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1、10申请公布号CN104144940A43申请公布日20141112CN104144940A21申请号201280028784822申请日20120418KCTC12178BP20120403C07K7/6420060171申请人明知大学工业和学术合作基金会地址韩国京畿道申请人伊利诺斯大学董事会72发明人金钟宇李常旭朴相珍徐胄源李仁爱尹泰美崔钟根李知彦金晋龙金英宇斯科特弗兰兹伯劳曺尚铉高薇吉多保利詹姆斯麦克阿尔潘约瑟纳波利塔诺波吉特杰希布伦特弗里森玛利亚弗洛伦西亚罗德里格斯布拉斯科大卫兰金74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人谢顺星刘成春54发明名称来自野野村菌的环肽、其。
2、制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物57摘要本发明涉及来自野野村菌MJM5123的新型抗TB环肽，一种生产该抗结核病肽的方法以及用于预防和治疗分支杆菌感染的包含该环肽的药物组合物。本发明的组合物对复制/非复制结核分支杆菌包括MDR和XDR菌株有很高的活性，因此其能有效地用作结核病的治疗剂。85PCT国际申请进入国家阶段日2013121186PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/0029332012041887PCT国际申请的公布数据WO2012/144790EN2012102683生物保藏信息51INTCL权利要求书3页说明书33页序列表1页PCT/RO/。
3、134表1页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书33页序列表1页PCT/RO/134表1页附图7页10申请公布号CN104144940ACN104144940A1/3页21从野野村菌MJM5123菌株（保藏号KCTC12178BP）分离的具有化学式1或化学式2的环肽化学式1H14化学式2H162用于预防或治疗分支杆菌MYCOBACTERIUMSPP相关疾病的药物组合物，包含作为活性成分的具有化学式1和/或化学式2的化合物，化学式1H14权利要求书CN104144940A2/3页3化学式2H163如权利要求2所述的药物组合物，其中所述分支杆菌相关疾病是结核。
4、病。4如权利要求3所述的药物组合物，其中所述结核病是MDR结核病或者XDR结核病。5如权利要求24中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含一种或多种抗分支杆菌剂。6如权利要求4所述的药物组合物，其中所述抗分支杆菌剂选自由以下各项组成的组一线口服抗结核病剂、可注射抗结核病剂、氟喹诺酮、二线口服抗结核病剂、其他抗TB剂和目前用于结核病临床试验中的化合物；其中，所述一线口服抗结核病剂选自由以下各项组成的组异烟肼、利福平、乙胺丁醇片和吡嗪酰胺；可注射抗TB剂选自由以下各项组成的组链霉素、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素；所述氟喹诺酮选自由以下各项组成的组环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星和莫西沙权利要。
5、求书CN104144940A3/3页4星；二线口服抗TB剂选自由以下各项组成的组利福布汀、丙硫异烟胺、乙硫异烟胺、环丝氨酸、PAS和胺苯硫脲；所述其他抗TB剂选自由以下各项组成的组利奈唑胺、氯苯吩嗪、阿莫西林/克拉维酸、克拉霉素和二氨基二苯砜的衍生物；以及目前用于结核病临床试验中的所述化合物选自由以下各项组成的组贝达喹啉BEDAQUILINE、PA824、DALAMANID、SQ109、SUTEZOLID、利福喷汀和临床前研发的化合物，具体是AZD5847、BTZ043、TBA354、CPZEN45、SQ641、SQ609、DC159A、Q201、THPP、氯苯吩嗪的氯法齐明类似物和含硼LEU。
6、RS抑制剂。7如权利要求5或6所述的药物组合物，其中具有通式1或者2的所述化合物和至少一个另外的化合物适于同时、顺序或者单独施用。8一种制造权利要求1所述的化学式1或者化学式2的抗TB环肽的方法，包括在好氧条件下，在含水培养基中培养野野村菌MJM5123菌株的产抗分支杆菌肽的微生物；以及从菌丝中分离权利要求1所述的抗TB环肽。9如权利要求8所述的方法，其中分离抗结核病环肽的步骤包括使用甲醇和氯仿作为洗脱液对野野村菌MJM5123菌丝的甲醇提取物进行真空液相色谱VLC；使用甲醇作为洗脱液进行SEPHADEXLH20开口柱色谱法；以及使用HEMWAT2作为溶剂进行高速逆流色谱HSCCC。10如权利。
7、要求8所述的方法，其中分离抗结核病环肽的步骤包括用甲醇作为溶剂提取野野村菌MJM5123菌丝；加水直至甲醇的30，以制得含水甲醇；用己烷对甲醇提取物进行脱脂；分离水层，并且调节至65含水甲醇；用氯仿提取所述水层；浓缩，并且用甲醇溶解氯仿提取物；使用甲醇作为洗脱液进行SEPHADEXLH20开口柱色谱法；以及进行高效液相色谱（HPLC），其配置了填有反相凝胶（RP18）的柱。权利要求书CN104144940A1/33页5来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物技术领域0001本申请要求于2011年4月18日提交的申请号为US61/476,473和2。
8、011年7月29日提交的申请号为US61/513,403和2011年11月3日提交的申请号为US61/555,257以及2012年3月7日提交的申请号为US61/607,934的美国临时专利申请的权益，其全部公开内容通过引用并入到本文中。0002本发明涉及新的抗分支杆菌肽，其对复制/非复制结核分支杆菌（MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS）和包括多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核病的耐药结核分支杆菌MTUBERCULOSIS在内的各种耐药结核分支杆菌菌株具有高活性。本发明还涉及一种培养野野村菌NONOMURAEASPMJM5123菌株以制备抗分支杆菌肽的发酵方法，以及生产。
9、抗分支杆菌肽的方法和用于预防和/或治疗结核病的含有本发明的抗分支杆菌肽的药物组合物。背景技术0003结核分支杆菌是一种大的复杂的引起人类和其他哺乳动物结核病（TB）病的细菌。TB是一种通过呼吸途径在人与人之间传播的高传染性疾病。0004在2009年，有940万新的TB病例，包括110万携带HIV的病例和30万MDRTBWHOACTIONSFORLIFETOWARDSAWORLDFREEOFTUBERCULOSISWORLDHEALTHORGANIZATIONGENEVA,SWITZERLAND,2006（世界卫生组织呼吁为生命的行动迈向无结核病世界）。MDRTB需要的治疗时间从6个月延长到至少。
10、2年。世界各地的MDR结核分支杆菌菌株中的广泛耐药TBXDRTB的流行率估计有66WHOACTIONSFORLIFETOWARDSAWORLDFREEOFTUBERCULOSISWORLDHEALTHORGANIZATIONGENEVA,SWITZERLAND,2006（世界卫生组织呼吁为生命的行动迈向无结核病世界）。0005尽管对该传染病已有深刻的认识，但MDRTB以及XDRTB的流行率继续增长WHOANTITUBERCULOSISDRUGRESISTANCEINTHEWORLDREPORT42008（世界卫生组织全球抗结核病药耐药性报道）。现有的化学疗法很难或者几乎不能医治快速出现的MDR。
11、和XDR结核病菌株。这些菌株对全球造成重大的健康威胁，特别是在发展中国家和HIV/AIDS流行率日渐增长的国家KOENIG,RDRUGRESISTANTTUBERCULOSISINSOUTHAFRICA,XDRTBANDHIVPROVEADEADLYCOMBINATIONSCIENCE2008,319,894897（耐药结核病）。0006感染有潜伏TB感染（LTBI）的大部分人能够遏制该杆菌引发症状，并且没有感染其他人的风险。除了明显的药物或疾病介导的免疫抑制以外，对于什么引发LTBI发展成活跃的TB疾病知之甚少，而一旦TB能避开免疫防护，则认为已发展成活跃的TB疾病。营养不良和/或有营养缺陷。
12、的孩子和成年人有更高的疾病进展风险。2008年，TB夺去了182万人的生命，其中50万发生在感染HIV的人中间，这成为感染HIV人群的主要死因WORLDHEALTHORGANIZATIONGLOBALTUBERCULOSISCONTROLASHORTUPDATETOTHE2009REPORTGENEVA,SWITZERLANDWORLDHEALTHORGANIZATION,2009（全球结核病控说明书CN104144940A2/33页6制）。0007因此，迫切需要研发新的抗TB药物，优选具有新的作用机制的抗TB药物。发明内容0008技术问题0009本发明的一个目的是，提供对复制/非复制结核分支。
13、杆菌和许多耐药结核分支杆菌具有活性的新型抗TB肽。0010本发明的另一个目的是，提供一种生产该抗结核病肽的方法和该抗TB肽在预防和/或治疗各种分支杆菌感染的药物组合物中的用途。技术方案0011为了实现以上目的，本发明提供了从野野村菌MJM5123菌株分离的环肽。在本发明的优选实施方案中，本发明的环肽具有以下化学式1或者化学式20012化学式1H1400130014化学式2H160015说明书CN104144940A3/33页70016此外，本发明提供了能有效预防和/或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物。在本发明的优选实施方案中，本发明的药物组合物包含用于治疗分支杆菌引起的感染且从野野村菌MJM5。
14、123菌株分离的新型抗TB环肽和药学上可接受的载体。发明人已于2012年4月3日将野野村菌MJM5123NONOMURAEASPMJM5123保藏在韩国生命工学研究院KRIBB韩国典型菌种保藏中心KCTC保藏号KCTC12178BP。0017在下文中，对本发明进行了详细阐述。0018本发明提供了从分支杆菌MYCOBACTERIUMSPP、优选野野村菌MJM5123菌株分离的环肽。在本发明的优选实施方案中，本发明的环肽具有化学式1或化学式2。优选地，本发明的环肽可以通过以下步骤从野野村菌MJM5123菌株分离出来0019放线菌新抗TB抗生素来源0020放线菌是已知用来生产各种次生代谢物的无所不在。
15、的土壤生物。几种用于治疗各种细菌感染的抗生素来源于放线菌，其包括链霉素、头孢菌素、四环素、红霉素、利福平和达托霉素。尽管现今用于治疗结核病的三种不同的药物（利福平、链霉素和环丝氨酸）是通过使用琼脂扩散试验从放线菌中发现的，但是最初并未使用结核分支杆菌进行这些筛选。这是由于TB的感染性和（在那时）时常致命的后果。因为我们现在知道结核分支杆菌特别容易受几种抗菌药物的影响，所以必须假设过去针对这种病原体直接筛选发酵液的失败导致许多潜在有用的化合物种类没有被发现。因此，我们通过对结核分支杆菌的强毒株进行直接筛选启动了这一TB药物研发计划。0021高通量筛选0022由结核病研究所ITR建立高通量筛选纯化。
16、合物或提取物的技术。南韩明知大学有用微生物提取物中心THEEXTRACTCOLLECTIONOFUSEFULMICROORGANISMS,ECUM保存7000份以上来自韩国、中国、尼泊尔、菲律宾、越南、南极洲和北极圈的放线菌分离物。在更合适的外来地点尝试分离稀有且新的种类。0023首先在3种不同的培养基即GSS（丰富培养基）、BENNETTS和GYC（基本培养基）中以20ML培养物发酵每一分离物，并且用微孔板ALAMAR蓝分析法MABA测定每一菌株的三份提取物并进一步划定优先级。说明书CN104144940A4/33页80024MJM5123的鉴定0025在筛选了韩国明知大学有用微生物提取物中。
17、心ECUM保存的65000份以上的提取物后，发现来自新放线菌种类即MJM5123的菌丝的甲醇提取物有强的抗TB活性。通过多相分类方法将菌株MJM5123鉴定为野野村菌NONOMURAEASP。0026生物测定指导的分离0027选择菌株MJM5123来进行基于用真空液相色谱VLC进行的初始分级的生物测定指导的分离步骤，之后通过数个高速逆流色谱分析CCC步骤进行定向纯化。0028用于天然产品生物活性原理的生物测定指导的研究需要能够有效地解析复杂混合物的制备分析技术HOSTETTMANN,KMARSTON,ATHESEARCHFORNEWDRUGSFROMHIGHERPLANTSCHIMIA2007。
18、,61,322326HOSTETTMANN,K（对来自高等植物的新药的研究）；MARSTON,APLANTSASASTILLUNEXPLOITEDSOURCEOFNEWDRUGSNATPRODCOM2008,3,13071315HOSTETTMANN,K（作为新药的还未开发的来源的植物）；MARSTON,AWOLFENDER,JLSTRATEGYINTHESEARCHFORNEWLEADCOMPOUNDSANDDRUGSFROMPLANTSCHIMIA2005,59,291294（对来自植物的新先导化合物和药的研究中的战略）。本领域目前的标准方法是利用固体静止相的各种形式的固液色谱分析法，如柱。
19、层析法/快速柱层析法CC、真空液相色谱VLC和高效液相色谱HPLC。然而，存在数种与固体静止相（吸附剂）的使用有关的缺点，这极大地限制了在生物测定指导的分级情况下它们的功能不可逆吸附是公认的这些限制中的其中一种LINDBLOM,TIRREVERSIBLEABSORPTIONOFDIPHENYLAMINEONTOASTRAIGHTPHASEANDAREVERSEPHASEHPLCCOLUMNSYMPOSIUMONCHEMICALPROBLEMSCONNECTEDWITHTHESTABILITYOFEXPLOSIVES,PROCEEDINGS1993,9TH,205213（二苯胺映射到正相和反相H。
20、PLC柱上的不可逆吸附）；KUBO,IRECENTAPPLICATIONSOFCOUNTERCURRENTCHROMATOGRAPHYTOTHEISOLATIONOFBIOACTIVENATURALPRODUCTSJCHROM1991,538,187191（逆流色谱层析生物活性天然产物的新应用）；SADEK,PCCARR,PWBOWERS,LDHADDAD,LCARADIOCHEMICALSTUDYOFIRREVERSIBLEADSORPTIONOFPROTEINSONREVERSEDPHASECHROMATOGRAPHICPACKINGMATERIALSANALBIOCHEM1986,153。
21、,359371（对反相色谱填充材料上蛋白的不可逆吸附的放射性研究）。相应地，LC方法经常与材料的损失（有限回收）有关，并且更重要地是，与沿分级途径的生物活性的衰减有关。这些限制在逆流色谱层析CCC中不存在，因为作为液液技术，其完全依靠两种不能混合的溶剂之间的样品分开来实现分离，这允许样品材料的完全回收，并且因此具有评价复杂天然产物混合物的协同效应的潜力。而且，它是一种对特定化合物种类定向分离的理想方法。因此，我们的分离步骤主要基于CCC。0029为了生产用于纯化合物H14和H16这两种高抗TB活性环肽的分离、结构鉴定和生物分析足够的生物质，在ECUM在20L的发酵罐中对菌株MJM5123进行大。
22、量培养、收集并提取。0030生物活性成分的结构鉴定0031利用基于最高质量和最先进的1D/2DNMR和高分辨率MSHIGHRESOLUTIONMSBASED且通过肽的X射线晶体学放大的结构信息对H14和H16进行完整的结构鉴定。定量NMRQNMR用于对每个分离步骤同时进行选择性识别和定量分析。QNMR不仅是用于确说明书CN104144940A5/33页9定活性分离株的纯度和/或质量的最佳工具，还是用于分析具有生物活性但仍复杂的化合物混合物/级分的最佳工具。通过X射线晶体学确定H14的整体3D结构和它的氨基酸残基。0032发酵工艺的优化0033为了改进抗TB肽的生产率，研发了最佳发酵工艺和成本效。
23、益好的培养基。在34、搅拌速度600RPM和03VVM曝气条件下进行6天主发酵。最终的湿菌丝浓度PACKEDMYCELIUMVOLUME在PH为820时是80，并且总糖量少于18。该发酵工艺的H14的产量为373MG/L。0034此外，本发明提供了有效预防和/或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的化学式1和/或化学式2的化合物。在优选实施方案中，分支杆菌相关疾病是结核病。在本发明的另一个优选实施方案中，结核病可以是MDR结核病或者XDR结核病。0035本发明的药物组合物包含本发明的从野野村菌MJM5123菌株分离的新抗TB肽。优选地，本发明的药物组合物可以进一步包含药。
24、学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。0036在本发明的一个实施方案中，本发明的环肽可以作为结核病治疗剂单独治疗，或者可以与一种或至少两种其它抗分支杆菌剂的混合组合物结合治疗。在本发明的优选实施方案中，该抗分支杆菌剂可以是一线口服抗结核病剂，例如异烟肼、利福平、乙胺丁醇片和吡嗪酰胺；可注射抗TB剂，如链霉素、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素；氟喹诺酮如环丙沙星、氧氟沙星和莫西沙星；二线口服抗TB剂，如利福布汀、丙硫异烟胺、乙硫异烟胺、环丝氨酸、PAS和胺苯硫脲；其它抗TB剂，如利奈唑胺、氯苯吩嗪CLOFAZIMINE、阿莫西林/克拉维酸和二氨基二苯砜的衍生物；以及目前用于结核病临床试验中的化合物，如贝。
25、达喹啉、PA824、DALAMANID（大冢制药）、SQ109、SUTEZOLID、利福喷汀和临床前研发的化合物，具体是AZD5847、BTZ043、TBA354、CPZEN45、SQ641、SQ609、DC159A、Q201、THPP、氯苯吩嗪的氯法齐明RIMINOPHENAZINE类似物和含硼LEURS抑制剂，但并不限于这些。0037本发明的抗TB环肽经配制就可以口服给药，例如粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、溶液剂、悬浮剂、乳剂和糖浆。载体、赋形剂和稀释剂的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维。
26、素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。0038用于口服的固体制剂是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊。通过与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或者乳糖、明胶等混合来制备这些固体制剂。除了这些简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等。0039用于口服的液体制剂是悬浮剂、溶液剂、乳剂和糖浆，且上述制剂可以含有除通常使用的简单稀释剂如水和液体石蜡外的多种赋形剂如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。0040本发明的新型抗TB肽经配制可以用于静脉内注射。对于静脉内IV使用，可以将本发明的水溶性形式的化合物溶解在任何常用的静脉注射液中，并且通过注入施用。
27、。静脉注射剂型可以包括载体、赋形剂或者稳定剂，其包括但不限于，钙、人血清白蛋白、柠檬酸盐、醋酸盐、氯化钙、碳酸盐以及其它盐。静脉注射液包括但不限于生理盐水或者林格氏溶液。本发明的抗TB肽还可以置于注射器、插管、导尿管和线中。说明书CN104144940A6/33页100041用于肠胃外给药的制剂可以是含水的或者无水的等渗无菌注射液或者悬浮剂的形式。这些注射液或者悬浮剂可以由具有一种或者多种提到的用在口服的剂型中的载体的无菌粉剂或者颗粒剂制得。本发明的新型抗TB肽可以溶解在聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲剂中。0042对于肌肉内、肠胃外或者静脉内制剂，可以将抗TB肽的。
28、无菌制剂或者该化合物的合适的可溶盐形式例如盐酸盐溶解在制药稀释剂如注射用水WFI、生理盐水或者5葡萄糖中施用。0043也可以制得该抗结核病肽的合适的不可溶形式，并且其作为水基或者药学上可接受的油基中的悬浮剂施用，例如，长链脂肪酸的酯如油酸乙酯。可以通过在生物可降解聚合物如聚乳酸聚乙交酯中形成该抗TB肽的微胶囊化基质来制得可注射的长效形式DEPOTFORM。根据药物与聚合物的比例和使用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放速度。生物可降解聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。还可以通过将药物裹入与体组织相容的微乳液中制得长效可注射剂型。0044为了应用于眼睛和耳朵，本发明的肽可以在疏水或亲水基质BASES中。
29、配制为膏剂、霜剂、洗剂、涂抹剂PAINTS或者粉剂。0045为了应用于直肠给药，本发明的肽可以以与常用的载体如可可油、蜡或者其它甘油酯混合的栓剂形式配制。0046本发明的抗TB肽还可以在吸入器如定量雾化吸入器和雾化器中使用。0047本发明还提供了一种制备本发明的化学式1或者化学式2的抗结核病环肽的方法。本发明的方法可以包括以下步骤在好氧条件AEROBICCONDITIONS下，在含水培养基中培养野野村菌MJM5123菌株的生产抗分支杆菌肽的微生物；并且从发酵的菌丝中分离本发明的抗结核病环肽。0048在本发明一个实施方案中，分离抗结核病环肽的步骤可以包括以下步骤使用甲醇和氯仿作为洗脱液对野野村菌。
30、MJM5123菌丝的甲醇提取物进行真空液相色谱分析VLC；使用甲醇作为洗脱液进行SEPHADEXLH20开口柱层析法；以及使用HEMWAT2作为溶剂进行高速逆流色谱法HSCCC。0049在本发明的另一个实施方案中，分离抗结核病环肽的步骤可以包括以下步骤用甲醇作为溶剂提取野野村菌MJM5123菌丝；加水直至达到30的甲醇提取物，以制得含水甲醇；用己烷对甲醇提取物进行脱脂；分离水层，并且调节至65含水甲醇；用氯仿提取该水层；浓缩，并且用甲醇解析氯仿提取物；使用甲醇作为洗脱液进行SEPHADEXLH20开口柱层析法；以及进行HPLC高效液相色谱，其配置了填有反相凝胶RP18的柱。0050发明的有益效。
31、果0051新型抗TB环肽对哺乳动物细胞有非常低的细胞毒性，对复制/非复制结核分支杆菌有强活性，该复制/非复制结核分支杆菌包括单耐药结核分支杆菌菌株、MDR和XDRTB，因此，它们可以有效地用作结核病的治疗剂。0052附图简要说明0053图L示出建立微生物提取物库的方法。0054图2示出本发明的肽的提取过程概观。0055图3示出于28、ISP3培养基上生长2周的野野村菌MJM5123的扫描电子显微照说明书CN104144940A107/33页11片。0056图4示出野野村菌MJM5123全细胞水解产物的分析结果。0057图5示出野野村菌MJM5123极性脂质检查。在板上喷钼磷酸以检测总脂质A，喷。
32、茚三酮以检测氨脂质B，喷钼蓝以检测磷脂质C，以及喷萘酚硫酸以检测糖脂D。0058图6示出系统发育分析，其以从NCBI数据库获得的16SRDNA序列为基础，用CLUSTALX对数据进行多重对比后构建THOMPSON,JDGIBSON,TJPLEWNIAK,FJEANMOUGIN,FHIGGINS,DGTHECLUSTAL_XWINDOWSINTERFACEFLEXIBLESTRATEGIESFORMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTAIDEDBYQUALITYANALYSISTOOLSNUCLEICACIDSRES1997,25,48764882（CLUSTALX视窗界面用于质量分。
33、析工具辅助的多重序列对比的柔性策略）。0059图7示出主发酵中抗TB化合物的生物质和活性的图表（DCW；干细胞重，PMV；湿菌丝浓度，活性；通过纸片扩散试验的对耻垢分支杆菌MYCOBACTERIUMSMEGMATISMC2155的生长抑制区域）。0060图8示出用慢蒸方法生长的H14晶体。最长尺寸大约是05MM。0061图9示出H14的3D结构。0062图10示出083分辨率下所选择的残基色氨酸W10、苯基丙氨酸F12、苏氨酸T5和异亮氨酸I3的电子密度图。0063图11示出本发明的环H14肽的结构布置。0064图12示出本发明的环H16肽的结构布置。0065图13示出图15和16的具体氨基酸。
34、残基。0066最佳实施方式0067目前本发明实际的且优选的实施方案在以下实施例中说明。0068然而，应该认识到，本领域技术人员根据本公开可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。0069实施例1用于高通量筛选的微生物提取物库的制备0070从具有独特的气候条件和生态的地区如高山区、热带区、极地区、沙漠、火山等中收集的土壤样品分离出大约7000份放线菌分离物，并且其已保藏在韩国明知大学的有用微生物提取物中心ECUM。从每一分离物制备9种不同种类的提取物，用于筛选抗TB候选物。首先，用30MLGSS、BENNETTS和GYC培养每一分离物。离心分离菌丝和培养液后，用甲醇提取该菌丝并分别用乙酸乙酯和水。
35、分开培养上清液。最后，通过真空蒸发器将来自三种培养基中培养的每一微生物分离物的9种有机含水提取物浓缩至干燥，并且于70保藏在冷藏器中（图1、图2和表1）0071表1用于放线菌的三种主要培养基0072GSS培养基可溶性淀粉10G葡萄糖20G说明书CN104144940A118/33页12大豆粉25G牛肉膏1G酵母膏4GNACL2GK2HPO4025GCACO32GDW1LPH72BENNETT氏培养基BENNETTSMEDIUM葡萄糖10G酵母膏1GBACTO蛋白胨2G牛肉膏1GDYC培养基糊精25G干酵母12GCSL20GNABR1GCOCL21GPH70DW1L0073实施例2大规模筛选00。
36、74ECUM的每一放射菌分离物首先在3种不同的培养基即GSS丰富培养基、BENNETTSANDGYC（基本培养基）中以20ML培养物发酵。用甲醇提取该菌丝，用乙酸乙酯萃取该培养上清液，随后用水萃取，每一分离物产生9种提取物。干燥100L等份试样ALIQUOTS，并将其从明知大学运到96孔板中的UIC，溶解在100LDMSO中，并按1100稀说明书CN104144940A129/33页13释为测试培养物。通过微孔板ALAMAR蓝试验MABA中的荧光读数确定，约63000份提取物的HTS产生对7H12培养基棕榈酸作为C源中结核分支杆菌具有90的抑制的349份提取物055。然后在ECUM重新发酵1升。
37、规模的90份原始采样，且该提取物随后在具有固相反相硅胶萃取的UIC中用20100MEOH水梯度进行分级，接着用100CHCL3进行分级，以使每份提取物产生6个级分。从以下方面对级分进行生物学分析1哺乳细胞毒性VERO细胞IC50；2对非复制结核分支杆菌LORA的活性；3对耐利福平RMP、异烟肼INH、链霉素SM、卡那霉素KM、卷曲霉素CAP、环丝氨酸CS、当然我们不仅仅发现这些放线菌衍生的抗生素或者莫西沙星MOX的结核分支杆菌菌株的活性；以及4对耻垢分支杆菌MSMEGMATIS、金黄色葡萄球菌SAUREUS、大肠杆菌ECOLI和白色念珠菌CALBICANS的活性。基于这些结果，对20种放射菌菌。
38、株划定用于进一步研究的优先级。0075实施例3MJM5123的鉴定0076形态和培养特征的确定0077从在韩国汉拿山收集的土壤样品中分离MJM5123。通过特征形态和细胞壁成分的化学分析鉴别菌株的属。为确定形态和培养特征，将该菌株在28于国际链霉菌计划（ISP）培养基SHIRLING,EBANDDGOTTLIEB,METHODSFORCHARACTERIZATIONOFSTREPTOMYCESSPECIESINTJSYSTEVOLMICROBIOL196616PT3313330（用于鉴定链霉菌属种类的方法）例如酵母膏麦芽膏琼脂（ISP2）、燕麦琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂（ISP4）和甘油。
39、天冬酰胺琼脂（ISP5）上生长2周。通过使用颜色调和手册JACOBSON,E,WCGRAUVILLE,ETAL,COLORHARMONYMANUAL1958CHICAGO,CONTAINERCORPORATIONOFAMERICA来确定菌落颜色。通过扫描电镜观察孢子和菌丝（HITACHI,S3500N,JAPAN）（图3）。0078表2MJM5123的培养特征00790080气生菌丝上的生长和孢子形成评级如下，好；，中等；，差；，不生长和无孢子形成。0081菌株在ISP2培养基上生长良好，而在其它培养基上显示生长中等。营养菌丝体和气生菌丝体的颜色是无扩散性色素的米黄色。白色孢子仅在燕麦培养基（。
40、ISP3）上形成，并说明书CN104144940A1310/33页14且扫描电子显微镜显示气生菌丝上不规则的孢子的螺旋链。0082使用蛋白胨酵母膏铁琼脂（ISP6）和酪氨酸琼脂（ISP7，含或者不含酪氨酸）来测试黑色素。确定ISP3培养基上用于生长的温度范围、NACL耐受性和PH范围，以及28在ISP2培养基上进行2周抗生素抗性测试。0083表3野野村菌MJM5123的生理特征00840085特征评级如下，好；，一般；，差0086MJM5123吸收作为营养来源的酪氨酸但不产生黑色素，并且该菌株能在说明书CN104144940A1411/33页15PH5090以及030NACL下生长，并且在20。
41、37表现良好的生长。MJM5123对阿泊拉霉素、卡那霉素、万古霉素和硫链丝菌素敏感，但对氨苄青霉素有抗性。0087表4存在抗生素50G/ML时的生长00880089特征评级如下，有；，无0090使用ISP9琼脂培养基作为基础培养基来检验作为唯一碳源的碳水化合物的利用。通过过滤对碳水化合物的原液10W/VSIGMAALDRICH,CAR10灭菌，并以10的最终浓度将其加入到高压蒸汽处理的ISP9培养基中。MJM5123利用了己糖、戊糖、醇糖ALCOHOLSUGARS和二糖（表5）。0091表5碳水化合物的利用0092利用MJM5123葡萄糖阿拉伯糖蔗糖木糖肌糖甘露醇果糖鼠李糖棉子糖0093特征评。
42、级如下（），好；（），一般；（），差0094化学分类学特征的确定0095为了对细胞壁成分进行化学分类表征，通过于28在旋转振动器上在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中生长7天来制得冻干的菌丝。通过TLC确定二氨基庚二酸（DAP）和甘说明书CN104144940A1512/33页16氨酸的立体异构体BECKER,BLECHEVALIER,MPGORDON,RELECHEVALIER,HARAPIDDIFFERENTIATIONBETWEENNOCARDIAANDSTREPTOMYCESBYPAPERCHROMATOGRAPHYOFWHOLECELLHYDROLYSATESAPPLMICROBIOL19。
43、64,12,421423（通过全细胞水解物的纸色谱分析快速区分诺卡氏菌和链霉菌）。将5MG干细胞和1ML6N盐酸一起密封在小安瓿中。将该安瓿在烘箱中于100储存过夜。用WHATMAN1号滤纸过滤该空气冷却的水解物。将过滤液浓缩至干，并溶解在03ML蒸馏水中。将2L该溶液点在TLC板上（MERCK，TLC纤维素F玻璃板编号105718），并用溶剂体系甲醇蒸馏水6NHCL吡啶8026410，VOL/VOL展开（DEVELOP）4小时。风干后，喷02茚三酮溶液（丙酮中），并且在100加热3分钟以显示这些斑点。用1L01MD,LDAPSIGMAALDRICH，编号D1377和1L01M甘氨酸SIGMA。
44、ALDRICH，编号50046作为正品标准。甘氨酸和D,LDAP斑点显示为灰绿色。0096用稍微改进的LECHEVALIER方法进行糖类分析。在密封的安瓿中，用20ML1N硫酸煮50MG干细胞2小时。将冷却的水解物转移到50ML尖底离心管中，用饱和氢氧化钡将PH调节到54。离心后，将上清液浓缩至03ML，并通过离心除去未溶解颗粒。在TLC板上加载1L该溶液MERCK，TLC纤维素F玻璃板编号105718。用溶剂体系正丁醇蒸馏水吡啶甲苯10661，VOL/VOL涂敷浓度为1的包含木糖、阿拉伯糖和半乳糖的第一糖类SIGMAALDRICH，CAR10标准和包含鼠李糖、核糖、甘露糖和葡萄糖的第二糖类标。
45、准的每一种4小时。喷涂邻苯二甲酸苯胺盐溶液（325G苯胺邻苯二甲酸氢盐TCIGR，编号P0284，溶于100ML水饱和丁醇中）后，在100将该TLC板加热4分钟。甘氨酸和D,LDAP是MJM5123肽聚糖的成分，并且全细胞水解物中的主要糖类是木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖（图4）。0097用MINNIKIN等的方法MINNIKIN,DEODONNELLA,AGGOODFELLOWB,MALDERSONB,GATHALYEB,MSCHAALA,APARLETT,JHANINTEGRATEDPROCEDUREFORTHEEXTRACTIONOFBACTERIALISOPRENOIDQUINONESA。
46、NDPOLARLIPIDSJMICROBIOLMETHODS1984,2,233241（用于提取细菌类异戊二烯醌类和极性脂质类的完整步骤）提取极性脂质和甲基萘醌。将2ML甲醇蒸馏水10010，VOL/VOL和2ML石油醚加入50MG干细胞中，并混合15分钟。将上层转移到新的小瓶中。将1ML石油醚加入下层中并混合。在氮气条件下于室温蒸发合并的上层，并且残余物用于分析甲基萘醌。从下层提取极性脂质。在沸水浴中将该下层加热5分钟。在37冷却后，加入23ML氯仿甲醇水9010030，VOL/VOL溶液，并混合60分钟。离心后，将上清液转移至新的试管中。通过与075ML氯仿甲醇水5010040，VOL/V。
47、OL溶液混合5分钟提取该下层，并且将分离的上清液与上述试管中的溶液混合。再重复一次该步骤。将收集的上清液与13ML氯仿和13ML03氯化钠溶液充分混合。在离心分离后，弃去上层，并在氮气下于室温干燥下层。将极性脂质提取物溶解在60L氯仿甲醇21，VOL/VOL中，并且在TLC板上点10L该溶液（MERCK，TLC硅胶60F254玻璃板编号105729），并使用氯仿甲醇蒸馏水65254，VOL/VOL和氯仿乙酸甲醇蒸馏水407562，VOL/VOL作为展开溶剂通过二维TCL方法鉴定。通过喷四种试剂，5乙醇中磷钼酸溶液SIGMAALDRICH，P4869、02水饱和正丁醇中茚三酮溶液SIGMAALD。
48、RICH，N4876、萘酚硫酸和钼蓝SIGMAALDRICH，M1942来显示极性脂质。0098极性脂质分析揭示，MJM5123的极性脂质由磷脂酰乙醇胺PE、双磷脂酰甘油说明书CN104144940A1613/33页17DPG、磷脂酰单甲基乙醇胺PME、磷脂酰肌醇甘露糖苷PIM、未知磷脂PL和未知极性脂质L构成（图5）。0099用与气相色谱组合的微生物鉴定系统MIDI，45版分析细胞脂肪酸，并用ACTIN6数据库鉴定。主要细胞脂肪酸是异C160；还检测了各种其它脂肪酸（表6）。0100表6MJM5123的脂肪酸组成0101脂肪酸MJM5123160ISO255171CIS91051500101。
49、160096150ISO93161CIS94317010甲基39170030160ISO2OH29161ISOG26140024140ISO2216010甲基16170ANTEISO16170ISO14150ANTEISO120102数值是总细胞脂肪酸的百分比。未示出少于10的微量。0103进化分析0104用引物对27F5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，SEQIDNO1和1492R5GGTTACCTTGTTACGACTT3,SEQIDNO2从MJM5123基因组DNA扩增16SRDNA。使用如上相同的引物对在ABI3730XL毛细管DNA测序仪（应用系统公司APPLIEDBIOSYSTEMS，美国）上对扩增的DNA测序。用HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/提供的NCBIBLAST进行16SRDNA说明书CN104144940A1714/33页18的计算机辅助比较。0105使用MEGA40软件通过邻接法构建系统树。通过1000次引导复制生成系统树的分支支持。0106根据BLAST研究，16SRDNA序列显示出与红色野野村菌NONOMURAEARUBRADSM43768T和玫瑰色野野村菌NONOMURAEAROSEOLADSM43767T有98的相似性，以及与迪氏野野村菌NONOMURAEADIE。