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1、10申请公布号CN104109715A43申请公布日20141022CN104109715A21申请号201410327825422申请日20140710C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人安徽农业大学地址230001安徽省合肥市长江西路130号72发明人王晓波张浩伟马元山高雅丽张文明74专利代理机构安徽汇朴律师事务所34116代理人汪蕙54发明名称一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法57摘要本发明公开了一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法，所述分子标记具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列，所述鉴定方法以大豆植物组织的基因组DNA为模板，所述分子标记为。
2、目的基因，设计特异性引物进行PCR扩增，获得扩增片段，用以判定大豆茸毛的颜色；本发明是基于大豆类黄酮3羟化酶的编码基因及其等位变异基因对大豆茸毛色的调控开发出的一种共显性分子标记，与现有技术相比，本发明的分子标记及其鉴定方法能够一次性将灰色茸毛大豆与棕色茸毛大豆鉴别开，适用于大豆茸毛色性状的早期鉴定，为开展该性状形成的生理基础和分子机制等相关研究奠定基础。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表3页附图1页10申请公布号CN104109715ACN104109715A1/1页21一种鉴定大豆茸毛色的分。
3、子标记，其特征在于，所述分子标记具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，其特征在于，包括以下步骤1提取大豆植物组织的基因组DNA，以所述分子标记的1445位点的核苷酸序列为模板设计上游引物，以所述分子标记的7071471位点的核苷酸序列为模板设计下游引物，进行PCR扩增，获得扩增片段，其中所述核苷酸序列为53；2若所述步骤1的扩增片段包含所述分子标记的445707位点的核苷酸序列，则所述大豆茸毛色为灰色，若不包含，则所述大豆茸毛色为棕色。3根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所述步骤1中，上游引物为如S。
4、EQIDNO2所示的核苷酸序列，下游引物为如SEQIDNO3所示的核苷酸序列上游引物SEQIDNO25GCATTATTGAGGAGCACA3；下游引物SEQIDNO35AGTAAGTATGGGAGGTGGG3；所述步骤2中，若扩增片段大小为1471BP，则所述大豆茸毛色为灰色，若扩增片段大小为1209BP，则所述大豆茸毛色为棕色。4根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所述步骤1的PCR扩增程序为95预变性5MIN，95变性30S，起始退火温度为66，以后每循环降低03，退火时间40S，72延伸90S，设38个循环，最后72继续延伸15MIN。5根据权利要求2所。
5、述的一种利用分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所述步骤1的大豆品种选自绥农1号、天鹅蛋、高作选1号、黑农2号、克北L号、东山69、平顶黄豆、合丰37号、马兰早茶豆、白秋1号、长沙泥豆、黑河L号、贡豆7号和中品661中的一种。6根据权利要求2所述的一种利用分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，其特征在于，所述步骤1的大豆植物组织选自叶片、根尖、种子和种皮中的一种。权利要求书CN104109715A1/4页3一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法技术领域0001本发明涉及的是一种大豆的分子标记技术领域，尤其涉及的是一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法。背景技术0002大豆茸毛色和花色是鉴定大。
6、豆品种的重要指标之一，其中茸毛色包括棕色和灰色两种颜色。一般来说，茸毛色为棕色、花色为紫色的大豆是大豆的野生原始性状，这种大豆对环境要求不严格，适应性强，而茸毛色为灰色、花色为白色的大豆属于大豆的进化性状，这种大豆对环境条件要求高，适应性差。茸毛色和花色，尤其是茸毛色，与大豆的品质关系密切，如棕毛紫花大豆，往往皮色发暗，脐色多为深色，易生褐斑，种子外观不良；而灰毛百花大豆，一般种皮鲜艳，脐色多为淡色，种子外观良好。0003大豆茸毛色的判别方法一般可直接用肉眼观测，但需要等到大豆结出果实后才能判定，不适宜前期选种，YONGGUO等人2013发表了一篇文章指出，类黄酮3羟化酶和类黄酮3，5羟化酶这。
7、两类具有催化B环类黄酮使B环类黄酮羟基化的酶，对大豆的颜色具有重要的调控作用。该文章中指出了类黄酮3羟化酶的编码基因与大豆茸毛色的关系，揭示了利用该这两种基因作为大豆茸毛色的标记基因进行分子鉴定的可行性。为验证两种基因与茸毛色的关系，该文章中还针对大豆茸毛色的标记基因设计了多对引物，但每一对引物扩增的片段都很短，且PCR产物需要酶切才能对目标性状进行区分，操作繁琐效率不高YONGGUO，LIJUANQIU,ALLELESPECICMARKERDEVELOPMENTANDSELECTIONEFCIENCIESFORBOTHFLAVONOID3HYDROXYLASEANDFLAVONOID3，5H。
8、YDROXYLASEGENESINSOYBEANSUBGENUSSOJA，THEORAPPLGENET,2013,12614451455。发明内容0004本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法，以提供一种简单高效的方法实现大豆茸毛色的早期鉴定。0005本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤0006一种鉴定大豆茸毛色的分子标记，所述分子标记具有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列。0007一种利用上述分子标记鉴定大豆茸毛色的方法，包括以下步骤00081提取大豆植物组织的基因组DNA，以所述分子标记的1445位点的核苷酸序列为模板设计上游引物，。
9、以所述分子标记的7071471位点的核苷酸序列为模板设计下游引物，进行PCR扩增，获得扩增片段，其中所述核苷酸序列为53；00092若所述步骤1的扩增片段包含所述分子标记的445707位点的核苷酸序列，则所述大豆茸毛色为灰色，若不包含，则所述大豆茸毛色为棕色。0010优选地，所述步骤1中，上游引物为如SEQIDNO2所示的核苷酸序列，下游引物为如SEQIDNO3所示的核苷酸序列说明书CN104109715A2/4页40011上游引物SEQIDNO25GCATTATTGAGGAGCACA3；0012下游引物SEQIDNO35AGTAAGTATGGGAGGTGGG3；0013利用上述优选的上游引物。
10、和下游引物对大豆茸毛色的分子标记进行PCR检测，若获得的扩增片段大小为1471BP，则所述大豆茸毛色为灰色，若获得的扩增片段大小为1209BP，则所述大豆茸毛色为棕色，所述大小为1471BP的扩增片段即为包含所述分子标记的445707位点的核苷酸序列。0014优选地，所述步骤1的PCR扩增程序为95预变性5MIN，95变性30S，起始退火温度为66，以后每循环降低03，退火时间40S，72延伸90S，设38个循环，最后72继续延伸15MIN。0015优选地，所述步骤1的大豆品种选自绥农1号、天鹅蛋、高作选1号、黑农2号、克北L号、东山69、平顶黄豆、合丰37号、马兰早茶豆、白秋1号、长沙泥豆、。
11、黑河L号、贡豆7号和中品661中的一种。0016优选地，所述步骤1的大豆植物组织选自叶片、根尖、种子和种皮中的一种。0017本发明的原理是本发明首先是通过对大豆类黄酮3羟化酶的编码基因其核苷酸序列如SEQIDNO4所示进行遗传多样性分析，发现该基因存在一种等位变异基因，该等位变异基因在不同绒毛色大豆品种中存在262BP的差异即所述分子标记的445707位点，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示，可以作为鉴别大豆茸毛色的标记基因。0018本发明相比现有技术具有以下优点本发明提供了一种鉴定大豆茸毛色的分子标记及其鉴定方法，该分子标记为大豆类黄酮3羟化酶的编码基因的等位变异基因，该等位变异基因只有在灰。
12、色茸毛的大豆中才存在，与类黄酮3羟化酶的编码基因存在262BP的差异，差异显著，利用该差异开发的分子标记无需进行酶切即可鉴别，属于共显性分子标记，不用担心假阴性的现象，可直接应用于大豆灰色茸毛和棕色茸毛的早期鉴定，为开展该性状形成的生理基础和分子机制等相关研究奠定基础；另外，基于该分子标记开发的鉴定方法，本发明还提供了一对特异性的引物，该引物PCR扩增的片段长度在10001500BP，与PCR扩增过程中降解产生的杂带相区分，可有效防止假阳性扩增片段的出现；本发明的鉴定方法简便易行，大大提高了对目标性状的检测效率和准确性。附图说明0019图1为实施例1的14种大豆茸毛色鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图。
13、。具体实施方式0020下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。0021实施例10022本实施例的一种鉴定大豆茸毛色的分子标记的方法，包括以下步骤00231、DNA提取0024选取绥农1号灰、天鹅蛋灰、高作选1号灰、黑农2号灰、克北L号灰、东山69灰、平顶黄豆灰、合丰37号棕、马兰早茶豆棕、白秋1号说明书CN104109715A3/4页5棕、长沙泥豆棕、黑河L号棕、贡豆7号棕和中品661棕括号中为各品种目测的茸毛色14种大豆品种作为待测样品，分别取取3粒外观、饱满度较好的大豆种。
14、子，用打孔器磨出豆粉100MG左右放入15ML离心管中，加入07ML的SDS提取缓冲液配方为NACL288MMOL/L，TRISHCL200MMOL/L，EDTA25MMOL/L，质量百分比为05的SDS，用07ML酚氯仿异戊醇体积比为25241抽提除去蛋白质，重复一次，经异丙醇和NAACPH52沉淀，70乙醇漂洗后，真空干燥。紫外分光光度检测DNA浓度，20保存备用，获得大豆基因组DNA。00252、以上述提取的14种大豆基因组DNA为模板，SEQIDNO2和SEQIDNO3所述序列为特异性引物，进行PCR扩增，获得扩增片段；0026SEQIDNO25GCATTATTGAGGAGCACA3；。
15、0027SEQIDNO35AGTAAGTATGGGAGGTGGG3；0028PCR扩增的反应体系为总反应体系为20L，含DDH2O128L，10PCREXBUFFER20L，25MMDNTP20L，10M如SEQIDNO1所示的引物序列05L,10M如SEQIDNO2所示的引物序列05L，5U/L的TAKARAEXTAQ02L，50NG/UL大豆基因组DNA2L。0029PCR扩增的反应程序为95预变性5MIN，95变性30S，起始退火温度为66，以后每循环降低03，退火时间40S，72延伸90S，设38个循环，最后72继续延伸15MIN。00303、琼脂糖凝胶电泳检测0031将上述PCR扩增。
16、获得的扩增片段用质量分数为15的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳的缓冲体系为1倍的TAE溶液，在100V恒压下，电泳50分钟，紫外灯下拍照并保存；0032若上述PCR获得的扩增片段长度为1209BP，则所述大豆茸毛色为棕色；0033若上述PCR获得的扩增片段长度为1471BP，则所述大豆茸毛色为灰色；00344、结果0035附图1为本实施例1琼脂糖凝胶电泳的具体实验结果图，其中M为MARKER5000，泳道114分别为绥农1号、天鹅蛋、高作选1号、黑农2号、克北L号、东山69、平顶黄豆、合丰37号、马兰早茶豆、白秋1号、长沙泥豆、黑河L号、贡豆7号和中品661。0036其中，泳道1、2、3、4、5、6。
17、、7获得了长度大小约为1400BP的片段，即绥农1号、天鹅蛋、高作选1号、黑农2号、克北L号、东山69和平顶黄豆的鉴定结果为灰色，与目测结果一致。0037泳道8、9、10、11、12、13、14获得的片段长度约为1200BP左右，即合丰37号、马兰早茶豆、白秋1号、长沙泥豆、黑河L号、贡豆7号和中品661的鉴定结果为棕色，与目测结果一致。0038附图1中可以看出，两种茸毛色的大豆的扩增片段长度差异大，PCR扩增条带清晰，肉眼可直接准确判断，同时，对14种大豆茸毛色的分子鉴定结果与目测结果一致，说明本发明的鉴定准确度高。0039实施例20040本实施例的一种大豆茸毛色的分子鉴定方法，包括以下步骤00411选取绥农1号大豆植物的叶片、根尖、种子和种皮，分别提取上述4种组织的基因组DNA，然后以上述4种组织的DNA为模板，SEQIDNO2和SEQIDNO3所述序列为特说明书CN104109715A4/4页6异性引物，分别进行PCR扩增，获得扩增片段。00422鉴定结果4种组织的DNA均扩增获得了长度为1471BP的片段，判定所述绥农1号大豆的茸毛色为灰色。说明书CN104109715A1/3页700010002序列表CN104109715A2/3页80003序列表CN104109715A3/3页9序列表CN104109715A1/1页10图1说明书附图CN104109715A10。