苔藓素组合物、其制备方法和用途.pdf

本发明的实施方案描写了新型苔藓素组合物、制备方法和治疗疾病的方法。

权利要求书
1.  第一苔藓素组合物，其分子量为约896-898Amu(质量+钠)和873-875Amu(单一同位素质量)，纯度为约50％至晶体成型纯度。

2.  根据权利要求1所述的第一苔藓素组合物，其测量的质量+钠为897.2Amu并且测量的单一同位素质量为874.2Amu。

3.  第二苔藓素组合物，其分子量为约910-912Amu(质量+钠)和888-890Amu(单一同位素质量)，纯度为约50％至晶体成型纯度。

4.  根据权利要求3所述的第二苔藓素组合物，其测量的质量+钠为911.5Amu并且测量的单一同位素质量为888.9Amu。

5.  第三苔藓素组合物，其分子量为约868-870Amu(质量+钠)和846-848Amu(单一同位素质量)，纯度为约50％至晶体成型纯度。

6.  根据权利要求5所述的第二苔藓素组合物，其测量的质量+钠为869.5Amu并且测量的单一同位素质量为846.6Amu。

7.  第四苔藓素组合物，其分子量为约895-897Amu(质量+钠)和872-874Amu(单一同位素质量)，纯度为约50％至晶体成型纯度。

8.  根据权利要求7所述的第四苔藓素组合物，其测量的质量+钠为895.5Amu并且测量的单一同位素质量为872.6Amu。

9.  一种制备苔藓素组合物的方法，包括以下步骤：从苔藓素来源分离苔藓素组合物并将所述苔藓素组合物纯化至50％的纯度和晶体成型纯度，所述苔藓素组合物选自由第一苔藓素、第二苔藓素、第三苔藓素和第四苔藓素组成的苔藓素组。

10.  一种治疗对苔藓素组合物有反应的疾病的方法，包括施用有效量的选自第一苔藓素、第二苔藓素、第三苔藓素和第四苔藓素的苔藓素组合物的步骤。

说明书苔藓素组合物、其制备方法和用途
相关申请
本申请要求2012年11月27日提交的美国临时专利申请61/730,227的权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦赞助的声明
本申请的发明受联邦赞助以美国国家衰老研究所和美国国家卫生研究院(National Institute of Aging and National Institutes of Health)授权编号SR44AG034760研发。
技术领域
本发明的实施方案涉及具有在神经退行性疾病(例如郝秦生氏病(Hutchinson Disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、唐氏综合征(Down’s syndrome)和阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease))、病毒潜伏性疾病例如HIV和疱疹、癌症例如前列腺癌和其它淀粉样蛋白介导的疾病例如青光眼中具有作为治疗剂的实用性的组合物。
发明背景
神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病、郝秦生氏病、帕金森氏病、克鲁病(Kuru)、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)和其它海绵状脑病仍然是主要的健康问题。目前治疗这些疾病的方式非常有限。至于阿尔茨海默氏病、郝秦生氏病和帕金森氏病，这些疾病本身往往在老年人中出现并且随着疾病进展，患病个体不大能够照顾自己。神经变性疾病与β-淀粉样斑块的形成相关。苔藓抑素1(Bryostatin 1)刺激使产生可溶性淀粉样前体蛋白的α-分泌酶生成增多的蛋白激酶C(PKC)的某些亚型生成，从而抑制β-淀粉样斑块。至于癌症例如前列腺癌，苔藓抑素1通过差异性调节蛋白激酶C(PKC)δ易位和防止PKCδ介导的肿瘤坏死因子-α释放，抑制前列腺癌细胞中佛波酯(phorbol ester)诱 导的凋亡。至于病毒潜伏性疾病例如HIV潜伏性疾病，苔藓抑素-1以及许多PKC激动剂激活结合HIV-1启动子并调节其转录活性的细胞转录因子例如NF-kB。在HIV-1潜伏性疾病中，病毒启动子不大易接近细胞转录因子，因为病毒启动子周围的核组蛋白去乙酰化(染色质紧密)。因此HDAC抑制剂可增加组蛋白的乙酰化(染色质放松)，然后转录因子可能容易接近HIV启动子。
苔藓素(Bryoid)由为复杂环状大环内酯分子的苔藓抑素族组成。最初从海生苔藓虫——总合草苔虫(Bulgula neritina)——中分离出少量苔藓素。合成方法困难且昂贵。已经鉴定出约20种苔藓素组合物，称为苔藓抑素并且编号为1-20。已知许多苔藓素拥有抗癌性。
具有拥有高效力和活性的新型苔藓素化合物将是有用的。
发明内容
本发明的实施方案描写了第一苔藓素组合物，其分子量为约896-898Amu(质量+钠(Mass+Sodium))，纯度为约50％至晶体成型纯度。第一苔藓素组合物也可表征为分子量为约873-875Amu(单一同位素质量)，具有约50％的纯度和晶体成型纯度的苔藓素化合物。第一苔藓素组合物测量的质量+钠为897.2Amu并且测量的单一同位素质量为874.2Amu。以下的详细讨论将这种苔藓素称为B10。
本发明的实施方案描写了第二苔藓素组合物，其分子量为约910-912Amu(质量+钠)，纯度为约50％至晶体成型纯度。第二苔藓素组合物也可表征为分子量为约888-890Amu(单一同位素质量)，具有约50％的纯度和晶体成型纯度的苔藓素化合物。第二苔藓素组合物测量的质量+钠为911.5Amu并且测量的单一同位素质量为888.9Amu。以下的详细讨论将这种苔藓素称为B12。
本发明的实施方案描写了第三苔藓素组合物，其分子量为约868-870Amu(质量+钠)，纯度为约50％至晶体成型纯度。第三苔藓素组合物也可表征为分子量为约846-848Amu(单一同位素质量)，具有约50％的纯度和晶体成型纯度的苔藓素化合物。第三苔藓素组合物测量的质量+钠为869.5Amu并且测量的单一同位素质量为846.6Amu。以下的详细讨论将这种苔藓素称为B14B。
本发明的实施方案描写了第四苔藓素组合物，其分子量为约895-897Amu(质量+钠)，纯度为约50％至晶体成型纯度。第四苔藓素组合物也可表征为分子量为约872-874Amu(单一同位素质量)，具有约50％的纯度和晶体成型纯度的苔藓素化合物。第四苔藓素组合物测量的质量+钠为895.5Amu并且测量的单一同位素质量为872.6Amu。以下的详细讨论将这种苔藓素称为B14C。
本发明的这些苔藓素化合物的分子量与苔藓抑素1-20的分子量不同。
如本文所使用，晶体成型纯度意指所述组合物具有使得组合物能够形成晶体的纯度。通常，此类纯度高于90％，并且更常高于95％纯度。本申请中提出的实施例描写了纯度高于99％的组合物。晶体纯度将包含其中未检测到杂质的组合物，但没有这样限制。
本发明的苔藓素组合物在治疗苔藓素反应性病况例如神经退行性疾病、癌症和病毒潜伏性疾病中有实用性。本发明的苔藓素组合物是蛋白激酶C(PKC)某些亚型和淀粉样前体蛋白的高活性调节剂。本发明的苔藓素和苔藓素组合物刺激增多将淀粉样前体蛋白转化为可溶形式的α(alpha)-分泌酶的生成的蛋白激酶C(PKC)的某些亚型生成。本发明的苔藓素组合物表现出与苔藓抑素1类似或更高的高活性水平。
本发明的一个实施方案涉及对苔藓素例如苔藓抑素1-20有反应性的疾病例如神经退行性疾病、癌症和病毒潜伏性疾病的治疗。所述方法包括施用有效量的选自第一苔藓素组合物、第二苔藓素组合物、第三苔藓素组合物和第四苔藓素组合物的至少一种苔藓素组合物的步骤。
本发明的实施方案还包括选自第一苔藓素组合物、第二苔藓素组合物、第三苔藓素组合物和第四苔藓素组合物、呈用于向患者施用的剂型的苔藓素组合物。所述剂型可呈许多形式，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服剂型，例如片剂、凝胶胶囊、胶囊剂、口服液和混悬液；气溶胶，例如用于向肺部或鼻通道施用的喷雾或生雾溶液，局部形式例如软膏、洗剂、贴片和喷雾；和本领域中已知的其它剂型。
本发明的另一实施方案涉及制备选自第一苔藓素组合物、第二苔藓素组合物、第三苔藓素组合物和第四苔藓素组合物的苔藓素组合物 的方法，包括从苔藓素来源分离苔藓素组合物并将所述苔藓素组合物纯化至50％的纯度和晶体成型纯度。苔藓素来源优选为海生苔藓虫，总合草苔虫。
查看附图并阅读下面的详细描述后，本发明的这些和其它特征及优点将显而易见。
附图简述
图1描绘了苔藓抑素1的高效液相色谱扫描；
图2描绘了总合草苔虫乙酸乙酯(EA)粗提物的HPLC色谱图；
图3描绘了苔藓抑素类组合物纯化步骤的流程图；
图4描绘了由体现本发明方方面面的苔藓抑素-1和其它提取物诱导的α-分泌酶活性；
图5描绘了苔藓素混合物的色谱图；
图6描绘了苔藓素混合物的色谱图并鉴定了在265nm下监测的保留时间；
图7描绘了265nm下不同苔藓素的紫外光谱；
图8-1描绘了从700-1000Amu扫描，苔藓抑素1的质谱；
图8-2描绘了从700-1000Amu扫描，具有与苔藓抑素2相关的内部标识104和B08的馏分的质谱；
图8-3描绘了从700-1000Amu扫描，具有与苔藓抑素3相关的内部标识106和B14的馏分的质谱；
图8-4描绘了从700-1000Amu扫描，具有体现本发明方方面面的内部名称112和B16的馏分的质谱；
图8-5描绘了从700-1000Amu扫描，具有与苔藓抑素-3相关的内部名称102及B12和B14的馏分的质谱；
图8-6描绘了从700-1000Amu扫描，具有内部名称103及B10和B12的馏分的质谱；
图8-7描绘了从700-1000Amu扫描，具有与苔藓抑素-3相关的内部名称105及B12和B14的馏分的质谱；
图9描绘了第一苔藓素组合物和第二苔藓素组合物的紫外光谱；
图10描绘了10-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经 母细胞瘤细胞中α-分泌酶活性的影响；
图11描绘了10-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中PKC-ε活性的影响；
图12描绘了10-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中PKC-δ活性的影响；
图13描绘了10-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中PKC-α活性的影响；
图14描绘了第一苔藓素的拟议结构；
图15描绘了第二苔藓素的拟议结构；
图16描绘了苔藓抑素-3的NMR图谱；
图17描绘了第一苔藓素的NMR图谱；及
图18描绘了第二苔藓素的NMR图谱。
发明详述
现将就选自第一苔藓素组合物(有时称为B10)、第二苔藓素组合物(有时称为B12)、第三苔藓素组合物(有时称为B14B)、第四苔藓素组合物(有时称为B14C)的苔藓素组合物描述本发明的实施方案。本发明的这些苔藓素组合物的分子量与苔藓抑素1-20的分子量不同，除似乎是苔藓抑素3的立体异构体的B12外。
分馏总合草苔虫产生苔藓抑素馏分(苔藓素)并分离单独苔藓素。
HPLC分析
使用15cm 5μm Phenomenex Luna PFP(2)柱(UPS包装L43)和每升用50μl 85％H3PO4酸化的60％乙腈流动相，通过HPLC分析苔藓抑素-1。流量设为1.0mL/min并且柱温设为30℃。使用并入996型光电二极管阵列检测器的Waters Millennium系统生成色谱扫描(图1)。在265nm下监测苔藓抑素-1，并且同时报道从195nm到345nm的等高线图。
苔藓抑素-1生产和表征：
在前两个步骤中，用包括异丙醇、甲醇、乙酸乙酯和水的有机溶剂从湿总合草苔虫中提取苔藓抑素，接着使用由己烷/亚甲基氯和乙酸乙酯/甲醇组成的流动相进行硅胶柱层析，或可选地用SuperFluidsTM(有 或无助溶剂的近临界和超临界流体)二氧化碳和甲醇从经洗涤、干燥和碾磨的总合草苔虫提取并且用二氧化碳和甲醇通过SuperFluidsTM硅胶柱层析部分纯化(Castor，1998，2001)。
第三步是在CG71聚合树脂(Rohm-Haas)上用由甲醇和水组成的流动相将苔藓抑素-1的纯度提高至60-70％的分段层析。第四步利用使用两根半制备级HPLC C18柱(Baker Scientific，Phenomenex)，用由乙腈和水组成的流动相的分段层析法以将苔藓抑素-1纯度提高至＞95％。第五步利用用乙腈和水的结晶法以将苔藓抑素-1纯化至＞98.5％。
通过紫外(UV)光谱以及高效液相层析(HPLC)保留时间与马里兰州贝塞斯达美国国家癌症研究所(NCI)、国家卫生研究院(NIH)提供的标准保留时间，确认苔藓抑素-1产物的同一性。还通过质谱(MS)数据以及通过元素分析、质子和碳核磁共振(NMR)、红外光(IR)谱法、差示扫描量热法(DSC)和熔点单独确认苔藓抑素-1产物的同一性。
苔藓抑素-1纯化至99.64％CP
纯化工序和结果：
国家癌症研究所(NCI)提供的总合草苔虫的乙酸乙酯提取物(样品C-021519#7)用作起始原材料。总共～57g的乙酸乙酯提取物溶于二氯甲烷(DCM)中并且经化验确定苔藓抑素-1和其它苔藓素的存在。现翻到图2，描绘了总合草苔虫乙酸乙酯粗提物的HPLC色谱图。有标签的箭头表示苔藓抑素样化合物的内部名称，包括B10、B12和苔藓抑素3(B16)及苔藓抑素-2(Bryo-2)和苔藓抑素-3(Bryo-3)。苔藓抑素-1(Bryo-1)在24.2min时洗脱。名称B10是与本发明的第一苔藓素相对应的苔藓素。B14的名称将指向本发明的第三和第四苔藓素。
如图3所示，使用各种层析树脂从总合草苔虫乙酸乙酯粗提物纯化苔藓抑素-1。初始步骤(步骤1和步骤2)在活性硅胶(100-200μm)上进行，并且样品随着DCM中乙酸乙酯浓度增加而洗脱。硅胶纯化步骤用于从乙酸乙酯粗提物中去除一些有色组分，非极性化合物(在层析操作结束时洗脱，图3)并且消除大部分B16峰。
接下来，在Amberchrom CG71上纯化含苔藓抑素-1的馏分，这样允许用酸化甲醇和水洗脱苔藓抑素样化合物。这种树脂有助于将对环境有害的氯化溶剂的使用减到最少。CG71纯化步骤去除了在苔藓抑素 -1之前洗脱的‘X5’峰。也用于将就在苔藓抑素-1之前的杂质，主要为B16减到最少。
使用Amicon C18 40μm树脂和两根制备级C18柱(2.5×2.5cm，10μm柱)的组合进行后续纯化。这个步骤允许将B12和Bryo-3与苔藓抑素-1进一步分离，尽管在苔藓抑素-1肩部仍然存在‘x5’峰。最终结晶步骤导致将苔藓抑素-1纯化至＞99％色谱纯度(CP)，从粗提物的回收率为69％。
HPLC监测：
图3概述的每个纯化步骤期间，在Luna C18(2)柱(250×4.6mm，10μm)上监测苔藓抑素-1。以经磷酸(ACNP)酸化的80％乙腈在恒溶剂模式下以2mL/min流量进行洗脱。柱温设为30℃。
苔藓抑素样化合物(苔藓素)
分馏总合草苔虫产生可用作苔藓抑素-1替代物的苔藓抑素馏分(苔藓素)。这些馏分经纯化并送至LSU进行体外分析(表1)。
表1：通过HPLC测定的馏分中每种苔藓素的量(mg)1

CP对应于黑体的苔藓素。
苔藓抑素-1类似物(苔藓素)在s-APPα分泌诱导中的效力
图4中示出了几种苔藓抑素-1类似物(苔藓素)在s-APPα分泌诱导中的效力。除馏分D外，与苔藓抑素-1相比，其全部诱导s-APPα明显释放。苔藓抑素-1的最佳替代馏分是对应于名称B16的类似物E，经 鉴定为苔藓抑素3。生物活性按顺序为馏分E(105)＞G(112)、F(106)、C(103)＞A(101)、B(102)＞D(104)。
从初始数据看，似乎B12或B14可比苔藓抑素-1明显更具生物活性。因为大多数馏分含两种或更多种苔藓素，所以除含有＞97.5％CP的B16的馏分G外，难以确定哪一种负责生物活性。本发明的第一苔藓素组合物，B10，具有明显高于苔藓抑素-1的活性，并且提出了作为治疗剂的另一种潜在替代苔藓素。
HPLC标准化：
现翻到图5，其描绘了265nm下苔藓素混合物的高效液相色谱图，在总合草苔虫乙酸乙酯粗提物中存在各种苔藓素。
为了每种苔藓素的鉴定(根据保留时间)和后续纯化的目的，标准化苔藓素(B09、B10、B12、B14C、B14B、B16、苔藓抑素-1、苔藓抑素-2和苔藓抑素-3)的混合物。图6中描绘了叙述高效液相色谱纯化结果的色谱图。如描绘265nm下不同苔藓素的紫外光谱的图7所述，这些苔藓素含有与苔藓抑素-1类似的紫外图谱，最大波长为265nm。
在UV-HPLC和LC/MS/MS上使用已知标准和/或与文献中的已知质量比较，尝试对每种苔藓素的鉴定。这很重要，因为先前的初步体外实验(上述)已经证实，这些苔藓素可能以与对苔藓抑素-1所观察到的相等或甚至更高的百分比诱导s-APPα分泌。
基于LC/MS/MS的初步表征
使用装备有Shimadzu HPLC系统的LC/MS/MS API 2000系统进行不同苔藓素的表征。从700至1000amu扫描，对苔藓抑素-1m/z 427[M+Na](图8-1)优化Q1扫描参数。在图8-2至8-7中呈现了其它馏分的质谱扫描。总共分析了7个馏分，包括单独的苔藓素和苔藓素的混合物(表2)。
表2：基于质量匹配每种馏分的苔藓抑素类似物


讨论：
对苔藓抑素-1观察到的LC/MS/MS数据显示出927Amu下与[M+NA]对应并且已经在文献中报道的峰(Manning等，2005)。表3中总结了关于苔藓抑素-1至18的质谱数据。根据进行的LC/MS/MS分析，确认馏分104和馏分106分别为苔藓抑素-2(863Amu)和苔藓抑素-3(889Amu)。
馏分112显示B16质量不与文献中报道的任何苔藓素匹配。馏分102、103和105显示出与对苔藓抑素-3观察到的质量峰相同的质量峰。馏分102和105在其混合物中均含有Bryo-3，这将解释在LC/MS/MS中观察到的911峰。在馏分103中为何看到911Amu还不清楚；这表明B12可能具有与苔藓抑素-3相同的质量(889Amu)。这受到含B12和Bryo-3的馏分105仅在911Amu处显示峰的事实支持。在馏分103中观察到的897峰可对应于B10，尽管其不与文献中报道的任何苔藓抑素质量匹配。馏分102中925Amu处的峰在馏分106中也观察到。
表3：苔藓抑素-1至18的质谱信息(Manning等，2005)

苔藓抑素类似物的分离：B16(98.5％CP)和B14B(93.4％CP)
从由先前苔藓抑素-1纯化收集的侧馏分纯化苔藓素样化合物，B16和B14B，并且已经储存在4℃下。苔藓素的紫外光谱与苔藓抑素-1的紫外光谱相同(图9)。
HPLC监测：
纯化期间，在Luna C18(2)柱(250×4.6mm，10μm)上监测B16和B14B。以80％ACNP(经磷酸酸化的乙腈)恒溶剂模式以2mL/min流量进行洗脱。柱温设为30℃。
纯化工序和结果：
使用两根制备级C18柱(2.5×2.5cm，10μm)和一根半制备级PFP柱 纯化含B16和B14B的馏分。使用递增的ACNP浓度以步长梯度进行纯化。监测洗脱，直至每种苔藓素大体上位于单独的柱上。使用快速梯度，用ACNP剥离柱，并且化验馏分以测定每个峰的浓度。
可使用所述柱体系成功分离苔藓素B16和B14B。C18和PFP柱的使用对于将B16与B14B分离，和从B14C中部分纯化B14B都是必须的。峰标记的B14C是与B14B共洗脱的另一种苔藓素，并且在以70％ACNP分析时可更好地监测。通过向含苔藓素的馏分中添加MeOH可能使B16和B14B/C结晶。总共收集到212mg、98.5％CP的B16晶体。总共回收108mg、93.4％CP的B14B/C并储存用于进一步纯化。随后将B14B/C分离成B14B和B14C。通过LC/MS/MS再次分析纯化的苔藓素。表4中总结了结果。
表4：基于质量匹配对每种馏分的纯化苔藓抑素类似物的LC/MS/MS分析

纯化苔藓素的生物活性：
图10中显示10-9M的纯化苔藓素增强了SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中的α-分泌酶活性。显示B3、B14B和B16比苔藓抑素-1提高了α-分泌酶的生成。
图11中显示B10比苔藓抑素-1提高了PKC-ε的生成。图12中显示B10比苔藓抑素-1提高了PKC-δ的生成。图13中显示B10比苔藓抑素-1提高了PKC-α的生成。
NMR和结构表征：
通过其NMR1H和13C共振和连通性(HSQC和HMBC光谱)将三种变体与苔藓抑素1和苔藓抑素3作比较。三种变体显然全部在苔藓抑素3的C22处具有闭环，并且具有类似的R1和R3侧链(OAc和8-碳2，4-烯)。相对于苔藓抑素3，变化为：
B10：NMR显示从C18上失去一个甲基，与质量差匹配：预测值C45H62O17＝874.4(单一同位素)；观测值B10874.4。图14中描绘了B10的假定结构。
B12似乎为立体异构体：在19-24环附近的许多质子在化学位移上具有适度变化；但是连通性显示出与苔藓抑素3相同的共价结构，并且其具有与苔藓抑素3相同的质量(C46H64O17＝888.4)。如果闭环机制立体选择性不完美，则最可能的位点在C22处。虽然在其它苔藓抑素中未见到这些变化，但是相邻位点(19、20或23)的反转也可解释NMR变化。图15中描绘了B12的假定结构。
B16中，26-OH已经变成酮。这个变化是在B16(C46H62O17＝886.4)和Bryo-3(888.4)之间观察到2Da质量差的原因。已知苔藓抑素-3 26-酮(Schaufelberger 1991)。
通过图16-18的NMR图谱中列出的NMR数据提出了这些结构。图16描绘了苔藓抑素-3的NMR图谱。图17描绘了B10的NMR图谱。图18描绘了在苔藓抑素-3的NMR图谱上重叠的B12的NMR图谱。
因此，我们已经根据我们当前对制备和使用这些化合物的最佳模式的理解公开了本发明的实施方案。本领域中的技术人员将易于理解此类优选实施方案易于改变和修改，因此本发明不应限于准确细节，但应涵盖所附权利要求的主题及其等效物。