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阿罗肽、 及制备方法和其药物组合物与用途
    技术领域 本发明包括含疏水性芳烃结构片段的寡肽化合物的溶液法合成、 固相法合成 ； 及 这些化合物对钠 - 钙交换体转运的影响和在脑缺血性疾病中的治疗作用。上述作用在细胞 及动物整体水平上进行了观察， 如： 化合物对谷氨酸损伤大鼠原代神经元的保护作用、 对钙 紊乱损伤原代培养大鼠神经元的保护作用、 以及暂时性局部脑缺血再灌注大鼠的脑保护作 用等活性指标。
     背景技术 ① NCX 的研究进展及应用情况
     钠钙交换体 (Na+-Ca2+ exchanger， NCX) 是一种具有 9 次跨膜结构的双向转运蛋 + 2+ + 2+ 白， 以 3Na :1Ca 或者 4Na :1Ca 的方式转运细胞膜两侧的 Na+ 和 Ca2+， 具有生电特性。Na+ 运入细胞伴随 Ca2+ 运出细胞， 为正向转运 (Forward mode)， 产生内向 Na+-Ca2+ 交换电流 (INa/
     )； Na+ 运出细胞伴随 Ca2+ 运入细胞， 为反向转运 (Reverse mode)， 产生外向 Na+-Ca2+ 交换 电流 (INa/Ca)[1-3]。在生理条件下， NCX 的主要功能是在细胞膜去极化或者由配体偶联离子通 2+ 道所导致的细胞内 Ca 浓度升高的条件下， 通过其正向转运机制向细胞外转运 Ca2+[3]。NCX 有三种亚型 ： NCX1、 NCX2 和 NCX3[4]。在大脑中， NCX 的这三种亚型在生理和病理条件下有着 [5-7] 不同的表达模式 ， 脑缺血病理条件下的 NCX 作用方式也为研究者所关注。因而 Na+-Ca2+ 交换反向转运被认为是缺血 / 再灌引起严重不良后果的重要机制。国内外至今尚无特异性 阻断 Na+-Ca2+ 交换反向转运的药物。钠钙交换体功能测定方法的建立及相应的整体实验研 究， 为筛选和确定先导化合物， 研制开发作用于 Na+-Ca2+ 交换这一潜在的、 新型的药物作用 靶点的神经保护药物， 提供了重要的理论和实际意义。
     脑缺血类疾病 (Cerebral ischemia) 是目前在世界范围内造成成年人死亡和残 9] 疾的主要因素之一， 仅次于心脏病和癌症， 位于疾病致死率的第三位 [8， 。脑缺血类疾病最 普遍和为人们熟悉的形式是脑卒中 (Stroke)， 其发病率占脑缺血类疾病的 85％， 其特点除 高死亡率外， 幸存者通常因为偏瘫、 失语等中枢神经功能的丧失， 引起难以承受的经济和社 [10-13] 会负担 。在我国， 每年新发脑卒中患者约 200 万， 死亡约 150 万， 存活的卒中患者约 600-700 万， 存活者中近 75％致残，5 年内复发率高达 41％， 并且近年来脑卒中发病呈现年 [10] 轻化趋势 。脑卒中主要可以分为出血性卒中和缺血性卒中两大类， 其中， 缺血性卒中发 [10， 11] 病率超过各种卒中病人的 80％， 是脑卒中的最常见类型 。 + +
     在脑缺血神经元缺氧损伤早期， 由于初期 Na -K ATPase 活性受到抑制， 导致细胞 + [14， 15] + 内 Na 浓度迅速升高 ， 细胞内 Na 超载会导致细胞肿胀并引发神经元的快速坏死， 此时 + 通过 NCX 反向转运机制可以将 Na 转运出细胞。虽然这种早期的 NCX 反向转运会使细胞内 Ca2+ 浓度有所升高， 但 NCX 的这种反向转运作用可以通过降低细胞内 Na+ 浓度而发挥对神经 元急性坏死的保护作用 [1]。相反， 当细胞内 Ca2+ 积累到一定程度， 导致 Ca2+ 超载的神经元 缺氧损伤晚期， NCX 可以通过正向转运机制降低细胞内 Ca2+ 浓度， 从而保护由于细胞内 Ca2+ 超载造成的神经元损伤 [7]。Ca在脑缺血的核心区， NCX1、 NCX2 和 NCX3 的 mRNA 表达水平均呈下降趋势， 蛋白表达 [16] 水平与 mRNA 表达水平相似 。在脑缺血的半影区， NCX2 的 mRNA 表达水平下调而 NCX3 的 [7] mRNA 表达水平上调 。
     值得注意的是， NCX 的三种亚型对 ATP 表现出不同的敏感性。NCX1 和 NCX2 的活性 依赖于细胞内 ATP 水平 ； 而 NCX3 可以一种 ATP 非依赖的方式工作 [17]， NCX3 的这一特性为 其在脑缺血过程中发挥保护作用提供了条件。
     大脑中 NCX3 的分布与神经元对脑缺血损伤的敏感程度密切相关。NCX3 表达水平 较高的神经元在脑缺血损伤条件下存活的几率较高， 而那些不表达 NCX3 或者表达水平较 7] 低的神经元则容易在脑缺血的情况下受到较严重的损伤 [6， 。在近期应用 NCX3 基因敲除 小鼠的实验研究中发现 ： 与野生型小鼠的培养海马脑片相比， 在 NCX3 基因敲除小鼠的培养 海马脑片氧糖剥夺实验中， 海马 CA3、 CA1 和 DG 区域神经元对氧糖剥夺损伤的敏感性明显增 强。与野生型小鼠相比， 在 NCX3 基因敲除小鼠的大脑中动脉缺血再灌 (tMCAO) 实验中， 动 [18] 物的脑梗死体积显著增大 ， 提示高表达 NCX3 或应用 NCX3 激动剂可以降低脑缺血对神经 元的损伤。
     从目前的研究结果来看， NCX 在对由脑缺血所造成的神经元损伤保护方面发挥着 重要作用， NCX 可能成为脑缺血治疗的一个新的药物作用靶点。目前作用于 NCX 的药物研 究多集中于心肌 NCX 抑制剂， 尚无合成或从天然植物中分离出 NCX 激动剂的文献报道， 那么 对中枢神经系统发挥作用的 NCX 激动剂的筛选和合成就有着重要的实际意义。
     由于 Na+-Ca2+ 交换是双向转运， 该双向转运失衡是造成缺血再灌损伤的主要原因 + 2+ 之一， 因而建立 Na -Ca 交换双向转运的细胞模型对研制缺血损伤保护药物有重要意义。 我们借助微电极向细胞内透析 Na+ 的方法， 成功建立了 Na+-Ca2+ 交 换双向转运研究模型， 并用膜片钳方法稳定记录了这一电流， 该方法已发表于 JCardiovascular Pharmacology， [26， 27] 2002 。 我们用此方法及大鼠整体脑缺血模型， 对众多化合物进行筛选和评价， 发现本发 明化合物含疏水性芳香结构区及相邻的氢键缔合结构区的非内源性寡肽化合物对 Na+-Ca2+ 交换具有明显的作用。本发明的化合物是作用于钠 - 钙交换系统的新型化合物， 具有此骨 + + 架的新寡肽化合物 ( 阿罗肽化合物 ) 可选择性激活或阻断 Na 超载引起的 Na -Ca2+ 交换反 向转运并具有明显的保护大鼠急性脑缺血所致脑损伤的作用。据此， 确定以寡肽化合物为 + 2+ 母核， 研制特异性更强， 选择性更高的 Na -Ca 交换双向转运调节剂。
     本专利权利要求包括化合物 H45E， H65B， H67C， H45C， YJH05 和 YJH27 的化学结构， 制备方法， 对 NCX 的选择性作用及在细胞水平和整体动物水平抗急性脑缺血的作用。
     ②合成策略
     与本发明目标化合物相关的肽合成技术， 包括溶液法及固相法两种。它们均为成 熟的技术， 都采用带保护基的氨基酸为原料。 经缩合剂作用， 使两个反应物的羧基与氨基之 间脱除一分子水形成肽键。本发明目标化合物分子的 N 端 ( 即通式左侧 )X1 部分多为非氨 基酸构件， 他们均为疏水性芳烃结构。引入该类结构旨在增强对抗蛋白酶降解及通过血脑 屏障的能力， 并与相应的受体结合发挥活性。 发明内容
     ①阿罗肽化合物的结构设计本发明涉及了具有以下结构特征的寡肽化合物 1. 一类合成肽化合物， 其特征在于它们具有以下结构通式 ：其中 ：
     X1 ＝ 1- 羟基 -2- 萘甲酰 (1-Hna)， 3- 羟基 -2- 萘甲酰 (3-Hna)， 芴甲氧羰酰 (Fmoc)， α- 萘甲酰， β- 萘甲酰， α- 萘乙酰， β- 萘乙酰， 阿魏酰 (Fer)， 水杨酰 (Sal)， 对羟基苯 甲酰， 3， 5- 二羟基苯甲酰， 苯甲酰， 丹磺酰 (Dan)， 苯丙氨酰 (Phe)， 酪氨酰 (Tyr)， 组氨酰 (His)， 色氨酰 (Trp)， 芴甲氧羰酰苯丙氨酰， 芴甲氧羰酰酪氨酰， 芴甲氧羰酰组氨酰， 芴甲氧 羰酰色氨酰， 苄氧羰酰苯丙氨酰， 苄氧羰酰酪胺酰， 苄氧羰酰组胺酰， 苄氧羰酰色氨酰。 1 3 3
     R ＝ -CH2-CH2-NH-CH(NH2)-NH-R (R ＝ H、 NO2)， 咪唑基， -SH， -SCH2NHCOCH3(Acm)， CH2SCH3， -CONH2， -CH2CONH2
     X2 ＝下列 L 型及 D 型氨基酸残基， 包括 ： 脯氨酰、 甘氨酰、 丙氨酰、 缬氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸、 赖氨酸、 精氨酸、 天冬氨酸、 谷氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 丝氨酸、 色氨酸、 天冬酰 胺、 谷氨酰胺、 苏氨酸、 甲硫氨酸、 半胱氨酸、 组氨酸 ； 4- 哌啶甲酰 (4-Inp)， β-Ala， w- 氨基 己酰 (Aca)， γ- 氨基丁酰 (Abu)， N- 苯基哌嗪 2
     R ＝ OH， NH2， NHR(R ＝ C1 ～ C10 的烷基， 其中 Me ＝甲基， Et ＝乙基， Pr ＝丙基， Bu ＝丁基 )， 甘胺醇 (Gol)， 或缺失
     ②阿罗肽的合成路线
     本发明设计的目标化合物中， 有一部分是经固相合成方法制备的， 另一部分是采 用液相方式制备的。两种方式的合成路线有所不同， 分别如下所表示 ：
     (A) 固相方式合成阿罗肽的路线
     (B) 液相方式合成路线③阿罗肽的合成及纯化方法
     本发明实施例涉及的保护氨基酸原料为 ： Boc-β-Ala-OH( 叔丁氧羰酰 -β- 丙 氨 酸 )、 Boc-Aca-OH( 叔 丁 氧 羰 酰 -ω- 氨 基 己 酸 )、 Boc-Ala-OH( 叔 丁 氧 羰 酰 - 丙 氨 酸 )、 Boc-Pro-OH( 叔 丁 氧 羰 酰 - 脯 氨 酸 )、 Boc-Gln-OH( 叔 丁 氧 羰 酰 - 谷 氨 酰 胺 )、 Boc-His-OH( 叔丁氧羰酰 - 组氨酸 )、 Boc-Arg(NO2)-OH[ 叔丁氧羰酰 -(ω- 硝基 ) 精氨酸 ]、
     Fmoc-Arg(NO2)-OH[ 芴甲氧羰酰 -(ω- 硝基 ) 精氨酸 ]、 Boc-Tyr-OH( 叔丁氧羰酰 - 酪氨酸 )、 Fmoc-Tyr-OH( 芴甲氧羰酰 - 酪氨酸 )、 Boc-Trp-OH( 叔丁氧羰酰色氨酸 )、 Fmoc-Trp-OH( 芴 甲氧羰酰色氨酸 )。缩合剂分别为 ： Cl-HOBt(5- 氯代 -N- 羟基苯并三唑 )、 DIC( 二异丙基 碳二亚胺 )、 HBTU( 苯并三唑 -N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 )。其他试剂及溶剂 为： NMM(N- 甲基吗啉 )、 TFA( 三氟乙酸 )、 TESi( 三乙基硅 )、 TEA( 三乙胺 )、 EtOH( 乙醇 )、 Et2O( 乙醚 )、 DMF( 二甲基甲酰胺 )、 DCM( 二氯甲烷 )、 EtOAc( 乙酸乙酯 )、 THF( 四氢呋喃 )。
     (A) 固相合成阿罗肽通法
     一倍 mol 当量的氯甲基树脂 ( 取代当量为 1.0mmol/g 树脂， 粒度 100-200 目， 交联 2 度为 1 ％ ) 与 3 倍 mol 当量的 Boc-AA-OH(AA ＝权利要求中的 X )、 三倍 mol 当量的 K2CO3、 0.1 倍等量的 KI 混合于是量的 DMF 中 ( 以每克树脂用 10mLDMF 为宜 )。混悬液在 60℃左右 的热浴上摇动 24 小时。反应后将混悬液移至带抽滤砂板的肽反应管内。抽净液体后， 树脂 用温热 (60℃左右 ) 的 DMF 洗涤 5 次。再依次用下列溶剂洗滤树脂 ： 95％ EtOH×3、 DMF×3、 50％ EtOH/H2O×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2。充分抽干溶剂后取出树脂， 干燥至恒重， 根据 树脂增重测得此步反应产率。
     脱除 Boc 保护基 ： 以 50％ TFA/DCM 为试剂， 按照每克树脂 10mL 的比例加入树脂中 混合， 摇动 5 分钟后抽除酸液， 再加入相同体积的酸解试剂， 摇动 30 分钟。 再次抽干酸液后， 树脂经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 EtOH×2、 Et2O×2、 6％ TEA/EtOAc×2、 EtOH×2、 50％ EtOH/ H2O×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。
     羧基组分活化及缩合 ： 将 3 倍于树脂上氨基 mol 量的 N- 保护氨基酸或羧基组分、 缩合剂 (HBTU 或 DIC)、 Cl-HOBt 混溶于适量的 DMF 中， 再加入与羧基组分等当量的 NMM。混 匀放置 4-5 分钟后加入反应管与树脂混合摇动 6 小时。抽除清液后树脂用下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×3、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。
     氨解切除树脂 ： 将 20 倍以上过量于肽树脂的胺化合物 ( 权利要求中的 R2) 与甲 醇 -THF(1 ∶ 1) 混溶， 再与肽树脂在密封的反应管中混合， 室温放置 ( 中间摇动几次 )24 小 时。收集滤液， 残余树脂用温热的 EtOH 淋洗， 合并滤液于 50℃以下减压浓缩至干。残渣经 无水乙醚充分研磨成粉状沉淀， 即为粗产物。
     (B) 粗产物的高效液相纯化
     将粗产物溶于适量的纯净水得到 5mg/mL 左右溶液， 经 0.45 微米滤膜过滤后通过 半制备型反向高效液相色谱仪纯化， 色谱柱规格 21.2mm×250mm， 流动相 ： 甲醇 / 水 (0.1％ TFA)， 流速 ： 15mL/min， 按色谱峰收集相应馏分后旋转蒸发除去溶剂， 得到的残余物经无水 乙醚研磨后抽滤得到产物纯品。
     (C) 液相合成阿罗肽通法
     将 1 当量的 Boc-X2-OH、 1 当量 HBTU、 1 当量 Cl-HOBt 溶于适量 DMF 中得到 3mmol/ml 左右溶液， 冰水外浴中冷却后加入 1 当量 NMM 搅拌 5min 后加入 1 当量丙胺， 0℃反应 4h， 室 温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯 萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后 用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水 溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚研磨得到 Boc-X2-NHPr。 将此产物溶于 10 倍当量的 3mmol/mL 饱和盐酸乙酸乙酯溶液中， 冰水外浴搅拌反应 4 小时， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带两次， 得到脱 Boc 保护产物。将此产物加入摩尔比等当量的 Boc-Arg(NO2)-OH、 HBTU、 Cl-HOBt 并溶于适量 DMF 中得到 3mmol/ml 左右溶液， 冰水外浴下加入 2 倍当量的 NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结 束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相 先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 2 后过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚研磨得到 Boc-Arg(NO2)-X -NHPr。将此产物溶于 10 倍当 量的 3mmol/mL 饱和盐酸乙酸乙酯溶液中， 冰水外浴搅拌反应 4 小时， TLC 监测反应， 反应结 束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带两次， 得到脱 Boc 保护产物。将此产物加入摩尔比等当量 1 的 X 组分、 HBTU、 Cl-HOBt 并溶于适量 DMF 中得到 3mmol/ml 左右溶液， 冰水外浴下加入 2 倍 当量的 NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水 稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸 氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥后过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚 1 2 研磨得到 X -Arg(NO2)-X -NHPr。 附图说明 图 1、 化合物 H45E 对 BHK-NCX1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 6-10)。反向转运 (reverse mode)， *p ＜ 0.05vs control， **p ＜ 0.05vs 1μM， ***p # ## ### ＜ 0.05vs10μM ； 正向转运 (forward mode)， p ＜ 0.05vs control， p ＜ 0.05vs 1μM， p
     ＜ 0.05vs 10μM ； 结果以 mean±sem 表示。 #
     图 2、 化合物 H45E 对谷氨酸损伤原代培养神经元的保护作用 (n ＝ 5)。 p ＜ 0.05vs control， *p ＜ 0.05vs glutamate 500μM， 结果以 mean±sem 表示。
     图 3、 化合物 H45E 对钙紊乱损伤原代培养大鼠神经元的保护作用 (n ＝ 5)。#p ＜ 0.05vs control， *p ＜ 0.05vs Ca2+ paradox， 结果以 mean±sem 表示。
     图 4、 化合物 H45E 对 tMCAO SD 大鼠神经行为学评分的影响 (n ＝ 10)。 **p ＜ 0.01vs vehiclegroup， 结果以 mean±sem 表示。
     图 5、 化合物 H45E 对 tMCAO SD 大鼠脑梗死体积的影响 (n ＝ 10)。**p ＜ 0.01vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 6、 化合物 H45E 对 tMCAO Wistar 大鼠神经行为学评分的影响 (n ＝ 10)。**p ＜ 0.01vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 7、 化合物 H45E 对 tMCAO Wistar 大鼠脑梗死体积的影响 (n ＝ 10)。 *p ＜ 0.05vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 8、 化合物 H65B 对 BHK-NCX1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 8-9)。反向转运 (reverse mode)， *p ＜ 0.05vs control， **p ＜ 0.05vs 1μM， ***p # ## ### ＜ 0.05vs10μM ； 正向转运 (forward mode)， p ＜ 0.05vs control， p ＜ 0.05vs 1μM， p ＜ 0.05vs 10μM ； 结果以 mean±sem 表示。
     图 9、 化合物 H67C 对 BHK-NCX1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 6-10)。反向转运 (reverse mode)， *p ＜ 0.05vs control， **p ＜ 0.05vs 1μM， ***p # ## ＜ 0.05vs 10μM ； 正向转运 (forward mode)， p ＜ 0.05vs control， p ＜ 0.05vs 1μM， ### p ＜ 0.05vs10μM。结果以 mean±sem 表示。
     图 10、 化合物 H45C 对 BHK-NCX1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 6-9)。正向转运 forward mode， *p ＜ 0.05vs control， **p ＜ 0.05vs 1μM， ***p # ## ### ＜ 0.05vs10μM ； 反向转运 reverse mode， p ＜ 0.05vs control， p ＜ 0.05vs 1μM， p ＜ 0.05vs 10μM。结果以 mean±sem 表示。
     图 11、 化合物 YJH05 对 BHK-NCX1 和 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 3)。*p ＜ 0.05vs control， 反向转运 (reverse mode)， 正向转运 (forward mode)。结果以 mean±sem 表示。
     图 12、 化 合 物 YJH05 对 谷 氨 酸 损 伤 原 代 培 养 神 经 元 的 保 护 作 用 (n ＝ 7)。#p ＜ 0.05vsvehicle， **p ＜ 0.01vs glutamate 500μM， 结果以 mean±sem 表示。
     图 13、 化 合 物 YJH05 对 tMCAO SD 大 鼠 神 经 行 为 学 评 分 的 影 响 (n ＝ 10)。*p ＜ 0.05vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 14、 化合物 YJH05 对 tMCAO SD 大鼠脑梗死体积的影响 (n ＝ 10)。*p ＜ 0.05vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 15、 化合物 YJH27 对 BHK-NCX1、 BHK-NCX3 细胞钠钙交换体电流的影响 (n ＝ 2-3)。*p ＜ 0.05vs control， 反向转运 (reverse mode)， 正向转运 (forward mode)。结果 以 mean±sem 表示。
     图 16、 化 合 物 YJH27 对 谷 氨 酸 损 伤 原 代 培 养 神 经 元 的 保 护 作 用 (n ＝ 9)。#p ＜ 0.05vsvehicle， *p ＜ 0.05vs glutamate 500μM， 结果以 mean±sem 表示。
     图 17、 化 合 物 YJH27 对 tMCAO SD 大 鼠 神 经 行 为 学 评 分 的 影 响 (n ＝ 11)。*p ＜ 0.05vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。
     图 18、 化合物 YJH27 对 tMCAO SD 大鼠脑梗死体积的影响 (n ＝ 11)。*p ＜ 0.05vs vehicle group， 结果以 mean±sem 表示。 具体实施方式
     实施例 1
     化合物 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-NHMe(H45E) 的合成
     ① Boc-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 20g(20mmol)、 Boc-Pro-OH 12.9g(60mmol)、 K2CO38.28g(60mmol) 及 KI 0.2g(0.12mmol)， 共同混合于 300mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60℃旋转反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用下 列溶剂洗滤 ： 60℃ DMF(×3 次 )、 50％ EtOH( 乙醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60℃ 95％ EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。称 量得 Boc-Pro- 树脂 23g， 增重 3.5g( 理论 ΔW ＝ 3.57g)， 此步产率为 98％。
     ②脱 Boc 基， 中间体 H2N-Pro-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     将上述的 Boc-Pro- 树脂在可密封的反应管内与 230ml 50％ TFA/DCM( 三氟乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 230mL 50％ TFA/DCM， 再摇动 30 分钟。收集酸 解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干备用。
     ③二肽树脂 H2N-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     羧 基 组 分 的 活 化 ： 取 Boc-Arg(NO2)-OH 3.828g(12mmol)、 Cl-HOBt2.04g(12mmol)、 HBTU 4.552g(12mmol)，共 同 溶 于 20mL DMF 中，全 溶 解 后 加 入 NMM 1.43mL(12mmol)。 混合反应三分钟后与 4.4g(4mmol)H2N-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂混于肽反 应管中。 室温下摇动 3h， 滤除上清液。 树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。取树脂样品 1 ～ 2mg 于小试管内， 加入 Kaiser 试剂加热 106℃反应 5 分 钟， 树脂未见变蓝。表明 Pro 上的氨基已被酰化完全， 即 Boc-Arg(NO2)-OH 已完全缩合上。 经脱 Boc 基处理 ( 与步骤②相同， 但不以 TEA 中和 )， 得到二肽 HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-OCH2聚苯乙烯树脂中间体 5.16g。
     ④三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 1-Hna 2.556g(12mmol) 为羧基组分， 按照上述步骤③的缩合条件与处理， 得到 三肽 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂 5.72g， 增重法计算固相合成总收率 89.6％。
     ⑤取三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 2.96g， 与 10ml 甲 胺醇溶液 (30％ ) 及 5ml THF 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集 上清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基本 除净溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分。得到淡黄色的残渣， 经无水 Et2O 充分研碎， 过滤收集得到产物 H45E 的粉末 886mg( 理论重 0.998mg)， 总收率为 88.8％， ESI-MS 分析 500.2257(M+H)。 实施例 2
     化合物 1-Hna-Arg-Pro-NHMe·HCl(H45C) 的合成
     ①按实施例 1 中①～②的步骤制备 H2N-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体
     ②二肽树脂 H2N-Arg(HCl)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     羧 基 组 分 的 活 化 ： 取 Boc-Arg(HCl)-OH 3.726g(12mmol)、 Cl-HOBt 2.04g(12mmol)、 HBTU 4.552g(12mmol)，共 同 溶 于 20mL DMF 中，全 溶 解 后 加 入 NMM 1.43mL(12mmol)。混 合反应三分 钟后与 4.4g(4mmol)H2N-Pro-OCH2- 聚苯乙烯 树脂混于 肽反应管中。室温下摇动 3h， 滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。取树脂样品 1 ～ 2mg 于小试管内， 加入 Kaiser 试剂加热 106℃ 反应 5 分钟， 树脂未见变蓝。表明 Pro 上的氨基已被酰化完全， 即 Boc-Arg(NO2)-OH 已完全 缩合上。经脱 Boc 基处理 ( 与实施例 1 中步骤②相同， 但不以 TEA 中和 )， 得到二肽 HCl. H2N-Arg(HCl)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 4.95g。
     ③三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 1-Hna 2.556g(12mmol) 为羧基组分， 按照上述步骤③的缩合条件与处理， 得 到三肽 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂 5.655g， 增重法计算固相合成总收率 86.6％。
     ④取三肽树脂 1-Hna-Arg(HCl)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 2g， 与 10ml 甲胺 醇溶液 (30％ ) 及 5ml THF 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集上清 液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基本除净 溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除 微量水分。得到淡黄色的残渣， 经无 水 Et2O 充分研碎， 过滤收集得到产物 H45C 的粉末 591mg( 理论重 693mg)， 总收率为 85.2％， ESI-MS 分析 455.2411(M+H)。
     实施例 3
     化合物 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-NHMe(H67C) 的合成
     ① 按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 以 2.2g H2N-Pro-OCH2- 聚 苯 乙 烯 树 脂 合 成 HCl. H2N-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体。
     ②三肽树脂 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 3-Hna 1.128g(6mmol) 为羧基组分， 按照实施例 1 中步骤③的缩合条件处理， 得 到三肽 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树 2.85g， 增重法计算固相合成总收率 88.3％。
     ⑤取三肽树脂 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 2.96g， 与 10ml 甲 胺醇溶液 (30％ ) 及 5ml THF 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集 上清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基本 除净溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分。得到淡黄色的残渣， 经无水 Et2O 充分研碎， 过滤收集得到产物 H67C 的粉末 866mg( 理论重 0.998mg)， 总收率为 86.8％， ESI-MS 分析 500.2259(M+H)。
     实施例 4
     化合物 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-Gol(H61E) 的合成
     取实施例 1 中步骤④的三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间 体 2.96g， 与 3ml 的乙醇胺 (50mmol) 及 15ml 95％ EtOH 混合。室温摇动反应 50h， 收集滤 液。残余树脂经 95％ EtOH 混合。室温摇动反应 50h， 收集滤液。残余树脂经 95％ EtOH 洗 滤两次， 合并滤液。50℃下减压蒸除 EtOH， 得到粘稠的浅黄色残留液。加入 200ml 蒸馏水， 经 C-18 固相萃取， 以 HOAc-EtOH(1 ∶ 2， v/v) 洗脱， 洗脱液浓缩蒸干， 用 Et2O 研磨， 得粉状 产物 H61E 重 783mg( 理论 1.058mg)， 总收率 81.6％， ESI-MS 分析 530.2359(M+H)。
     实施例 5
     化合物 1-Hna-Arg(NO2)-(4-Inp)-NHMe(H73C) 的合成
     ① Boc-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 10g(10mmol)、 Boc-4-Inp-OH 6.87(30mmol)、 K2CO3 4.14g(30mmol) 及 KI 0.1g (0.06mmol)， 共同混合于 150mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60℃旋转反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用下 列溶剂洗滤 ： 60℃ DMF(×3 次 )、 50％ EtOH( 乙醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60℃ 95％ EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。称 量得 Boc-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂 11.87g， 增重 1.87g( 理论 ΔW ＝ 1.92g)， 此步产率为 97％。
     ②脱 Boc 基， 中间体 H2N-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     将上述的 Boc-4-Inp- 树脂在可密封的反应管内与 100ml 50％ TFA/DCM( 三氟乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 100mL 50％ TFA/DCM， 再摇动 30 分钟。收集酸 解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干备用。
     ③二肽树脂 H2N-Arg(NO2)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     羧基组分的活化 ： 取 Boc-Arg(NO2)-OH 0.957g(3mmol)、 Cl-HOBt 0.51g(3mmol)、 HBTU 1.138g(3mmol)， 共同溶于 10mL DMF 中， 全溶解后加入 NMM 0.36mL(3mmol)。混合反 应三分钟后与 1.12g(1mmol)H2N-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。室温下摇动3h， 滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。 取树脂样品 1 ～ 2mg 于小试管内， 加入 Kaiser 试剂加热 106℃反应 5 分钟， 树脂未见变蓝。 表明 4-Inp 上的氨基已被酰化完全， 即 Boc-Arg(NO2)-OH 已完全缩合上。经脱 Boc 基处理 ( 与步骤②相同， 但不以 TEA 中和 )， 得到二肽 H2N-Arg(NO2)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂中 间体。
     ④三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 1-Hna 0.564g(3mmol) 为羧基组分， 按照上述步骤③的缩合条件与处理， 得到 三肽 1-Hna-Arg(NO2)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂 1.49g， 增重法计算固相合成缩合总收率 86.0％。
     ⑤取上述三肽树脂 1-Hna-Arg(NO2)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体， 与 10ml 甲 胺醇溶液 (30％ ) 及 5ml THF 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集上 清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基本除净 溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分。得到淡黄色的残渣， 经无 水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 H73C 的粉末 422mg( 理论重 441mg)， 总收率为 82.3％， ESI-MS 分析 514.2413(M+H)。 实施例 6
     化合物 3-Hna-Arg-(4-Inp)-NHMe 盐酸盐 (H71A) 的合成
     ①二肽树脂 HCl.H2N-Arg-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     羧基组分的活化 ： 取 Boc-Arg(HCl)-OH 0.931g(3mmol)、 Cl-HOBt 0.51g(3mmol)、 HBTU 1.138g(3mmol)， 共同溶于 10mL DMF 中， 全溶解后加入 NMM 0.36mL(3mmol)。 混合反应 三分钟后与 1.12g(1mmol)H2N-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。 室温下摇动 3h， 滤除上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。经 脱 Boc 基处理 ( 与步骤②相同， 但不以 TEA 中和 )， 得到二肽 H2N-Arg(HCl)-4-Inp-OCH2- 聚 苯乙烯树脂中间体。
     ④三肽树脂 3-Hna-Arg(HCl)-Pro-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 3-Hna 0.564g(3mmol) 为羧基组分， 按照上述步骤③的缩合条件与处理， 得到 三肽 3-Hna-Arg(HCl)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂 1.43g， 增重法计算固相合成缩合总收率 84.6％。
     ⑤取上述三肽树脂 3-Hna-Arg(NO2)-4-Inp-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体， 按实施 例 4 中步骤⑤的方法甲胺解， 得到淡黄色的残渣， 经无水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 H71A 的粉末 409mg( 理论重 426mg)， 总收率为 81.2％， ESI-MS 分析 469.2561(M+H)。
     实施例 7
     化合物(H77B) 的制备① Boc-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 5g(5mmol)、 Boc-Arg(NO2)-OH 4.785g(15mmol)、 K2CO32.07g(15mmol) 及 KI0.05g(0.03mmol)， 共同混合 于 50mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60℃旋转反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用 下列溶剂洗滤 ： 60℃ DMF(×3 次 )、 50％ EtOH( 乙醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60℃ 95％EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。称 量得 Boc-Arg(NO2)-OCH2- 树脂 5.87g， 增重 0.87g( 理论 ΔW ＝ 1.412g)， 此步产率为 62％。
     ②脱 Boc 基， 中间体 H2N-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     将上述的 Boc-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂在可密封的反应管内与 50ml50 ％ TFA/DCM( 三氟乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 50mL 50％ TFA/DCM， 再摇 动 30 分钟。收集酸解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树 脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干备用。
     ③中间体 Dan-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     将 0.807g(3mmol) 丹磺酰氯完全溶解于 DCM 后加入 TEA0.83mL(6mmol)。混合与 1.8g(1mmol)HCl.H2N-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。室温下摇动 5h， 滤除 上清液。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。经脱 Boc 基处理 ( 与步骤②相同 )， 得到 Dan-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体。
     ⑤取 Dan-Arg(NO2)-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 2.17g， 1.62g 苯基哌嗪 (10mmol) 及 10ml MeOH-THF(1 ∶ 1， v/v) 溶液共混于可密闭的肽反好应管内。室温摇动反应 24h， 收 集上清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基 本除净溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分， 所得黄色液体加入 50ml 乙酸乙酯以 50ml 1N HCl 水溶液洗涤 3 次， 再以饱和 NaCl 水溶液洗涤 3 次后以 Na2SO4 干燥 3 小时， 过滤后将滤液旋转蒸发浓缩， 向残余物中加入无水乙醚研磨得到黄色的残渣， 经过滤收集得到产物 H77B 的粉末 399mg( 理论重 0.531mg)， 总收率为 67 ％， ESI-MS 分析 597.2611(M+H)。
     实施例 8
     化合物 Trp-Arg(NO2)-β-Ala-NHPr(113O) 的制备
     ① Boc-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 20g(20mmol)、 Boc-β-Ala-OH 11.34g(60mmol)、 K2CO38.28g(60mmol) 及 KI 0.2g(0.12mmol)， 共同混合于 300mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60℃旋转反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用下 列溶剂洗滤 ： 60℃ DMF(×3 次 )、 50％ EtOH( 乙醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60℃ 95％ EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。称 量得 Boc-β-Ala- 树脂 23g， 增重 3.0g( 理论 ΔW ＝ 3.05g)， 此步产率为 98％。
     ②脱 Boc 基， 中间体 H2N-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯的制备
     将上述的 Boc-β-Ala- 树脂在可密封的反应管内与 230ml 50 ％ TFA/DCM( 三氟 乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 230mL 50％ TFA/DCM， 再摇动 30 分钟。 收集酸解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95 ％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干备用。
     ③ 按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 以 4.6g H2N-β-Ala-OCH2- 聚 苯 乙 烯 树 脂 合 成 HCl. H2N-Arg(NO2)-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体 5.5g。
     ④三肽树脂 Trp-Arg(NO2)-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 Boc-Trp-OH 0.912g(3mmol) 为 羧 基 组 分，羧 基 组 分 的 活 化 ：取Boc-Trp-OH0.931g(3mmol)、 Cl-HOBt 0.51g(3mmol)、 HBTU 1.138g(3mmol)，共 同 溶 于 10mL DMF 中， 全溶解后加入 NMM 0.72mL(6mmol)。混合反应三分钟后与 1.44g(1mmol)HCl. H2N-Arg(NO2)-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂混于肽反应管中。室温下摇动 3h， 滤除上清液。 树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DMF×3、 EtOH×2、 DMF×3、 EtOH×5、 Et2O×2。经脱 Boc 基处理 ( 与步骤②相同 )， 得到三肽 H2N-Trp-Arg(NO2)-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体。
     ⑤取三肽树脂 H2N-Trp-Arg(NO2)-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 1.61g， 与 5ml 丙胺及 10ml MeOH-THF(1 ∶ 1， v/v) 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集上清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶 剂。基本除净溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分。得到淡黄色 的残渣， 经无水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 113O 的粉末 441mg( 理论重 0.496mg)， 总 收率为 89.1％， ESI-MS 分析 518.2825(M+H)。
     实施例 9
     化合物 3-Hna-Gln-β-Ala-NHPr(112R) 的制备
     ①中间体 HCl.H2N-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 Boc-Gln-OH 为 羧 基 组 分，按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 以 1.15g(1mmol) H2N-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂合成 HCl.H2N-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体。
     ②中间体 3-Hna-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 3-Hna 为 羧 基 组 分， 按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 与 上 述 HCl. H2N-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂缩合得到 3-Hna-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂树 脂中间体 1.337g。
     ③取三肽树脂 3-Hna-Gln-β-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体 1.33g， 与 5ml 丙胺 及 10ml MeOH-THF(1 ∶ 1， v/v) 溶液共混于可密闭的肽反应管内。室温摇动反应 24h， 收集 上清液。残余树脂再用 95％ EtOH 洗滤两次。合并滤液， 并于 50℃下减压蒸除溶剂。基本除 净溶剂后， 加入 5ml 甲苯及 10ml 95％ EtOH， 再减压蒸除微量水分。 得到淡黄色的残渣， 经无 水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 112R 的粉末 296mg( 理论重 327mg)， 总收率为 69.1％， ESI-MS 分析 429.2131(M+H)。
     实施例 10
     化合物 3-Hna-Gln-Aca-NHMe(112U) 的制备
     ① H2N-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 10g(10mmol)、 Boc-Aca-OH 6.9g(30mmol)、 K2CO34.14g(30mmol) 及 KI 0.1g(0.06mmol)， 共同混合于 150mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60 ℃旋转反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用下列 溶剂洗滤 ： 60 ℃ DMF(×3 次 )、 50 ％ EtOH( 乙 醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60 ℃ 95 ％ EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。将 上述的 Boc-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂在可密封的反应管内与 150ml 50 ％ TFA/DCM( 三氟 乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 150mL 50％ TFA/DCM， 再摇动 30 分钟。 收集酸解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95 ％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干称量得 Boc-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂 10.93g， 增重 0.93g( 理论 ΔW ＝ 0.945g)， 此步产率为 98％。②中间体 HCl.H2N-Gln-β-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 Boc-Gln-OH 为 羧 基 组 分，按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 以 1.12g(1mmol) H2N-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂合成 HCl.H2N-Gln-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体。
     ③中间体 3-Hna-Gln-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 3-Hna 为羧基组分， 按实施例 1 中③的步骤与上述 HCl.H2N-Gln-Aca-OCH2- 聚苯 乙烯树脂缩合得到 3-Hna-Gln-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体 1.35g。
     ④取上述三肽树脂 3-Hna-Gln-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体， 按实施例 4 中步 骤⑤的方法甲胺解， 得到淡黄色的残渣， 经无水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 112U 的 粉末 335mg( 理论重 442mg)， 总收率为 75.8％， ESI-MS 分析 443.2291(M+H)。
     实施例 11
     化合物 3-Hna-Gln-Ala-NHMe(H65B) 的制备
     ① H2N-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     称取氯甲基树脂 ( 取代度 1mmol/g， 交联度 1％， 粒度 100-200 目 ) 重 10g(10mmol)、 Boc-Ala-OH 5.67g(30mmol)、 K2CO34.14g(30mmol) 及 KI 0.1g(0.06mmol)， 共同混合于 150mL DMF(N， N- 二甲基甲酰胺 ) 中。经 60℃旋转 反应 24h 后， 滤除上清液。树脂依次用 下列溶剂洗滤 ： 60℃ DMF(×3 次 )、 50％ EtOH( 乙醇 )/H2O(×3 次 )、 DMF(×5 次 )、 60℃ 95％ EtOH(×5 次 )、 Et2O( 乙醚 ×2 次 ) 之后抽干。将树脂至于红外灯下， 50℃干燥至恒重。将 上述的 Boc-Aca-OCH2- 聚苯乙烯树脂在可密封的反应管内与 150ml 50 ％ TFA/DCM( 三氟 乙酸 / 二氯甲烷 ) 混摇 10 分钟， 抽除酸液， 再加入 150mL 50％ TFA/DCM， 再摇动 30 分钟。 收集酸解液 ( 用于下回的第一次脱 Boc 反应 )。树脂依次经下列溶剂洗滤 ： DCM×5、 95 ％ EtOH×3、 10％ TEA/EtOAc( 三乙胺 / 乙酸乙酯 )×2、 DMF×3、 EtOH×3、 Et2O×2、 抽干称量得 Boc-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂 10.51g， 增重 0.51g( 理论 ΔW ＝ 0.525g)， 此步产率为 97％。
     ②中间体 HCl.H2N-Gln-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 Boc-Gln-OH 为 羧 基 组 分，按 实 施 例 1 中 ③ 的 步 骤 以 1.083g(1mmol) H2N-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂合成 HCl.H2N-Gln-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体。
     ③中间体 3-Hna-Gln-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂的制备
     以 3-Hna 为羧基组分， 按实施例 1 中③的步骤与上述 HCl.H2N-Gln-Ala-OCH2- 聚苯 乙烯树脂缩合得到 3-Hna-Gln-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂树脂中间体 1.293g。
     ④取上述三肽树脂 3-Hna-Gln-Ala-OCH2- 聚苯乙烯树脂中间体， 按实施例 4 中步 骤⑤的方法甲胺解， 得到淡黄色的残渣， 经无水 Et2O 充分研磨， 过滤收集得到产物 H65B 的 粉末 276mg( 理论重 400mg)， 总收率为 69％， ESI-MS 分析 401.1822(M+H)。
     实施例 12
     化合物 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-NHPr(YJH05) 的合成
     ①中间体 Boc-Pro-NHCH2CH2CH3 的合成
     将 2.15g(10mmol)Boc-Pro-OH， 1.7g(10mmol)Cl-HOBt， 3.79g(10mmol)HBTU 溶 于 25ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 1.1ml(10mmol)NMM 后搅拌 5min， 再加入 0.83ml(10mmol) 丙胺， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚研磨得到白色固体 1.54g， 收率为 60.3％。
     ②中间体 Boc-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH3 的合成
     将 Boc-Pro-NHCH2CH2CH3 约 1.4g(5.46mmol) 溶于 20ml 3mol/LHCl/EtOAc 中， 0℃搅 拌反应 2 ～ 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩，以甲苯反复抽带两次， 得到油状物， 直接进行下一步反应。
     将以上油状物溶于 5ml DMF， 置于冰水浴中冷却 5min， 依次加入 1.74g(5.46mmol) Boc-Arg(NO2)-OH， 0.928g(5.46mmol)Cl-HOBt， 2.07g(5.46mmol)HBTU， 1.20ml(10.92mmol) NMM。0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释 反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠 水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚研 磨得到白色固体 1.01g， 两步反应总收率为 40.3％。
     ③中间体 HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH3 的合成
     将步骤②中所得产物 1.01g(22mmol) 溶于 10ml 3mol/LHCl/EtOAc 中， 0℃搅拌反 应 2 ～ 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带两次， 用乙醚研磨 2 次， 得 到白色固体产物 0.831g， 收率为 96％。 ④目标产物 3-Hna-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH3(YJH05) 的合成
     将 3-Hna 0.188g(1mmol)， 中间体 HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH30.393g(1mmo l)， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0 ℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去 溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分离得白色固体 0.21g， 收率为 39.8％， ESI-MS 分析 528.2657(M+H)。
     实施例 13
     化合物 1-Hna-Arg(NO2)-Pro-NHPr(YJH08) 的合成
     将 1-Hna 0.188g(1mmol)， 中间体 HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH30.393g(1mm ol， 经实施例 11 中步骤①～③制得 )， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监 测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无 水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分 离得得 到白色固体 0.31g， 收率为 58.8％， ESI-MS 分析 528.2728(M+H)。
     实施例 14
     化合物 Sal-Arg(NO2)-Pro-NHPr(YJH27) 的合成
     将 0.138g(1mmol) 水杨酸， 中间体 HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH30.393g(1mm ol， 经实施例 11 中步骤①～③制得 )， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监 测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无
     水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分离得到白 色固体 0.22g， 收率为 46.1％。 ， ESI-MS 分析 478.2411(M+H)。
     实施例 15
     化合物(YJH64) 的合成将 0.138g(1mmol) 对羟基苯甲酸， HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH30.393g(1mm ol， 经实施例 11 中步骤①～③制得 )， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监 测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无 水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分离得到白 色固体 0.19g， 收率为 39.8％， ESI-MS 分析 478.2435(M+H)。
     实施例 16
     化合物(YJH65) 的合成将 0.152g(1mmol) 对甲氧基苯甲酸， HCl.H2N-Arg(NO2)-Pro-NHCH2CH2CH30.393g(1 mmol， 经实施例 11 中步骤①～③方法制得 )， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶 于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后 用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分 离得到白色固体 0.25g， 收率为 50.9％， ESI-MS 分析 492.2598(M+H)。
     实施例 17
     化合物 Fmoc-Arg(NO2)-Pro-NHPr(YJH03) 的合成
     将按实施例 11 中步骤①方法合成所得产物约 0.7g(2.73mmol) 溶于 10ml 3mol/L HCl/AcOEt 中， 0℃搅拌反应 2 ～ 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带 两次， 得到油状物， 直接进行下一步反应。
     将以上油状物溶于 5ml DMF， 置于冰水浴中冷却 5min， 依次加入 0.87g(2.73mmol) Fmoc-Arg(NO2)-OH， 0.464g(2.73mmol)Cl-HOBt， 1.03g(5.46mmol)HBTU， 0.60ml(5.46mmol) NMM。0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反 应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水 溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂得到粗产物， 柱色谱分 离 ( 洗脱剂为 DCM ∶ MeOH ＝ 35 ∶ 1) 得白色固体 1.12g， 两步反应总收率为 71.1％ ESI-MS 分析 580.2959(M+H)。 。
     实施例 18
     化合物 Sal-Arg(NO2)-Val-NHPr(YJH05V) 的合成
     ① Boc-Val-NHCH2CH2CH3 的合成
     将 2.17g(10mmol)Boc-Val-OH， 1.7g(10mmol)Cl-HOBt， 3.79g(10mmol)HBTU 溶 于 25ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 1.1ml(10mmol)NMM 后搅拌 5min， 再加入0.83ml(10mmol) 丙胺， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙 醚或石油醚研磨得到白色固体 2.11g， 收率为 82％。
     ②中间体 Boc-Arg(NO2)-Val-NHCH2CH2CH3 的合成
     将 Boc-Val-NHCH2CH2CH3 约 1.86g(7.2mmol) 溶于 20ml 3mol/LHCl/EtOAc 中， 0℃ 搅拌反应 2 ～ 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带两次， 得到油状物， 直接进行下一步反应。
     将以上油状物溶于 5ml DMF， 置于冰水浴中冷却 5min， 依次加入 1.74g(5.46mmol) Boc-Arg(NO2)-OH， 0.928g(5.46mmol)Cl-HOBt， 2.07g(5.46 mmol)HBTU， 1.20ml(10.92mmol) NMM。0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释 反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠 水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚或石油醚研 磨得到白色固体 1.01g， 两步反应总收率为 40.3％。
     ③中间体 HCl.H2N-Arg(NO2)-Val-NHCH2CH2CH3 的合成
     将步骤②中所得产物 1.52g(3.3mmol) 溶于 10ml 3mol/L HCl/EtOAc 中， 0℃搅拌 反应 2 ～ 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 减压浓缩， 以甲苯反复抽带两次， 用乙醚研磨 2 次， 得到白色固体产物 1.28g， 收率为 98％。
     ④目标产物 Sal-Arg(NO2)-Val-NHPr(YJH05V) 的合成
     将 0.138g(1mmol) 水 杨 酸， HCl.H2N-Arg(NO2)-Val-NHCH2CH2CH30.393g(1mmol)， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍 量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合并有机相先后用 1N HCl 水溶液、 饱 和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚 研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分离得到白色固体 0.24g， 收率为 49.5％， ESI-MS 分 析 480.2717(M+H)。
     实施例 19
     化合物 1-Hna-Arg(NO2)-Val-NHPr(YJH06V) 的合成
     将 0.188g(1mmol)1-Hna， HCl.H2N-Arg(NO2)-Val-NHCH2CH2CH30.393g(1mmol， 按实 施例 17 中步骤①～③方法制备 )， 0.17g(1mmol)Cl-HOBt， 0.379g(1mmol)HBTU 溶于 2ml DMF 中， 置于冰水浴中冷却 5min， 加入 0.22ml(2mmol)NMM， 0℃反应 4h， 室温反应 4h， TLC 监测反 应， 反应结束后， 后处理用 5 ～ 7 倍量的水稀释反应液后， 用乙酸乙酯萃取水相 2 ～ 3 次， 合 并有机相先后用 1NHCl 水溶液、 饱和碳酸氢钠水溶液、 饱和 NaCl 水溶液各洗 3 次， 无水硫酸 钠干燥 8h， 过滤， 蒸去溶剂用乙醚研磨得到黄色固体粗产物， 硅胶柱色谱分离得到白色固体 0.32g， 收率为 60.5％， ESI-MS 分析 530.2639(M+H)。
     实施例 20
     化合物 H45E 对钠钙交换体 (NCX) 转运功能的影响
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株幼仓鼠肾细胞 (Baby hamster kidney cell， BHK) 野生型， 以及稳定转染钠钙交换 体三种亚型 (NCX1、 NCX2 和 NCX3) 的 BHK 细胞 (BHK-NCX1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3)， 由意大 利那不勒斯 Fedrico II 大学药理学部提供。
     2、 试剂和药品
     化合物 H45E 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 89 ％ (HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMF 溶解 后用细胞外液配制。 DMEM、 FBS、 0.05％ Trypsin-EDTA 和 Ham’ s-F12 购自 Gibco 公司。 NaCl、 KCl、 ATP-Mg、 Ouabain、 DMSO 等购自 Sigma 公司。
     3、 仪器
     Port-a-patch system 购自德国 Nanion 公司， EPC-10 型膜片钳放大器购自德国 HEKA 公司， CC1-K6 型循环控温水浴购自德国 HUBER 公司。
     4、 电生理全细胞膜片钳实验方法
     应用稳定表达 NCX1、 NCX2 和 NCX3 的幼仓鼠肾细胞 (BHK cell) 进行实验。 将传代三 天后， 近 80％长满的 BHK-NCX 1、 BHK-NCX2 和 BHK-NCX3 细胞先用 0.05％ Trypsin-EDTA 洗两 次， 弃去胰酶。 置于孵箱中消化 1min 后， 用 1ml 培养基吹打重悬细胞， 1000rpm 离心 2min ； 弃 上清液后， 再将细胞用 1ml 细胞外液 (mM ： NaCl 140， CaCl22， MgCl21， D-glucose 10， Ouabain 0.02， HEPES10， 用 1M Tris 调 pH 值为 7.3， 0.22μm 微孔滤膜过滤 ) 洗一次， 1000rpm 离心 1min ； 弃上清后， 用适量细胞外液重悬。
     在室温下 (20-22℃ ) 应用 Port-a-patch 自动膜片钳系统记录 BHK-NCX 细胞钠钙 交换电流。 首先在膜片钳全细胞电流记录芯片内侧面加 5μl 细胞内液 (mM ： CsCl 120， NaCl 20， Mg-ATP 5， BAPTA20， CaCl213， HEPES 10， 用 1MTris 调 pH 值为 7.3， 0.22μm 微孔滤膜过 滤)； 然后将全细胞电流记录芯片安装在记录封接装置上 ； 再在全细胞电流记录芯片外侧 面加 5μl 细胞外液 ； 系统自动检测无误后， 按照操作提示加 5μl 细胞悬液于细胞外液中 ； 操作 patch control 软件进行实验。全细胞记录形成待电流稳定后再进行药物实验观察， 钳制电流幅度或输入电阻值发生明显变化， 或无药物作用下电流衰减＞ 1％ /min 的细胞不 再进 一步观察。
     5、 实验分组和给药
     实验观察化合物用细胞外液配制， 终浓度为为 1、 10、 30μM， 其中需要 DMF 或 DMSO 溶解的化合物， 使 DMF 或 DMSO 在细胞外液中的终浓度小于 0.5％。首先记录 5 个 sweep 电 流作为对照组 ( 每个 sweep 时间间隔为 10s)。随后每 5 个 sweep 观察药物的一个作用浓 度， 给药方式为使用微量移液器在细胞外液中小心加入 20l 含待测试化合物的溶液， 吸去， 重复三次以完成含药溶液置换， 在 20s 内完成上述操作 (chip 上细胞外液总体积不超过 35μl) ； 故整个实验时间为 200s。在一个细胞上观察不同浓度药物的作用效果， 以浓度递 增趋势给药， 观察待测化合物对钠钙交换正向电流和反向电流的影响。
     二、 结果
     1、 10、 30μM 化合物 H45E 对 NCX1 钠钙交换电流无明显影响 ( 在 30μM 时， Forward mode(121.1±3.4)％， Reverse mode(133.1±14.3)％， p ＞ 005， 见图 1)。1、 10、 30μM 化合 物 H45E 可以剂量依赖性地显著增强 NCX2 正向和反向钠钙交换电流 ( 在 1μM 时， Forward mode(111.5±1.0) ％， Reverse mode(117.4±3.6) ％， p ＜ 0.05 ； 在 10μM 时， Forwardmode(132.0±2.3) ％， Reverse mode(146.4±9.2) ％， p ＜ 0.05 ； 在 30μM 时， Forward mode(169.7±1.6)％， Reverse mode(183.7±6.5)％， ， p ＜ 0.05， 见图 1)。 1、 10、 30μM 化合 物 H45E 可以剂量依赖性地显著增强 NCX3 正向和反向钠钙交换电流 ( 在 30μM 时， Forward mode(146.1±6.4)％， Reverse mode(152.8±7.7)％， p ＜ 0.05， 见图 1)。
     实施例 21
     化合物 H45E 对谷氨酸损伤大鼠原代神经元的保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物
     新生 Wistar 大鼠， 购自中国医学科学院动物研究中心。
     2、 试剂和药品
     化合物 H45E 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于 DMSO 制成 母液， 临用前用培养基倍比稀释后制成工作液， 过滤除菌。高糖无 L-glutamine 的 DMEM、 FBS、 penicillin/streptomycin(P/S) 购 自 PAA 公 司， Equine serum 购 自 Hyclone 公 司， Neurobasal medium、 B27 supplement、 cytosine arabinoside 购自 Gibco 公司， HEPES、 EGTA、 DMSO、 MTT 等购自 Sigma 公司。
     3、 仪器
     BP121S 型电子天平、 PB-10 型酸度计购自德国 Sartorius 公司， 3k15 型低温高速 离心机购自德国 Sigma 公司， CC1-K6 型循环控温水浴购自德国 HUBER 公司， 全自动酶标仪 购自美国 Molecular Devices 公司。
     5、 新生大鼠皮层神经元的原代培养 [19]
     将培养皿或培养板预先用 L 型多聚赖氨酸铺底 30min， 晾干待用。将新生 Wistar 大鼠 75％乙醇中浸泡后， 超净台内快速断头， 摘取全脑置于冰冷的无血清 DMEM 中。分离出 3 皮层， 转移到新的 DMEM 中， 剪成 1mm 大小的组织块。加入 0.25％ Trypsin 液 2ml， 37℃消化 20min， 每 5min 转皿 1 次， 使消化均匀。消化完毕时加入 10ml 接种培养基终止消化， 吸管轻 柔吹打数次。将细胞悬液经滤网 (200 目 ) 过滤后， 100g 离心 5min。倾掉上清， 加入 10ml 6 接种培养基， 轻柔吹打均匀后， 计数板计数。细胞按 1×10 个 /ml 接种于 L 型多聚赖氨酸 化的 96 孔培养板内， 置 37℃ 5％ CO2 孵箱内进行培养。细胞接种 24h 后， 改换半液 ( 维持 培养基 )， 48h 后加入 10μM 阿糖胞苷， 72h 后， 换全液 ( 维持培养基 )。之后， 细胞每隔 2 天 换半液 ( 维持培养基 )， 细胞培养成熟后 ( 第七天 ) 实验。
     6、 MTT 法检测谷氨酸损伤原代神经元存活率 [20] ：
     大鼠原代神经元生长至第七天， 模型给药组加入新鲜配置的待测化合物工作液 20μl 至所需终浓度， 预孵育 15min， 每孔再加入 500μM 谷氨酸孵育 24h ； 终止培养前 4h 每 孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml)20μl 至终浓度为 0.5mg/ml， 置 37℃继续培养 4h。翻板将 96 孔 板内的培养基弃去， 在每孔中加入 DMSO 150μl， 振荡 10min 使结晶产物充分溶解。在酶标 仪上以波长 570nm 检测每孔的光密度值 (Optical density， OD) 值。所检测 OD 值的大小可 反映细胞代谢活性的强弱。每组设 6 个孔， 实验重复 5-10 次。细胞存活率的计算 ：
     细胞存活率＝ ( 实验组光密度值 / 对照组光密度值 )×100％。
     二、 结果
     MTT 法分析神经元细胞存活率发现 ： 化合物 H45E 与 500μM 谷氨酸共同孵育后，与对照组相比， 皮层神经元存活率显著降至 (60.2±1.4)％ (p ＜ 0.05)， 加入 1μM 化合物 H45E 后神经元细胞存活率升至 (78.8±4.0)％ (p ＜ 0.05， 见图 2)。
     实施例 22
     化合物 H45E 对钙紊乱损伤原代培养大鼠神经元的保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物 ( 同实施例 21)
     2、 试剂、 药品和溶液配制
     1) 化合物 H45E 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于 DMSO 制 成母液， 临用前用培养基倍比稀释后制成工作液， 过滤除菌。 2+
     2)1.8mM[Ca ]EBSS 平衡盐溶液 ： 6.779g NaCl， 0.197g MgSO4·7H2O， 0.4026gKCl， 0.156g NaH2pO4·2H2O， 2.201gNaHCO3， 0.1998g CaCl2 溶于 1L 三蒸水中， 0.22M 过滤除菌。 2+
     3)[Ca ]free EBSS 平衡盐溶液 ： 6.779g NaCl， 0.197g MgSO4·7H2O， 04026g KCl， 0.156g NaH2PO4·2H2O 2.201g NaHCO3， 溶于 1L 三蒸水中， 0.22M 过滤除菌。
     其余试剂及药品同实施例 2。
     3、 仪器 ( 同实施例 21)
     4、 新生大鼠皮层神经元的原代培养 ( 同实施例 21)
     5、 MTT 法检测钙紊乱 (Ca2+ paradox) 损伤原代神经元存活率
     大鼠原代神经元生长至第七天， 模型给药组加入新鲜配置的待测化合物工作液 20μl 至所需终浓度， 预孵育 15min 后， 将细胞培养液更换为 Ca2+ free EBSS 平衡盐溶液 (180μl 孔 ) ； 无钙液孵育 60min 后， 将细胞培养液更换为 [Ca2+]1.8mM 的 EBSS 平衡盐溶 液 (180μl/ 孔 )， 孵育 23h， 在每一次更换液体的过程中， 同 时加入待测化合物 20μl 至 所需终浓度 (1μM、 3μM)。终止培养前 4h 每孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml)20μl 至终浓度为 0.5mg/ml， 置 37℃继续培养 4h。 翻板将 96 孔板内的培养基弃去， 在每孔中加入溶解液 DMSO 150μl， 振荡 10min 使结晶产物充分溶解。在酶标仪上以波长 570nm 检测每孔的光密度值 (Optical density， OD) 值。所检测 OD 值的大小可反映细胞代谢活性的强弱。每组设 6 个 孔， 实验重复 5-10 次。细胞存活率的计算 ：
     细胞存活率＝ ( 实验组光密度值 / 对照组光密度值 )×100％
     二、 结果
     MTT 法分析神经元细胞存活率发现 ： 与空白对照组相比， 钙紊乱组大鼠原代皮层 神经元的存活率显著降至 (69.03±3.48)％ (p ＜ 0.05)， 化合物 H45E 与 1.8mM[Ca2+] 细胞 外液共同孵育后， 与钙紊乱模型组相比， 细胞存活率有明显改善， 其中 3μM 组神经元存活 率升至 (80.8±1.6)％ (p ＜ 0.05)， 10μM 组神经元存活率升至 (80.8±2.8)％ (p ＜ 0.05， 见图 3)。
     实施例 23
     化合物 H45E 对暂时性局部脑缺血再灌注 SD 大鼠的脑保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物
     雄性 SD 大鼠， 体重 260-280 克， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。手术 前后单独饲养， 室温保持 23-25℃， 自由进食和进水。2、 药品和试剂
     化合物 H45E 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO 中， 配制成母液， 生理盐水稀释后配制成工作液， 临用前配制。
     氯代三苯基四氮唑 (2， 3， 5-Triphenyltetrazolium chloride， TTC) 购自 Sigma Co.， 用蒸馏水配制成 4％溶液， 避光保存。
     3、 暂时性局部脑缺血再灌注模型 (tMCAO) 制备 ： 22]
     按照 Longa 等的方法 [21， 制备 tMCAO 模型。大鼠用 10％水合氯醛麻醉 (350mg/ kg， i.p.)， 体温维持在 (37.0±0.5)℃， 仰卧位固定于手术台上。沿颈正中线 切开皮肤， 仔 细分离右侧颈总动脉 (CCA)、 颈外动脉 (ECA)、 颈内动脉 (ICA)。 将 ECA 结扎剪断， 拉直与 ICA 成一直线。在 ECA 上剪一小口， 将一根长 4.0cm， 直径 0.26mm 的圆头硅化尼龙线 ( 用 0.1％ L 型多聚赖氨酸包被 ) 由此开口插入 ICA 约 1.85-2.00cm， 至大鼠大脑前动脉起始处， 阻断 大脑中动脉的血流供应。缺血 2 小时后小心抽出尼龙线， 结扎 ECA 开口并缝合手术切口， 动 物放回笼子中再灌 24 小时。全部过程中室温保持在 24-25℃。
     4、 实验分组及给药 ：
     大鼠随机分为模型对照组 (Vehicle) 及 H45E 给药组 (H45E 1mg/kg)。MCA 阻断开 始缺血前 10 分钟， 腹腔注射给药 (1ml/kg body weight， i.p.)。 5、 神经行为学评分 ：
     于再灌注终末期进行动物的行为学观察。参照 Bederson[23] 和 Belayev[24] 等的方 法， 提鼠尾离开地面约 1 尺， 观察两前肢状况 ； 将大鼠置于水平地面， 推动其双肩， 观察两侧 抵抗力有无差异 ； 大鼠置于地面， 观察其行走情况。 按以下标准进行评分， 分数越高， 说明其 神经行为损伤越严重。
     1) 行为完全正常为 0 分 ；
     2) 提起鼠尾离开地面， 手术对侧前肢内旋、 内收者， 为1分；
     3) 大鼠至地面， 用手挤压两侧检查其抗力， 手术对侧抗力下降者， 为2分；
     4) 大鼠至地面， 观察其行走， 围绕手术对侧转圈者， 为3分；
     5) 损伤极其严重， 已无法自主活动者， 为 4 分。 [25]
     6、 脑梗死体积的测定 ：
     大鼠再灌注 24 小时后， 即刻断头取脑， 去除嗅束、 小脑和低位脑干， 冠状切成 6 片 ( 第一至第五片 2mm/slice， 第六片 4mm)， 迅速置于 5ml 含有 1.5ml4 ％ TTC 及 0.1ml 1M 避光 )20-30 分钟， 其间每隔 5 分钟翻动一次。经 TTC 染色后， K2HPO4 的溶液中染色 (37℃， 正常组织深染呈红色， 梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐， 拍照保存。应用图象分析系 统软件 (Photoshop 软件 ) 处理并统计， 求算每片的梗死面积， 并最终叠加换算成梗死体积。 梗死体积以所占大脑半球的百分率来表示， 以消除脑水肿的影响。
     脑梗死体积 (％ ) ＝ ( 手术对侧半球的体积 - 手术侧半球未梗死部分的体积 )/ 手 术对侧半球的体积 ×100％
     二、 结果
     1、 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO SD 大鼠的神经行为学损伤
     在术后 24h 神经行为学评分中， 与模型对照组 (3.0±0.2) 相比， 1mg/kg 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO 大鼠的神经行为学功能 (2.1±0.2， p ＜ 0.01， 图 4)。
     2、 化合物 H45E 可以显著减小 tMCAO SD 大鼠的脑梗死体积
     TTC 染色结果统计显示， 与模型对照组 ((54.6±2.8) ％ ) 相比， 1mg/kg 化合物 H45E 可明显减小 tMCAO SD 大鼠的脑梗死体积 ((34.2±3.4)％， p ＜ 0.01， 图 5)。
     因此， 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO SD 大鼠脑的神经行为学评分， 并减小脑缺 血大鼠的脑梗死体积， 从而发挥抗脑缺血损伤的脑保护作用。
     实施例 24
     化合物 H45E 对暂时性脑缺血再灌注 Wistar 大鼠的脑保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物
     雄性 Wistar 大鼠， 体重 260-280 克， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 手 术前后单独饲养， 室温保持 23-25℃， 自由进食和进水。
     2、 药品和试剂
     化合物 H45E 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO 中， 配制成母液， 生理盐水稀释后配制成工作液， 临用前配制。
     3、 暂时性局部脑缺血再灌注模型 (tMCAO) 制备 ( 同实施例 23)
     4、 实验分组及给药 ( 同实施例 23)
     5、 神经行为学评分 ( 同实施例 23)
     6、 脑梗死体积的测定 ( 同实施例 23)
     二、 结果
     1、 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO Wistar 大鼠神经行为学损伤
     在术后 24h 神经行为学评分中， 与模型对照组 (3.0±0.2) 相比， 1mg/kg 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO 大鼠的神经行为学功能 (1.8±0.2， p ＜ 0.01， 图 6)。
     2、 化合物 H45E 可以显著减小 tMCAO Wistar 大鼠的脑梗死体积
     TTC 染色结果统计显示， 与模型对照组 ((45.9±3.9) ％ ) 相比， 1mg/kg 化合物 H45E 可明显减小 tMCAO Wistar 大鼠的脑梗死体积 ((30.0±4.7)％， p ＜ 0.05， 图 7)。
     因此， 化合物 H45E 可以显著改善 tMCAO Wistar 大鼠脑的神经行为学评分， 并减小 脑缺血大鼠的脑梗死体积， 从而发挥抗脑缺血损伤的脑保护作用。
     实施例 25
     化合物 H65B 对钠钙交换体 (NCX) 转运功能的影响
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株 ( 同实施例 20)
     2、 试剂和药品
     化合物 H65B 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 85 ％ (HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMSO 溶 解后用细胞外液配制 ； 其他试剂和药品同实施例 20。
     3、 仪器 ( 同实施例 20)
     4、 电生理全细胞膜片钳实验方法 ( 同实施例 20)
     5、 实验分组和给药 ( 同实施例 20)
     二、 结果1、 10、 30μM 化合物 H65B 可以剂量依赖性地增强 NCX1 正向和反向钠钙交换电流 (1μM， Forward mode(114.3±6.1)％， Reverse mode(115.6±7.6)％， p ＜ 0.05 ； 10μM， Forward mode(129.4±9.9)％， Reverse mode(143.6±18.0)％， p ＜ 0.05 ； 30μM， Forward mode(158.1±11.9) ％， Reverse mode 176.7±23.1 ％， p ＜ 0.05)。1μM 化 合 物 H65B 对 NCX2 正向和反向钠钙交换电流无明显影响 (Forward mode(104.0±3.5) ％， Reverse mode(109.2±5.9) ％ ) ； 10、 30μM 化合物 H65B 可以剂量依赖性地增强 NCX2 正向和反向 钠 钙 交 换 电 流 (10μM， Forward mode(118.2±5.6) ％， Reverse mode(128.6±8.8) ％， p ＜ 0.05 ； 30μM Forward mode(128.7±11.0) ％， Reverse mode(151.6±12.9) ％， p ＜ 0.05)。1、 10、 30μM 化 合 物 H65B 可 以 剂 量 依 赖 性 地 增 强 NCX3 正 向 和 反 向 钠 钙 交 换 电 流 (1μM， Forward mode(106.0±4.6) ％， Reverse mode(107.8±6.2) ％ ； 10μM Forward mode(119.8±5.2) ％， Reverse mode(129.2±8.3) ％ ； 30μM Forward mode(157.0±17.0)％， Reverse mode(157.0±10.1)％， p ＜ 0.05， 图 8)。
     实施例 26
     化合物 H67C 对钠钙交换体 (NCX) 转运功能的影响
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株 ( 同实施例 20)
     2、 试剂和药品
     化合物 H67C 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 96 ％ (HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMF 溶解 后用细胞外液配制 ； 其他试剂和药品， 同实施例 20。
     3、 仪器 ( 同实施例 20)
     4、 电生理全细胞膜片钳实验方法 ( 同实施例 20)
     5、 实验分组和给药 ( 同实施例 20)
     二、 结果
     1、 10、 30μM 化 合 物 H67C 可 以 增 强 NCX1 正 向 和 反 向 钠 钙 交 换 电 流 (1μM， Forward mode(149.0±7.6)％， Reverse mode(162.5±7.2)％， p ＜ 0.05 ； 10μM， Forward mode(214.6±6.0) ％， Reverse mode(240.8±27.4) ％， p ＜ 0.05 ； 30μM， Forward mode(245.5±9.6)％， Reverse mode(296.9±32.0)％， p ＜ 0.05)， 其中 1、 10μM 剂量组间 呈剂量依赖性关系， 10、 30μM 剂量组间无显著性差异。10、 30μM 化合物 H67C 可以将 NCX2 正向和反向钠钙交换电流增强到接近原来的 180％ (p ＜ 0.05)， 在 1、 10μM 剂量组间呈剂 量依赖性关系， 10、 30μM 剂量组间无显著性差异。10、 30μM 化合物 H67C 可以将 NCX3 正向 钠钙交换电流增强到接近原来的 150％ (p ＜ 0.05)， 在 1、 10μM 剂量组间呈剂量依赖性关 系， 10、 30μM 剂量组间无显著性差异 ( 见图 9)。
     实施例 27
     化合物 H45C 对钠钙交换体 (NCX) 转运功能的影响
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株 ( 同实施例 20)
     2、 试剂和药品
     化合物 H45C 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 82 ％(HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMSO 溶 解后用细胞外液配制 ； 其他试剂和药品同实施例 1。
     3、 仪器 ( 同实施例 20)
     4、 电生理全细胞膜片钳实验方法 ( 同实施例 20)
     5、 实验分组和给药 ( 同实施例 20)
     二、 结果
     1、 10、 30μM 化合物 H45C 可以剂量依赖性地增强 NCX1 反向钠钙交换电流 (1μM， Reverse mode(105.3±3.5) ％ ； 10μM， Reverse mode(121.9±6.2) ％ ； 30μM， Reverse mode(143.8±10.5)％ ) ； 1、 10μM 化合物 H45C 对正向钠钙交换电流无显著影响， 30μM 化 合物 H45C 可以增强正向钠钙交换电流 (Forward mode(118.7±7.4)％ )。 1μM 化合物 H45C 对 NCX2 正向和反向钠钙交换电流无明显影响， 10、 30μM 化合物 H45C 可以增强 NCX2 正向和 反向钠钙交换电流 (10μM， Forward mode(119.1±5.7)％， Reverse mode(127.8±7.9)％ ； 30μM， Forward mode(125.0±5.3)％， Reverse mode(133.5±8.4)％ )， 但 10、 30μM 两剂 量组间无显著性差异。1、 10、 30μM 化合物 H45C 可以增强 NCX3 正向和反向钠钙交换电流 (1μM， Forward mode(112.2±5.0)％， Reverse mode(123.3±7.1)％； 10μM， Forward mode (130.1±10.6)％， Reverse mode(126.9±8.1)％ ； 30μM， Forward mode(142.6±14.5)％， Reverse mode(120.0±14.7)％ )， 但组间无显著性差异 ( 见图 10)。
     实施例 28
     化合物 YJH05 对钠钙交换体 (NCX) 功能影响的电生理学研究
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株 ( 同实施例 20)
     2、 试剂和药品
     化合物 YJH05 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 95 ％ (HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMSO 溶 解后用细胞外液配制 ； 其他试剂和药品同实施例 20。
     4、 电生理全细胞膜片钳实验方法 ( 同实施例 20)
     5、 实验分组和给药 ( 同实施例 20)
     二、 结果
     1μM 化 合 物 YJH05 对 NCX1 钠 钙 交 换 电 流 无 明 显 影 响， 10μM 化 合 物 YJH05 对 NCX1 钠钙交换反向电流具有激动作用 (10μM， Forward mode(119.6±7.9) ％， Reverse mode(167.0±8.4)％， p ＜ 0.05)。10μM 化合物 YJH05 对 NCX3 正反向钠钙交换电流没有 明显影响 (10μM， Forward mode(93.9±2.1)％， Reverse mode(116.6±4.7)％， p ＞ 0.05， 见图 11)。
     实施例 29
     化合物 YJH05 对谷氨酸损伤原代培养神经元的保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物 ( 同实施例 21)
     2、 试剂、 药品和溶液配制
     化合物 YJH05 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO中， 配制成母液， 培养基倍比稀释后配制成工作液， 过滤除菌， 临用前配制。
     其他试剂、 药品和溶液配制同实施例 21。
     3、 仪器 ( 同实施例 21)
     4、 新生大鼠皮层神经元的原代培养 ( 同实施例 21)
     5、 MTT 法检测谷氨酸损伤原代神经元存活率 ( 同实施例 21)
     二、 结果
     MTT 法分析神经元细胞存活率发现 ： 在 500μM 浓度损伤下， 与对照组相比， 皮层神 经元存活率显著降至 (59.2±1.4)％ (p ＜ 0.05)， 1μM YJH05 与 500μM 谷氨酸共同孵育 后， 与谷氨酸损伤组相比， 神经元存活率升至 (66.4±1.1)％ (p ＜ 0.01， 图 12)。
     实施例 30
     化合物 YJH05 对暂时性局部脑缺血再灌注 SD 大鼠的脑保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物 ( 同实施例 23)
     2、 药品和试剂
     化合物 YJH05 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO 中， 配制成母液， 200 倍体积生理盐水稀释后配制成浓度为 0.5mg/ml 工作液， 临用前配制。 其他药品和试剂同实施例 23。
     3、 暂时性局部脑缺血再灌注模型 (tMCAO) 制备 ( 同实施例 23)
     4、 实验分组及给药 ( 同实施例 23)
     5、 神经行为学评分 ( 同实施例 23)
     6、 脑梗死体积的测定 ( 同实施例 23)
     二、 结果
     1、 化合物 YJH05 改善 tMCAO SD 大鼠神经行为学损伤
     在术后 24h 神经行为学评分中， 与模型对照组 (2.6±0.2) 相比， 1mg/kg 化合物 YJH05 可以显著改善 tMCAO SD 大鼠的神经行为学功能 (1.9±0.2， p ＜ 0.05， 图 13)。
     2、 化合物 YJH05 显著减小 tMCAO SD 大鼠脑梗死体积
     TTC 染色结果统计显示， 与模型对照组 ((41.7±3.9) ％ ) 相比， 1mg/kg 化合物 YJH05 可明显减小 tMCAO SD 大鼠的脑梗死体积 ((27.9±3.3)％， p ＜ 0.05， 图 14)。
     因此， 化合物 YJH05 可以显著改善 tMCAO SD 大鼠脑的神经行为学评分， 并减小脑 缺血大鼠的脑梗死体积， 从而发挥抗脑缺血损伤的脑保护作用。
     实施例 31
     化合物 YJH27 对钠钙交换体 (NCX) 转运功能的影响
     一、 材料和方法
     1、 实验细胞株 ( 同实施例 20)
     2、 试剂和药品
     化合物 YJH27 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 化学纯度 97 ％ (HPLC 法测定， 流动相 ： 20-95％乙腈∶水， 0.1％ TFA， 梯度洗脱， 220nm 紫外检测 )， DMSO 溶 解后用细胞外液配制 ； 其他试剂和药品同实施例 20。
     3、 仪器 ( 同实施例 20)4、 电生理全细胞膜片钳实验方法 ( 同实施例 20)
     5、 实验分组和给药 ( 同实施例 20)
     二、 结果
     1μM 化合物 YJH27 对 NCX1 钠钙交换反向电流具有激动作用 (10μM， Forward mode(116.5±6.0) ％， Reverse mode(134.6±4.1) ％， p ＜ 0.05)， 10μM 化合物 YJH27 对 NCX1 钠钙交换电流没有明显影响。10μM 的化合物 YJH27 对 NCX3 正反向钠钙交换电流均 具有激动作用 (10μM Forward mode(136.6±1.8) ％， Reverse mode(157.4±3.2) ％， p ＜ 0.05， 见图 15)。
     实施例 32
     化合物 YJH27 对谷氨酸损伤原代培养神经元的保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物 ( 同实施例 21)
     2、 试剂、 药品和溶液配制
     化合物 YJH27 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO 中， 配制成母液， 培养基倍比稀释后配制成工作液， 过滤除菌， 临用前配制。 其他试剂、 药品和溶液配制同实施例 21。
     3、 仪器 ( 同实施例 21)
     4、 新生大鼠皮层神经元的原代培养 ( 同实施例 21)
     5、 MTT 法检测谷氨酸损伤原代神经元存活率 ( 同实施例 21)
     二、 结果
     MTT 法分析神经元细胞存活率发现 ： 在 500μM 浓度损伤下， 与对照组相比， 皮层神 经元存活率显著降至 (64.2±3.6)％ (p ＜ 0.05)， 1μM YJH27 与 500μM 谷氨酸共同孵育 后， 与谷氨酸损伤组相比， 神经元存活率升至 (71.4±2.2)％ (p ＜ 0.05， 图 16)。
     实施例 33
     化合物 YJH27 对暂时性局部脑缺血再灌注 SD 大鼠的脑保护作用
     一、 材料和方法
     1、 实验动物 ( 同实施例 23)
     2、 药品和试剂
     化合物 YJH27 由本发明人 ( 中国医学科学院药物研究所 ) 合成， 溶解于微量 DMSO 中， 配制成母液， 生理盐水稀释后配制成工作液， 临用前配制。 其他药品和试剂同实施例 23。
     3、 暂时性局部脑缺血再灌注模型 (tMCAO) 制备 ( 同实施例 23)
     4、 实验分组及给药 ( 同实施例 23)
     5、 神经行为学评分 ( 同实施例 23)
     6、 脑梗死体积的测定 ( 同实施例 23)
     7、 统计学分析 ( 同实施例 23)
     二、 结果
     1、 化合物 YJH27 改善 tMCAO SD 大鼠神经行为学损伤
     在术后 24h 神经行为学评分中， 与模型对照组 (2.6±0.2) 相比， 1mg/kg 化合物 YJH27 可以显著改善 tMACO SD 大鼠的神经行为学功能 (1.8±0.2， p ＜ 0.05， 图 17)。
     2、 化合物 YJH27 显著减小 tMCAO SD 大鼠脑梗死体积
     TTC 染色结果统计显示， 与模型对照组 ((41.7±3.9) ％ ) 相比， 1mg/kg 化合物 YJH27 可明显减小 tMCAO SD 大鼠的脑梗死体积 ((30.7.9±3.1)％， p ＜ 0.05， 图 18)。
     因此， 化合物 YJH27 可以显著改善 tMCAO SD 大鼠脑的神经行为学评分， 并减小脑 缺血大鼠的脑梗死体积， 从而发挥抗脑缺血损伤的脑保护作用。
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