《长FISH探针的合成.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《长FISH探针的合成.pdf（18页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104099409A43申请公布日20141015CN104099409A21申请号201410045228222申请日2014020761/772,95820130305USC12Q1/68200601C12N15/1020060171申请人安捷伦科技有限公司地址美国加利福尼亚州72发明人S陈M鲁沃洛EM莱普鲁斯特74专利代理机构北京市嘉元知识产权代理事务所特殊普通合伙11484代理人陈静54发明名称长FISH探针的合成57摘要本发明涉及长FISH探针的合成，具体地提供了一种方法，其包括合成包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列的一组重叠的寡核苷酸；以一定方式组装所述重叠的。
2、寡核苷酸从而产生一个或多个双链多核苷酸，每个双链多核苷酸均包含多个探针序列；标记该一个或多个双链多核苷酸而产生一个或多个标记探针；和将所述标记探针与完整染色体原位杂交。30优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书12页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页附图4页10申请公布号CN104099409ACN104099409A1/1页21一种方法，包括A合成包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列的一组重叠的寡核苷酸；B以一定方式组装这些重叠的寡核苷酸，从而产生一个或多个双链多核苷酸，每一个均包含多个探针序列；C标记该一个或多个双链多核苷酸以产生一个。
3、或多个标记探针；和D将所述标记探针与完整染色体原位杂交。2权利要求1的方法，其中所述组装是通过将多个双链寡核苷酸彼此连接，或者通过聚合酶链式组装而完成的。3权利要求1的方法，其中所述标记是通过随机引发、缺口平移，或通过将一个或多个标记物缀合于所述一个或多个双链多核苷酸而完成的。4权利要求1的方法，其中所述探针序列的长度范围是10150个核苷酸。5权利要求1的方法，其中所述一个或多个双链多核苷酸的长度范围是3005,000个碱基对。6权利要求1的方法，其中所述探针序列在所述一个或多个双链多核苷酸中的顺序是随机的。7权利要求1的方法，其中所述一组寡核苷酸与染色体中的多个不同区域杂交，其中所述不同区。
4、域被重复序列所分隔。8权利要求1的方法，其中所述染色体是哺乳动物染色体。9权利要求1的方法，还包括E使用显微镜阅读步骤D的产物以生成杂交模式。10权利要求9的方法，还包括F将所述杂交模式与对照杂交模式进行比较。权利要求书CN104099409A1/12页3长FISH探针的合成背景技术0001染色体重排、缺失和其它畸变久已被与遗传疾病关联。染色体结构异常经常起因于同源重组中的错误。非整数倍性ANEUPLOIDY，也称作数目异常NUMERICALABNORMALITY，其中细胞中的染色体含量异常，可能由于减数分裂期间染色体不分离而发生。在EDWARDS、PATAU和唐氏综合征中会见到三倍体，其中存。
5、在染色体的三个拷贝，而不是通常的两个。结构异常和非整数倍性可能在配子GAMETE中出现，因此可能存在于受影响的人体的所有细胞中，或者它们也可以在减数分裂期间出现，导致同时具有一些正常细胞和一些异常细胞的遗传嵌合MOSAIC个体的产生。0002基因组不稳定性还会在某些细胞中，例如癌细胞中，造成复杂的染色体重排模式。常规细胞遗传学测定法，例如吉姆萨G条带分析，已经在癌细胞中鉴定了大量的癌症特异性易位和染色体异常，例如费城T9,22染色体。唐氏综合征三体、JACOBSEN综合征缺失和伯基特氏淋巴瘤易位在传统上是通过核型分析KARYOTYPEANALYSIS进行研究的。0003细胞遗传条带分析CYTO。
6、GENETICBANDING和可视化VISUALIZATION，例如M条带和光谱核型分析SPECTRALKARYOTYPINGSKY的进步已经使得人们能够对颠换和易位进行细致的分析，并能够鉴定感兴趣的癌症中染色体材料的失衡增加或缺失。荧光原位杂交FISH进一步使得人们能够使用仅与染色体中显示高度互补性的区域结合的荧光探针来检测染色体上特定DNA序列的存在或缺失。0004在开发用于检测染色体异常的技术方法方面，还存在很大的、未能满足的需求。发明内容0005提供了一种方法，其包括A合成一组重叠的寡核苷酸，该组重叠的寡核苷酸包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列；B以一定方式组装这些重叠的寡核苷酸从。
7、而产生一个或多个双链多核苷酸，其中每一个均包含多个探针序列；C标记该一个或多个双链多核苷酸而产生一个或多个标记探针；和D将所述标记探针与完整染色体原位杂交。所述一个或多个双链多核苷酸可以通过多种不同的方式，例如通过连接或通过聚合酶链式组装POLYMERASECHAINASSEMBLY，从所述重叠的寡核苷酸制备。0006附图简述0007图1是示意性图解本文所述探针合成方法的某些一般特征的图。0008图2是示意性图解本方法的一个实施方案的图。0009图3是示意性图解本方法的另一个实施方案的图。0010图4是示意性图解本方法的另一个实施方案的图。0011定义0012如本文中所使用的，术语“样品”是指。
8、含有一种或多种感兴趣的被分析物的材料或材料混合物，其通常是，但不一定是液体形式。0013如本文中所使用的，术语“基因组样品”是指含有来自生物体的遗传材料的材料或说明书CN104099409A2/12页4材料混合物。如本文中所使用的，术语“基因组DNA”是指从生物体获得的脱氧核糖核酸。术语“基因组样品”和“基因组DNA”涵盖可能已经过扩增、纯化或断裂的遗传材料。如本文中所使用的，术语“测试基因组”是指在某个研究中感兴趣的基因组DNA。0014术语“核苷酸”意图包括这样的部分MOIETIES它们不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还包含其它已经被修饰的杂环碱基。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤。
9、或嘧啶、烷基化核糖或其它杂环。此外，术语“核苷酸”包括这样的部分，其含有半抗原或荧光标记，并且可能不仅包含常规的核糖和脱氧核糖，还包含其它的糖。修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团代替，或者被官能化为醚、胺或其它。0015术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，描述由核苷酸例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的任意长度例如大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500个碱基，大于1000个碱基，直至约10,000个或更多个碱基的聚合物，其可以通过酶促或合成产生例如美国专利NO5,948,902及其引用的参考文献中所述的P。
10、NA，其能够与天然存在的核酸以类似两个天然存在的核酸的序列特异性方式杂交，例如能够参与WATSONCRICK碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶分别为G、C、A、T和U。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复N2氨基乙基甘氨酸单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键METHYLENECARBONYLBONDS与骨架相连。锁定核酸LOCKEDNUCLEICACIDLNA通常被称作无法触及的RNA，是一种修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被修饰而具有一个连接2氧和4碳的额外的桥。该桥将核糖“锁闭。
11、”为3内向北型NORTH构象，这种构象常常在A型双链体中发现。在任何期望的情况下，在寡核苷酸中LNA核苷酸可以与DNA或RNA残基混合。术语“非结构核酸UNSTRUCTUREDNUCLEICACID”或“UNA”是含有以降低的稳定性彼此结合的非天然核苷酸的核酸。例如，非结构核酸可以含有G残基和C残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在形式，即类似物，它们彼此以降低的稳定性碱基配对，但是仍然保持分别与天然存在的C和G残基进行碱基配对的能力。非结构核酸在US20050233340中有描述，本文为了公开UNA而通过援引将其并入。0016如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指核苷酸的单链多聚体，长度。
12、为约2200个核苷酸，多达500个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的，或者可以酶促制备，并且在一些实施方案中，长度为30150个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体即可以是寡核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体。寡核苷酸的长度可以是例如1020、1130、3140、4150、5160、6170、7180、80100、100150或150200个核苷酸。0017如本文中所使用的，术语“序列特异性寡核苷酸”是指仅与单倍体基因组中的单一位点结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，“序列特异性”寡核苷酸可以和所研究样品中独特的互补核苷酸序列杂交。0018如本文中所使用的，术语“互补”是指通过非共价键与感兴趣的靶核酸碱。
13、基配对的核苷酸序列。在经典的WATSONCRICK碱基配对中，DNA中的腺嘌呤A与胸腺嘧啶T形成碱基对，鸟苷酸G与胞嘧啶C形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶U代替。这样，A与T互补，而G与C互补。在RNA中，A与U互补，反之亦然。典型地，“互补”是指说明书CN104099409A3/12页5与感兴趣的靶标完全互补的核苷酸序列，从而序列中的每一个核苷酸均与靶核酸相应位置处的每一个核苷酸互补。在某些情况下，核苷酸序列可以与靶部分互补，其中不是所有核苷酸均与靶核酸所有相应位置处的每一个核苷酸互补。0019如本文中所使用的，术语“引物”是指这样的寡核苷酸，其或者是天然存在的，例如在纯化的限制性消。
14、化物中，或者是合成产生的，当将该寡核苷酸置于与某条核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱发的条件下，即有核苷酸和诱发剂如DNA聚合酶存在、且温度和PH适宜时，该寡核苷酸能够充当合成的启动点。引物可以是单链的或者双链的，并且必须足够长，以便在存在诱发剂时可以引发期望的延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源、和方法的用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有1525或更多个核苷酸，尽管它也可含有更少的核苷酸。本文中的引物经过选择以与特定靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味着，引物必须有足够的互补性以与其相应链杂交。因此，引物序列不必反映模板的确切。
15、序列。例如，在引物的5端可以附接非互补的核苷酸片段，而引物序列的其余部分与所述链互补。或者，可以将非互补的碱基或更长序列散布在引物中，只要引物序列与链的序列足够互补从而可以与之杂交，藉此形成用于合成延伸产物的模板即可。0020如本文中所使用的，术语“探针”是指这样的核酸，其与感兴趣的核苷酸序列部分或完全互补，从而能够在严格的杂交条件下与之稳定杂交。在某些情况下，靶分析物的检测需要探针与靶杂交。探针可以具有，但非必须具有与靶序列不互补的区域，只要这样的序列在严格杂交条件下不会实质性地改变探针期望的特异性即可。如果存在这些非互补区，它们可能含有5启动子序列和/或RNA转录的结合位点，限制性内切酶识。
16、别位点，或可以含有可赋予探针、靶核酸、或者探针和靶核酸二者以期望的二级或三级结构例如催化活性位点或发夹结构的序列。探针可以用能够用来检测或确认探针已与靶序列杂交的报告基团部分，例如放射性同位素、荧光基团或化学发光部分，用酶或其它配体进行标记。在某些实施方案中，探针可以固定在基质的表面上，其中基质可以具有各种构型，例如片层、珠子或其它结构。在某些实施方案中，探针可以存在于平面支持物的表面上，例如以阵列的形式。0021如本文中所使用的，术语“扩增”是指，合成与模板核酸的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性、使引物在低于引物熔点的温度下与模板核酸退火、和酶促地从引物延。
17、长以产生扩增产物。变性、退火和延长步骤可以分别进行一次。然而，一般而言，变性、退火和延长步骤进行多次例如至少510次，多达3040次，或更多次，从而使扩增产物的量增加，经常指数倍增，尽管指数扩增并不是本方法要求的。扩增通常要求存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶和对该聚合酶的最佳活性而言合适的缓冲液和/或辅助因子。术语“扩增产物”是指由此处所定义的扩增程序产生的核酸序列。0022本文中，术语“确定”、“测量”、“评估”、“评价”、“分析”和“测定”可以互换使用，指任意形式的测量，并且包括确定某要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估的存在”包括确定某物的存。
18、在量，以及确定其是否存在。0023如本文中所使用的，术语“TM”是指寡核苷酸双链体的熔解温度，在该温度一半的双链体仍保持杂交，而一半的双链体解离为单链。寡核苷酸双链体的TM可以通过实验确定或者用如下的公式预测TM815166LOG10NA041GC分数60/N，其中N是链说明书CN104099409A4/12页6长度，NA小于1M。见SAMBROOKANDRUSSELL2001MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,第三版,COLDSPRINGHARBORPRESS,COLDSPRINGHARBORNY,第10章。还存在其它用于预测寡核苷酸双链体TM的公式，且一个公。
19、式可能或多或少地适用于一个给定的条件或一组条件。0024术语“使用（USING）”具有其常规含意，并且同样意指“利用（EMPLOYING）”，例如，利用方法或组合物以达成目的。例如，如果使用程序创造一个文件，则该是执行该程序以制作文件，所述文件通常是所述程序的输出物。在另一个例子中，如果使用计算机文件，则通常是访问、读取所述文件，且使用存储于该文件中的信息以达成目的。简单地说，如果使用一种独特的标识，例如条形码，则通常是读取该独特的标识以识别，例如，与该独特的标识相关联的物体或文件。0025如本文中所使用的，术语“染色体重排”是指染色体的一个或多个部分在单个染色体内或者在染色体之间重新排列的事。
20、件。在某些情况下，染色体重排可以反映染色体结构的异常。染色体重排可以是例如颠换INVERSION、缺失、插入、或易位。0026术语“接触”意思是使之在一起。因此，当将第一个物品与第二个物品放在一起，例如使它们彼此碰到或将它们置于同一溶液中，则称第一个物品与第二个物品接触。因此“被接触样品”是寡核苷酸探针所杂交的测试染色体。0027术语“杂交”是指核酸与互补核酸通过WATSONCRICK碱基配对的特异结合。因此，术语“原位杂交”是指核酸与中期METAPHASE或间期INTERPHASE染色体的特异结合。0028术语“杂交”和“结合”在用于指示核酸时可以互换使用。0029术语“多个”、“一组”、“。
21、多”、和“群体”可以互换使用，意思是至少2个、至少10个、至少100个、至少500个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个，至少1000,000个、至少10,000,000个或者更多。0030如本文中所使用的，术语“染色体区”是指生物体基因组中连续的一段核苷酸。染色体区的长度范围可以是10KB到整个染色体，例如100KB10MB。0031“测试染色体”是从哺乳动物细胞分离的完整中期或间期染色体，其中完整染色体具有与哺乳动物细胞中存在的相同染色体相同的整体形态，例如含有着丝粒、含有端粒的长臂和含有端粒的短臂。测试染色体与参考染色体相比可以含有颠换、易位、缺失、插入或其它重排。。
22、测试染色体是所研究的染色体。0032“参考染色体”是完整的中期染色体，可以将测试染色体与其进行比较以鉴定重排。参考染色体可以任意选择。参考染色体可以具有已知的序列。参考染色体可以自身含有染色体重排。0033如本文中所使用的，术语“参考染色体区”是指将测试染色体区与之比较的染色体区。在某些情况下，参考染色体区可以具有已知的核苷酸序列，例如其序列已录入NCBI的GENEBANK数据库和其它数据库中的染色体区。0034如本文中所使用的，术语“原位杂交条件”是指允许核酸与完整染色体中的互补核酸杂交的条件。合适的原位杂交条件可以包括杂交条件和任选的清洗条件，清洗条件包括温度、变性剂浓度、盐、温育时间等。。
23、这些条件是本领域已知的。0035术语“不同的非连续区域”是指染色体上不连续的区域或间隔。0036术语“结合模式”是指一组标记探针与某个完整染色体结合的模式。说明书CN104099409A5/12页70037如本文中所使用的，术语“聚合酶链式组装”是指这样的方案，其中将多个重叠的寡核苷酸组合，并使之经历多轮引物延伸即在聚合酶和核苷酸存在下进行多轮连续的引物延伸、变性和退火使用彼此作为模板经历，从而延长寡核苷酸，借此产生含有每个起始寡核苷酸核苷酸序列的产物分子。然后，在标记之前，使用与产物分子末端位点结合的引物对产物分子进行扩增。0038如本文中所使用的，术语“使变性”是指通过将核酸双链体置于合适。
24、的变性条件下使核酸双链体的至少一部分碱基对分离。变性条件是本领域众所周知的。在一个实施方案中，为了使核酸双链体变性，可以将双链体暴露于超过双链体的TM的温度，由此使双链体的一条链从另一个链上释放。在某些实施方案中，可以通过将核酸暴露于至少90达合适的时间量例如至少30秒，多达30MIN使之变性。在某些实施方案中，可以使用完全变性条件来完全分离双链体的碱基对。在其它实施方案中，可以使用部分变性条件例如用低于完全变性条件的温度分离双链体某些部分的碱基对例如富含AT碱基对的区域可以分离，而富含GC碱基对的区域可以保持配对。核酸还可以被化学变性例如使用尿素或NAOH。0039如本文中所使用的，术语“延。
25、伸”是指通过使用聚合酶添加核苷酸使引物延伸。如果与核酸退火的引物被延伸，则该核酸充当延长反应的模板。0040术语“重叠的寡核苷酸”是指一组寡核苷酸，其中每一个寡核苷酸的某个末端例如3端与该组中另一个寡核苷酸的某个末端互补，使得重叠的寡核苷酸的各末端可以彼此杂交，并可以通过使用其它寡核苷酸作为模板被聚合酶所延伸。0041术语“彼此连结”是指彼此结合形成一个单元。多核苷酸序列可以彼此连结产生一个单一的序列。0042术语“重复序列”是指基因组中非独特的序列，例如卫星DNA、LINES、SINES，或者本来在单倍体基因组的至少两个区域内出现的序列，例如在同源基因或已被复制的基因中出现的序列。0043示。
26、例实施方案详细说明0044在更详细描述本发明之前，应当理解，本发明并不仅限于所述的特定实施方案，因此它们当然可以发生变化。还应当理解，这里所用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，并不意图有限制，因为本发明的范围仅由随附的权利要求所限定。0045当提供某个值的范围时，应该理解为还具体公开了上限和下限之间的每一个居间值，到下限的单位的十分之一，除非上下文中另有明确说明。在指明的范围中，任意指明的值或居间值与该范围中的其它指明的或居间值之间的每一个更小范围都包括在本发明之中。0046除非另外指出，否则这里所用全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所公知的相同的意思。尽管在实践或测试本。
27、发明时也可以使用与本文中所述的相似或等同的方法或材料，但是现在描述的是优选的方法和材料。0047本文通过援引并入本说明书中所引证的全部出版物和专利的内容，就像具体地逐个声明通过援引并入每一个单独的出版物或专利一样；通过援引并入这些出版物和专利是为了公开和描述与对这些出版物的引证相关联的方法和/或材料。对任何出版物的引证是出于引证其中早于申请日的公开内容的目的，而不应当被解释为了承认本发明无权基于发说明书CN104099409A6/12页8明在先而使这些出版物不构成本发明的现有技术。而且，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，其可能需要单独加以确认。0048应当注意，如本文中所使用的，以及在。
28、随附的权利要求中，除非上下文明确地另有要求，否则单数形式“一”、“一个”、和“该”包括复数形式。此外应当注意，权利要求可以使用排除任何任选元素的表述。因此，本陈述应视为将排他性术语如“唯一”、“仅”等与某一权利要求元素联用、或使用“负”限定的在先基础。0049如本领域技术人员阅读本公开文件时容易想到的，本文中所描述和例示的每个单独的实施方案都具有离散的组成成分和技术特征，其可以随时从任意其它几个实施方案的特征分离或与其它几个实施方案的特征结合而不背离本发明的教导的范围或精神。任何提到的方法都可以以提到的顺序进行，或以任意逻辑上可能的顺序进行。0050本方法的某些方面如图1所示。在某些实施方案中。
29、，该方法包括合成一组重叠的寡核苷酸2，其包含探针序列，所述探针序列中每一个与基因组4中的一个独特序列即仅与一个位置杂交。在这些实施方案中，重叠寡核苷酸的长度范围可以是50200个核苷酸或者更长。重叠寡核苷酸中每一个的一个末端例如3端与重叠寡核苷酸中另一个的一个末端互补，从而重叠寡核苷酸的末端可以彼此杂交，并且如果需要，可以用另一个重叠寡核苷酸ANOTHEROFTHEOVERLAPPINGOLIGONUCLEOTIDES作为模板加以延伸。相邻的寡核苷酸之间可以有1090重叠。在某些情况下，重叠的区域即相邻寡核苷酸之间的互补区域可以是1250个碱基，例如1530个碱基的范围。探针序列的长度范围可以。
30、是10200个，例如20150个核苷酸。取决于寡核苷酸是如何制备的例如取决于它们是刚刚合成的未处理的寡核苷酸，还是已经通过PCR进行了扩增的寡核苷酸，寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。在制备重叠寡核苷酸之后，以一定的方式组装重叠寡核苷酸，以产生一个或多个双链多寡核苷酸6，所述双链多寡核苷酸各自包含多个例如至少2个、至少5个、至少10个、至少50个、或者至少100个或更多、多达1,000个或更多探针序列。如将在下文中更详细描述的，如果寡核苷酸是单链的，则可以通过聚合酶链式组装制备所述一个或多个双链多核苷酸。在一个其中寡核苷酸为双链的实施方案中，所述一个或多个双链多核苷酸可以通过将双链寡核。
31、苷酸连接在一起来制备。在组装好所述一个或多个双链多核苷酸之后，将它们标记产生一个或多个标记探针8。标记可以用任何方便的方式完成。例如，在某些情况下，可以通过将一个或多个标记化学缀合于一个或多个双链多核苷酸来标记探针，例如使用通用连接系统UNIVERSALLINKAGESYSTEMULSTM,KREATECHDIAGNOSTICSVANGIJLSWIJKETALUNIVERSALLINKAGESYSTEMVERSATILENUCLEICACIDLABELINGTECHNIQUEEXPERTREVMOLDIAGN200118191。简而言之，ULSTM标记是基于铂II与核酸的稳定结合性质。ULS分。
32、子由与所选的可检测分子偶联的单功能铂复合体组成。或者，标记可以用缺口平移、随机引发RANDOMPRIMING、或任何其它在AUSUBEL等,SHORTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,第三版,WILEYSPEICHER等,NATUREGENETICS,12,368376,1996等,SCIENCE,494497,1996GRIFN等,CYTOGENETGENOMERES20071182414856PESCHKA等,PRENATDIAGN,1999,DEC191211439HILGENFELD等,CURRTOPMICROBIOLIMMUNOL,1999,24616974。0。
33、062在原位杂交之前，可以使探针变性。变性通常是通过在存在高PH、热例如温度约70约90、有机溶剂例如甲酰胺和卤化四烷基铵，或其组合的条件下进行温育而实施的。0063使完整的染色体在原位杂交条件下与标记探针接触。“原位杂交条件”是帮助核酸与完整染色体中的互补核酸退火的条件。杂交条件依赖于探针的浓度、碱基组成、复杂性和长度、以及温育的盐浓度、温度和长度而改变。例如，原位杂交可以在含有1X2XSSC、50甲酰胺的杂交缓冲液中、且封闭DNA以抑制非特异性杂交的条件下进行。一般地，杂交条件包括温度为约25至约55，温育时间为约05小时至约96小时。对于一组寡核苷酸和染色体靶而言的合适杂交条件可以由本领。
34、域技术人员通过常规实验加以确定。0064杂交了的染色体的荧光可以用荧光显微镜进行评估。一般地，来自激发源的具有第一波长的激发辐射通过激发光学装置OPTICS。激发光学装置导致所述激发辐射激发样品。作为响应，样品中的荧光分子发射出波长与激发波长不同的辐射。随后收集光学装置收集来自样品的发射。计算机还能够将测定期间收集的数据转换为另一种格式用于呈现。一般地，可以使用已知的机器人系统和组件。0065在某些实施方案中，可以将来自标记探针对染色体的结合的信号与参考染色体的信号进行比较。参考染色体可以来自健康的或野生型生物体。简而言之，该方法包括在原位杂交条件下使来自细胞样品的测试染色体与通过本主题方法产。
35、生的多个荧光标记的FISH探针接触，并在原位杂交条件下使参考染色体与相同的多个荧光标记的FISH探针接触。杂交之后，将从来自测试染色体的独特结合模式生成的发射光谱与参考染色体的进行比较。0066因此，通过比较标记的FISH探针对测试染色体的结合模式与相同的标记FISH探针与参考染色体的结合模式，可以确定测试染色体的结构。参考染色体的结合模式可以在确定测试染色体的结合模式之前、之后或同时加以确定。该确定可以通过人工或自动系统执行。与测试染色体相关的结合模式可以和具有已知缺失、插入、易位、脆弱位点FRAGILESITES和其它更复杂的重排和/或精细断点BREAKPOINT的预期结合模式进行比较。匹。
36、配可以使用本领域已知的基于计算机的分析软件执行。一致性的确定可以人工进行例如通过检视数据和手动比较识别标志、自动进行例如通过采用特别配置用来匹配光学可检测识别标志的数据分析软件，或组合进行。0067在另一个实施方案中，测试样品来自怀疑患有癌症的生物体，而参考样品可以包含代表野生型基因组的阴性对照非癌症样品和代表与已知的染色体重排相关的癌症的第二测试样品或阳性对照。在该实施方案中，使用本主题方法对所有这些样品彼此间进行比较，可能不仅显示测试样品是否产生与野生型基因组不同的结果，还显示测试样品是否可能与另一个癌症测试样品具有相同或相似的基因组重排。说明书CN104099409A1211/12页13。
37、0068试剂盒0069本发明还提供了用于实施如上所述的主题方法的试剂盒。在某些情况下，本试剂盒包含多组如上文讨论的重叠寡核苷酸探针。该试剂盒还可包含用于聚合酶链式组装的试剂、用于寡核苷酸PCR的试剂、连接酶、用于荧光标记双链多核苷酸的试剂、用于原位杂交的试剂、和/或要在主题方法中使用的参考样品。试剂盒的各种组分可以位于不同的容器内。0070除了上述组分之外，本试剂盒可以进一步包括使用试剂盒的组分实施本方法的说明书。用于实施主题方法的说明书一般被记录在合适的记录媒介上。例如，说明书可以打印在基质，例如纸或塑料等上面。这样，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组分的容器的标签上即。
38、与包装或分包装在一起，等等。在其它实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存储于合适的计算机可读存储介质上，例如CDROM、磁盘等。在另外的实施方案中，试剂盒中并不实际存在说明书，但提供了从远程来源例如通过互联网获取说明书的手段。该实施方案的一个实例是试剂盒包含一个万维网地址，在那里可以查看和/或下载使用说明书。和说明书一样，这种获得说明书的手段被记录在合适的基质上。0071实用性0072本发明可应用于多种应用，其中这些应用一般包括基因组DNA分析应用，其中要检测给定样品中特定染色体重排的存在。本方法还可以用于在某些情况下，在没有有关染色体断点和其它畸变例如微颠换MICROINVERSION、缺。
39、失和易位的位置的先验知识的条件下对染色体断点和其它畸变进行精细定位。0073在一些实施方案中，一组本主题探针与靶染色体的杂交可以提供多颜色模式。使所研究的染色体，其可能被怀疑或不被怀疑含有染色体重排，与标记的探针接触。杂交之后，对探针的结合模式进行分析，如上所述。0074具体的感兴趣的检测应用不仅包括染色体重排和畸变。基因组分析测定的一个实施方案允许检测染色体颠换。在该实施方案中，该测定使对参考染色体区的某个区域特异性的探针在原位杂交条件下接触。如果测试染色体区含有被颠换的染色体节段其可以通过特征发射光谱的特定改变观察到，则表明发生了颠换。将探针的位置与数据库进行匹配，可以提供探针所杂交的测试。
40、染色体的核苷酸序列信息。使用该序列信息，可以揭示颠换关节点JUNCTION的详细位置。0075本主题方法还可用于检测染色体重排。在该实施方案中，该测定使对参考染色体区的某个区域特异的探针在原位杂交条件下接触。如果测试染色体区含有新近被并置的来自远离的染色体区域这些区域通过其特征性发射光谱可视化的节段，则表明发生了易位或复杂的染色体异常。在某些情况下，可以利用来自描述起始探针的数据库的序列信息来揭示易位节点的位置。0076本主题方法可以用于多种诊断和研究目的，因为染色体颠换和易位在与人类疾病相关的条件下和在许多生物体的基因组进化中发挥重要的作用。0077特别地，上述方法可用于诊断或研究各种类型的。
41、遗传异常、癌症和其它哺乳动物疾病，包括但不限于，白血病；乳腺癌；前列腺癌；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；肌萎缩侧索硬化；多发性硬化；卒中；自闭症；猫叫综合征CRIDUCHAT5号染色体短臂说明书CN104099409A1312/12页14截短、1P36缺失综合征染色体1短臂部分缺失、ANGELMAN综合征15号染色体长臂部分缺失；PRADERWILLI综合征15号染色体短臂部分缺失；急性淋巴细胞白血病，更具体地，慢性髓细胞白血病9号染色体和22号染色体之间易位；腭心面综合征VELOCARDIOFACIALSYNDROME22号染色体长臂部分缺失；特纳综合征单X染色体；KLINEFELTER。
42、综合征多一条X染色体；爱德华氏综合征18号染色体三体性；唐氏综合征21号染色体三体性；PATAU综合征13号染色体三体性；和8、9和16号染色体三体性，其一般不能存活到出生。0078疾病可能是遗传继承性的种系突变或散发性的体细胞突变。本文中讨论的许多示例性染色体重排与这些病症相关，并且被认为是产生这些病症的因素。知晓染色体重排的类型和位置可以极大地帮助对各种哺乳动物疾病的诊断、预后和理解。0079上述方法还能够用于比较两个生物物种的基因组，以推演进化关系。0080染色体可以从多种来源分离而得，包括组织培养细胞和哺乳动物受试者，例如人、灵长动物、小鼠或大鼠受试者。例如，可以对来自少于5毫升ML外。
43、周血的染色体进行分析。白细胞含有染色体而红细胞没有。可以采取血液并与抗凝剂例如肝素钠混合。还可以对来自羊水其含有胎儿细胞的染色体进行分析。可以使这些细胞在组织培养中生长，从而在510天内便有分裂中的细胞可用于染色体分析。还可以对来自骨髓的染色体进行分析，其可用于诊断白血病或其它骨髓癌症。还可以对来自实体瘤样品的染色体进行分析。可以无菌地获得约23MM范围的皮肤或其它组织活检，并转移到含有无菌生理盐水或组织输送介质的无菌瓶中，以提供用于染色体分析的材料。流产后获得的胎儿组织也能够用于染色体分析，例如对来自胎盘的胎儿侧、覆盖胸骨的骨膜或腹股沟韧带上面的筋膜的染色体，或来自绒毛膜绒毛的染色体。胎儿组。
44、织还可以从多个部位收集，例如肾脏、胸腺、肺、膈膜、肌肉、腱、和性腺。还可以进行羊膜腔穿刺术。0081除了上面以外，还可以对例如骨髓涂片、血涂片、石蜡包埋组织制备物、酶解离组织样品、未培养的骨髓、未培养的羊水细胞和细胞离心涂片制备物实施本方法。0082本文通过援引并入本说明书中所引证的全部出版物和专利申请，就像具体地逐个声明通过援引并入每一个单独的出版物或专利一样。对任何出版物的引证是出于引证其中早于申请日的公开内容的目的，而不应当被解释为了承认本发明无权基于发明在先而使这些出版物不构成本发明的现有技术。0083尽管出于澄清理解的目的通过图解和举例的方式对前述发明进行了一定程度的描述，但是本领域技术人员根据本发明的教导可以容易地想到，在不背离附加权利要求精神和范围的前提下可以实现某些变化和修改。说明书CN104099409A141/4页15图1说明书附图CN104099409A152/4页16图2说明书附图CN104099409A163/4页17图3说明书附图CN104099409A174/4页18图4说明书附图CN104099409A18。