨甲基尿苷)；cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-O甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨甲基-2-硫代尿苷)；m62A(N6,N6-二甲基腺苷)；Tm(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟基甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)；rn62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)；m2'7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)；m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)虹膜甲基尿苷(irinomethyluridine))；tm5s2U(S-牛磺酸(taurino)甲基-2-硫代尿苷))；imG-14(4-去甲基鸟苷)；imG2(异鸟苷)；ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C₁-C₆)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C₂-C₆)-烯基尿嘧啶、5-(C₂-C₆)-炔基尿嘧啶、5-(羟基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C₁-C₆)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 5-(C₂-C₆)-烯基胞嘧啶、5-(C₂-C₆)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N²-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-氮杂-7-取代嘌呤、7-氮杂-8-取代嘌呤、氢(脱碱基残基)、m5C、m5U、m6A、s2U、W、或2'-O-甲基-U。这些修饰核碱基中的任意一种或任何组合可包含在本发明所述自复制RNA中。许多这些经修饰的核碱基及其对应的核糖核苷可从市场供应商获得。
必要时，所述自复制RNA分子可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯连接。
包含至少一个经修饰的核苷酸的自复制RNA分子可通过任何合适的方法制备。数种制备包含经修饰核苷酸的RNA分子的合适方法为本领域已知。例如，含修饰核苷酸的自复制RNA分子可通过用合适的DNA依赖性RNA聚合酶转录(如体外转录)编码自复制RNA分子的DNA来制得，所述酶例如T7噬菌体RNA聚合酶、SP6噬菌体RNA聚合酶、T3噬菌体RNA聚合酶等，或能将经修饰核苷酸有效纳入RNA分子的这些聚合酶的突变体。所述转录反应将包含核苷酸和修饰的核苷酸，和支持所选聚合酶活性的其它组分，如合适的缓冲剂和合适的盐。将核苷酸类似物纳入自复制RNA可经工程改造以(例如)改变此类RNA分子的稳定性、提高对RNA酶的抗性、在导入合适宿主细胞后确立复制(RNA的“感染性”)、和/或诱导或降低先天和适应性免疫应答。
合适的合成方法可单独使用，或与一种或多种其它方法(如重组DNA或RNA技术)联用来生产包含一个或多个经修饰核苷酸的自复制RNA分子。从头合成的合适方法为本领域熟知且可适于具体应用。示例性的方法包括例如化学合成，使用合适保护基团例如CEM(Masuda等(2007)Nucleic Acids Symposium Series51:3-4)、β-氰乙基亚磷酸胺方法(Beaucage S L等(1981)Tetrahedron Lett22:1859)；核苷H-磷酸酯方法(Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett27:4051-4；Froehler B C等(1986)Nucl Acid Res14:5399-407；Garegg P等(1986)Tetrahedron Lett27:4055-8；Gaffney B L等(1988)Tetrahedron Lett29:2619-22)。这些化学法能运行或调整适用于市售可得的自动核酸合成仪。额外的合适合成方法公开于Uhlmann等(1990)Chem Rev90:544-84，和Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem1:165。核酸合成还可用本领域熟知和常规的合适重组方法进行，所述方法包括 多核苷酸和该多核苷酸所编码基因产物的克隆、加工和/或表达。通过随机片段化的DNA改组以及基因片段和合成多核苷酸的PCR再组装是可用于设计并工程改造多核苷酸序列的已知技术的示例。可采用定点诱变来改变核酸和经编码的蛋白质，例如，用于插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体、导入突变等。转录、翻译和表达核酸序列的合适方法为本领域已知并且是常规方法。(通常参见，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》),第2卷，Ausubel等编，格林出版集团和威力出版公司(Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience),第13章，1988;Glover，DNA Cloning(《DNA克隆》)，第II卷，华盛顿特区IRL出版社(IRL Press)，第3章，1986；Bitter等，Methods in Enzymology(《酶学方法》)153:516-544(1987)；The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(《酿酒酵母分子生物学》),Strathern等编，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，卷I和II，1982；和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，冷泉港出版社，1989)。
可用任何合适的方法确定自复制RNA分子中一个或多个经修饰的核苷酸的存在和/或含量。例如，自复制RNA可消化成单磷酸酯(如使用核酸酶P1)并去磷酸化(如使用合适的磷酸酶如CIAP)，得到的核苷用反相HPLC分析(例如使用YMC Pack ODS-AQ柱(5微米，4.6X250mm)，且使用梯度洗脱，30%B(0～5分钟)-100%B(5～13分钟)和100%B(13～40)分钟，流速(0.7毫升/分钟)，UV检测(波长：260nm)，柱温(30℃))。缓冲液A(20mM乙酸-乙酸铵，pH3.5)，缓冲液B(20mM乙酸-乙酸铵，pH3.5/甲醇[90/10]))。
所述自复制RNA可与递送系统关联。所述自复制RNA可用或不用佐剂一起递送。
RNA递送系统
本文所述的自复制RNA适于以不同形式递送，如裸露RNA递送或与有助于进入细胞的脂质、聚合物或其它化合物联合。自复制RNA分子可采用任何合适的技术来引入靶细胞或对象，所述技术例如直接注射、微注射、电穿孔、脂质转染、生物裂解(biolystics)等。所述自复制RNA分子还可通过受体介导的胞吞作用引入细胞。参见例如美国专利第6,090,619号;Wu和Wu,J.Biol.Chem.,263:14621(1988);和Curiel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8850(1991)。例如，美国专利号6,083,741公开了通过使核酸连接聚阳离子部分(例如，具有3～100个赖氨酸残基的聚-L-赖氨酸(SEQ ID NO:4))将外源核酸引入哺乳动物细胞，所述聚阳离 子部分本身与整联受体结合部分(例如，具有序列Arg-Gly-Asp的环肽(SEQ ID NO:5))偶联。
可通过两亲物将自复制RNA分子递送进入细胞。参见例如，美国专利号6,071,890。核酸分子通常可形成具有阳离子两亲物的复合物。与该复合物接触的哺乳动物细胞能容易地将其吸收。
所述自复制RNA可作为裸露RNA递送(如仅作为RNA水溶液)，但为了增强进入细胞以及随后的细胞间效应，所述自复制RNA优选与递送系统(如微粒或乳液递送系统)组合给予。本领域技术人员熟知大量递送系统。所述递送系统包括例如基于脂质体的递送(Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7):682-691；Rose美国专利号5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414)，以及病毒载体的应用(如腺病毒(综述参见例如Berns等(1995)Ann.NY Acad.Sci.772:95-104；Ali等(1994)Gene Ther.1:367-384；和Haddada等(1995)Curr.Top.Microbiol.Immunol.199(Pt3):297-306)、乳头瘤病毒、逆转录病毒(参见例如Buchscher等(1992)J.Virol.66(5)2731-2739；Johann等(1992)J.Virol.66(5):1635-1640(1992)；Sommerfelt等,(1990)Virol.176:58-59；Wilson等(1989)J.Virol.63:2374-2378；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；Wong-Staal等,PCT/US94/05700，和Rosenburg和Fauci(1993)，Fundamental Immunology(《基础免疫学》),第三版Paul(编辑)纽约雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)和其参考文献，和Yu等,Gene Therapy(《基因治疗》)(1994)同上)、和腺相关病毒载体(AAV载体的综述参见West等(1987)Virology160:38-47；Carter等(1989)美国专利号4,797,368；Carter等WO93/24641(1993)；Kotin(1994)Human Gene Therapy(《人类基因治疗》)5:793-801；Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.94:1351和Samulski(同上)；还参见Lebkowski,美国专利号5,173,414；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5(11):3251-3260；Tratschin,等(1984)Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081；Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470；McLaughlin等(1988)和Samulski等(1989)J.Virol.,63:03822-3828)等。
三种特别有用的递送系统是(i)脂质体，(ii)非毒性和可生物降解的聚合物微粒，和(iii)阳离子亚微米水包油乳液。
脂质体
各种两亲性脂质能在水环境下形成双层以包封含RNA的水核心形成脂质 体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头基。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到上世纪六十年代，而形成阳离子脂质体的脂质从上世纪九十年代已开始研究。一些磷脂为阴离子型而其他为两性离子型。合适类型的磷脂包括但不限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和表2所列的一些有用的磷脂。有用的阳离子脂质包括但不限于：二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质包括但不限于酰基两性离子脂质和醚基两性离子脂质。有用的两性离子脂质示例为DPPC、DOPC和十二烷基磷酸胆碱。所述脂质可以是饱和或不饱和脂质。
脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包括(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性离子脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质混合物(v)阴离子脂质和两性离子脂质混合物(vi)两性离子脂质和阳离子脂质混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质混合物。类似地，混合物可包括饱和脂质和不饱和脂质。例如，混合物可包括DSPC(两性离子、饱和)、DlinDMA(阳离子、不饱和)和/或DMPG(阴离子、饱和)。采用脂质混合物时，并非混合物中的所有脂质成分都需要是两亲性的，例如可使一种或多种两亲性脂质与胆固醇混合。
可使脂质的亲水部分PEG化(即通过共价连接聚乙二醇修饰)。此修饰可增加稳定性并防止所述脂质体的非特异性吸收。例如，可采用例如Heyes等(2005)J Controlled Release107:276-87公开的那些技术使脂质与PEG偶联。
可采用DSPC、DlinDMA、PEG-DMPG和胆固醇的混合物来形成脂质体。本发明的单独方面是含DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包封RNA，如例如编码免疫原的自复制RNA。
脂质体通常分为3组：多层囊泡(MLV)；小单层囊泡(SUV)；和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双层，形成数个分开的水隔室。SUV和LUV具有包封水核心的单一双层；SUV通常直径≤50nm，LUV直径>50nm。本发明所用的脂质体理想上为直径范围50～220nm的LUV。对于包含直径不同的LUV群的组合物：(i)数量上有至少80%的直径应在20～220nm，(ii)该群的平均直径(Zav，以强度计)理想上在40～200nm，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应<0.2。
本领域熟知制备合适的脂质体的技术，例如参见Liposomes:Methods and Protocols(《脂质体：方法和实验方案》)，卷一：Pharmaceutical Nanocarriers:Methods and Protocols(《药物纳米载体：方法和实验方案》)(Weissig编著).休马那(Humana)出版,2009.ISBN160327359X；Liposome Technology(《脂质体技术》)，卷I、II和III(Gregoriadis编著).印富玛健康护理公司(Informa Healthcare),2006；和Functional Polymer Colloids and Microparticles(《功能性聚合物胶质和微粒》)，卷4(Microspheres,microcapsules&liposomes(微球、微囊和脂质体)).(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司(Citus Books),2002。一种有用的方法涉及混合(i)所述脂质的乙醇溶液(ii)所述核酸的水溶液和(iii)缓冲剂，随后混合、平衡、稀释和纯化(Heyes等.(2005)J Controlled Release107:276-87.)。
RNA优选包封在所述脂质体中，从而所述脂质体形成围绕含RNA水性核心的外层。已发现所述包封可保护RNA免于RNA酶消化。所述脂质体可包括一些外部的RNA(如在所述脂质体的表面)，但优选至少包封一半(理想上为基本全部)的RNA。
聚合微粒
许多聚合物可形成微粒以包封或吸附RNA。采用基本非毒性的聚合物意味着受体可安全地接受所述颗粒，而采用可生物降解的聚合物意味着所述颗粒可在递送后被代谢以避免长期留存。可用的聚合物还可进行灭菌，以辅助制备药物级别制剂。
合适的非毒性且可生物降解的聚合物包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚二噁烷酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸源的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯酰胺和其组合。
在一些实施方式中，所述微颗粒由聚(α-羟基酸)(如聚(丙交酯)(“PLA”))、丙交酯和乙交酯的共聚物(如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”))和D,L-丙交酯和己内酯的共聚物形成。可用的PLG聚合物包括丙交酯/乙交酯摩尔比范围为例如20:80～80:20(如25:75、40:60、45:55、55:45、60:40、75:25)的那些。可用的PLG聚合物包括分子量为例如5,000～200,000Da(如10,000-100,000、20,000-70,000、40,000-50,000Da)的那些。
所述微粒的直径理想上是0.02μm～8μm。对于包含直径不同的微粒群的组合物而言，数量上至少80%的组合物的直径应在0.03～7μm。
本领域熟知制备合适的微粒的技术，例如参见Functional Polymer Colloids and Microparticles(《功能性聚合物胶质和微粒》)，卷4(Microspheres,microcapsules&liposomes(微球、微囊和脂质体)).(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司(Citus Books),2002；Polymers in Drug Delivery(《药物递送中的聚合物》).(Uchegbu和Schatzlein编著).CRC出版社,2006.(具体第7章)和Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines(《递送蛋白和疫苗的微粒系统》).(Cohen和Bernstein编著).CRC出版社,1996。为了有助于RNA的吸收，微粒可包括阳离子表面活性剂和/或脂质，如O’Hagan等(2001)J Virology75:9037-9043；和Singh等(2003)Pharmaceutical Research20:247-251中所公开。制备聚合微粒的替代方法是通过模塑和固化，如WO2009/132206中所公开。
本发明的微粒可具有40～100mV的ζ电势。RNA可吸附到微粒上，并通过在所述微粒中纳入阳离子材料(如阳离子脂质)来促进所述吸附。
水包油阳离子乳液
已知水包油乳液能用于流感疫苗如FLUAD^TM产品中的MF59^TM佐剂和PREPANDRIX^TM产品中的AS03佐剂。通过采用水包油乳液可实现RNA递送，只要该乳液包含一种或多种阳离子分子即可。例如，阳离子脂质可包含在所述乳液中，以提供带正电的液滴表面供于带负电的RNA与之结合。
所述乳液包含一种或多种油。合适的一种或多种油包括来自例如动物(如鱼)或植物来源的那些油。所述油理想上是可生物降解(可代谢)和生物相容性的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油起始，通过水解、分离和酯化合适物质制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因而可以使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。
大多数鱼类含有易回收的可代谢的油。例如，本文可用的几种鱼油的示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。也可采用鲨烯的饱和类似物，角鲨烷。鱼油， 包括鲨烯和角鲨烷，易于获自市售来源，或可通过本领域已知的方法获得。
其它有用的油为生育酚，尤其是和鲨烯联合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α生育酚是DL-α生育酚。可使用包括鲨烯和生育酚(如DL-α-生育酚)的油的组合。
乳液优选包含鲨烯，其为一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油(C₃₀H₅₀；[(CH₃)₂C[=CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂=CHCH₂-]₂；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯；CAS RN7683-64-9)。
所述乳液中的油可包括油(例如鲨烯)和至少一种其它油的组合。
所述乳液的水性组分可以是淡水(如w.f.i.)或可包括其他组分(如溶质)。例如，其可包含盐以形成缓冲液，例如柠檬酸盐或磷酸盐，如钠盐。通常，缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。优选带缓冲的水相，并且所包含的缓冲剂通常将在5～20mM。
所述乳液还包含阳离子脂质。优选地，该脂质为表面活性剂，从而其有助于所述乳液的形成和稳定。可用的阳离子脂质通常包含生理条件下带正电的氮原子，如叔胺或季胺。所述氮可在两亲性表面活性剂的亲水头部基团中。有用的阳离子脂质包括但不限于：1,2-二油酰氧基-3-(三甲胺)丙烷(DOTAP)、3'-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC胆固醇)、二甲基双十八烷基-铵(DDA如溴化物)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵丙烷(DMTAP)、二棕榈酰(C16:0)三甲铵丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲铵丙烷(DSTAP)。其它可用的阳离子脂质有：苯扎氯铵(BAK)、苄索氯铵、溴棕三甲铵(其含十四烷基三甲基溴化铵和可能少量的十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵)、十六烷基氯化吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N,N',N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-l,3-二氨基丙烷、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基-氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基十八烷基溴化铵(DDAB)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合的三烷基氯化铵、甲基三辛基氯化铵)、N,N-二甲基-N-[2(2-甲基-4-(1,1,3,3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化铵(DEBDA)、二烷基二甲基铵盐、[l-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N,三甲基氯化铵、1,2-二酰基-3-(三甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二酰基-3(二 甲基铵)丙烷(酰基基团=二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、(4'-三甲基铵)丁酸甲酯)、N-烷基吡啶盐(如溴化十六烷基吡啶和氯化十六烷基吡)、N-烷基哌叮盐、二价阳离子bola型电解质(C12Me6;C12BU6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、L-α二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(DPPES)、脂聚-L(或D)-赖氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L(或D)-赖氨酸偶联N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有侧接氨基基团的双十二烷基谷氨酸(C^GluPhCnN)、具有侧接氨基基团的双十四烷基谷氨酸酯(Cl4GIuCnN+)、胆固醇阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基-二甲基铵、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基三甲基铵盐，和胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基二甲基铵。其它有用的阳离子脂质在美国2008/0085870和美国2008/0057080中有描述，其通过引用纳入本文。阳离子脂质优选可生物降解(可代谢)和生物相容性的阳离子脂质。
除所述油和阳离子脂质以外，乳液可包含非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。所述表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选的表面活性剂有聚山梨酯80(吐温80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
所述乳液中可包含这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85的混合物或吐温80/曲通-X100的混合物。聚氧乙烯脱水山梨醇酯(如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9＋聚氧乙烯脱水山梨醇酯和/或辛苯聚醇。可用的混合物可包括HLB值为10～20的表面活性剂(如聚山梨酯 80，HLB为15.0)和HLB值为1～10的表面活性剂(如去水山梨醇三油酸酯，HLB为1.8)。
最终乳液中油的含量(体积%)优选为2～20%，如5～15%、6～14%、7～13%、8～12%。约4～6%或约9～11%的鲨烯含量尤其有用。
最终乳液中表面活性剂的含量(重量%)优选为0.001%～8%。例如：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚山梨酯80)0.2～4%，具体为0.4～0.6%、0.45～0.55%、约0.5%或1.5～2%、1.8～2.2%、1.9～2.1%、约2%、或0.85～0.95%、或约1%；去水山梨糖醇酯(如去水山梨糖醇三油酸酯)0.02～2%，具体约0.5%或约1%；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100)0.001～0.1%，具体为0.005～0.02%；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1～8%,优选0.1～10%且具体为0.1～1%或约0.5%。
油和表面活性剂的绝对含量及其比例可在较广范围内变化而仍能形成乳液。技术人员可容易地改变组分的相对比例以获得需要的乳液，但油和表面活性剂的重量比通常在4:1和5:1之间(油过量)。
确保乳液的免疫刺激活性(特别是在大型动物中)的重要参数是油滴尺寸(直径)。最有效的乳液的液滴尺寸在亚微米级别。所述液滴的合适尺寸是50～750nm。最常用的平均液滴尺寸小于250nm，如小于200nm、小于150nm。可用的平均液滴尺寸是80～180nm。理想上，至少80%(以数量计)(且优选至少90%)的乳液油滴的直径小于250nm。用于测定乳液中平均液滴尺寸和尺寸分布的仪器市售可得。这些通常采用动态光散射和/或单粒子光学传感的技术如获自PSS公司(Particle Sizing Systems)(美国圣塔芭芭拉)的Accusizer^TM和Nicomp^TM系列仪器，或马文仪器公司(Malvern Instruments)(英国)的Zetasizer^TM仪器，或堀场公司(Horiba)(日本京都)的粒径分布分析仪(Particle Size Distribution Analyzer instruments)。
理想上，液滴尺寸分布(以数量计)仅有一个最大值而不是两个最大值，即围绕平均值(模式)分布有单一液滴群。优选乳液的多分散性<0.4，如0.3、0.2或更小。
含亚微米液滴和窄尺寸分布的合适乳液可通过采用微流化法来获得。该技术以高压和高速推动输入组分流通过几何学固定的通道来降低油滴平均尺寸。这些流接触通道壁、室壁和彼此。所导致的剪切力、冲击力和空化力使液滴尺寸变小。可重复微流化法步骤直至得到具有所需平均液滴尺寸和分布的乳液。
作为微流化法的替代，可采用加热法来引起相转化(phase inversion)。这些方法还可提供紧密粒径分布的亚微米乳液。
优选的乳液可经过滤灭菌，即可使其液滴穿过220nm滤器。除了实现灭菌，该过程还去除所述乳液中的任何大液滴。
在某些实施方式中，所述乳液中的所述阳离子脂质是DOTAP。所述阳离子水包油乳液可包含约0.5mg/ml～约25mg/ml DOTAP。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOTAP可为约0.5mg/ml～约25mg/ml、约0.6mg/ml～约25mg/ml、约0.7mg/ml～约25mg/ml、约0.8mg/ml～约25mg/ml、约0.9mg/ml～约25mg/ml、约1.0mg/ml～约25mg/ml、约1.1mg/ml～约25mg/ml、约1.2mg/ml～约25mg/ml、约1.3mg/ml～约25mg/ml、约1.4mg/ml～约25mg/ml、约1.5mg/ml～约25mg/ml、约1.6mg/ml～约25mg/ml、约1.7mg/ml～约25mg/ml、约0.5mg/ml～约24mg/ml、约0.5mg/ml～约22mg/ml、约0.5mg/ml～约20mg/m、约0.5mg/ml～约18mg/ml、约0.5mg/ml～约15mg/ml、约0.5mg/ml～约12mg/ml、约0.5mg/ml～约10mg/ml、约0.5mg/ml～约5mg/ml、约0.5mg/ml～约2mg/ml、约0.5mg/ml～约1.9mg/ml、约0.5mg/ml～约1.8mg/ml、约0.5mg/ml～约1.7mg/ml、约0.5mg/ml～约1.6mg/ml、约0.6mg/ml～约1.6mg/ml、约0.7mg/ml～约1.6mg/ml、约0.8mg/ml～约1.6mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约24mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml～约1.6mg/ml DOTAP，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质是DC胆固醇。所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml～约5mg/ml DC胆固醇。例如所述阳离子水包油乳液包含的DC胆固醇可为约0.1mg/ml～约5mg/ml、约0.2mg/ml～约5mg/ml、约0.3mg/ml～约5mg/ml、约0.4mg/ml～约5mg/ml、约0.5mg/ml～约5mg/ml、约0.62mg/ml～约5mg/ml、约1mg/ml～约5mg/ml、约1.5mg/ml～约5mg/ml、约2mg/ml～约5mg/ml、约2.46mg/ml～约5mg/ml、约3mg/ml～约5mg/ml、约3.5mg/ml～约5mg/ml、约4mg/ml～约5mg/ml、约4.5mg/ml～约5mg/ml、约0.1mg/ml～约4.92mg/ml、约0.1mg/ml～约4.5mg/ml、约0.1mg/ml～约4mg/ml、约0.1mg/ml～约3.5mg/ml、约0.1mg/ml～约3mg/ml、约0.1mg/ml～约2.46 mg/ml、约0.1mg/ml～约2mg/ml、约0.1mg/ml～约1.5mg/ml、约0.1mg/ml～约1mg/ml、约0.1mg/ml～约0.62mg/ml、约0.15mg/ml、约0.3mg/ml、约0.6mg/ml、约0.62mg/ml、约0.9mg/ml、约1.2mg/ml、约2.46mg/ml、约4.92mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.62mg/ml～约4.92mg/ml DC胆固醇，如2.46mg/ml。
在一些实施方式中，所述阳离子脂质是DDA。所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml～约5mg/ml的DDA。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DDA可为约0.1mg/ml～约5mg/ml、约0.1mg/ml～约4.5mg/ml、约0.1mg/ml～约4mg/ml、约0.1mg/ml～约3.5mg/ml、约0.1mg/ml～约3mg/ml、约0.1mg/ml～约2.5mg/ml、约0.1mg/ml～约2mg/ml、约0.1mg/ml～约1.5mg/ml、约0.1mg/ml～约1.45mg/ml、约0.2mg/ml～约5mg/ml、约0.3mg/ml～约5mg/ml、约0.4mg/ml～约5mg/ml、约0.5mg/ml～约5mg/ml、约0.6mg/ml～约5mg/ml、约0.73mg/ml～约5mg/ml、约0.8mg/ml～约5mg/ml、约0.9mg/ml～约5mg/ml、约1.0mg/ml～约5mg/ml、约1.2mg/ml～约5mg/ml、约1.45mg/ml～约5mg/ml、约2mg/ml～约5mg/ml、约2.5mg/ml～约5mg/ml、约3mg/ml～约5mg/ml、约3.5mg/ml～约5mg/ml、约4mg/ml～约5mg/ml、约4.5mg/ml～约5mg/ml、约1.2mg/ml、约1.45mg/ml等。或者，所述阳离子水包油乳液包含的DDA可为约20mg/ml、约21mg/ml、约21.5mg/ml、约21.6mg/ml、约25mg/ml。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml～约1.45mg/mlDDA，如1.45mg/ml。
可采用导管或类似设备将本发明的自复制RNA分子以裸露RNA或与递送系统组合的方式递送至靶器官或组织。合适的导管在如下文献中公开，例如美国专利号4,186,745；5,397,307；5,547,472；5,674,192；和6,129,705，其皆通过引用纳入本文。
本发明包括采用合适的递送系统，例如包封有或吸附有自复制RNA的脂质体、聚合物微粒或亚微米乳液微粒，来递送编码两种或更多种CMV蛋白的自复制RNA分子，例如，以单独或结合其他大分子来引发免疫应答。本发明包括吸附和/或包封有自复制RNA分子的脂质体、微粒和亚微米乳液，及其组合。
与脂质体和亚微米乳液微粒结合的自复制RNA分子可有效地被递送至宿主细胞，从而能引起针对所述自复制RNA编码的蛋白质的免疫应答。
可采用编码CMV蛋白的多顺反子自复制RNA分子和用多顺反子α病毒复制 子产生的VRP来在细胞中形成CMV蛋白质复合物。复合物包括但不限于：gB/gH/gL；gH/gL；gH/gL/gO；gM/gN；gH/gL/UL128/UL130/UL131；和UL128/UL130/UL131。
在一些实施方式中，可向细胞递送VRP的组合。组合包括但不限于：
1.gH/gL VRP
2.gH/gL VRP和gB VRP;
3.gH/gL/gO VRP和gB VRP;
4.gB VRP和gH/gL/UL128/UL130/UL131VRP;
5.gB VRP和UL128/UL130/UL131VRP;
6.gB VRP和gM/gN VRP;
7.gB VRP、gH/gL VRP和UL128/UL130/UL131VRP;
8.gB VRP、gH/gLgO VRP和UL128/UL130/UL131VRP;
9.gB VRP、gM/gN VRP、gH/gL VRP和UL128/UL130/UL131VRP;
10.gB VRP、gM/gN VRP、gH/gL/O VRP和UL128/UL130/UL131VRP;
11.gH/gL VRP和UL128/UL130/UL131VRP；并且
在一些实施方式中，可向细胞递送自复制RNA分子的组合。组合包括但不限于：
1.编码gH和gL的自复制RNA分子
2.编码gH和gL的自复制RNA分子和编码gB的自复制RNA分子；
3.编码gH、gL和gO的自复制RNA分子和编码gB的自复制RNA分子；
4.编码gB的自复制RNA分子和编码gH、gL、UL128、UL130和UL131的自复制RNA分子；
5.编码gB的自复制RNA分子和编码UL128、UL130及UL131的自复制RNA分子；
6.编码gB的自复制RNA分子和编码gM和gN的自复制RNA分子；
7.编码gB的自复制RNA分子，编码gH和gL的自复制RNA分子以及编码UL128、UL130和UL131的自复制RNA分子；
8.编码gB的自复制RNA分子，编码gH、gL和gO的自复制RNA分子和编码UL128、UL130和UL131的自复制RNA分子；
9.编码gB的自复制RNA分子，编码gM和gN的自复制RNA分子，编码gH和gL的自复制RNA分子以及编码UL128、UL130和UL131的自复 制RNA分子；
10.编码gB的自复制RNA分子，编码gM和gN的自复制RNA分子，编码gH、gL和gO的自复制RNA分子以及编码UL128、UL130和UL131的自复制RNA分子；
11.编码gH和gL的自复制RNA分子以及编码UL128、UL130和UL131的自复制RNA分子；和
CMV蛋白
合适的CMV蛋白包括gB、gH、gL、gO、UL128、UL130、UL131，并可来自任何CMV毒株。例如，CMV蛋白可来自Merlin、AD169、VR1814、Towne、Toledo、TR、PH、TB40或Fix CMV毒株。本文描述了示例性CMV蛋白和片段。这些蛋白质和片段可由任何合适的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包括就在所需宿主(例如人细胞)中表达而进行密码子优化或去优化的序列。表2中提供了CMV蛋白的示例性序列和编码所述蛋白质的核酸。
表2.

全长gH多核苷酸(CMV gH FL)SEQ ID NO:12全长gH多肽(CMV gH FL)SEQ ID NO:13全长gL多核苷酸(CMV gL FL)SEQ ID NO:16全长gL多肽(CMV gL FL)SEQ ID NO:17全长gO多核苷酸(CMV gO FL)SEQ ID NO:22全长gO多肽(CMV gO FL)SEQ ID NO:23gH sol多核苷酸(CMV gH sol)SEQ ID NO:14gH sol多肽(CMV gH sol)SEQ ID NO:15全长UL128多核苷酸(CMV UL128FL)SEQ ID NO:24全长UL128多肽(CMV UL128FL)SEQ ID NO:25全长UL130多核苷酸(CMV UL130FL)SEQ ID NO:26全长UL130多肽(CMV UL130FL)SEQ ID NO:27全长UL131多核苷酸(CMV UL131FL)SEQ ID NO:28全长UL131多肽(CMV UL131FL)SEQ ID NO:29全长gB多核苷酸(CMV gB FL)SEQ ID NO:6
全长gB多肽(CMV gB FL)SEQ ID NO:7gB sol750多核苷酸(CMV gB750)SEQ ID NO:8gB sol750多肽(CMV gB750)SEQ ID NO:9gB sol692多核苷酸(CMV gB692)SEQ ID NO:10gB sol692多肽(CMV gB692)SEQ ID NO:11全长gM多核苷酸(CMV gM FL)SEQ ID NO:18全长gM多肽(CMV gM FL)SEQ ID NO:19全长gN多核苷酸(CMV gN FL)SEQ ID NO:20全长gN多肽(CMV gN FL)SEQ ID NO:21
CMV gB蛋白
gB蛋白可以是全长或可省去所述蛋白质的一个或多个区域。或者，可使用gB蛋白的片段。gB氨基酸根据SEQ ID NO:7中所示的全长gB氨基酸序列(CMV gB FL)编号，其长度为907个氨基酸。可从所示全长蛋白质排除，或作为片段包含的gB蛋白合适区域包括：信号序列(氨基酸1～24)、gB-DLD去整合素样结构域(氨基酸57～146)、弗林蛋白酶切割位点(氨基酸459～460)、七肽重复区(氨基酸679～693)、跨膜结构域(氨基酸751～771)和来自氨基酸771～906的胞质结构域。在一些实施方式中，gB蛋白包括氨基酸67～86(中和表位AD2)和/或氨基酸532～635(免疫优势表位AD1)。gB片段的具体示例包括：含有gB前692个氨基酸的“gB sol692”和含有gB前750个氨基酸的“gB sol750”。所述信号序列即氨基酸1～24可存在或不存在于gB sol692和gB sol750中。任选地，gB蛋白可以是10个氨基酸或更长的gB片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850或875个氨基酸。gB片段可始于以下残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、 536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896或897。
任选地，gB片段可从所述片段的起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gB片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV gH蛋白
在一些实施方式中，gH蛋白是全长gH蛋白(CMV gH FL，SEQ ID NO:13， 例如，其为743个氨基酸的蛋白质)。gH具有跨膜结构域和始于716位至743位的胞质结构域。去除717～743的氨基酸获得可溶性的gH(例如，CMV gH sol,SEQ ID NO:15)。在一些实施方式中，gH蛋白可以是10个氨基酸或更长的gH片段。例如，所述片段中的氨基酸数可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700或725个氨基酸。任选地，gH蛋白可以是10个氨基酸或更长的gH片段。例如，所述片段中的氨基酸数可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700或725个氨基酸。gH片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、 312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、731、732或733。
根据SEQ ID NO:13中所示的全长gH氨基酸序列(CMV gH FL)对gH残基编号。任选地，gH片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gH片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV gL蛋白
在一些实施方式中，gL蛋白是全长gL蛋白(CMV gL FL，SEQ ID NO:17，例如，其为278个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，可使用gL片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或250个氨基酸。gL片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或268。
根据SEQ ID NO:17中所示的全长gL氨基酸序列(CMV gL FL)对gL残基编号。任选地，gL片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gL片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV gO蛋白
在一些实施方式中，gO蛋白是全长gO蛋白(CMV gO FL，SEQ ID NO:23，例如，其为472个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，gO蛋白可以是10个氨基酸或更长的gO片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、或450个氨基酸。gO片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、 370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461或462。
根据SEQ ID NO:23中所示的全长gO氨基酸序列(CMV gO FL)对gO残基编号。任选地，gO片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gO片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV gM蛋白
在一些实施方式中，gM蛋白是全长gM蛋白(CMV gM FL，SEQ ID NO:19，例如，其为371个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，gM蛋白可以是10个氨基酸或更长的gM片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个氨基酸。gM片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、 221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360或361。
根据SEQ ID NO:19中所示的全长gM氨基酸序列(CMV gM FL)对gM残基编号。任选地，gM片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gM片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV gN蛋白
在一些实施方式中，gN蛋白是全长gN蛋白(CMV gN FL，SEQ ID NO:21，例如，其为135个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，gN蛋白可以是10个氨基酸或更长的gN片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或125个氨基酸。gN片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125。
根据SEQ ID NO:21中所示的全长gN氨基酸序列(CMV gN FL)对gN残基编号。任选地，gN片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，gN片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、 10、20或30个氨基酸。
CMV UL128蛋白
在一些实施方式中，UL128蛋白是全长UL128蛋白(CMV UL128FL，SEQ ID NO:25，例如，其为171个氨基酸的蛋白)。在一些实施方式中，UL128蛋白可以是10个氨基酸或更长的UL128片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125或150个氨基酸。UL128片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或161。
根据SEQ ID NO:25中所示的全长UL128氨基酸序列(CMV UL128FL)对UL128残基编号。任选地，UL128片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，UL128片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV UL130蛋白
在一些实施方式中，UL130蛋白是全长UL130蛋白(CMV UL130FL，SEQ ID NO:27，例如，其为214个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，UL130蛋白可以是10个氨基酸或更长的UL130片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200个氨基酸。UL130片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203或204。
根据SEQ ID NO:27中所示的全长UL130氨基酸序列(CMV UL130FL)对UL130残基编号。任选地，UL130片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，UL130片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
CMV UL131蛋白
在一些实施方式中，UL131蛋白是全长UL131蛋白(CMV UL131，SEQ ID NO:29，例如，其为129个氨基酸的蛋白质)。在一些实施方式中，UL131蛋白可以是10个氨基酸或更长的UL131片段。例如，所述片段中的氨基酸数目可包括10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200个氨基酸。UL131片段可始于以下任何残基号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119。
根据SEQ ID NO:29中所示的全长UL131氨基酸序列(CMV UL131FL)对UL131残基编号。任选地，UL131片段可从所述片段起始残基向N末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。任选地，UL131片段可从所述片段的最末位残基向C末端进一步延伸5、10、20或30个氨基酸。
如上所述，前述的某些优选实施方式，例如包含编码CMV蛋白或其片段的 序列的α病毒VRP和自复制RNA，是对本发明的说明但不是对本发明范围的限制。应理解，所示优选实施方式中编码CMV蛋白的序列可被编码来自其他疱疹病毒(例如，HHV-1、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-6、HHV-7和HHV-8)的10个氨基酸长度或更长的蛋白质(例如gH和gL)或其片段的序列取代。例如，合适的VZV(HHV-3)蛋白包括gB、gE、gH、gI和gL，及其长度为10个氨基酸或更长的片段，并可来自任何VZV毒株。例如，VZV蛋白或其片段可来自VZV的pOka、Dumas、HJO、CA123或DR毒株。这些示例性VZV蛋白及其片段可由任何合适的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包括就所需宿主(例如人细胞)中表达而言进行密码子优化或去优化的序列。本文提供了VZV蛋白的示例性序列。
例如，在一个实施方式中，所述多顺反子核酸分子包含编码VZV gH蛋白或其片段的第一序列和编码VZV gL蛋白或其片段的第二序列。
合适的抗原包括来自病原体如病毒、细菌、真菌、原生动物、植物或肿瘤的蛋白质和肽。可由自复制RNA分子编码的病毒抗原和免疫原包括但不限于来自下述病毒的蛋白质和肽：正粘病毒如流感病毒A、B和C；副粘病毒科病毒、如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、偏肺病毒和麻疹病毒(如麻疹)；肺炎病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒；副粘病毒如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎病毒、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒、尼帕病毒、亨尼帕病毒和新城疫病毒；痘病毒科，包括正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花病毒(Variola vera)(包括但不限于，重型天花(Variola major)和轻型天花(Variola minor))；偏肺病毒、如人偏肺病毒(hMPV)和禽偏肺病毒(aMPV)；麻疹病毒如麻疹；小核糖核酸病毒、如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、副肠孤病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒；肠道病毒、如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型柯萨奇病毒A、1-6型柯萨奇病毒B、1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71型、布尼亚病毒、包括正布尼亚病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒；白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒；内罗病毒(Nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever)；嗜肝RNA病毒如甲肝病毒(HAV)；披膜病毒(风疹病毒)、如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒；抗黄病毒、如蜱媒脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒的抗原；瘟病毒、如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)；肝DNA病毒、如 乙肝病毒、丙肝病毒；弹状病毒、如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)、杯状病毒、如诺沃克病毒、和诺沃克样病毒、如夏威夷病毒和雪山病毒；冠状病毒，如SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)；逆转录病毒如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒；呼吸道肠道病毒、如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒、或科罗拉多壁虱热病毒(Coltivirus)；细小病毒、如细小病毒B19；丁肝病毒(HDV)；戊肝病毒(HEV)；庚肝病毒(HGV)；人疱疹病毒、如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)、和人疱疹病毒8(HHV8)；乳头状多瘤空泡病毒、如乳头瘤病毒和多瘤病毒、腺病毒和沙粒病毒。
在一些实施方式中，所述抗原蛋白来自感染鱼的病毒，例如：传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA样病毒(又称为大西洋鲑鱼小RNA样病毒)、陆封鲑鱼病毒(LSV)、大西洋鲑鱼轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)、或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
在一些实施方式中，所述抗原蛋白是来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫，如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵圆疟原虫(P.ovale)。因此本发明可用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，所述抗原引起的免疫应答针对来自鱼虱科的寄生虫，特别是来自疮痂鱼虱属和鱼虱属的那些，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。
可由自复制RNA分子编码的细菌抗原和免疫原包括但不限于来自下述的蛋白和肽：脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)(如鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、破伤风梭菌(Clostridium tetani(破伤风))、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭 菌(Clostridium botulinums(肉毒杆菌))、白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae(白喉))、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetii)、布鲁氏菌(Brucella sp.)(如流产布鲁氏菌(B.abortus)、狗布鲁氏菌(B.canis)、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、木鼠布鲁氏菌(B.neotomae)、羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)和鳍足类海洋布鲁氏菌(B.pinnipediae))、弗朗西斯氏菌(Francisella sp.)(如新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)和土拉热弗朗西斯氏菌(F.tularensis))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、淋病奈瑟球菌(Neiserria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum(梅毒))、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、大肠杆菌(E.coli)如产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散性粘着大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC；如尿致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症-相关大肠杆菌(MNEC))，和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis(炭疽))、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis(鼠疫))、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、立克次体(Rickettsia)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi(伤寒))、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorfer)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、克雷伯菌(Klebsiella)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)等。
可由自复制RNA分子编码的真菌抗原和免疫原包括但不限于：来自皮肤真菌的蛋白质和肽，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophyton floccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格尼毛癣菌(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，昆克毛癣菌(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌 (Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白变种(var.album)、盘状变种(var.discoides)、赭黄变种(var.ochraceum)，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、肠间隔微孢子虫(Septata intestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的有短粒虫属(Brachiola spp.)、微胞子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉 属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核盘菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.)。
可由自复制RNA分子编码的原生动物抗原和免疫原包括但不限于来自痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫(Giardia lambli)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡宴环孢子球虫(Cyclospora cayatanensis)和弓形虫(Toxoplasma)的蛋白质和肽。
可由自复制RNA分子编码的植物抗原和免疫原包括但不限于来自蓖麻(Ricinus communis)的蛋白质和肽。
合适的抗原包括来自例如下述病毒的蛋白质和肽：人体免疫缺陷病毒(HIV)、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)、呼吸道合胞病毒(RSV)、细小病毒、诺如病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、鼻病毒、黄热病毒、狂犬病病毒、登革热病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒(如肠道病毒71)、埃博拉病毒、和牛性腹泻病毒。优选地，抗原物质选自下组：HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV糖蛋白gp40、HIV p55gag、和来自pol和tat区域的多肽。在本发明其它优选实施方式中，抗原蛋白质或肽源自细菌，所述细菌例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae(霍乱))、白喉棒状杆菌(C.diphtheriae(白喉))、破伤风梭菌(C.tetani(破伤风))、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、百日咳博德特菌(B.pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等。
可由本发明的自复制RNA分子编码的HIV抗原描述于1990年3月9日提交的美国申请序列号490,858和公开的欧洲申请号181150(1986年5月14日)，以及美国申请序列号60/168,471；09/475,515；09/475,504；和09/610,313，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
可由本发明的自复制RNA分子编码的巨细胞病毒抗原描述于美国专利号4,689,225，1989年6月16日提交的美国申请序列号367,363和PCT公开WO89/07143，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
可由本发明的自复制RNA分子编码的丙肝病毒抗原描述于 PCT/US88/04125，公开的欧洲申请号318216(1989年5月31日)，1988年11月18日提交的公开日本申请号1-500565，加拿大申请583,561，和EPO388,232，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。一组不同的HCV抗原描述于1990年3月16日提交的欧洲专利申请90/302866.0和1989年12月21日提交的美国申请序列号456,637，和PCT/US90/01348，它们的公开内容通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，抗原源自变应原，如花粉变应原(树、草本、杂草和草花粉变应原)；昆虫或蜘蛛类变应原(吸入、唾液和毒液变应原如螨虫变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)；动物毛发和皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；和食物变应原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉变应原是那些源自分类目壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木目的，包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，雪松(柳杉属和圆柏属)，法国梧桐(悬铃木)，禾本目包括黑麦属(Lolium)、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属(Secale)和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和欧蓍草属。其它重要的吸入变应原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原或抗原，或者癌免疫原或抗原可由所述自复制RNA分子编码。在某些实施方式中，肿瘤免疫原和抗原是含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。
适用于本文的肿瘤免疫原和抗原包括各种分子，如(a)含多肽的肿瘤抗原，包括多肽(长度范围可以是(例如)8～20个氨基酸，虽然超出此范围以外的长度也常见)、脂多肽和糖蛋白。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原是例如：(a)与癌细胞相关的全长分子，(b)其同源物和修饰形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)其片段。肿瘤免疫原包括例如：CD8+淋巴细胞识别的I型-限制性抗原或CD4+淋巴细胞识别的II型-限制性抗原。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于(a)睾丸癌抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(其可用于例如，检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(例如，与黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(例如，与黑色素瘤有关)、MUM1(例如，与黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(例如，与头颈癌有关)、CIA0205(例如，与膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(例如，与黑色素瘤有关)、TCR(例如，与T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-abl(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过表达抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，与结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(例如，与霍奇金病有关)、蛋白酶3(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(例如，与多种白血病有关)、碳酸酐酶(例如，与肾癌有关)、醛缩酶A(例如，与肺癌有关)、PRAME(例如，与黑色素瘤有关)、HER-2/neu(例如，与乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、甲胎蛋白(例如，与肝细胞癌有关)、KSA(例如，与结直肠癌有关)、胃泌素(例如，与胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(例如，与乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(例如，与肾细胞癌有关)、p53(例如，与乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(例如，与乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如，与黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，例如与前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。
在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人嗜T淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、 TLP、TPS等。
方法与应用
在一些实施方式中，向个体给予自复制RNA分子或VRP来刺激免疫应答。在该实施方式中，自复制RNA分子或VRP一般存在于可包含药学上可接受载体和任选佐剂的组合物中。参见例如，美国6,299,884；美国7,641,911；美国7,306,805和美国2007/0207090。
所述免疫应答可包含体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或两者。在一些实施方式中，诱导针对每各经递送的CMV蛋白的免疫应答。细胞介导的免疫应答可包括辅助T细胞(T_h)应答、CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答或两者。在一些实施方式中，所述免疫应答包括体液免疫应答，并且抗体是中和抗体。中和抗体阻断病毒对细胞的感染。CMV感染上皮细胞，也感染成纤维细胞。在一些实施方式中，所述免疫应答减少或防止感染两种类型的细胞。中和抗体应答可以是补体依赖性或非补体依赖性的中和抗体应答。在一些实施方式中，所述中和抗体应答是非补体依赖性的中和抗体应答。在一些实施方式中，所述中和抗体应答是交叉中和；即针对所给予组合物产生的抗体会中和用于所述组合物中毒株以外的CMV病毒株。
本领域中有用的抗体效力的量度是“50%中和效价”。为测定50％中和效价，稀释经免疫动物的血清以评价稀释血清如何能保留阻断50％病毒进入细胞的能力。例如，效价700是指血清经700倍稀释后仍具有中和50％病毒的能力。因此，较高效价表明较强效的中和抗体应答。在一些实施方式中，该效价范围的下限为约200、约400、约600、约800、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500或约7000。所述50％中和效价范围的上限可为约400、约600、约800、约1000、约1500、约200、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500、约7000、约8000、约9000、约10000、约11000、约12000、约13000、约14000、约15000、约16000、约17000、约18000、约19000、约20000、约21000、约22000、约23000、约24000、约25000、约26000、约27000、约28000、约29000或约30000。例如，50%中和效价可以是约3000～约6500。“约”指所述值增加或减少10%。中和效价可根据下文具体实施例所述测定。
可通过向个体给予VRP或自复制RNA来刺激免疫应答，所述个体一般为哺乳动物，包括人。在一些实施方式中，所诱导的免疫应答是保护性免疫应答， 即减少CMV感染风险或严重性的应答。一些具有来自CMV感染和疾病风险的群体尤其需要刺激保护性免疫应答。例如，风险群体包括实体器官移植(SOT)患者、骨髓移植患者和造血干细胞移植(HSCT)患者。可将VRP可给予移植前的移植供体或移植前/后的移植受体。因为母亲对孩子的垂直传播是婴儿感染的常见来源，对可能怀孕的妇女给予VRP或自复制RNA特别有用。
可采用任何合适的给予途径。例如，组合物可肌内、腹膜内、皮下或经皮给予。一些实施方式可通过例如口内、鼻内、阴道内和直肠内的肌内途径给予。可根据任何合适的方案给予组合物。
本公开中引用的所有专利、专利申请和参考文献(包括登录号下的核苷酸和氨基酸序列)均明确地通过引用纳入本文。上述公开是总体说明。可参考以下具体实施例得到更完整的理解，所述实施例仅提供用于说明目的。
实施例：编码CMV蛋白的双顺反子和五顺反子核酸
RNA合成
以编码α病毒复制子的质粒DNA作为模板用于RNA体外合成。α病毒复制子包含RNA复制所需的遗传元件但缺少编码组装颗粒所需基因产物的那些；α病毒基因组的结构基因由编码外源蛋白的序列替代。将所述复制子递送至真核细胞后，正义链RNA经翻译产生4种非结构蛋白，它们一起复制基因组RNA并转录大量编码异源基因产物或感兴趣基因(GOI)的亚基因组mRNA。由于缺少α病毒结构蛋白的表达，复制子无法诱导产生感染性颗粒。α病毒cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)启动子促进所述复制子RNA体外合成，且紧邻聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过其自切割活性产生校正的3’端。
为能形成抗原性蛋白质复合物，在同一细胞中表达所述复合物的单独组成成分是极其重要的。理论上，这可以通过采用编码单独组成成分的基因共同感染细胞来实现。然而，在非病毒或VRP递送α病毒复制子RNA的情况下，该策略的阻碍是向同一细胞低效地共同递送多种RNA或者在单独细胞中低效地产生多种自复制RNA。一种可能更有效促进蛋白质复合物组成成分共同表达的方法是使各基因作为相同自复制RNA分子一部分来递送。出于该目的，我们工程改造了编码多种感兴趣基因的α病毒复制子构建体。每种GOI前面都有其自身的亚基因组启动子，所述亚基因组启动子由α病毒转录机制识别。因此，在单独细胞中合成多个亚基因组信使RNA物质以组装多组成成分蛋白质复合物。
采用合适的限制性内切核酸酶使HDV核酶下游的质粒DNA线性化之后，用 T7噬菌体来源的DNA依赖性RNA聚合酶体外合成失控转录本。按照生产商(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司(Ambion))提供的说明书，在7.5mM的各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)存在下于37℃转录2小时。转录后，用TURBO DNA酶(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)消化模板DNA。用LiCl沉淀所述复制子RNA并在无核酸酶的水中重建。如用户手册所述，未加帽的RNA在转录后通过牛痘加帽酶(VCE)用ScriptCap m⁷G加帽系统(威斯康星州麦迪逊的艾比森得生物技术公司(Epicentre Biotechnologies))加帽。用LiCl使转录后加帽的RNA沉淀并在无核酸酶的水中重建。RNA样品的浓度通过测量260nm处的光密度来测定。体外转录本的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳证实。
制备表达来自人巨细胞病毒(HCMV)的糖蛋白质复合物的双顺反子和五顺反子α病毒复制子，示意图见图1。所述α病毒复制子基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。所述α病毒复制子基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。将所述复制子包装入病毒复制子颗粒(VRP)中、包封于脂质纳米颗粒(LNP)中或用阳离子纳米乳液配制(CNE)。通过免疫印迹、免疫共沉淀和流式细胞术来证实来自各复制子的编码的HCMV蛋白和蛋白质复合物的表达。采用流式细胞仪验证五聚gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物的表达，所述表达来自编码所述复合物的蛋白组成成分的五聚体复制子，利用了对五聚体复合物上所存在构象表位特异的人单克隆抗体(Macagno等(2010),J.Virol.84(2):1005-13)。图2显示这些抗体与采用表达HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物(A527)的复制子RNA转染的BHKV细胞结合。当采用相同复制子构建体制备的VRP感染细胞时获得相似结果。这显示设计成表达五聚体复合物的复制子确实表达所需抗原而不是可能的副产物gH/gL。
通过在后方四头肌的肌内注射，用VRP、包封在LNP中的RNA和采用阳离子水包油纳米乳液(CNE)配制的RNA来免疫Balb/c小鼠。所述小鼠免疫三次，相隔三周，每次免疫接种前以及第三次且最终免疫接种后三周收集血清样品。用微中和试验评估所述血清并以测定疫苗接种所引发的中和抗体应答效力。所述效价表示为50％中和效价。
相比表达gH/gL的LNP包封RNA和VRP(A160)来评估LNP包封的编码五聚体复合物(A526和A527)的RNA的免疫原性。表3显示表达五聚体复合物的复制子比表达gH/gL的复制子引发更强效的中和抗体。


将引发中和抗体(A527)最高效价的基于五顺反子VEE的RNA复制子包装成VRP，并将该VRP的免疫原性与表达gH/gL的VRP和表达gH/gL和五聚体复合物的LNP包封复制子做比较。表4显示表达五聚体复合物的VRP比表达gH/gL的VRP引发更高的中和抗体效价。另外，当VRP和RNA编码相同的蛋白质复合物时，VRP的10⁶感染单位至少相当于1μg经LNP包封的RNA的效力。

通过用血清阻断不同HCMV毒株对成纤维细胞和上皮细胞的感染来评估血清中HCMV中和活性的宽度和效力，所述血清来自用基于VEE的编码五聚体复合物(A527)的RNA免疫的小鼠。表5显示抗gH/gL/UL128/UL130/UL131免疫血清广泛并有效中和上皮细胞的感染。该作用是补体依赖性的。相反，所述血清对成纤维细胞感染的作用减少或检测不到。就含有大部分具有gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物特异性的抗体的免疫血清而言，这些 结果是预料中的，因为感染成纤维细胞不需要五聚体复合物，因此针对UL128、UL130和UL131的抗体不会阻断成纤维细胞的感染(Adler等(2006),J.Gen.Virol.87(Pt.9):2451-60；Wang和Shenk(2005),Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(50):18153-8)。因此，这些数据证实，编码gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物的五聚体复制子在体内特异性引发针对所述复合物的抗体。

为观察表达gH/gL和五聚体复合物的双顺反子和五顺反子复制子在不同制剂中是否引发中和抗体，将双顺反子或五顺反子复制子与阳离子纳米乳液(CNE)混合来免疫接种棉鼠。表6显示CNE中复制子引起的中和抗体效价与LNP中包封的相同复制子相当。

序列
CMV gB FL:
1
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CMV gB FL
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CMV gL FL;
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CMV gM FL;
MAPSHVDKVNTRTWSASIVFMVLTFVNVSVHLVLSNFPHLGYPCVYYHVVDFERLNMSAYNVMHLHTPMLFLDSVQLVCYAVFMQLVFLAVTIYYLVCWIKISMRKDKGMSLNQSTRDISYMGDSLTAFLFILSMDTFQLFTLTMSFRLPSMIAFMAAVHFFCLTIFNVSMVTQYRSYKRSLFFFSRLHPKLKGTVQFRTLIVNLVEVALGFNTTVVAMALCYGFGNNFFVRTGHMVLAVFVVYAIISIIYFLLIEAVFFQYVKVQFGYHLGAFFGLCGLIYPIVQYDTFLSNEYRTGISWSFGMLFFIWAMFTTCRAVRYFRGRGSGSVKYQALATASGEEVAALSHHDSLESRRLREEEDDDDEDFEDA--(SEQ ID NO:19)
CMV gN FL:
1-atggaatggaacaccctggtcctgggcctgctggtgctgtctgtcgtggccagcagcaacaacacatccacagccagcacccctagacctagcagcagcacccacgccagcactaccgtgaaggctaccaccgtggccaccacaagcaccaccactgctaccagcaccagctccaccacctctgccaagcctggctctaccacacacgaccccaacgtgatgaggccccacgcccacaacgacttctacaacgctcactgcaccagccacatgtacgagctgtccctgagcagctttgccgcctggtggaccatgctgaacgccctgatcctgatgggcgccttctgcatcgtgctgcggcactgctgcttccagaacttcaccgccaccaccaccaagggctactgataa–411(SEQ ID NO:20)
CMV gN FL;
MEWNTLVLGLLVLSVVASSNNTSTASTPRPSSSTHASTTVKATTVATTSTTTATSTSSTTSAKPGSTTHDPNVMRPHAHNDFYNAHCTSHMYELSLSSFAAWWTMLNALILMGAFCIVLRHCCFQNFTATTTKGY--(SEQ ID NO:21)
CMV gO FL:
1-atgggcaagaaagaaatgatcatggtcaagggcatccccaagatcatgctgctgattagcatcacctttctgctgctgtccctgatcaactgcaacgtgctggtcaacagccggggcaccagaagatcctggccctacaccgtgctgtcctaccggggcaaagagatcctgaagaagcagaaagaggacatcctgaagcggctgatgagcaccagcagcgacggctaccggttcctgatgtaccccagccagcagaaattccacgccatcgtgatcagcatggacaagttcccccaggactacatcctggccggacccatccggaacgacagcatcacccacatgtggttcgacttctacagcacccagctgcggaagcccgccaaatacgtgtacagcgagtacaaccacaccgcccacaagatcaccctgaggcctcccccttgtggcaccgtgcccagcatgaactgcctgagcgagatgctgaacgtgtccaagcggaacgacaccggcgagaagggctgcggcaacttcaccaccttcaaccccatgttcttcaacgtgccccggtggaacaccaagctgtacatcggcagcaacaaagtgaacgtggacagccagaccatctactttctgggcctgaccgccctgctgctgagatacgcccagcggaactgcacccggtccttctacctggtcaacgccatgagccggaacctgttccgggtgcccaagtacatcaacggcaccaagctgaagaacaccatgcggaagctgaagcggaagcaggccctggtcaaagagcagccccagaagaagaacaagaagtcccagagcaccaccaccccctacctgagctacaccacctccaccgccttcaacgtgaccaccaacgtgacctacagcgccacagccgccgtgaccagagtggccacaagcaccaccggctaccggcccgacagcaactttatgaagtccatcatggccacccagctgagagatctggccacctgggtgtacaccaccctgcggtacagaaacgagcccttctgcaagcccgaccggaacagaaccgccgtgagcgagttcatgaagaatacccacgtgctgatcagaaacgagacaccctacaccatctacggcaccctgg acatgagcagcctgtactacaacgagacaatgagcgtggagaacgagacagccagcgacaacaacgaaaccacccccacctcccccagcacccggttccagcggaccttcatcgaccccctgtgggactacctggacagcctgctgttcctggacaagatccggaacttcagcctgcagctgcccgcctacggcaatctgaccccccctgagcacagaagggccgccaacctgagcaccctgaacagcctgtggtggtggagccagtgataa–1422(SEQ ID NO:22)
CMV gO FL;
MGKKEMIMVKGIPKIMLLISITFLLLSLINCNVLVNSRGTRRSWPYTVLSYRGKEILKKQKEDILKRLMSTSSDGYRFLMYPSQQKFHAIVISMDKFPQDYILAGPIRNDSITHMWFDFYSTQLRKPAKYVYSEYNHTAHKITLRPPPCGTVPSMNCLSEMLNVSKRNDTGEKGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYIGSNKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTRSFYLVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQALVKEQPQKKNKKSQSTTTPYLSYTTSTAFNVTTNVTYSATAAVTRVATSTTGYRPDSNFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRNEPFCKPDRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNETMSVENETASDNNETTPTSPSTRFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDKIRNFSLQLPAYGNLTPPEHRRAANLSTLNSLWWWSQ--(SEQ ID NO:23)
CMV UL128FL:
1-atgagccccaaggacctgacccccttcctgacaaccctgtggctgctcctgggccatagcagagtgcctagagtgcgggccgaggaatgctgcgagttcatcaacgtgaaccacccccccgagcggtgctacgacttcaagatgtgcaaccggttcaccgtggccctgagatgccccgacggcgaagtgtgctacagccccgagaaaaccgccgagatccggggcatcgtgaccaccatgacccacagcctgacccggcaggtggtgcacaacaagctgaccagctgcaactacaaccccctgtacctggaagccgacggccggatcagatgcggcaaagtgaacgacaaggcccagtacctgctgggagccgccggaagcgtgccctaccggtggatcaacctggaatacgacaagatcacccggatcgtgggcctggaccagtacctggaaagcgtgaagaagcacaagcggctggacgtgtgcagagccaagatgggctacatgctgcagtgataa–519(SEQ ID NO:24)
CMV UL128FL;
MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ--
(SEQ ID NO:25)
CMV UL130FL:
1-atgctgcggctgctgctgagacaccacttccactgcctgctgctgtgtgccgtgtgggccaccccttgtctggccagcccttggagcaccctgaccgccaaccagaaccctagccccccttggtccaagctgacctacagcaagccccacgacgccgccaccttctactgcccctttctgtaccccagccctcccagaagccccctgcagttcagcggcttccagagagtgtccaccggccctgagtgccggaacgagacactgtacctgctgtacaaccgggagggccagacactggtggagcggagcagcacctgggtgaaaaaagtgatctggtatctgagcggccggaaccagaccatcctgcagcggatgcccagaaccgccagcaagcccagcgacggcaacgtgcagatcagcgtggaggacgccaaaatcttcggcgcccacatggtgcccaagcagaccaagctgctgagattcgtggtcaacgacggcaccagatatcagatgtgcgtgatgaagctggaaagctgggcccacgtgttccgggactactccgtgagcttccaggtccggctgaccttcaccgaggccaacaaccagacctacaccttctgcacccaccccaacctgatcgtgtgataa–648(SEQ ID NO:26)
CMV UL130FL;
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV--(SEQ ID NO:27)
CMV UL131FL:
1-atgcggctgtgcagagtgtggctgtccgtgtgcctgtgtgccgtggtgctgggccagtgccagagagagacagccgagaagaacgactactaccgggtgccccactactgggatgcctgcagcagagccctgcccgaccagacccggtacaaatacgtggagcagctcgtggacctgaccctgaactaccactacgacgccagccacggcctggacaacttcgacgtgctgaagcggatcaacgtgaccgaggtgtccctgctgatcagcgacttccggcggcagaacagaagaggcggcaccaacaagcggaccaccttcaacgccgctggctctctggcccctcacgccagatccctggaattcagcgtgcggctgttcgccaactgataa–393(SEQ ID NO:28)
CMV UL131FL;
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN--(SEQ ID NO:29)
EMCV IRES核苷酸序列;
aacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgataat(SEQ ID NO:30)
EV71IRES核苷酸序列;
gtacctttgtacgcctgttttataccccctccctgatttgcaacttagaagcaacgcaaaccagatcaatagtaggtgtgacataccagtcgcatcttgatcaagcacttctgtatccccggaccgagtatcaatagactgtgcacacggttgaaggagaaaacgtccgttacccggctaactacttcgagaagcctagtaacgccattgaagttgcagagtgtttcgctcagcactccccccgtgtagatcaggtcgatgagtcaccgcattccccacgggcgaccgtggcggtggctgcgttggcggcctgcctatggggtaacccataggacgctctaatacggacatggcgtgaagagtctattgagctagttagtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacatacccttaatccaaagggcagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttctttttattcttgtattggctgcttatggtgacaattaaagaattgttaccatatagctattggattggccatccagtgtcaaacagagctattgtatatctctttgttggattcacacctctcactcttgaaacgttacacaccctcaattacattatactgctgaacacgaagcg(SEQ ID NO:31)
VEE亚基因组启动子
5’-CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA-3’(SEQ ID NO:1)
VZV gB
MFVTAVVSVSPSSFYESLQVEPTQSEDITRSAHLGDGDEIREAIHKSQDAETKPTFYVCPPPTGSTIVRLEPPRTCPDYHLGKNFTEGIAVVYKENIAAYKFKATVYYKDVIVSTAWAGSSYTQITNRYADRVPIPVSEITDTIDKFGKCSSKATYVRNNHKVEAFNEDKNPQDMPLIASKYNSVGSKAWHTTNDTYMVAGTPGTYRTGTSVNCIIEEVEARSIFPYDSFGLSTGDIIYMSPFFGLRDGAYREHSNYAMDRFHQFEGYRQRDLDTRALLEPAARNFLVTPHLTVGWNWKPKRTEVCSLVKWREVEDVVRDEYAHNFRFTMKTLSTTFISETNEFNLNQIHLSQCVKEEARAIINRIYTTRYNSSHVRTGDIQTYLARGGFVVVFQPLLSNSLARLYLQELVRENTNHSPQKHPTRNTRSRRSVPVELRANRTITTTSSVEFAMLQFTYDHIQEHVNEMLARISSSWCQLQNRERALWSGLFPINPSALASTILDQRVKARILGDVISVSNCPELGSDTRIILQNSMRVSGSTTRCYSRPLISIVSLNGSGTVEGQLGTDNELIMSRDLLEPCVANHKRYFLF GHHYVYYEDYRYVREIAVHDVGMISTYVDLNLTLLKDREFMPLQVYTRDELRDTGLLDYSEIQRRNQMHSLRFYDIDKVVQYDSGTAIMQGMAQFFQGLGTAGQAVGHVVLGATGALLSTVHGFTTFLSNPFGALAVGLLVLAGLVAAFFAYRYVLKLKTSPMKALYPLTTKGLKQLPEGMDPFAEKPNATDTPIEEIGDSQNTEPSVNSGFDPDKFREAQEMIKYMTLVSAAERQESKARKKNKTSALLTSRLTGLALRNRRGYSRVRTENVTGV(SEQ ID NO:32)
VZV gH
MFALVLAVVILPLWTTANKSYVTPTPATRSIGHMSALLREYSDRNMSLKLEAFYPTGFDEELIKSLHWGNDRKHVFLVIVKVNPTTHEGDVGLVIFPKYLLSPYHFKAEHRAPFPAGRFGFLSHPVTPDVSFFDSSFAPYLTTQHLVAFTTFPPNPLVWHLERAETAATAERPFGVSLLPARPTVPKNTILEHKAHFATWDALARHTFFSAEAIITNSTLRIHVPLFGSVWPIRYWATGSVLLTSDSGRVEVNIGVGFMSSLISLSSGLPIELIVVPHTVKLNAVTSDTTWFQLNPPGPDPGPSYRVYLLGRGLDMNFSKHATVDICAYPEESLDYRYHLSMAHTEALRMTTKADQHDINEESYYHIAARIATSIFALSEMGRTTEYFLLDEIVDVQYQLKFLNYILMRIGAGAHPNTISGTSDLIFADPSQLHDELSLLFGQVKPANVDYFISYDEARDQLKTAYALSRGQDHVNALSLARRVIMSIYKGLLVKQNLNATERQALFFASMILLNFREGLENSSRVLDGRTTLLLMTSMCTAAHATQAALNIQEGLAYLNPSKHMFTIPNVYSPCMGSLRTDLTEEIHVMNLLSAIPTRPGLNEVLHTQLDESEIFDAAFKTMMIFTTWTAKDLHILHTHVPEVFTCQDAAARNGEYVLILPAVQGHSYVITRNKPQRGLVYSLADVDVYNPISVVYLSKDTCVSEHGVIETVALPHPDNLKECLYCGSVFLRYLTTGAIMDIIIIDSKDTERQLAAMGNSTIPPFNPDMHGDDSKAVLLFPNGTVVTLLGFERRQAIRMSGQYLGASLGGAFLAVVGFGIIGWMLCGNSRLREYNKIPLT(SEQ ID NO:33)
VZV gL
MASHKWLLQMIVFLKTITIAYCLHLQDDTPLFFGAKPLSDVSLIITEPCVSSVYEAWDYAAPPVSNLSEALSGIVVKTKCPVPEVILWFKDKQMAYWTNPYVTLKGLTQSVGEEHKSGDIRDALLDALSGVWVDSTPSSTNIPENGCVWGADRLFQRVCQ(SEQ ID NO:34)
VZV gI
MFLIQCLISAVIFYIQVTNALIFKGDHVSLQVNSSLTSILIPMQNDNYTEIKGQLVFIGEQLPTGTNYSGTLELLYADTVAFCFRSVQVIRYDGCPRIRTSAFISCRYKHSWHYGNSTDRISTEPDAGVMLKITKPGINDAGVYVLLVRLDHSRSTDGFILGVNVYTAGSHHNIHGVIYTSPSLQNGYSTRALFQQARLCDLPATPKGSGTSLFQHMLDLRAGKSLEDNPWLHEDVVTTETKSVVKEGIENHVYPTDMSTLPEKSLNDPPENLLIIIPIVASVMILTAMVIVIVISVKRRRIKKHPIYRPNTKTRRGIQNATPESDVMLEAAIAQLATIREESPPHSVVNPFVK(SEQ IDNO:35)
VZV gE
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHS HVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRYAAWTGGLAAVVLLCLVIFLICTAKRMRVKAYRVDKSPYNQSMYYAGLPVDDFEDSESTDTEEEFGNAIGGSHGGSSYTVYIDKTR(SEQ ID NO:36)
A526载体:SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-2A-UL130-2Amod-UL131
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A556载体:SGP-gHsol6His-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131("6His"公开为SEQ ID NO:45)
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基于VEE的编码eGFP的复制子(SEQ ID NO:42)
  

                          nsP2

                          nsP3

                     nsP3

                         
     
VEE帽辅助物(SEQ ID NO:43)
    


 
 


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