HALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用.pdf

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体通过水动力转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达，从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景。

1.  hALR微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成药物中的应用，所述hALR微环真核表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.  根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述降低肝脏胶原蛋白合成药物能治疗肝纤维化或肝硬化。

3.  根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为：
S1.扩增得到人肝再生增强因子基因表达序列；
S2.将人肝再生增强因子基因表达序列通过酶切连接技术转入质粒ZY781中；得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒；
S3.将携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中得重组工程菌，优化重组工程菌发酵及诱导条件，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子微环真核表达载体；
S4.将人肝再生增强因子微环真核表达载体通过水动力转染方法，靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内。

4.  根据权利要求3所述应用，其特征在于，S3所述重组工程菌的优化发酵及诱导条件为：将重组工程菌种子液按照0.1～0.3%的接种量接种到含 50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中， 37℃， 250 rpm/min，培养15～18h；然后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32℃，250 rpm/min 培养6h；所述诱导液为含有3% （v/v）1N NaOH和0.3%（v/v）20% L-Arabinose的 LB液体培养基。

5.  根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述重组工程菌种子液的制备方法为将重组工程菌接种到含 50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中，37℃， 250 rpm/min，培养15～18h得OD₆₀₀值为4～5的重组工程菌种子液。

hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用。
背景技术
肝纤维化、肝硬化等慢性肝病均存在以肝脏胶原蛋白合成为主的病理变化，所以，抑制肝脏胶原蛋白合成，成为治疗和预防肝纤维化、肝硬化等慢性肝病的有效方式。有大量文献表明肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）能减少肝脏纤维化时胶原蛋白的产生，因此，肝再生增强因子成为了基因治疗肝纤维化的靶标基因。现有技术中以肝再生增强因子为靶标来治疗肝纤维化的方法主要有以下几种：（1）通过外源物质增加动物体内肝再生增强因子基因的表达量，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤维化。如彭彦辉等发表的文献“中药方剂对肝纤维化大鼠肝脏ALR基因表达的影响”证明：其文献中记载的中药方剂可显著升高肝纤维化大鼠肝组织ALR mRNA表达，从而抑制肝纤维化。（2）借助常规表达载体将肝再生增强因子基因导入动物细胞，使肝再生增强因子基因在细胞内高表达，从而通过降低肝脏胶原蛋白合成来治疗肝纤维化。但是，通过常规表达载体来介导肝再生增强因子基因的效率很低，而且，常规载体在基因治疗中可能会引起严重的生物安全问题。如病毒载体中的病毒基因会整合到宿主基因组，病毒载体中的病毒基因编码蛋白具有免疫原性等；传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因未甲基化的CpG基因序列和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒是必须的，但在基因治疗中可能引起严重的生物安全问题。除此之外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播；隐藏在真核表达信号上游的抗性基因还会导致哺乳动物细胞中基因的表达发生改变；甚至细菌序列的存在也会导致目的基因的沉默。这些因素都严重影响基因治疗的效果。
微环DNA( minicircle DNA，MC)是1997年发展起来的除细菌序列和仅编码外源基因的小超螺旋高效载体。具有安全性能好，同时转染效率高、表达时间持久的优点。微环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成, 不含有来自细菌质粒的骨架结构，在生物安全性、转染效率、生物活性方面都优于传统质粒载体。相关文献报道，体内、外试验证明微环DNA载体的表达效率是亲本质粒载体的几十至几百倍。
目前，国内外尚无用微环载体来介导人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）基因的相关报道。因为，微环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的目的基因能否与宿主工程菌相兼容也是很难控制的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中利用肝再生增强因子进行基因治疗存在的缺陷，提供一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体及其构建方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种人肝再生增强因子基因微环真核表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明选取微环质粒ZY781作为表达载体，将人肝再生增强因子序列通过酶切连接技术连接到质粒ZY781中，得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒，将获得的携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子基因微环真核表达载体。
本发明之所以选择微环质粒ZY781作为表达载体是经过优化筛选的。现有技术微环质粒种类纷杂，微环质粒与宿主工程菌的匹配度是很难选择的，而且，微环质粒中携带的目的基因能否与宿主工程菌相兼容也是很难控制的。另外，本发明通过合理优化重组工程菌E.coli ZYCY10P3S2T的发酵条件，高效率制备得到高纯度的人肝再生增强因子基因微环真核表达载体。
 所述重组工程菌的优化发酵及诱导条件为：将重组工程菌种子液按照0.1～0.3%的接种量接种到含 50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中， 37℃， 250 rpm/min，培养15h；然后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32℃，250 rpm/min 培养6h；所述诱导液为含有3% （v/v）1N NaOH和0.3%（v/v）20% L-Arabinose的 LB液体培养基。
 所述重组工程菌种子液的制备方法为将重组工程菌接种到TB培养液中，37℃， 250 rpm/min，培养15～18h得OD600值为4～5的重组工程菌种子液。
本发明的有益效果是：
本发明通过研究发现，将人肝再生增强因子基因（hALR）微环真核表达载体通过水动力转染方法，可靶向性地将人肝再生增强因子基因导入肝细胞内，并使其在肝脏中有效表达，从而有效抑制降低肝脏胶原蛋白合成。因此，人肝再生增强因子基因微环真核表达载体在制备降低肝脏胶原蛋白合成的药物方面具有很大的应用前景，例如可以使用该载体制备出hALR蛋白作为药物使用，也可以用于基因治疗，即直接将基因打到动物体内进行基因治疗。
说明书附图
图1.pcDNA3.1(+)-hALR质粒图谱。
图2.ZY781空载体结构图。
图3. hALR基因表达序列图。
图4.hALR基因表达序列酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，1、Marker :DL5000bp；6、Marker :DL2000bp；2、3、4、5：hALR基因表达序列酶切样品。
图5.酶切、连接、转化技术将hALR微环亲本质粒导入工程菌过程图。
图6.ZY781-CMV-hALR 质粒图谱。
图7.转化结果酶切电泳鉴定图；Marker :DL15000bp；2、3、4、5：NdeI酶切结果；6、7、8：KpnI酶切结果9、Marker :DL2000bp。
图8.hALR基因微环真核表达载体制备流程图。
    图9.hALR基因微环真核表达载体电泳鉴定图；1: Marker DL15000bp；2:亲本质粒KpnI酶切结果；3、5: 微环KpnI、EcoRI酶切结果; 4、6:对照pcDNA3.1(+)-hALR载体KpnI、EcoRI酶切结果：9:Marker DL5000bp。
图10.hALR基因微环真核表达载体结构图。
图11.采用新老制备条件制备出的hALR微环真核表达载体纯度比较；左图：文献制备条件制备的hALR微环质粒；右图：新制备条件制备的hALR微环真核表达载体；左图：1、2：maker；3：亲本质粒KpnI酶切结果；4、5：hALR微环真核表达载体KpnI酶切结果；右图：1、2、7：maker；3：亲本质粒KpnI酶切结果；4、5、6：hALR微环真核表达载体KpnI酶切结果。
图12.大鼠肝脏外观裸视观察结果。
图13.大鼠肝功能指标。
图14.各组肝脏病理切片HE染色图
图15.各组肝脏切片胶原染色图。
图16.各组肝组织胶原蛋白I mRNA检测。
图17. pMC-CMV-hALR和pcDNA3.1(+)-hALR在体内表达比较图；1.健康对照组；2.为生理盐水对照组；3.模型对照组；4、5. pcDNA3.1(+)-hALR治疗组48小时和7天ALR表达情况；6、7：pMC-CMV-hALR治疗组48小时和7天ALR表达情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
pcDNA3.1(+)-hALR质粒（6013bp）是由解放军458医院全军肝病中心构建并保藏，其结构图如图1所示；E.coli ZYCY10P3S2T和ZY781空载体由斯坦福大学陈志英教授惠赠，ZY781空载体结构图如图2所示。
实施例1
S1.人肝再生增强因子基因序列的获得：以解放军458医院全军肝病中心构建并保藏pcDNA3.1(+)-hALR质粒（质粒序列如SEQ ID NO：2所示）为模版，设计扩增人肝再生增强因子基因序列的正向和反向引物：
正向引物F：5’-GACTGAAGATCTATGTACGGGCCAGATATA-3’
反向引物 R：5’-ATACCGCTCGAGGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3’
PCR反应体系及反应程序如下：
                                                 
PCR反应程序：（1）98℃反应10 s，62℃反应15 s，72℃反应30 s，共35个循环；（2）72℃反应10 min；（3）10℃ ∞。    
PCR反应结束后，回收、测序PCR产物，获得1671bp的CMV-hALR-BGHpolyA基因片段，CMV-hALR-BGHpolyA基因片段经BglII（NEB）和XhoI（NEB）双酶切获得CMV-hALR-BGHpolyA（1647bp），即hALR基因表达序列，hALR基因表达序列如SEQ ID NO：3所示，hALR基因表达序列结构图如图3所示，酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定如图4所示。
S2.将人肝再生增强因子基因序列通过酶切连接技术转入空白微环DNA亲本质粒中；得到携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒；将携带人肝再生增强因子的微环DNA亲本质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中得重组工程菌，重组菌构建图如图5所示；具体步骤为：
酶切所用酶：hALR基因表达序列用BglII（NEB）和XhoI（NEB）双酶切，ZY781空载体用BglII（NEB）和SalI（NEB）双酶切。
酶切反应体系及条件：反应物37℃，酶切过夜。酶切反应体系如下：

酶切产物纯化方法：切胶回收，采用胶回收试剂盒（TaKaRa, DV805A）纯化。酶切产物连接：采用连接试剂盒（NEB，M2200S），连接体系如下：

回收连接产物，得ZY781-CMV-hALR质粒，即 hALR基因亲本质粒；ZY781-CMV-hALR质粒的质粒图谱图如图6所示。
转化：采用氯化钙法制备E.coli ZYCY10P3S2T感受态细胞，将构建的ZY781-CMV-hALR质粒转入工程菌E.coli ZYCY10P3S2T中，通过亲本质粒携带的卡那霉素抗性筛选得到转化子E.coliZYCY-ZY781-CMV-hALR205。
转化子鉴定：提取质粒酶切电泳鉴定以及测序鉴定，电泳鉴定结果如图7。
S3.优化重组工程菌E.coliZYCY-ZY781-CMV-hALR205发酵及诱导条件，通过工程菌自身重组酶的作用下制备出高纯度的人肝再生增强因子微环真核表达载体。操作流程图如图8所示，具体步骤如下：将重组工程菌接种到含 50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中，37℃，250 rpm/min，培养15～18h得OD600值为4～5的重组工程菌种子液。将重组工程菌种子液按照0.1～0.3%的接种量接种到含 50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中， 37℃， 250 rpm/min，培养15h；然后向培养液中加入1.2倍体积的诱导液，32℃，250 rpm/min 培养6h；所述诱导液为含有3% （v/v）1N NaOH和0.3%（v/v）20% L-Arabinose的 LB液体培养基。发酵及诱导结束后离心回收发酵液，采用常规的去毒素质粒提取方法提取hALR基因微环真核表达载体。hALR基因微环真核表达载体经电泳鉴定得阳性hALR基因微环真核表达载体；电泳鉴定结果如图9所示。阳性hALR基因微环真核表达载体送公司测序，其序列如SEQ ID NO：1所示。hALR基因微环真核表达载体的结构图如图10所示。
实施例2重组工程菌E.coli ZYCY-ZY781-CMV-hALR205发酵条件优化过程
本研究发现：不同的诱导时间、加碱的量以及L-(+)-Arabinose 加入量都会影响hALR基因微环真核表达载体的产量和质量。而且hALR基因微环真核表达载体的产量和质量并不是仅仅靠改变一个因素就可以的，诱导时间、加碱的量以及L-(+)-Arabinose的加入量之间存在复杂的相互作用关系，尤其是L-(+)-Arabinose的加入量直接影响后续诱导时间的控制。
现有文献报道：包括微环质粒ZY781和工程菌E.coli ZYCY10P3S2T微环载体系统的发酵条件为：加入等体积的诱导液，诱导液为1体积的LB液体培养基中加入0.04体积的1N NaOH，0.02%L-Arabinose；诱导条件为32℃，5h，如果需要可适当延长1～3小时。本发明针对特定的目的基因hALR摸索出一套特定的发酵工艺条件，与文献方法相比，此制备工艺获得的hALR基因微环真核表达载体的纯度高于文献中方法，几乎没有亲本质粒及其他杂质粒的存在（图11）。图11中左图为文献方法制备出的hALR基因微环真核表达载体带有亲本质粒，右图为改进方法制备出的hALR基因微环真核表达载体很纯净，未见亲本质粒条带。
实施例3  hALR基因微环真核表达载体的应用
试验方法
模型建立及hALR转染：为了比较微环hALR表达载体和pcDNA3.1(+)-hALR质粒载体（pcDNA3.1(+)-hALR质粒载体的构建参照本技术领域常规方法）在降低肝脏胶原蛋白合成方面的效果，我们选择了CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，同时体内转染采用水动力转染方法。
CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的给药途径采用灌胃法，根据文献对CCl4灌胃方法进行了部分修改，CCl4灌胃前让大鼠自由饮用含35mg/dL苯巴比妥 (phenobarbital) 的饮用水两周。CCl4/花生油溶液浓度为0.08 ml CCl4/1 ml 花生油，灌胃起始剂量为412 mg CCl4/kg bw，每三天一次。
50只健康SD大鼠(120±10g)随机分成6组，Group I为健康对照组 (n=5)；Group II为生理盐水对照组 (n=5) ，尾静脉水动力方法注射生理盐水 (5%BW, 每一周一次)；Group III为模型对照组(n=10)，CCl4灌胃；Group IV为pcDNA3.1(+)-hALR质粒对照组 (n=10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pcDNA3.1(+)-hALR质粒(500μg/kg溶于5%BW生理盐水中， 每一周一次；GroupV为微环低剂量治疗组 (n=10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pMC-CMV-hALR质粒(200μg/kg溶于5%BW体积的生理盐水中，5～8秒通过尾静脉打入， 每隔一周一次)；GroupVI为微环高剂量治疗组 (n=10)，CCl4灌胃，尾静脉水动力方法注射pMC-CMV-hALR质粒(200μg/kg溶于5%BW体积的生理盐水中， 5～8秒通过尾静脉打入，每周一次)。
 所述水动力转染技术是一种快速方便高效的外源基因转染方法，是指通过鼠尾静脉快速注射大体积含有目的基因的生理盐水，从而实现外源目的基因在鼠体内的高效表达，尤其是很好的在肝脏表达。参考文献：Zhang G，Budker V，Wolff JA. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked Plasmid DNA［J］. HumGene Ther，1999，10 (10) :1735－1737.
实验结果
    （1）大鼠肝脏裸眼观察：裸眼观察大鼠肝脏外观结构，结果见图12，图中显示正常组(I、II)大鼠肝脏外观色深，表面光滑如镜，柔软有韧性；肝硬化 (III) 大鼠肝脏表面呈现颗粒状、粗糙不平、质地坚硬、色浅、个别地方如砂石状，但是，pcDNA3.1(+)-hALR质粒 (IV)和pMC-CMV-hALR (V、VI )治疗明显减少肝脏这些非正常的表观(如图1)。而且pMC-CMV-hALR (V、VI ) 较pcDNA3.1(+)-hALR质粒 (IV)效果明显，pMC-CMV-hALR 高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR 低剂量组（V) 肝脏外观更光滑平整。
（2）大鼠肝功能指标：大鼠的肝纤维化程度直接影响到肝脏的功能，肝功能检测结果（图13）显示，模型组（III）大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平均明显高于健康（I），差异显著(p<0.01)，hALR质粒治疗组（ IV、V和VI）较肝硬化造模组 (III)在血清AST和ALT水平均有显著性差异(P<0.01)，ALP水平也有一定程度的降低。与健康组大鼠相比较，造模组ALB水平均有显著性差异(P<0.01)，微环hALR治疗低剂量组和微环hALR高剂量治疗组大鼠较造模组的ALB水平也有所改善。从血清转氨酶指标看，ALR基因表达产物对大鼠肝脏功能具有良好的保护作用，从而降低了肝纤维化的发生。
（3）大鼠肝脏病理学变化：从各组肝脏病理切片HE染色图（图14）中可知：健康组（I）和生理盐水水动力对照组(II)的大鼠肝细胞索绕中央静脉呈放射状排列，未见病变；模型组(III)大鼠肝组织小叶内、小叶间有炎性细胞浸润，有脂肪空泡产生，肝纤维化明显，增生的胶原延伸至小叶间，并向邻近肝小叶延伸，包绕、分割肝组织形成网络状的纤维间隔，肝脏固有的小叶结构不清楚，胶原包绕形成假小叶；hALR质粒治疗组（ IV、V和VI）较肝硬化造模组 (III)均有明显改善，尤其是pMC-CMV-hALR治疗组 (V 、VI )结缔组织增生减少，纤维间隔变窄，部分纤维间隔断裂，炎性浸润程度明显减轻。 pMC-CMV-hALR 高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR 低剂量组（V)结果更为明显。
（4）胶原蛋白染色：从肝脏切片Sirius-red胶原染色图（图15）结果显示，健康组（I）和生理盐水水动力对照组(II)的大鼠肝小叶结构正常，中央静脉壁周围及肝窦周有少量胶原纤维着色；肝硬化模型组(III)肝组织中可见大量胶原沉积，胶原层层盘绕形成宽大纤维间隔并向肝组织穿插形成大小不等的假小叶；hALR质粒治疗组（ IV、V和VI）较肝硬化造模组 (III)肝纤维化程度显著减轻，胶原沉积的纤维间隔变窄，切片中部分纤维中断，尤其是pMC-CMV-hALR治疗组 (V 、VI )部分纤维间隔断裂，纤维脉络舒展开；pMC-CMV-hALR 高剂量组(VI)较pMC-CMV-hALR 低剂量组（V)纤维面积更为明显的减少。
（5）胶原蛋白I检测：经qRT-PCR检测胶原蛋白I mRNA表达得出如图16结果。大鼠的各组肝组织胶原蛋白I含量检测结果（图15）显示，模型组（III）大鼠胶原蛋白I（ColI） mRNA水平均明显高于健康（I），差异显著(p<0.01)，hALR质粒治疗组（ IV、V和VI）较肝硬化造模组 (III)在胶原蛋白I（ColI） mRNA水平上均有显著性差异(P<0.01)。与健康组大鼠相比较，微环hALR治疗低剂量组和微环hALR高剂量治疗组大鼠较造模组的有大幅度降低。证明了微环hALR基因治疗在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中有较好降低胶原蛋白合成的作用。
实施例4    
    本发明同时也使用其他载体以及其他制备方法来制备人肝再生增强因子微环真核表达载体，如用传统质粒pcDNA3.1(+)加载人肝再生增强因子，再用酶切连接的技术来产生环化人肝再生增强因子基因，即人肝再生增强因子微环载体。但是，通试验发现：此方法步骤多，成本高，成功率低，后续提取处理很复杂等不足。综上，我们采用本发明中提及的质粒ZY781和工程菌E.coli ZYCY10P3S2T来制备人肝再生增强因子微环真核表达载体，优化发酵和诱导微环产生工艺条件，最终一步得到人肝再生增强因子微环真核表达载体，减少步骤，免去提取过程，节省成本，且人肝再生增强因子微环真核表达载体在细胞以及动物实验中的转染和表达效果明显高于传统质粒，且持续表达时间长，见图17。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国人民解放军第四五八医院
<120>  hALR基因微环真核表达载体在降低肝脏胶原蛋白合成方面的应用
 <130> 
 <160>  5    
 <170>  PatentIn version 3.2
 <210>  1
<211>  1720
<212>  DNA
<213>  1hALR基因微环真核表达载体基因序列
 <400>  1
actagtgaat tcagatctat gtacgggcca gatatacgcg ttgacattga ttattgacta     60
 gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg    120
 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga    180
 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat    240
 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa    300
 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca    360
 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca    420
 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat    480
 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg    540
 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac    600
 ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc    660
 ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa    720
 gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattcatggc ggcgcccggc    780
 gagcggggcc gcttccacgg cgggaacctc ttcttcctgc cggggggcgc gcgctccgag    840
 atgatggacg acctggcgac cgacgcgcgg ggccggggcg cggggcggag agacgcggcc    900
 gcctcggcct cgacgccagc ccaggcgccg acctccgatt ctcctgtcgc cgaggacgcc    960
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 gctgaagacc taagaaaaag gttgtgcagg aaccacccag acacccgcac ccgggcatgc   1260
 
ttcacacagt ggctgtgcca cctgcacaat gaagtgaacc gcaagctggg caagcctgac   1320
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 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact   1500
 gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt   1560
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 gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccctcga cccatggggg   1680
 cccgccccaa ctggggtaac ctttgggctc cccgggcgcg                         1720
 
<210>  2
<211>  6013
<212>  DNA
<213>  2 pcDNA3.1(+)-hALR质粒
 <400>  2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     60
 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120
 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180
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 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600
 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660
 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720
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 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840
 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900
 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattcatg    960
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 tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac   1800
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