一种穿心莲内酯分离纯化方法.pdf

一种穿心莲内酯分离纯化方法，是一种集成采用溶剂除杂-溶剂萃取分离-柱层析-超临界流体抗溶剂结晶方法对穿心莲浸膏进行加工制备高纯穿心莲内酯单体。用氯仿除杂、乙酸乙酯萃取；柱层析填料(固定相)采用氧化铝等，流动相为正己烷与甲醇溶剂；超临界CO2抗溶剂结晶，结晶条件为：压力≤20MPa，温度≤80℃。产品含量最高可达99％以上。该分离纯化工艺，方法简便、成本低、易于工业生产应用。

1、  一种穿心莲内酯分离纯化方法，以15％左右穿心莲内酯单体的浸膏为起始原料，包括萃取除杂、萃取分离、柱层析分离和结晶纯化，其特征在于：所述的萃取分离是穿心莲浸膏溶于30～45℃温水中先用氯仿进行除杂，再用乙酸乙酯萃取至少两次，萃取液脱溶得到固体粉末，然后用色谱柱层析分离，混合溶剂洗脱，收集含量≥70％穿心莲内酯流份，真空浓缩成饱和溶液，最后用超临界CO₂抗溶剂结晶纯化，压力12～20MPa、温度55～80℃。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：层析色谱柱固定相选自氧化铝。

3、  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：层析色谱柱流动相为正己烷与甲醇混合溶剂，正己烷与甲醇体积比4∶6～5∶5。

一种穿心莲内酯分离纯化方法
一、技术领域
本发明涉及中药有效成分分离纯化方法，确切地说是一种穿心莲内酯分离纯化方法。
二、背景技术
穿心莲[Andrographis paniculate(Burm.f.)Nees]为爵床科植物穿心莲的全草或叶。别名：春莲秋柳(《岭南采药录》)、一见喜(《泉州本草》)、榄核莲、苦胆草、斩蛇剑、日行千里、印度草(广东)，苦草(福建)等。原产于印度，我国主产于华南、西南等长江以南温暖、湿润地区、其气味苦、性寒、归大肠、心、肺、膀胱经，具有清热解毒、凉血、消肿的功效。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。穿心莲内酯(Andrograholide)是中药穿心莲的主要活性成分之一。1986年Boorsma首先从穿心莲中分离得到一个分子式为C₂₀H₃₀O₅的无色结晶，1911年Gorter证明所分离得到的是一种内酯类化合物，因而将其命名为Andrograholide(穿心莲内酯)。其后的50多年的研究中，人们集中在其化学结构、理化性质、及提取工艺等方面的研究。
穿心莲内酯是穿心莲内酯类化合物(总内酯)中的一种单体，别名：穿心莲乙素，雄茸内脂；分子式C₂₀H₃₀O₅，分子量350.44，为二萜内酯类有机小分子化合物；白色方棱形片状结晶(乙醇或甲醇)，无臭，味苦。在沸乙醇中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，极微溶于氯仿，在水或乙醚中几乎不溶。熔点230～231℃。有以下化学结构式：

穿心莲提取物在大鼠和小鼠身上进行动物实验推断所有四种内酯都具有刺激肾上腺所得抗炎症能力以及抗发热能力。其活性要素和其标准是基于穿心莲内酯。标准的提取物应含有50～95％的穿心莲内酯。在1896年伯斯马首次从穿心莲中分离穿心莲内酯。在1911年，柯特确认该成分为内酯类物质，其主要药理学活性为抗过敏，抗HIV病毒，抗炎症和抗感染作用。
穿心莲内酯可预防BHC诱导γ-谷氨酰基转肽酶，谷胱甘肽-S-转移酶的酶活性和脂类过氧化反应，显示出抗老化、护肝、保护内皮功能和维持氧化-氮/内皮素平衡等功能；迄今为止穿心莲内酯是作为保肝剂，抗血小板剂和抗血栓剂为人所知，也能阻止内脏吸收葡萄糖，有降血糖功能；另外，穿心莲内酯可抑制HIV病毒导致的细胞循环障碍，导致HIV-1感染患者的CD4(+)淋巴细胞水平上升。
鉴于穿心莲内酯有上述专属性功效，有必要进行分离纯化，为中药新药开发提供优质原料。国内对穿心莲内酯类化合物提取分离研究比较早，也比较多。早期主要以水浸提、乙醇提取、碱水提取为主，得到的产品为粗提物(穿心莲总内酯含量在30％左右)。目前也有采用新技术提取分离穿心莲内酯，取得了一定的成效，如南开大学采用大孔吸附树脂提取穿心莲总内酯的研究(范去鸽，张秀莉，史作清，等.《离子交换与吸附》，2002，18(1)：30-35)；也有采用超临界流体技术提取穿心莲总内酯(葛发欢，林秀仙，黄晓芬，等.《中药材》，2002，25(2)：101-102)，产品质量相对传统工艺有所提高，但在提高产品纯度上没有明显优势，只是以穿心莲内酯总内酯为考察指标的粗提物；也有采用超临界流体萃取技术提取分离穿心莲内酯专利报道，如专利：一种提取穿心莲有效成份的方法(专利号：ZL00114213.5)。国内外对穿心莲内酯单体提取分离研究的报道较少。
关于穿心莲内酯提取分离方法的授权或申请发明专利有2件：
(1)ZL200510105514.4(张文生，《一种穿心莲内酯制备方法》)：该发明涉及一种穿心莲内酯制备方法，特别是涉及用大孔树脂分离纯化穿心莲内酯的方法。大孔树脂吸附分离后再通过硅胶柱脱色，最后采用丙酮重结晶，最后获得98％以上的目标物质。
(2)CN101168537A(申请号200710142800.7，《同时制备穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的方法》：该发明是以穿心莲全草为原料，采用醇溶剂进行提取，再上大孔树脂进行吸附分离，用不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，分别获得较高纯度的目标物质，再进行溶剂结晶，可获得97％的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯。
目前制备高纯度萜内酯类化合物大都采用有机溶剂反复重结晶方法，其耗时长、得率低，且纯度也难于达到98％以上。
三、发明内容
本发明旨在为开发I类中药新药提供高纯度的原料穿心莲内酯，所要解决的技术问题是穿心莲内酯的分离和纯化。
本发明的技术方法是以穿心莲浸膏(穿心莲总内酯含量≥30％)为起始原料，浸膏经过氯仿脱脂和除去大部分脱水穿心莲内酯和去氧穿心莲内酯后，再用乙酸乙酯进行萃取，脱溶后得到浅黄色的粗晶体，再上色谱柱，接收含量70％以上的穿心莲内酯单体组份，浓缩为饱和溶液后，再进行超临界流体抗溶剂结晶。
所谓的超临界流体抗溶剂结晶，就是以超临界流体为逆溶剂，其与溶质、溶剂形成的溶液相混合，快速带走溶剂和部分杂质使溶液在较短的时间内形成较高的过饱和度，溶质结晶析出，得到纯度高，粒径分布均匀的微粒。一般选CO₂为超临界流体。
具体技术方案是：
将穿心莲浸膏溶解于温水中，先用氯仿萃除杂，萃余物(水相))再用乙酸乙酯进行萃取，萃取液脱溶后上色谱层析柱，并用混合溶剂洗脱，接收含量70％以上的穿心莲内酯单体组份，再进行超临界CO₂抗溶剂结晶，通过控制压力、温度、时间进行结晶，经3次抗溶剂结晶后，可制得99％上的穿心莲内酯高纯品。
具体操作步骤如下：
(1)首先将穿心莲浸膏溶解到10-20倍体积的30～50℃温水中，选择氯仿进行预除杂，再采用乙酸乙酯进行溶剂萃取至少2次；
(2)将萃取液合并、脱溶后，进行柱层析分离，分离介质(固定相)选自氧化铝等，流动相选自正己烷与甲醇的混合液，进行分段收集流份，主要收集含量70％以上的目标物质流份；
(3)将上述收集到的流份合并、浓缩成过饱和溶液后，进行超临界CO₂抗溶剂结晶，控制在压力12～20MPa，温度在55～80℃，时间在50～90min；
(4)停机后收集首次抗溶剂结晶产物，产品纯度达90％左右；
(5)将上述收集到的结晶产物再配成饱和溶液，抗溶剂结晶2次，可制得纯度99％以上穿心莲内酯。
本发明为相关企业提供一种纯度达99％以上的穿心莲内酯分离纯化方法。超临界流体抗溶剂结晶不但具有传统的细化微粒的效果，同时具有脱除溶剂和萃取微量杂质等功能，从而达到结晶纯化效果；结晶析出穿心莲内酯的结晶条件要求较低，一般压力小于20MPa，温度80℃以下，所析晶体纯度高，可达到99％以上，适合高纯物质的制备。本法工艺简单，无需冷冻干燥或喷雾干燥等复杂耗能工艺。同时其得率也较传统工艺高，穿心莲内酯纯度超过99％，收率≥50％(以浸膏中穿心莲内酯单体计)，适合批量生产。穿心莲浸膏产品目前市场饱和，价格便宜，运输方法，既可提高分离纯化的生产效率，又可降低层析柱的污染。
三、具体实施方式
实施例1：
①称取1kg含穿心莲内酯单体15％以上浸膏，按1∶15(W/V)的固液比溶于30℃温水中，先用氯仿进行萃取，按1∶8(W/V)的固液比萃取2次除杂；
②再将萃余物采用乙酸乙酯萃取，按1∶10(W/V)的固液比萃取两次，溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到氧化铝色谱柱中，用正己烷与甲醇(40％∶60％～50％∶50％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上穿心莲内酯流份；
③将上述流份合并、浓缩成饱和溶液(至有微量晶体析出)，冷却到40～50℃，再放置于超临界CO₂结晶釜中，结晶压力控制在13MPa，温度在65℃，进行超临界CO₂抗溶剂结晶；
④在超临界状态下结晶70min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在90％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃左右乙醇溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
⑥过程⑤重复两次；
⑦试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯穿心莲内酯单体76.5g。
实施例2：
①称取1kg含穿心莲内酯单体15％以上浸膏，按1∶20(W/V)的固液比溶于40℃温水中，先用氯仿进行萃取，按1∶8(W/V)的固液比萃取2次除杂；
②再将萃余物采用乙酸乙酯萃取，按1∶10(W/V)的固液比萃取两次，溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到氧化铝色谱柱中，用正己烷与甲醇(40％∶60％～50％∶50％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集70％以上酯流份；
③将上述流份合并、浓缩成饱和溶液(至有微量晶体析出)，冷却到45℃左右，现放置于超临界CO₂结晶釜中，结晶压力控制在17Mpa，温度在55℃，进行超临界CO₂抗溶剂结晶；
④在超临界状态下结晶50min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在90％以上；
⑤将上述结晶产物用45℃左右乙醇溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
⑥过程⑤重复两次；
⑦试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯穿心莲内酯77.4g。