蛋白激酶抑制剂及其使用方法.pdf

本发明提供了可用作蛋白激酶抑制剂的化合物及其药物组合物，以及使用此类化合物治疗、缓解或预防与激酶活性异常或失控有关的病症的方法。在某些实施方案中，本发明提供了使用此类化合物治疗、缓解或预防涉及Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-Raf、C-Src、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶异常活化的疾病或病症的方法。

1.  式(1)化合物：

或其可药用盐或互变异构体，其中：
A是
或包含N、O或S且任选地被C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基取代的5-6元杂环，所述的取代基各自可以任选地被卤素、氨基或羟基所取代；
环B是苯基或包含N、O或S的5-6元杂环；
L是NRCO、CONR、NRCONR、NRSO₂、SO₂NR或O(CR₂)_q；
X¹、X²和X³独立地是N或CR；
Y是O、S或NR；
Z¹、Z²、Z³、Z⁴和Z⁵独立地是卤素、O(CR₂)_qR⁴、氰基、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷、CO₂(CR₂)_qR⁴、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴、NR⁸CONR⁶R⁷；或C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基所取代；或
Z¹、Z³和Z⁵独立地是H；
或者，Z¹和Z²、Z²和Z³、Z³和Z⁴或Z⁴和Z⁵形成5-7元环；
R是H或C_1-6烷基；
R¹是H、卤素、C_1-6烷氧基、O(CR₂)_qR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR²)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R²是卤素；羟基；或C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基所取代；；
R³是卤素；C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基所取代；O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R⁴和R⁵独立地是任选取代的C_3-7环烷基、C₆芳基或5-7元杂环或杂芳基；或R⁴是H；
R⁶和R⁷独立地是H；C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基所取代；C_1-6链烷醇、(CR₂)_pO(CR₂)_qR⁴或(CR₂)_p-R⁵；或R⁶和R⁷与NR⁶R⁷中的N一起可以形成任选取代的环；
R⁸是H或C_1-6烷基；
m是1-4；且
n、p和q独立地是0-4。

2.  如权利要求1所述的化合物，其中X¹、X²和X³各自是CH。

3.  如权利要求1所述的化合物，其中R各自是H。

4.  如权利要求1所述的化合物，其中L是NRCO、CONR或O(CR₂)_q。

5.  如权利要求1所述的化合物，其中A是

L是O(CR₂)_q；且
B是包含N的5-6元杂环。

6.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式(2)：

其中L是NRCO或CONR；且
X¹、X²和X³各自是CH。

7.  如权利要求6所述的化合物，其中n是1-2且R³是CF₃或(CR₂)_pR⁵。

8.  如权利要求7所述的化合物，其中R⁵是任选取代的哌啶基。

9.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是式(3)：

其中X¹、X²和X³各自是CH。

10.  如权利要求9所述的化合物，其中Z⁴和Z⁵形成C₆芳基或包含N、O或S的5-7元杂芳基。

11.  如权利要求9所述的化合物，其中Z¹、Z²和Z⁵独立地是卤素；O(CR₂)_qR⁴；或C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基取代；
Z³是H；且
Z⁴是氰基、O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷或CO₂(CR₂)_qR⁴。

12.  如权利要求9所述的化合物，其中Z¹和Z²独立地是卤素；O(CR₂)_qR⁴；或C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基，其各自可以任选地被卤素、氨基或羟基取代；
Z³和Z⁵独立地是H；且
Z⁴是氰基、O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷或CO₂(CR₂)_qR⁴。

13.  药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1所述的化合物和可药用的载体。

14.  如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自下列：
4-氨基-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)苯基]-酰胺；
4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺；
4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸[3-(1-乙基-吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氯-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
3-(4-氨基喹唑啉-8-甲酰氨基)-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-氰基-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噁唑-2-基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-(3-(二甲基氨基)苯基氨基)-N-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5-(三氟甲基)苯甲酰氨基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-甲氧基-N-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(5-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)-4-(4-吗啉代苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2-氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(3-吗啉代丙基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
(Z)-4-氨基-N′-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲脒；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(2-吗啉代乙基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙氧基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(二甲基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噻唑-2-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(苯基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(丙基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(3-(丁基氨基甲酰基)-2，6-二氯-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基甲基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-3-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-4-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙氧基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-乙氧基-5-(乙氧基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-乙氧基-5-(乙基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-乙氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-甲基萘-1-基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-6-氟-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-溴-6-氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氟-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-甲氧基-N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)-4-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；和
4-氨基-N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)喹唑啉-8-甲酰胺。

15.  治疗B-Raf、Bcr-Abl或FGFR3介导的病症的方法，该方法包括向需要该治疗的细胞或组织系统或哺乳类个体施用有效量的权利要求1所述的化合物或其可药用盐或药物组合物，其中所述病症是细胞增殖性病症或自身免疫疾病；从而治疗所述病症。

16.  如权利要求15所述的方法，其中所述细胞增殖性病症是黑色素瘤、白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌、淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺、肾、前列腺、结肠直肠、甲状腺、卵巢、胰腺、神经、肺、子宫或胃肠的肿瘤。

17.  如权利要求15所述的方法，其中所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮、炎性肠病、风湿性关节炎、II型胶原关节炎、多发性硬化症、银屑病、青少年糖尿病、舍格伦病、甲状腺疾病、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻或重症肌无力。

18.  如权利要求1所述的化合物或其可药用盐或药物组合物以及任选的第二治疗剂在制备治疗细胞增殖性病症或自身免疫疾病的药物中的用途。

19.  如权利要求18所述的用途，其中所述细胞增殖性病症是黑色素瘤、白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌、淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺、肾、前列腺、结肠直肠、甲状腺、卵巢、胰腺、神经、肺、子宫或胃肠的肿瘤。

20.  如权利要求18所述的用途，其中所述自身免疫疾病是系统性红斑狼疮、炎性肠病、风湿性关节炎、II型胶原关节炎、多发性硬化症、银屑病、青少年糖尿病、舍格伦病、甲状腺疾病、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻或重症肌无力。

蛋白激酶抑制剂及其使用方法
相关申请的交叉参考
本发明要求2007年6月21日提交的美国临时申请序号为60/945,410的优先权利益，该申请整体引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及蛋白激酶抑制剂以及使用这些化合物的方法。
背景技术
蛋白激酶包括很多的家族成员，其在调节广泛多样的细胞功能方面起关键作用。这些激酶非限定性的部分名单包括：受体酪氨酸激酶，例如血小板衍生生长因子受体激酶(PDGFR)、神经生长因子受体TrkB、C-Met和成纤维细胞生长因子受体(FGFR3)；非受体酪氨酸激酶如Abl和相应的融合激酶Bcr-Abl、Lck、Csk、Fes、Bmx和Src；以及丝氨酸/苏氨酸激酶，例如B-Raf、C-Raf、Syk、MAP激酶(如MKK4、MKK6等)和SAPK2α、SAPK2β和SAPK3。在许多疾病状态中已经观察到异常的激酶活性，包括良性和恶性增殖性紊乱以及免疫和神经系统不恰当的激活所导致的疾病。因此，抑制此类激酶将有多种治疗性适应症。
发明内容
本发明提供了可用作蛋白激酶抑制剂的化合物及其药物组合物。
一方面，本发明提供了式(1)的化合物：

或其可药用盐或互变异构体，其中：
A是
或任选取代的包含N、O或S的5-6元杂环；
环B是苯基或包含N、O或S的5或6元杂环；
L是NRCO、CONR、NRCONR、NRSO₂、SO₂NR或O(CR₂)_q；
X¹、X²和X³独立地是N或CR；
Y是O、S或NR；
Z¹、Z²、Z³、Z⁴和Z⁵独立地是卤素、O(CR₂)_qR⁴、氰基、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷、CO₂(CR₂)_qR⁴、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴、NR⁸CONR⁶R⁷，或任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；或
Z¹、Z³和Z⁵独立地是H；
或者，Z¹和Z²、Z²和Z³、Z³和Z⁴或Z⁴和Z⁵形成5-7元环；
R是H或C_1-6烷基；
R¹是H、卤素、C_1-6烷氧基、O(CR₂)_qR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R²是卤素、羟基或任选卤代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；
R³是卤素、任选卤代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R⁴和R⁵独立地是任选取代的C_3-7环烷基、5-7元芳基、杂环或杂芳基；或R⁴是H；
R⁶和R⁷独立地是H、任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；C_1-6链烷醇、(CR₂)_pO(CR₂)_qR⁴或(CR₂)_p-R⁵；或R⁶和R⁷与NR⁶R⁷中的N一起可以形成任选取代的环；
R⁸是H或C_1-6烷基；
m是1-4；且
n、p和q独立地是0-4。
在式(1)的某些实例中，L是NRCO、CONR或O(CR₂)_q。在其他实例中，A是
L是O(CR₂)_q；且
B是含N的5或6元杂环。
在一项实施方案中，本发明化合物具有式(2)：

其中L是NRCO或CONR；且
X¹、X²和X³各自是CH。
在上述的式(2)中，n可以是1-2。在某些实例中，R³是CF₃或(CR₂)_pR⁵，其中R⁵可以是任选取代的哌啶基。
在另一项实施方案中，本发明化合物具有式(3)：

其中X¹、X²和X³各自是CH。
在式(3)的一些实例中，Z¹、Z²和Z⁵独立地是卤素、O(CR₂)_qR⁴，或任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；Z³是H；且Z⁴是氰基、O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷或CO₂(CR₂)_qR⁴。在其他实例中，Z¹和Z²独立地是卤素、O(CR₂)_qR⁴或任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；Z³和Z⁵独立地是H；且Z⁴是氰基、O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷或CO₂(CR₂)_qR⁴。或者，Z⁴和Z⁵可以形成包含N、O或S的5-7元芳基或杂芳基。
在上述的式(1)、(2)和(3)中，X¹、X²和X³可以各自是CH。在一些实例中，R是H。
在上述的式(1)、(2)和(3)中，合适的取代基是本领域普通技术人员已知的那些，包括但不限于卤素、任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_2-6炔基、氰基、硝基或(CR₂)_pR⁹；其中R⁹是O(CR₂)_qR¹⁰、S(CR₂)_qR¹⁰、(CR₂)_pCO_1-2R¹⁰、CONR¹⁰(CR₂)_qR¹⁰、SO₂NR¹⁰(CR₂)_qR¹⁰或NR¹⁰(CR₂)_qR¹⁰或R¹⁰；R¹⁰是H、任选卤代的C_1-6烷基，或任选取代的C_3-7环烷基、5-7元芳基、杂环或杂芳基。
在另一方面，本发明提供了包含式(1)、(2)或(3)的化合物以及可药用赋形剂的药物组合物。
本发明还提供了调节蛋白激酶的方法，该方法包括向需要其的系统或个体施用治疗有效量的式(1)、(2)或(3)的化合物或其可药用盐或药物组合物，从而调节所述蛋白激酶。
可以使用本发明化合物调节的蛋白激酶的例子包括但不限于Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-RAF、C-SRC、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶。更具体而言，式(1)、(2)或(3)的化合物可以用于抑制B-Raf、Bcr-Abl或FGFR3或其组合。
另一方面，本发明提供了改善由蛋白激酶介导的病症的方法，例如B-Raf、Bcr-Abl或FGFR3介导的病症，该方法包括向需要此类治疗的系统或个体施用有效量的式(1)、(2)或(3)的化合物或其可药用盐或药物组合物，以及任选的第二治疗剂，从而治疗所述病症。例如，本发明化合物任选地与化疗剂组合，可以用于治疗细胞增殖性病症，包括但不限于黑色素瘤、白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌、淋巴瘤、骨肉瘤或乳腺、肾、前列腺、结肠直肠、甲状腺、卵巢、胰腺、神经、肺、子宫或胃肠的肿瘤。本发明化合物也可用于治疗自身免疫疾病，包括但不限于系统性红斑狼疮、炎性肠病、风湿性关节炎、II型胶原关节炎、多发性硬化症、银屑病、青少年糖尿病、舍格伦病、甲状腺疾病、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻或重症肌无力。
在使用本发明化合物的上述方法中，式(1)、(2)或(3)的化合物可以向包括细胞或组织在内的系统施用。在其他实施方案中，式(1)、(2)或(3)的化合物可以向人或动物个体施用。
本发明还提供了式(1)、(2)或(3)的化合物在制备治疗细胞增殖性病症或自身免疫性疾病的药物中的用途。
定义
“烷基”是指基团和作为其它基团(例如卤素取代的烷基和烷氧基)的结构元件，可以是直链的或支链的。本文所用的任选取代的烷基、链烯基或炔基可以任选地被卤代(例如CF₃)，或者可以具有一个或多个被取代的或被杂原子如NR、O或S替换的碳(例如-OCH₂CH₂O-、烷基硫醇、硫代烷氧基、烷基胺等)。
“芳基”是指含有碳原子的单环或稠合双环芳香环。例如，芳基可以是苯基或萘基。“亚芳基”表示衍生自芳基的二价基团。
本文所用的“杂芳基”如上文对芳基所定义，其中一个或多个环原子为杂原子。杂芳基的例子包括但不限于吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
本文所用的“碳环”是指含有碳原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连的多环，其可以任选地被取代，例如被＝O取代。碳环的例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、亚环丙基、环己酮等。
本文所用的“杂环”如上文对碳环所定义，其中一个或多个环原子是杂原子。例如，杂环可以包含N、O、S、-N＝、-S-、-S(O)-、-S(O)₂或-NR-，其中R可以是氢、C_1-4烷基或保护基。杂环的例子包括但不限于吗啉代、吡咯烷基、吡咯烷-2-酮、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基等。
本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等意欲囊括对单个患者施用所选择的治疗药物，并且意欲包括其中药物不必以同一给药途径或在同一时间施用的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”是指将多种活性成分混合或合并所得的产品，包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”指活性成分，例如式(1)化合物和共同药物，以单一实体或剂量同时施用于患者。术语“非固定组合”指活性成分，例如式(1)化合物和共同药物，以分开的实体同时、共同或无特定时间限制地依次施用于患者，其中这种施用为患者体内提供了活性成分的治疗有效水平。后者还用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或更多种的活性成分。
术语“治疗有效量”是指能在细胞、组织、器官、系统、动物或人中引起研究者、兽医、医生或其他医师所寻求的生物学或医学响应的量。
术语“施用”主题化合物是指向需要治疗的个体提供本发明化合物及其前药。
“激酶名单”是包括但不限于下述激酶的激酶名单：Abl、JAK2、JAK3、ALK、JNK1α1、KDR、Aurora-A、Lck、Blk、MAPK1、Bmx、MAPKAP-K2、BRK、MEK1、CaMKII、C-Met、CDK1/细胞周期蛋白B、p70S6K、CHK2、PAK2、CK1、PDGFRα、CK2、PDK1、C-Kit、Pim-2、C-Raf、PKA、CSK、PKBα、Src、PKCα、DYRK2、Plk3、EGFR、ROCK-I、Fes、Ron、FGFR-3、Ros、Flt3、SAPK2、Fms、SGK、Fyn、SIK、GSK3β、Syk、IGFR、Tie-2、IKKβ、TrkB、IR、WNK3、IRAK4、ZAP-70、ITK、AMPK、LIMK1、Rsk2、Axl、LKB1、SAPK2β、BrSK2、Lyn、SAPK3、BTK、MAPKAP-K3、SAPK4、CaMKIV、MARK1、Snk、CDK2/细胞周期蛋白A、MINK、SRPK1、CDK3/细胞周期蛋白E、MKK4、TAK1、CDK5/p25、MKK6、TBK1、CDK6/细胞周期蛋白D、MLCK、TrkA、CDK7/细胞周期蛋白H/MAT1、MRCKβ、TSSK1、CHK1、MSK1、Yes、CK1d、MST2、ZIPK、MuSK、DAPK2、NEK2、DDR2、NEK6、DMPK、PAK4、DRAK1、PAR-1Bα、EphA1、PDGFRβ、EphA2、Pim-1、EphA5、PKBβ、EphB2、PKCβI、EphB4、PKCδ、FGFR1、PKCη、FGFR2、PKCθ、FGFR4、PKD2、Fgr、PKG1β、Flt1、PRK2、Hck、PYK2、HIPK2、Ret、IKKα、RIPK2、IRR、ROCK-II、JNK2α2、Rse、JNK3、Rsk1(h)、PI3Kγ、PI3Kδ和PI3-Kβ。
实施本发明的方式
本发明提供了可用作蛋白激酶抑制剂的化合物及其药物组合物。
一方面，本发明提供了式(1)的化合物：

或其可药用盐或互变异构体，其中：
A是
或任选取代的包含N、O或S的5-6元杂环；
环B是苯基或包含N、O或S的5或6元杂环；
L是NRCO、CONR、NRCONR、NRSO₂、SO₂NR或O(CR₂)_q；
X¹、X²和X³独立地是N或CR；
Y是O、S或NR；
Z¹、Z²、Z³、Z⁴和Z⁵独立地是卤素、O(CR₂)_qR⁴、氰基、(CR₂)_pR⁵、CONR⁶R⁷、CO₂(CR₂)_qR⁴、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴、NR⁸CONR⁶R⁷，或任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；或
Z¹、Z³和Z⁵独立地是H；
或者，Z¹和Z²、Z²和Z³、Z³和Z⁴或Z⁴和Z⁵形成5-7元环；
R是H或C_1-6烷基；
R¹是H、卤素、C_1-6烷氧基、O(CR₂)_qR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R²是卤素、羟基或任选卤代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；
R³是卤素、任选卤代的C_1-6烷基或C_1-6烷氧基；O(CR₂)_qR⁴、(CR₂)_pR⁵、NR⁶R⁷、NR⁸(CR₂)_qNR⁶R⁷、NR⁸CONR⁶R⁷、NR⁸CO₂R⁴、NR⁸SO₂R⁴或NR⁸CONR⁶R⁷；
R⁴和R⁵独立地是任选取代的C_3-7环烷基、5-7元芳基、杂环或杂芳基；或R⁴是H；
R⁶和R⁷独立地是H、任选卤代的C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_2-6炔基；C_1-6链烷醇、(CR₂)_pO(CR₂)_qR⁴或(CR₂)_p-R⁵；或R⁶和R⁷与NR⁶R⁷中的N一起可以形成任选取代的环；
R⁸是H或C_1-6烷基；
m是1-4；且
n、p和q独立地是0-4。
在一项实施方案中，A是
L是O(CR₂)_q；且
B是包含N的5或6元杂环。
在另一项实施方案中，本发明的化合物具有式(2)：

其中L是NRCO或CONR；且
X¹、X²和X³各自是CH。
在另一项实施方案中，本发明的化合物具有式(3)：

其中X¹、X²和X³各自是CH。
式(1)、(2)或(3)的代表性化合物包括但不限于：
4-氨基-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)苯基]-酰胺；
4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺；
4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸[3-(1-乙基-吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氯-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
3-(4-氨基喹唑啉-8-甲酰氨基)-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-氰基-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噁唑-2-基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-(3-(二甲基氨基)苯基氨基)-N-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5-(三氟甲基)苯甲酰氨基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-甲氧基-N-(2-甲基-5-(3-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(5-(4-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)-4-(4-吗啉代苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(5-(3-(4-乙基哌嗪-1-基)-5-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2-氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(3-吗啉代丙基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
(Z)-4-氨基-N′-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲脒；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(苯基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(4-(2-吗啉代乙基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙氧基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(二甲基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噻唑-2-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(苯基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(丙基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(3-(丁基氨基甲酰基)-2，6-二氯-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基甲基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-2-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-3-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(吡啶-4-基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙氧基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-氟苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-乙氧基-5-(乙氧基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-乙氧基-5-(乙基氨基甲酰基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(环丙基氨基甲酰基)-5-乙氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-甲基萘-1-基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-6-氟-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2-溴-6-氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-氨基-N-(2，6-二氟-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺；
4-甲氧基-N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)喹唑啉-8-甲酰胺；
N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)-4-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺；和
4-氨基-N-(5-甲氧基苯并[d]异噁唑-7-基)喹唑啉-8-甲酰胺；
或其可药用盐。
在每种上述的式中，可以(R)-、(S)-或(R，S)-构型存在任何不对称碳原子。因此，所述化合物可以异构体混合物或纯异构体的形式存在，例如以纯的对映异构体或非对映异构体存在。本发明还包括本发明化合物的可能的互变异构体。
本发明还包括本发明化合物或其可药用盐的所有合适的同位素变体。本发明化合物或其可药用盐的同位素变体定义为：其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子量与自然界常见的原子量不同的原子所替换。可掺入本发明化合物及其可药用盐的同位素的实例包括但不限于氢、碳、氮和氧的同位素，如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl和¹²³I。本发明化合物和其可药用盐的某些同位素变体，例如其中掺入放射性同位素诸如³H或¹⁴C的那些，可用于药物和/或底物的组织分布研究。
在特定实例中，可以使用³H和¹⁴C，原因在于它们容易制备和检测。在其他实例中，用同位素如²H替代，可以提供某些因代谢稳定性更高而造成的治疗优势，例如体内半衰期延长或剂量需求减少。本发明化合物或其可药用盐的同位素变体一般可利用合适试剂的适当同位素变体通过常规方法来制备。化合物的同位素变体具有改变化合物代谢归宿和/或在物理性质例如疏水性等上产生小的改变的潜力。同位素变体具有增强效能和安全性、增加生物利用度和半衰期、改变蛋白结合、改变生物分布、增加活性代谢物比例和/或减少反应性或毒性代谢物形成的潜力。
在每种上述的式中，每个任选被取代的部分可以被下述基团取代：C_1-6烷基、C_2-6链烯基或C_3-6炔基，所述烷基、链烯基或炔基各自可任选地被卤代或任选地具有可以被N、S、O所替换的碳，或它们的组合(例如，羟基C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基C₁-C₈烷基)；卤素、氨基、脒基、C_1-6烷氧基；羟基、亚甲二氧基、羧基；C_1-8烷基羰基、C_1-8烷氧基羰基、氨基甲酰基、C_1-8烷基氨基甲酰基、氨磺酰基、氰基、氧代、硝基，或如上所述的任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基。
具有式(1)、(2)和(3)的化合物可以用作蛋白激酶抑制剂。例如，式(1)、(2)或(3)的化合物及其可药用盐、溶剂化物、N-氧化物、前药和异构体可以用于治疗激酶介导的病症或疾病，例如由下述激酶介导的疾病：Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-RAF、C-SRC、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶，或其组合。
本发明化合物也可与第二治疗剂组合，用于改善由蛋白激酶介导的病症，例如B-Raf、Bcr-Abl或FGFR3介导的病症。例如，本发明化合物可以与化疗剂组合用于治疗细胞增殖性病症，包括但不限于淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤或乳腺、肾、前列腺、结肠直肠、甲状腺、卵巢、胰腺、神经、肺、子宫或胃肠的肿瘤。
可用于本发明的组合物和方法中的化疗剂实例包括但不限于：蒽环类、烷化剂(例如丝裂霉素C)、烷基磺酸酯、氮丙啶类、乙烯亚胺类、甲基蜜胺类、氮芥、亚硝基脲类、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物(例如二氢叶酸还原酶抑制剂，如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂的药物、干扰素类和白介素类。可用于本发明的组合物和方法的已知化疗剂的具体例子包括但不限于：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、三乙撑密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、trimethylolomelamine、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、阿克拉霉素、放线菌素F(1)、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、道诺霉素、6-重氮基-5-氧代-1-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、替加氟、L-门冬酰胺酶、阿法链道酶、醋葡醛内酯、醛磷酰胺、氨基酮戊酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、卡铂、顺铂、defofamide、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋铵、依托格鲁、依托泊苷、氟他胺、硝酸镓、羟基脲、干扰素-α、干扰素-β干扰素-γ、白介素-2、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝氨丙吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、雷佐生、西佐喃、锗螺胺、紫杉醇、他莫昔芬、替尼泊苷、替奴佐酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙胺、乌拉坦、长春碱、长春新碱和长春地辛。
药理学和应用
本发明化合物是筛选用于对抗所述激酶名单(野生型和/或其突变)，并且可以调节至少一种激酶名单的成员的活性。因此，本发明化合物可以用于治疗其中激酶对疾病的病理学和/或症状学起作用的疾病或病症。可以被本文所述的化合物和组合物抑制并且可通过本文所述的方法有效对抗的激酶例子包括但不限于：Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-RAF、C-SRC、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶，以及其突变形式。
Ras-Raf-MEK-ERK信号通路介导了对生长信号的细胞应答。在约15％的人类癌症中，Ras突变为致癌形式。Raf家族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它包括三个成员，A-Raf、B-Raf、C-Raf(或Raf-1)。Raf作为药物靶点的焦点集中于Raf作为Ras的下游效应子的关系上。但是，B-Raf可能在某些肿瘤的形成中具有重要地位，并不需要活化的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002))。特别是，已经在很大比例的恶性黑色素瘤中检测出B-Raf突变。现有的对于黑色素瘤的医学疗法受限于其效能，特别是对于晚期的黑色素瘤。本发明化合物也抑制涉及B-Raf激酶的细胞过程，为人类癌症如黑色素瘤的治疗提供了新的治疗机会。
据称，某些异常增殖病症与Raf的表达有关，因此认为其应该对Raf表达的抑制有响应。Raf蛋白的异常的高水平表达也与转化及异常的细胞增殖有关。这些异常增殖病症也会对Raf表达的抑制有响应。例如，据报道，所有肺癌细胞系的60％都表现出异常高水平的C-Raf mRNA和蛋白，因此相信C-Raf蛋白的表达在异常细胞增殖中起到一定的作用。异常增殖病症的另外的实例为过度增殖性疾病，例如癌症、肿瘤、增生、肺纤维化、血管生成、银屑病、动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞增生，例如狭窄或血管成形术后的再狭窄。Raf参与其中的细胞信号通路还涉及以T-细胞增殖(T-细胞活化和生长)为特征的炎性疾病，例如组织移植排斥、内毒素性休克和肾小球肾炎。
本发明的化合物也可抑制涉及C-Raf激酶的细胞过程。C-Raf被Ras癌基因所活化，该基因在大量人类癌症中发生突变。因此，抑制C-Raf的激酶活性可提供阻止Ras介导的肿瘤生长的方法[Campbell，S.L.，Oncogene，17，1395(1998)]。
成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)是FGF受体酪氨酸激酶家族的成员。FGFR3的激活突变在74％的表浅膀胱肿瘤(占38-46％的全部膀胱癌)、5％的宫颈癌和约10％的具有t(4；14)(p16.3；q32.3)染色体易位的多发性骨髓瘤患者中发现。这种t(4；14)染色体易位在约15％的多发性骨髓瘤患者中发现，造成FGFR3在浆细胞中表达升高。当其在造血细胞中表达时，激活的突变型和野生型FGFR3是致癌性的。因此，FGFR3的抑制剂例如本发明化合物，可以为膀胱癌和其他患者如t(4；14)多发性骨髓瘤患者提供新的和有效的治疗方案。
FGFR3还显示出发挥对骨生长的负调节作用和对软骨细胞增殖的抑制作用。致死性发育不良是由成纤维细胞生长因子受体3中的不同突变导致，并且一种突变TDII FGFR3具有组成型的酪氨酸激酶活性，它活化转录因子Stat1，导致细胞周期抑制物的表达、生长停止和异常的骨发育(Su等人，Nature，1997，386，288-292)。FGFR3通常还在多发性骨髓瘤型癌症中表达。FGFR3活性的抑制剂用于治疗T-细胞介导的炎性或自身免疫性疾病，包括但不限于风湿性关节炎(RA)、II型胶原关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、青少年糖尿病、舍格伦病、甲状腺疾病、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻和重症肌无力。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl、c-Abl)参与细胞周期的调节、对遗传毒性应激的细胞应答以及通过整联蛋白信号转导来传递细胞环境中的信息。Abl蛋白似乎是作为细胞组件起着复杂的作用，其整合各种胞外和胞内来源的信号并影响细胞周期和细胞凋亡的决定。Abelson酪氨酸激酶包括亚型衍生物，例如具有失调的酪氨酸激酶活性的嵌合融合(癌蛋白)Bcr-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95％的慢性髓细胞性白血病(CML)和10％的急性淋巴细胞白血病的发病机制中起重要作用。
本发明化合物可以抑制Abl激酶，例如v-Abl激酶。本发明化合物也可抑制野生型Bcr-Abl激酶和突变的Bcr-Abl激酶，因此可能适合于治疗Bcr-abl阳性的癌症和肿瘤疾病，例如白血病(例如慢性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞白血病)以及其它与Bcr-Abl相关的增殖性病症。本发明化合物还可有效对抗白血病的干细胞，并且可用于在取出所述细胞(例如，取出骨髓)后在体外纯化这些细胞，并在清除其中的癌细胞后再将细胞植入(例如，将纯化的骨髓细胞重新植入)。
Src激酶家族与癌症、免疫系统功能障碍和骨重建的疾病相关。在哺乳动物中Src家族成员包括下列8种激酶：Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck和Blk。有关其一般性综述可参见Thomas和Brugge，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.(1997)13，513；Lawrence和Niu，Pharmacol.Ther.(1998)77，81；Tatosyan和Mizenina，Biochemistry(莫斯科)(2000)65，49；Boschelli等，Drugs of the Future 2000，25(7)，717。
Fyn编码参与控制细胞生长的与膜结合的酪氨酸激酶。
Lck在T细胞信号转导中起作用。缺乏Lck基因的小鼠胸腺细胞发育能力差。Lck作为T细胞信号转导的正向活化剂的功能表明Lck抑制剂可用于治疗自身免疫性疾病，例如风湿性关节炎。Molina等，Nature，357，161(1992)。已确定Hck、Fgr和Lyn是骨髓白细胞中整联蛋白信号转导的重要调节子。Lowell等，J.Leukoc.Diol.，65，313(1999)。所以抑制这些激酶调节子也用于治疗炎症。Boschelli等，Drugs of the Future 2000，25(7)，717。
Lyn是Src家族的成员，在B细胞免疫应答的调节中起作用。Lyn缺陷小鼠表现出B细胞功能的破坏，导致自身免疫和肥大细胞脱颗粒作用缺陷。研究也表明Lyn在多种细胞系统中是凋亡的负调节剂。在白血病细胞中，Lyn被组成性激活，并且抑制Lyn的表达可逆转增殖。另外发现Lyn在结肠和PC细胞中有表达，在结肠癌细胞系中显性活化的Lyn的过表达诱导了化学抗性。(Goldenberg-Furmanov等，Cancer Res.64：1058-1066(2004))。
激酶C-Src传递许多受体的致癌信号。例如，在肿瘤中的EGFR或HER2/neu的过表达可引起C-Src组成型的激活，它是恶性细胞的特征，在正常细胞中不存在。另一方面，C-Src表达缺失的小鼠表现出骨硬化病的表型，说明C-Src在破骨细胞功能中的关键性参与，且可能涉及相关的病症。C-Src酪氨酸激酶(CSK)影响癌细胞、特别是结肠癌的转移潜能。
C-Kit与PDGF受体和CSF-1受体(c-Fms)基本上同源。对多种红细胞系和骨髓细胞系的研究表明，在分化早期有C-Kit基因的表达(Andre等人，Oncogene 4(1989)，1047-1049)。某些肿瘤如胶质母细胞瘤细胞也显示出C-Kit基因的显著表达。
Eph受体包括EphA和EphB亚家族，由最大的受体酪氨酸激酶组构成。已发现EphB在一些肿瘤中过表达，包括卵巢肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤和黑色素瘤。EphB信号的下调显示出抑制肿瘤生长和转移。因此，EphB可能是抗癌治疗的重要靶点(Clevers等人，Cancer Res.66：2-5(2006)；Heroult等人，Experimental Cell Res.312：642-650(2006)；和Batlle等人，Nature 435：1126-1130(2005))。
含激酶插入结构域的受体(下文中称作“KDR”)[WO 92/14748；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9026(1991)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，187：1579(1992)；WO 94/11499]和Fms样酪氨酸激酶(下文称作“Flt1”)[Oncogene，5：519(1990)；Science，255：989(1992)]属于受体型酪氨酸激酶家族。据报道，VEGF特异性结合于Flt-1和KDR，Kd值分别为20pM和75pM，Flt1和KDR在血管内皮细胞中以特定的方式表达[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7533(1993)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8915(1993)]。据报道，在多种疾病中对Flt-1而言，与正常组织的血管内皮细胞相比，在人类成胶质细胞瘤组织的肿瘤血管内皮细胞[Nature，359：845(1992)]和人类消化器官癌组织的肿瘤血管内皮细胞[Cancer Research，53：4727(1993)]中的Flt-1mRNA的表达增加。另外，据报道，通过原位杂交在风湿性关节炎患者的关节的血管内皮细胞中观察到Flt-1mRNA的表达[J.Experimental Medicine，180：341(1994)]。研究也表明Flt-1在肿瘤血管生成中起重要作用。
Flt3是III型受体酪氨酸激酶家族(RTK)的成员。Flt3(Fms样酪氨酸激酶)也被称为Flk-2(胎肝激酶2)。在包括急性髓性白血病(AML)、AML伴骨髓三系细胞异常增生(AML/TMDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨髓增生异常综合征(MDS)在内的成人和儿童白血病中都报道了Flt3基因的异常表达。在约25％的AML中，白血病细胞在细胞表面表达了自磷酸化的(p)FLT3酪氨酸激酶的组成性活化形式。p-FLT3的活性使得白血病细胞具有生长和存活的优势。抑制p-FLT3激酶活性可诱导白血病细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。
间变性淋巴瘤酶(ALK)是受体酪氨酸激酶的胰岛素受体超家族的成员，牵涉于造血系统和非造血系统肿瘤的肿瘤发生。据报道，神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤中全长ALK受体蛋白的表达异常；且ALK融合蛋白在间变的大细胞淋巴瘤中出现。对ALK融合蛋白的研究已经提升了ALK阳性的恶性疾病患者的新治疗方法的可能性。(Pulford等人，Cell.Mol.LifeSci.61：2939-2953(2004))。
Aurora-A是一种丝氨酸/苏氨酸有丝分裂激酶，据报道在多种人类癌症中过表达，并且其过表达可诱导培养的人和啮齿类细胞的非整倍性、中心体扩增和致瘤性转化。(Zhang等人，Oncogene 23：8720-30(2004))。
Bmx/Etk非受体酪氨酸蛋白激酶在体外参与内皮细胞迁移和血管的形成。在内皮和骨髓中的Bmx据报道也在体内的动脉生成和血管生成中起重要作用，表明Bmx可能是治疗血管疾病如冠状动脉病和外周动脉病的新靶点(He等人，J.Clin.Invest.116：2344-2355(2006))。
Bruton酪氨酸激酶(BTK)基因编码在调节BCR信号转导中发挥重要作用的胞质酪氨酸激酶(de Weers等人，J.Biol.Chem.269：23857-23860(1994)；Kurosaki等人，Immunity.12：1-5(2000))。BTK基因的缺陷造成丙种球蛋白缺乏血症，这是一种X连锁的免疫缺陷，其特征在于不能产生成熟的B淋巴细胞，并且与不能进行Ig重链的重排有关。
乳腺肿瘤激酶(Brk)是在大多数乳腺癌中过表达的可溶性蛋白-酪氨酸激酶，也存在于正常的皮肤和肠上皮细胞中，但是在正常的乳腺上皮细胞中不存在。(Zhang等，J Biol.Chem.280：1982-1991(2005))。
詹纳斯激酶(JAK)是一个包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2在内的酪氨酸激酶家族。JAK在细胞因子信号转导中起重要的作用。JAK家族的激酶的下游底物包括信号转导及转录激活物(STAT)蛋白。JAK/STAT信号转导涉及介导许多异常的免疫应答，如变态反应、哮喘、自身免疫病如移植排斥、风湿性关节炎、肌萎缩侧索硬化和多发性硬化，也涉及实体瘤和恶性血液病如白血病和淋巴瘤。
血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤血管生成中的一个重要因子。VEGF可以促进和维持肿瘤血管系统的构建，且可以直接促进肿瘤生长。VEGF可以诱导血管内皮细胞(VEC)和肿瘤细胞(TC)的有丝分裂发生和趋化性。几乎所有类型的TC和肿瘤VEC都可以分泌VEGF，但VEGF在正常组织中的表达非常低。在四种VEGF受体中，KDR是主要受体，其使VEGF的功能得到发挥。KDR在TC和肿瘤VEC中高表达，而在正常组织中表达低。(Ren等，World J.Gastroentrol.8：596-601(2002))。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是保守的信号转导通路的成员，它响应于各种胞外信号而激活转录因子、翻译因子和其它靶分子。通过促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKKs)在具有Thr-X-Tyr序列的双重磷酸化模体上使MAPKs磷酸化而激活。在高等真核细胞中，MAPK信号的生理学作用与细胞事件有关，例如增殖、肿瘤形成、发育及分化。因此，经由这些通路(尤其是通过MKK4和MKK6)来调节信号转导的能力，可以使与MAPK信号有关的疾病(例如炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症)的治疗和预防性治疗得到进展。
通过不同基因编码的多种形式的p38MAPK(α、β、γ、δ)形成了参与细胞对各种刺激(包括渗透性应激、紫外线和细胞因子介导的事件)的反应的激酶级联的一部分。这四种亚型的p38被认为调节着细胞内信号过程的不同方面。它的激活是导致合成和产生前炎性细胞因子如TNFα的信号事件级联反应的一部分。P38通过将包括其他激酶和转录因子的下游底物磷酸化来发挥作用。已证实，抑制p38激酶的物质可以阻断包括但不限于TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β的细胞因子的产生。当在体外用脂多糖(LPS)刺激时，外周血单核细胞(PBMC)会表达和分泌前炎性细胞因子。在用LPS刺激前用P38抑制剂预处理PBMC可有效地阻断该效应。P38抑制剂在炎性疾病动物模型中是有效的。很多疾病的破坏作用是由过度产生前炎性细胞因子引起的。p38抑制剂调节这种过度产生的能力使得它们可用作改善疾病的药物。
已证实，阻断p38功能的分子可有效地抑制骨吸收、炎症和其它基于免疫和炎症的病理改变。因此，安全有效的p38抑制剂将提供一种治疗可通过调节p38信号传递来进行调节的衰弱性疾病的方法。因此，可以抑制p38活性的本发明化合物可用于治疗炎症、骨关节炎、风湿性关节炎、癌症、自身免疫疾病，并且可用于治疗其他细胞因子介导的疾病。
PDGF(血小板衍生生长因子)是普遍存在的生长因子，它在正常生长和病理性细胞增殖中起重要作用，例如在癌发生和血管平滑肌细胞疾病、例如在动脉粥样硬化和血栓形成中可见到它。本发明化合物可抑制PDGF受体(PDGFR)活性并由此适合于治疗肿瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤和结肠、乳腺和卵巢的肿瘤。
本发明的化合物不仅可用作抑制肿瘤的物质，例如用于小细胞肺癌中，而且可用作治疗非恶性增殖性病症如动脉粥样硬化、血栓形成、银屑病、硬皮病和纤维化的药物。本发明化合物还可用于保护干细胞、例如对抗化疗药如5-氟尿嘧啶的血液毒性作用和用于治疗哮喘。本发明化合物尤其可用于治疗对抑制PDGF受体激酶有响应的疾病。
本发明的化合物可在治疗因移植引起的病症中表现出有用的作用，例如同种异体移植、尤其是组织排斥，诸如闭塞性细支气管炎(OB)，即同种异体肺移植物的慢性排斥反应。与不具有OB的患者相反，那些具有OB的患者通常显示在支气管肺泡灌洗液中PDGF浓度升高。
本发明的化合物也对与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(其中PDGF和PDGFR经常也起作用)如再狭窄和动脉粥样硬化有效。在体内和体外对血管平滑肌细胞增殖或迁移的这些作用及其后果，可通过施用本发明的化合物来证实，并且也可通过研究其对体内机械性损伤后血管内膜增厚的作用来证实。
蛋白激酶C(PKC)在与致癌作用、肿瘤细胞转移和细胞凋亡有关的过程中起作用。PKCα与许多种类的癌症相关，并且先前已证实其在四种抗雌激素耐药的乳腺癌细胞系中的三种中过度表达。(Frankel等，BreastCancer Res Treat.2006年10月24日(ePub))。
应激活化蛋白激酶(SAPKs)是蛋白激酶的一个家族，它代表了导致c-Jun转录因子活化和c-Jun所调控基因的表达的信号转导通路的倒数第二步。具体而言，c-Jun涉及编码参与修复由于遗传毒性损伤而受损的DNA的蛋白的基因转录。所以，在细胞中抑制SAPK活性的药物能够阻止DNA修复，使细胞对诱导DNA损伤或抑制DNA合成的药物敏感，并诱导细胞凋亡或抑制细胞增殖。
包含SNF1LK基因座(也称为SIK)的区域与经常在唐氏综合征患者中发现的先天性心脏缺陷有关。Snf1lk也在受精后9.5天时开始的体节的骨骼肌祖细胞中表达，表明snf1lk在肌肉生长和/或分化的最早阶段有更广泛的作用(Genomics 83：1105-15(2004))。
Syk是在肥大细胞脱颗粒作用和嗜酸性粒细胞活化中起重要作用的酪氨酸激酶。因此，Syk激酶参与多种变态反应性疾病、特别是哮喘。已证实Syk通过N-末端SH2结构域与FcεR1受体的磷酸化的γ-链结合，并且对于下游信号转导是重要的。
Lin等人(J.Clin.Invest.100，8：2072-2078(1997)和P.Lin，PNAS 95，8829-8834，(1998))已经证明：在腺病毒感染期间或在乳房肿瘤和黑色素瘤异种移植物模型中注射Tie-2(Tek)的胞外结构域期间，肿瘤生长和血管形成受到抑制，并且肺转移降低。Tie2抑制剂可以在新血管发生出现不当时使用(即，用于糖尿病视网膜病、慢性炎症、银屑病、卡波西肉瘤、由黄斑变性导致的慢性新血管形成、风湿性关节炎、婴儿血管瘤和癌症中)。
神经营养因子受体的Trk家族(TrkA、TrkB或TrkC)促进神经和非神经组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白在下列细胞中表达：在小肠和结肠的神经内分泌型细胞中、在胰脏的α细胞中、在淋巴结和脾脏的单核细胞和巨噬细胞中，以及表皮的颗粒层中(Shibayama和Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与威尔姆斯瘤和神经母细胞瘤的不良进展有关。而且，TrkB可在癌性的前列腺细胞中表达，而在正常细胞中不表达。Trk受体的下游信号通路涉及通过Shc激活的MAPK级联、激活的Ras、ERK-1和ERK-2基因，以及PLC-γ转导通路(Sugimoto等人，Jpn J.Cancer Res.2001年2月；92(2)：152-60)。
据报道，III型受体酪氨酸激酶(RTK)包括c-FMS、C-Kit、FLT3、血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)和β(PDGFRβ)，其与数量越来越多的恶性肿瘤的发病机制相关。(Blume-Jenseu等人，Nature 411：355-565(2001)；Scheijin等人，Oncogene 21：3314-3333(2002))。
根据上述，本发明进一步提供了在需要该治疗的个体中预防或治疗上文所描述的任何疾病或病症的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的式(1)、(2)或(3)的化合物或其可药用盐。对于上文任何用途，所需要的剂量都应当根据施用的方式、待治疗的具体病症和所需效果而变化。(参见下文的“给药和药物组合物”)
给药和药物组合物
一般而言，可以采用任何本领域众所周知的常用和可接受的给药方式(单独或与一种或多种治疗剂组合)来施用治疗有效量的本发明化合物。治疗有效量可根据疾病的严重性、个体的年龄和相关健康状况、所用化合物的效力和其它因素而有较大改变。一般而言，以约0.03至2.5mg/kg体重的日剂量全身施用可获得满意的结果。大型哺乳动物(例如人类)的指示日剂量范围为约0.5mg至约100mg，方便地以例如一天至多四次的分次剂量或以缓释的形式施用。适于口服给药的单位剂量形式包含约1-50mg活性成分。
本发明的化合物可以以药物组合物通过任何常规的途径来给药，具体而言，胃肠内给药，例如口服(以片剂或胶囊形式)；胃肠外给药，例如以注射用溶液或混悬液的形式；局部给药，例如以洗液、凝胶、软膏剂或霜剂的形式；或经鼻施用或栓剂的形式。
包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物与至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可用常规方式通过混合、制粒或包衣的方法进行制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊，包含活性成分与a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；和/或b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁或钙盐和/或聚乙二醇。片剂还可包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要的话，还包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾合剂；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。注射用组合物可以是水性等张溶液或混悬液，栓剂可以由含脂肪的乳剂或混悬剂来制备。
该组合物可以是无菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可含有其它有治疗价值的物质。适于透皮应用的制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体包含可吸收的药理学可接受的溶剂以帮助穿过宿主皮肤。例如，透皮装置是包含背衬膜、储库和确保装置在皮肤上的手段的绷带剂形式，其中储库含有化合物和任选含有载体，任选有控速屏障以便在延长的时间内向宿主皮肤以可控和预定的速率递送化合物。还可以使用基质型透皮制剂。适于局部应用、例如用于皮肤和眼的制剂可以是本领域众所周知的水性溶液、软膏剂、霜剂或凝胶。这些制剂可含有助溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂组合(药物组合)施用。例如，与其它免疫调节或抗炎物质组合可产生协同作用，例如当与以下药物组合时：环孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制类似物，例如环孢素A(CsA)、环孢素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制的抗体，尤其是白细胞受体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它们的配体的单克隆抗体，或其它免疫调节化合物，例如CTLA41g。当本发明的化合物与其它疗法组合施用时，共同给药的化合物的剂量自然要取决于共用药物的类型、所用具体药物以及所治疗病症等而变化。
本发明还提供了药物组合产品，例如药盒，其包含a)第一种药物，它是如本文所公开的游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，和b)至少一种共用药物。该药盒可以包含其给药说明书。
制备本发明化合物的方法
制备本发明化合物的通用方法描述于下文的实施例中。在所述反应中，可能有必要保护在终产物中期望存在的反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基，从而避免它们不期望地参与反应。常规的保护基团可以按照标准操作来使用(例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts的“有机化学中的保护基团”(Protective Groups in Organic Chemistry)，John Wileyand Sons，1991)。
通过将游离碱形式的化合物与可药用的无机或有机酸反应可制备本发明化合物的可药用酸加成盐。或者，本发明化合物的可药用碱加成盐可通过游离酸形式的化合物与可药用的无机或有机碱反应来制备。或者，盐形式的本发明化合物可以使用原料或中间体的盐来制备。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可以分别地从相应的碱加成盐或酸加成盐制备。例如通过用适合的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理，酸加成盐形式的本发明化合物可以转化为相应的游离碱。通过用适合的酸(例如盐酸等)处理，碱加成盐形式的本发明化合物可以转化为相应的游离酸。
非氧化形式的本发明化合物可由本发明化合物的N-氧化物在0-80℃下、在适合的惰性有机溶剂(例如，乙腈、乙醇、含水二噁烷等)中用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化物等)处理而制备。
本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(例如，参见Saulnier等，(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，卷4，1985页)。例如，适合的前药可以通过未衍生化的本发明化合物与适合的氨基甲酰化试剂(例如1，1-酰氧基烷基氨基碳酰氯、碳酸对硝基苯基酯等)反应来制备。
本发明化合物可以在本发明的方法中方便地制备或形成溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可以通过从水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备，采用的有机溶剂例如二噁英、四氢呋喃或甲醇。
可以通过将化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应形成一对非对映异构的化合物、分离非对映异构体并回收光学纯的对映体来制备本发明化合物的单个立体异构体。对映体拆分可使用本发明化合物的共价非对映异构的衍生物，或使用可解离的复合物(例如结晶的非对映异构的盐)来进行。非对映异构体有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可利用这些不同点容易地分离。非对映异构体可通过色谱法，或基于溶解度差异的分离/拆分技术进行分离。然后通过任何不会导致外消旋的实用方法回收光学纯对映体和拆分剂。用于从该化合物外消旋混合物中拆分出其立体异构体的技术的更详细描述可参见Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“Enantiomers，Racemates and Resolutions”，John WileyAnd Sons，Inc.，1981。
总之，式(1)、(2)或(3)的化合物可通过实施例所述的方法制备；并且
a)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；
b)任选地将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式；
c)任选地将非氧化形式的本发明化合物转化为可药用的N-氧化物；
d)任选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化为其非氧化的形式；
e)任选地从本发明化合物的异构体混合物中拆分出其单个异构体；
f)任选地将未衍生化的本发明化合物转化为可药用的前药衍生物；和
g)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其未衍生化的形式。
在文中当没有具体描述原料的制备时，这些化合物是已知的或可通过与本领域已知方法类似的方法制备或按下文实施例中所公开的方法制备。本领域技术人员应当理解，以上转化仅是制备本发明化合物的方法中的代表，并且可类似地使用其他公知的方法。
提供以下实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例1
4-氨基-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)苯基]-酰胺

4-羟基-喹唑啉-8-甲酸

在微波条件下将2-氨基-间苯二甲酸(47.63mg，0.263mmol)和甲酰胺(0.104ml，2.628mmol)的混合物在150℃搅拌30分钟。用甲醇稀释该反应混合物，过滤所得沉淀，用甲醇洗涤，得到4-羟基-喹唑啉-8-甲酸，为白色固体。¹H NMR 400MHz(DMSO-d₆)δ8.49(s，1H)，8.38(d，1H)，8.25(d，1H)，7.58(t，1H)，4.11(s，1H)，3.33(s，1H)；MS m/z 191.1(M+1)
4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸乙酯

向搅拌的4-羟基-喹唑啉-8-甲酸(500mg，2.62mmol)在EtOH的溶液中加入几滴浓硫酸，将该反应混合物在回流条件下于80℃搅拌8小时。减压浓缩该反应混合物，用2-丙醇和氯仿(1/4)的共溶剂稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机层用MgSO₄干燥并减压浓缩。所得粗产物经快速柱色谱法(正己烷/EtOAc＝1/4)纯化，得到4-羟基-喹唑啉-8-甲酸乙酯，为白色固体。
将4-羟基-喹唑啉-8-甲酸乙酯(28.8mg，0.13mmol)溶于POCl₃中，并在100℃下搅拌该反应混合物3小时。蒸发剩余的POCl₃，并将浓缩的反应混合物进一步真空干燥。将所得粗产物溶于THF中，然后用2，4-二甲氧基-苄基胺和DIEA处理。在室温下搅拌该反应混合物1小时，减压浓缩，并经制备型HPLC纯化，得到4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)喹唑啉-8-甲酸乙酯，为黄色固体。MS m/z 368.2(M+1)。
4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺

向4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)喹唑啉-8-甲酸乙酯(25.21mg，0.07mmol)在MeOH的溶液中加入1N的NaOH(2mL)，在室温下搅拌该反应混合物1小时，然后用1N的HCl中和。过滤所得沉淀并用小体积的MeOH洗涤，得到4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸，为黄色固体。
向N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(6.94mg，0.02mmol)、4-(2，4-二甲氧基-苄基氨基)-喹唑啉-8-甲酸(8.01mg，0.02mmol)和二异丙基乙胺(16.4μL，0.09mmol)在DMF的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(10.7mg，0.03mmol)。在室温下搅拌该反应混合物12小时，用EtOAc稀释并用10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤。有机层用MgSO₄干燥并减压浓缩。所得粗产物经制备型HPLC纯化，得到4-(2，4-二甲氧基-苄基胺)-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺。MS m/z 616.2(M+1)。
4-氨基-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)苯基]-酰胺

将4-(2，4-二甲氧基-苄基胺)-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺(6.53mg，10μmol)溶于三氟乙酸中，在80℃搅拌该混合物30分钟。用DMSO(1mL)稀释该粗产物，并经制备型HPLC纯化，得到4-氨基-喹唑啉-8-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰氨基)-苯基]-酰胺，为TFA盐形式。¹H NMR 400MHz(DMSO-d₆)δ10.54(s，1H)，8.73(s，1H)，8.74(d，1H)，8.64(s，1H)，8.52(d，1H)，8.40(s，1H)，8.30(d，1H)，7.97(d，1H)，7.79(t，1H)，7.71(t，1H)，7.61(dd，1H)，7.28(d，1H)，1.23(s，3H)；MS m/z466.1(M+1)。
实施例2
4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸[3-(1-乙基-吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺


4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸

向搅拌中的4-羟基-喹唑啉-8-甲酸乙酯(27.9mg，0.13mmol)在DMF的溶液中加入NaH和MeI，并于室温下搅拌该反应混合物1小时。用EtOAc稀释该反应混合物，并用10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤。有机层用MgSO₄干燥并减压浓缩。所得粗产物经制备型HPLC纯化，得到4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸乙酯，为白色固体。
向4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸乙酯(28.21mg，0.12mmol))的MeOH溶液中加入1N的NaOH(2mL)。在室温下搅拌该反应混合物1小时，然后用1N的HCl中和。过滤所得沉淀并用小体积的MeOH洗涤，得到4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸，为白色固体。¹H NMR 400MHz(DMSO-d₆)δ8.75(s，1H)，8.42(m，2H)，7.71(t，1H)，3.55(s，3H)；MS m/z 205.1(M+1)。
4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸[3-(1-乙基-吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺

向盐酸盐形式的3-(1-乙基-1-吡咯烷-2-基甲氧基-5-三氟甲基-苯基胺(13.45mg，37.23μmol)、4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸(7.60mg，37.23μmol)和二异丙基乙胺(51.8μL，0.29mmol)在DMF的溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(28.30mg，74.46μmol)。在室温下搅拌该反应混合物12小时，用EtOAc稀释，并用10％的硫代硫酸钠水溶液洗涤。有机层用MgSO₄干燥并减压浓缩。粗产物经制备型HPLC纯化，得到4-甲氧基-喹唑啉-8-甲酸[3-(1-乙基-吡咯烷-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-酰胺，为白色固体。¹H NMR 400MHz(DMSO-d₆)δ12.50(s，1H)，8.69(s，1H)，8.46(d，1H)，8.40(d，1H)，7.89(s，1H)，7.72(m，2H)，7.13(s，1H)，4.43(m，1H)，4，31(m，1H)，3.97(m，1H)，3.61(m，1H)，3.57(s，3H)，3.50(m，1H)，3.19(m，2H)，2.27(m，1H)，2.06(m，1H)，1.94(m，2H)，1.29(t，3H)，MSm/z 475.2(M+1)。
实施例3
4-氨基-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

4-氯喹唑啉-8-甲酰氯

向3，4-二氢-4-氧代喹唑啉-8-甲酸(500mg，2.6mmol)在亚硫酰氯(10mL)的混悬液中加入5滴DMF，并将该混合物回流1小时直至溶液澄清。真空除去过量的亚硫酰氯并将残余物与氯仿共蒸发。将固体悬浮在己烷中并过滤，得到标题化合物，为芥末状固体。¹H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.48(dd，1H)，8.39(dd，1H)，7.71(t，1H)。
4-氯-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

向4-氯喹唑啉-8-甲酰氯(100mg，0.44mmol)在氯仿(5mL)的溶液中加入2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯胺(117mg，0.53mmol)。在60℃下搅拌该混合物17小时，并真空除去溶剂。将粗产物容纳在乙酸乙酯中，收集固体得到标题化合物。MS m/z 411.9(M+1)。
4-氨基-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

在密封容器中将4-氯-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺在2.0N的NH₃在异丙醇(5mL)的溶液中于115℃加热30分钟。冷却后，收集沉淀，然后经硅胶纯化，用甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物，为白色结晶固体。¹H NMR 400MHz(CD₃OD)δ8.76(s，1H)，8.58(s，1H)，8.45(d，1H)，7.73(brs，1H)，6.87(s，1H)，3.98(s，6H)；MS m/z 393.1(M+1)。
实施例4
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

3-氨基-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯

向2，4-二氯-5-氟-3-硝基苯甲酸(5g，19.7mmol)在DMF(50mL)的溶液中用滴液漏斗历经15分钟逐滴加入甲醇钠(25重量％，在MeOH中，25.5mL，118.2mmol)在50mL DMF中的溶液。搅拌该反应物30分钟，将其倒入冰水(100mL)中，并用3N的HCl酸化至pH 1。过滤白色沉淀，用水冲洗并干燥，得到2，4-二氯-5-甲氧基-3-硝基苯甲酸。向2，4-二氯-5-甲氧基-3-硝基苯甲酸(1.5g，5.6mmol)在甲醇(5mL)和二氯甲烷(25mL)的溶液中加入TMSCHN₂(2.0M在乙醚中，2.8mL)直至持续出现淡黄色。将有机物浓缩得到定量产率的甲基酯。最后，用SnCl₂还原，得到标题化合物。
3-(4-氨基喹唑啉-8-甲酰氨基)-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯

按照实施例1所述的方法来制备3-(4-氯喹唑啉-8-甲酰氨基)-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯，用3-氨基-2，4-二氯-5-甲氧基苯甲酸甲酯代替苯胺。用1N LiOH的MeOH/THF溶液皂化该甲酯为混悬液。在室温下搅拌该混合物直至溶液澄清(48小时)，然后酸化至pH～5。收集沉淀并用水冲洗。与乙胺(2.0M在THF中的溶液)、HATU形成酰胺键，经反相HPLC纯化，得到最终化合物4-氨基-N-(2，6-二氯-3-(乙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺，为白色固体。MS m/z 430.1(M+1)。
实施例5
N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)-4-(5-(吗啉代甲基)吡啶-2-基氨基)喹唑啉-8-甲酰胺

向微波用的密封容器中装入4-氯-N-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺(44mg，0.11mmol)和5-(吗啉代甲基)吡啶-2-胺(62mg，0.32mmol)。加入二噁烷并将该混合物在150℃加热1小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯并收集固体。经反相LC-MS纯化该固体，得到标题化合物，为黄色固体(TFA盐)。MS m/z 569.1(M+1)。
实施例6
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-氰基-5-甲氧基苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

按照实施例4中所述的方法合成标题化合物，使用3-氨基-2，4-二氯-5-甲氧基苄腈。MS m/z 388.0(M+1)。
3-氨基-2，4-二氯-5-甲氧基苄腈

向2，4-二氯-5-甲氧基-3-硝基苯甲酸(2g，7.5mmol)中加入亚硫酰氯(40mL)和一滴DMF。回流该混悬液，并加热使该溶液澄清。2小时后，将该反应混合物冷却至室温，真空除去过量的亚硫酰氯。将残余物与氯仿共蒸，从己烷中过滤，得到酰氯。在室温下将该酰氯(500mg，1.75mmol)在氨(2.0M异丙醇溶液，10mL)中搅拌30分钟。除去溶剂得到甲酰胺。在100℃将该酰胺(100mg，0.38mmol)在POCl₃(3mL，32mmol)中脱水，除去过量的POCl₃，得到腈，其可直接用于下一步骤。在75℃将上述腈用SnCl₂(360mg，1.9mmol)在HCl和乙醇中还原，用K₂CO₃中和，并用乙酸乙酯萃取，得到标题化合物，为白色固体。
实施例7
4-氨基-N-(2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噁唑-2-基)苯基)喹唑啉-8-甲酰胺

按照实施例4中所述的方法来合成标题化合物，用2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噁唑-2-基)苯胺作为胺试剂。MS m/z 445.0(M+1)。
2，6-二氯-3-甲氧基-5-(噁唑-2-基)苯胺

向2，4-二氯-5-甲氧基-3-硝基苯甲酰氯(330mg，1.2mmol)在5mL二氯甲烷的溶液中加入氨基乙醛二乙基缩醛(209uL，1.4mmol)。完成后，浓缩该反应混合物，并从水中收集固体，得到2，4-二氯-N-(2，2-二乙氧基乙基)-5-甲氧基-3-硝基苯甲酰胺，为淡黄色固体。在惰性气体下，将甲磺酸(364uL，5.6mmol)加入上述酰胺缩醛(100mg，0.28mmol)和五氧化二磷(95mg，0.67mmol)的混合物中。将该反应混合物在140℃加热6小时，然后在冰浴中冷却，并用50％NaOH调至pH 12-13。将该混合物加热至45℃以水解甲磺酸甲酯副产物，用乙酸乙酯萃取，并经硅胶(用己烷/乙酸乙酯洗脱)纯化得到所述噁唑，为白色固体。用氯化亚锡(II)还原硝基并进行后处理，得到标题化合物。
本发明的代表性化合物在表1中进行说明。
表1







试验
本发明化合物可以进行试验来测定其抑制激酶名单的能力，所述的名单包括但不限于Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-RAF、C-SRC、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶。
B-Raf-酶测定法
可以测试本发明化合物抑制b-RAF活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中进行测定。在DPBS中稀释底物IκBα(1∶750)并在各孔中加入15μL。在4℃下将板培养过夜并采用EMBLA板洗涤器用TBST(25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。在室温下，将板用Superblock(15μL/孔)封闭3小时，用TBST洗涤3次并拍干(pat-dried)。将含有20μM ATP(10μL)的测定缓冲液加到各孔中，然后加入100nL或500nL化合物。将B-Raf在测定缓冲液中稀释(1μL稀释至25μl)，并将10μl稀释的B-Raf加到各孔中(0.4μg/孔)。在室温下将该板培养2.5小时。通过用TBST洗涤该板6次来终止激酶反应。在Superblock中稀释磷酸化-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加到各孔中。将板在4℃下培养过夜并用TBST洗涤6次。在Superblock中稀释AP-结合的山羊-抗-鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。在室温下培养该板1小时并用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μL Attophos AP荧光底物(普洛麦格(Promega)公司)，并在室温下将板子孵育15分钟。在Acquest或AnalystGT上采用荧光强度程序读板(激发波长455nm，发射波长580nm)。
B-Raf-细胞测定法
在A375细胞中测试本发明化合物抑制MEK磷酸化的能力。A375细胞系(ATCC)来自人黑色素瘤患者，它在B-Raf基因上具有V599E突变。由于B-Raf突变，磷酸化MEK的水平上升。在无血清培养基中，于37℃将亚汇合到汇合的A375细胞与化合物一起培养2小时。然后用冷PBS洗涤细胞一次，用含有1％Triton X100的裂解缓冲液裂解细胞。离心后，上清液进行SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上。随后将膜用抗-磷酸化-MEK抗体(ser217/221)(细胞信号传导公司(Ceu Signaling))进行蛋白质印迹。通过硝酸纤维素膜上磷酸-MEK带的密度来监测磷酸化MEK的量。
细胞Bcr-Abl依赖性增殖的抑制(高通量法)
鼠细胞系是用Bcr-Abl cDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。这些细胞保持在补充有50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素和200mM L-谷氨酰胺的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未经转化的32D细胞在添加15％WEHI条件培养基作为IL3来源而类似地保持。
将50μl 32D或32D-p210细胞混悬液铺在Greiner 384孔微板(黑色)中，密度为5000个细胞/孔。每孔加入50μl测试化合物(1mM的DMSO储备液)(包括作为阳性对照的STI571)。细胞在37℃、5％二氧化碳下孵育72小时。每孔加入10μl 60％Alamar Blue溶液(泰克诊断公司(Tek diagnostics))，将细胞再孵育24小时。使用Acquest^TM系统(分子装置公司(MolecularDevices))对荧光强度(激发波长530nm，发射波长580nm)进行定量。
细胞Bcr-Abl依赖性增殖的抑制
将32D-p210细胞接种在96孔TC板中，密度为15000个细胞/每孔。每孔加入50μl测试化合物的两倍系列稀释液(C_max为40μM)(包括作为阳性对照的STI571)。细胞在37℃、5％二氧化碳条件下孵育48小时后，每孔加入15μl MTT(普洛麦格(Promega)公司)，细胞另外孵育5小时。采用分光光度法对570nm处的光密度进行定量，IC₅₀值，即50％抑制所需的化合物浓度，由剂量-响应曲线确定。
对细胞周期分布的作用
将32D或32D-p210细胞接种在6孔TC板中，每孔5ml培养基、2.5×10⁶个细胞，加入1或10μM测试化合物(包括作为对照的STI571)。继而将细胞在37℃、5％二氧化碳条件下孵育24或48小时。取2ml细胞混悬液用PBS洗涤，在70％乙醇中固定1小时，并用PBS/EDTA/RNase A处理30分钟。加入碘化丙啶(Cf＝10μg/ml)，使用FACScalibur^TM系统(碧迪生物科学公司(BD Biosciences))以流式细胞法对荧光强度进行定量。在一些实施方案中，本发明的测试化合物可以证明对32D-p210细胞有凋亡作用，但不诱导32D亲本细胞凋亡。
对细胞Bcr-Abl自磷酸化的作用
Bcr-Abl自磷酸化使用c-Abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体通过捕获ELISA进行定量。将32D-p210细胞铺在96孔TC板中，每孔2×10⁵个细胞、50μl培养基。每孔加入50μl测试化合物的两倍系列稀释液(C_max为10μM)(包括作为阳性对照的STI571)。细胞在37℃、5％二氧化碳条件下孵育90分钟。继而将细胞用150μl含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，1mM EGTA和1％NP-40)在冰上处理1小时。将50μl细胞裂解物加入预先涂有抗Abl特异性抗体并封闭的96孔光学板中。将板在4℃孵育4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入50μl偶联了碱性磷酸酶的抗磷酸酪氨酸抗体，将板进一步在4℃孵育过夜。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入90μl发光底物，采用Acquest^TM系统(分子装置公司(Molecular Devices))对发光强度进行定量。在一些实施方案中，本发明的测试化合物可以抑制表达Bcr-Abl的细胞增殖，以剂量依赖性的方式抑制细胞Bcr-Abl自磷酸化。
对表达Bcr-Abl突变形式的细胞增殖的作用
测试本发明化合物对表达野生型或导致对STI571耐药或敏感性降低的突变形式的Bcr-Abl(G250E、E225V、T315I、F317L、M351T)的Ba/F3细胞的抗增殖作用。如上所述(在不含IL3的培养基中)，在10、3.3、1.1和0.37μM浓度可以测试这些化合物对表达Bcr-Abl突变体的细胞和对未转化细胞的抗增殖作用。根据如上所述获得的剂量-响应曲线来确定对未转化细胞无毒的化合物的IC₅₀值。
FGFR-3(酶测定法)
利用纯化的FGFR-3(Upstate)进行激酶活性测定，终体积为10μL，其中含有0.25μg/mL酶在激酶缓冲液(30mM Tris-HClpH7.5，15mM MgCl₂，4.5mM MnCl₂，15μM Na₃VO₄和50μg/mL BSA)中的溶液，和底物(5μg/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US公司)和3μM ATP)。制备两种溶液：将5μL第一种溶液(含有在激酶缓冲液中的FGFR-3酶)首先分配在384-孔(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中，然后加入50nL化合物的DMSO溶液，然后向每孔加入5μL第二种溶液，其含有在激酶缓冲液中的底物(聚-EY)和ATP。将反应于室温孵育1小时，加入10μL HTRF检测混合物来终止反应，所述混合物含有30mM Tris-HCl pH7.5、0.5M KF、50mMETDA、0.2mg/mL BSA、15μg/mL链霉抗生物素-XL665(CIS-US公司)和150ng/mL偶联了抗-磷酸酪氨酸抗体的穴状化合物(CIS-US公司)。于室温孵育1小时以使链霉抗生物素与生物素相互作用后，在Analyst GT(分子装置公司(Molecular Devices Corp.))上读取时间分辨荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度(从50μM按1∶3稀释至0.28nM)下的抑制百分率进行线性回归分析，计算得到IC₅₀值。在该试验中，本发明化合物的IC₅₀范围为10nM至2μM。
FGFR-3(细胞测定法)
测试本发明化合物抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR3细胞增殖的能力，这种增殖依赖于FGFR-3细胞激酶活性。将Ba/F3-TEL-FGFR3在用作培养基的补充有10％胎牛血清的RPMI 1640中培养至800,000细胞/mL混悬液。将每孔50μL细胞的培养基混悬液分配在384-孔板中，密度为5000个细胞/孔。将本发明化合物溶解和稀释在二甲基亚砜(DMSO)中。在DMSO中进行十二个点的1∶3系列稀释，产生的浓度梯度通常从10mM至0.05μM。向细胞加入50nL稀释化合物，在细胞培养箱中孵育48小时。向细胞加入最终浓度为10％的(特克诊断系统公司(TREK DiagnosticSystems))，其可用于监测由增殖细胞所产生的还原性环境。在37℃细胞培养箱中再孵育4小时后，在Analyst GT(分子装置公司(Molecular DevicesCorp.))上对来自被还原的的荧光信号(激发波长530nm，发射波长580nm)进行定量。通过对每种化合物在12种浓度下的抑制百分率进行线性回归分析，计算得到IC₅₀值。
FLT3和PDGFRβ
利用与上述FGFR3细胞活性所述相同的方法，使用Ba/F3-FLT3-ITD和Ba/F3-Tel-PDGFRβ，可以测定本发明化合物对FLT3和PDGFRβ的细胞活性的作用。
可以测试本发明化合物抑制转化的Ba/F3-FLT3-ITD或Ba/F3-Tel-PDGFRβ细胞增殖的能力，这种增殖依赖于FLT3或PDGFRβ细胞激酶的活性。采用补充有10％的胎牛血清的RPMI 1640为培养基，在悬浮液中将Ba/F3-FLT3-ITD或Ba/F3-Tel-PDGFRβ培养到至多800,000细胞/mL。将细胞在50μL培养基中以每孔5000个细胞接种于384-孔板上。在二甲亚砜(DMSO)中溶解并稀释本发明化合物。在DMSO中制备12个点的1∶3系列稀释液，以产生范围通常从10mM到0.05μM的浓度梯度。向细胞中加入50nL稀释的化合物并在细胞培养箱中孵育48小时。将(TREK Diagnostic Systems)以10％的终浓度加入细胞中，其可用于监测由增殖细胞产生的还原性环境。在37℃细胞培养箱中再孵育4小时后，在Analyst GT(Molecular Devices公司)上对来自被还原的(在530nm激发，在580nm发射)的荧光信号进行定量。通过每种化合物在12个浓度下的抑制百分率的线性回归分析来计算IC₅₀值。
FLT3、PDGFRβ、KDR、ALK、EphA/B、InsR、JAK2、C-Kit、Lck、Lyn、c-Met、Ret、Ron、Ros、Src、Syk、Tie-2、TrkB、TYK2和Zap-70(细胞测定法)
使用与上述的FGFR3细胞活性所述相同的方法，除了使用以下代替：Ba/F3-TEL-FGFR3、Ba/F3-TEL-FLT3、Ba/F3-TEL-PDGFRβ、Ba/F3-TEL-KDR、Ba/F3-TEL-ALK、Ba/F3-TEL-EphA/B、Ba/F3-TEL-InsR、Ba/F3-TEL-JAK2、Ba/F3-TEL-C-Kit、Ba/F3-TEL-Lck、Ba/F3-TEL-Lyn、Ba/F3-TEL-c-Met、Ba/F3-TEL-Ret、Ba/F3-TEL-Ron、Ba/F3-TEL-Ros、Ba/F3-TEL-Src、Ba/F3-TEL-Syk、Ba/F3-TEL-Tie-2、Ba/F3-TEL-TrkB、Ba/F3-TEL-TYK2和Ba/F3-TEL-Zap-70，分别进行了本发明化合物对FLT3、PDGFRβ、KDR、ALK、EphA/B、InsR、JAK2、C-Kit、Lck、Lyn、C-Met、Ret、Ron、Ros、Src、Syk、Tie-2、TrkB、TYK2和Zap-70的细胞活性的作用测定。
Upstate KinaseProfiler^TM-放射酶滤膜结合分析
可以评价本发明的化合物抑制激酶名单中单个成员的能力(部分的、非限制性的激酶名单包括：Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、C-Kit、C-Raf、C-SRC、CSK、EphB、FGFR3、FLT1、Fms、Fyn、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、SIK、Src、Syk、Tie2和TrkB激酶)。按该通用方法以终浓度10μM来测试化合物，一式两份，所用激酶缓冲液成分和底物对“Upstate KinaseProfiler^TM”名单中包括的不同激酶是不同的。将激酶缓冲液(2.5μl，10×，需要时含有MnCl₂)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μL)、在激酶缓冲液中的特异性或聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.1mg/ml)以及激酶缓冲液(50μM；5μl)在冰上的eppendorf管中混合。加入Mg/ATP混合液(10μL；67.5(或33.75)mMMgCl₂，450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-³²P]-ATP(3000Ci/mmol))，反应物在30℃孵育约10分钟。将反应混合物在2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电荷的肽底物)或Whatman 1号(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)的正方形纸上点样(20μL)。用于分析的正方形纸用0.75％磷酸洗涤4次，每次5分钟，并用丙酮冲洗一次(5分钟)。将分析的正方形纸移入闪烁小瓶中，加入5ml闪烁混合剂，掺入肽底物的³²P(cpm)用Beckman闪烁计数器进行定量。计算每个反应的抑制百分率。
游离形式或可药用盐形式的式(1)、(2)或(3)的化合物可以显示出有价值的药理学性质，例如在本申请中所描述的体外试验所显示的那样。在这些试验中的IC₅₀值是指导致细胞计数比使用对照并且没有抑制剂的条件下所得结果低50％时的测试化合物的浓度。一般而言，本发明化合物对于一种或多种以下激酶：Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-Raf、C-Src、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB，其IC₅₀值为1nM到10μM。
在某些实施例中，本发明化合物的IC₅₀值为0.01μM到5μM。在其他实施例中，本发明化合物的IC₅₀值为0.01μM到1μM，或者更特别是1nM到1μM。在某些实施方案中，本发明化合物对于野生型Bcr-Abl、T315IBcr-Abl和PDGFRβ的IC₅₀值为1nM-50nM。在其他实施例中，本发明化合物的IC₅₀值低于1nM或高于10μM。
式(1)、(2)或(3)的化合物在10μM时对于一种或多种下述激酶：Alk、Abl、Aurora-A、B-Raf、C-Raf、Bcr-Abl、BRK、Blk、Bmx、BTK、C-Kit、C-Raf、C-Src、EphB1、EphB2、EphB4、FGFR3、FLT1、Fms、Flt3、Fyn、FRK3、JAK2、KDR、Lck、Lyn、PDGFRα、PDGFRβ、PKCα、p38、Src、SIK、Syk、Tie2和TrkB激酶，可以具有高于50％的抑制百分率，或者在其他实施方案中可以具有高于约70％的抑制百分率。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于解释说明的目的，它们的各种变通或变化方法将提示给本领域技术人员，并且被包括在本申请的宗旨和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请引入本文作为参考，用于所有目的。