作为选择性JAK3和/或JAK1激酶抑制剂的芳杂环化合物的制备方法及其应用技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及具有Janus激酶3(JAK3)和/或Janus激酶
1(JAK1)抑制活性的芳杂环化合物，本发明还涉及所述化合物的制备方法、包
含所述化合物作为活性成分的药物组合物以及其制药应用。本发明的化合物可作
为JAK3和/或JAK1激酶的抑制剂，用于治疗/预防与这些激酶活性异常相关疾
病的临床应用，包括自身免疫性疾病、炎症疾病、癌症及其它疾病。
背景技术
2002年，Manning等人确定了人类激酶组中包括518种蛋白激酶基因，其中
218种酶基因与人类疾病的发生发展密切相关(ManningG.，etal.2002，Science，
298：1912-1934)。在目前已发现的药物中，以酶为作用靶点的药物占20％之多，
特别是靶向蛋白激酶在临床应用上具有特殊价值。
蛋白激酶是一类胞内信使依赖的，催化特定蛋白磷酸化并完成信号传递过程
的酶，主要包括酪氨酸蛋白激酶(JAKs、Src、Abl、EGFR、FGFR、PDGFR等)、
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKC、MAPK、Rho激酶等)、双特异性蛋白激酶
(MAPKK)以及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)。蛋白激酶磷酸化/去磷酸化过程能够
调节不同细胞的多种生物学过程，如代谢、细胞分化、细胞存活、细胞凋亡、器
官形成、血管生成、免疫应答等(ShchemelininI.，etal.2006，FoliaBiol.，52：
81-100)。
JAK激酶(Januskinase，简称JAKs，包括四个已知成员JAK3、JAK1、TYK2、
JAK2)是胞浆内非受体酪氨酸蛋白激酶超家族中的一个小家族。JAK3分布于骨
髓和淋巴系统中，JAK1、TYK2、JAK2则广泛分布于多种组织细胞中。当JAKs
结合到细胞表面的细胞因子受体后，激活受体偶联的JAKs，进而使受体磷酸化，
这为胞浆信号转导和转录激活因子STAT蛋白(SignalTransducersandActivators
ofTranscription，STAT1～4、STAT5a、STAT5b、STAT6)提供了募集反应位点，
JAKs磷酸化STAT蛋白，后者二聚化后转移到细胞核内调控基因表达，这条途
径即JAK/STAT信号通路(O’SheaJ.J.，etal.2013，N.Engl.J.Med.，368：161-170)。
JAK/STAT信号通路是一条由多种细胞因子和生长因子受体刺激的信号转导
通路，这些因子包括白介素类(IL-2～7、IL-9、IL-10、IL-15、IL-21)、干扰素类
(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞和巨细胞集落刺激
因子(GM-CSF)、促生长素(GH)、催乳素(PRL)、促血小板生成素(TPO)
等，其在参与免疫细胞和造血干细胞的增殖、免疫调节的生物学过程中起关键作
用(GhoreschiK.，etal.2009，Immunol.Rev.，228：273-287)。不同受体可激活不同
亚型的JAK激酶，从而实现差异化的生物学功能。
JAK1可与IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-28、IFN-α、IFN-γ、gp130
家族中的IL-6以及含γc的其它受体等结合(RodigS.J.，etal.1998，Cell，93：
373-383)。小鼠模型上的JAK1基因敲除实验表明该酶在调节上述多种细胞因子
受体的生物学效应中起着关键作用(KisselevaT.，etal.2002，Gene，285：1-24)。
JAK1是免疫相关疾病、炎症和癌症等疾病领域的新型靶点。JAK1抑制剂可用
于治疗/预防自身免疫性疾病、炎症和肿瘤(HornakovaT.，etal.2010，Blood，115：
3287-3295)，如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、关节炎、银屑病、克罗恩病、红斑
狼疮、获得性免疫缺陷综合症、白塞病(HouS.，etal.2013，Hum.Genet.，132：
1049-1058)等，但并不限于此。
JAK2在包括EPO、GH、PRL、IL-3、IFN-γ等多种受体信号的调节过程中
发挥重要作用(KisselevaT.，etal.2002，Gene，285：1-24；LevyD.E.，etal.2002，
Nat.Rev.Mol.CellBiol.，3：651-662；O’SheaJ.J.，etal.2002，Cell，109(suppl.)：
S121-S131)。在小鼠模型中敲除JAK2可导致贫血动物死亡(SchindlerC.，etal.
2007，J.Biol.Chem.，282：20059-20063)；人体中的JAK2基因上的一个碱基突变
JAK2V617F，其与骨髓增生性疾病中的真性红细胞增多症(PV)、特发性血小板
增多症(ET)、特发性骨髓纤维化(IMF)、慢性粒细胞白血病(CML)等的发
生密切相关(GhoreschiK.，etal.2009，Immunol.Rev.，228：273-287)。因此，JAK2
已成为该类疾病的治疗/预防的确切作用靶点。
JAK3通过与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等细胞因子受体复合物
中的γ共链(γc)相结合，调节细胞信号传导。JAK3或γc突变都可导致重症联
合免疫缺陷(SCID)(VillaA.，etal.1996，Blood，88：817-823)。JAK3活性异常表
现为T细胞和NK细胞大量减少、B细胞功能丧失，严重影响免疫系统等的正常
生物学功能。基于其功能特点和特殊的组织分布，JAK3成为针对免疫系统相关
疾病极具吸引力的药物靶点，其抑制剂在类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病、系
统性红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、过敏性疾病、哮喘、慢性
阻塞性肺病、白血病、淋巴瘤、器官移植和其它等疾病的治疗/预防方面具有重
要的临床应用价值(PapageorgiouA.C.，etal.2004，TrendsPharm.Sci.，2004，25：
558-562)。
TYK2是JAK家族中的第一个成员，其可被干扰素(IFNs)、IL-10、IL-6、
IL-12、IL-23、IL-27等多种受体激活。在小鼠中，TYK2功能缺失会引起多种细
胞因子受体的信号通路发生缺陷，进而导致病毒感染、抗菌免疫功能下降并增加
了肺部感染的可能性等(KisselevaT.，etal.2002，Gene，285：1-24)。另外，Larner
A.C.小组的研究表明TYK2可有助于抑制乳腺癌的生长和转移(ZhangQ.，etal.
2011，J.InterferonCytokineRes.，31：671-677)；该课题组近来报道了TYK2可在小
鼠和人体内通过棕色脂肪组织(BAT)的分化而协助肥胖调节的研究成果，其可
保护机体免于肥胖，甚至能够逆转肥胖(DereckaM.，etal.2012，CellMetab.，16：
814-824)。这或许为肥胖的癌症患者治疗提供了新机会。
2012年11月，Pfizer公司的pan-JAKs抑制剂Xeljanz(Tofacitinib)获FDA
批准用于治疗RA。2013年10月，该公司公开了Xeljanz用于治疗银屑病的III临
床数据，对照Enbrel(Etanercept)的双盲试验，该药物满足了非劣效性设计研
究结果。然而，Xeljanz具有包括引起红细胞与白细胞数量下降、胆固醇水平上
升等副作用，这或许与其具有高JAK2抑制活性但选择性较低相关(ZakM.，etal.
2012，J.Med.Chem.，55：6176-6193)。因此，需要研究并发现选择性的JAK抑制
剂。
现已有多种选择性JAK抑制剂处于不同的临床研究阶段，包括选择性JAK3
抑制剂VX-509、选择性JAK1抑制剂GLPG0634(FeistE.，etal.2013，
Rheumatology，52：1352-1357)和INCB39110(http://www.incyte.com/research/pipeline)
等，用于治疗RA、克罗恩病、银屑病、骨髓纤维化等免疫系统相关疾病。除此
之外，多种不同结构类型的选择性抑制剂的相关专利被公开：1)选择性JAK3
抑制剂，如吡咯并[1，2-b]哒嗪(WO2012125887)、吡唑并[3，4-d]嘧啶
(WO2011048082，WO2011134861，WO2012022681)、二氨基嘧啶类
(WO2011029807，WO2012015972)、吡咯并[2，3-b]吡啶(JP2012012332)、二氨
基-吡啶-3-甲酰胺(WO2010061971，US20120108566)、吡咯并[2，3-b]吡嗪
(WO2011144584，WO2011144585)等；2)选择性JAK1抑制剂，如三环类化合
物(WO2011086053)、取代的吡唑类和吡咯类(WO2010135650，WO2011112662)、
苯胺基酞嗪类(WO2012037132)等。另外，具有选择性JAK2抑制剂、选择性
TYK2抑制剂以及同时具有两种亚型(JAK3/1，JAK1/2等)抑制剂的相关专利
也已被报道，在此不再赘述。
ITK(InducibleT-cellkinase)是Tec家族中的非受体酪氨酸激酶之一，亦称
Emt或Tsk。ITK表达于T细胞、NKT细胞和肥大细胞中。该激酶在T细胞受体
(TCR)、CD28、CD2、趋化因子受体CXCR4及FcεR等的信号通路调节过程中
起着关键作用，对T细胞的分化和增殖等有重要影响。Th2类型细胞因子(包括
IL-4、IL-5、IL-13等)的分泌在调节免疫炎症过程中具有重要作用，ITK缺陷影
响Th2细胞应答，从而降低慢性或晚期炎症反应(SahuN.，etal.2009，Curr.Top.
Med.Chem.，9：690-703；LinT.A.，etal.2004，Biochemistry，43：11056-11062)。
BLK(B-celllymphocytekinase)是Src家族中的非受体酪氨酸激酶之一，表达于
B淋巴细胞中，与B淋巴细胞的生长和分化等相关。BLK激酶、磷酸酯酶及相
应共同受体之间的紧密结合在B细胞受体(BCR)的信号通路调节过程中发挥
重要作用，如该激酶可影响BCR的凋亡和生成阻滞(TexidoG.，etal.2000，Mol.
CellBiol.，20：1227-1233)。BLK在前B细胞受体介导NF-κB的活化中也具有重
要作用(SaijoK.，etal.2003，Nat.Immunol.，4：274-279)。近来的研究表明了BLK
与RA、系统性红斑狼疮以及其它多种自身免疫性疾病的发病机制相关
(SimpfendorferKR.，etal.2012，Hum.Mol.Genet.，21：3918-3925；GéninE.，etal.
2013，PLoSOne，8：e61044)。
TBK1(TANK-bindingkinase1)是IKK家族中的一种Ser/Thr蛋白激酶，也
被称为NAK(NF-κBactivatingkinase)或T2K。TBK1在小鼠的胃部、结肠、肺
部、胸腺和肝脏等中广泛表达；同时在人的淋巴和非淋巴器官中都有表达，包括
脾脏、大脑和肾脏等。该激酶对细菌和病毒的免疫应答、炎症相关因子的表达都
具有调节作用，如IL-6、TNF-α及IFN-β等。在胰岛素信号通路中，TBK1可调
节胰岛素受体上Ser994的磷酸化和脂代谢。这些结果表明，TBK1在不同的免疫
生物学和免疫病理学机制中起着关键作用(YuT.，etal.2012，MediatorsInflamm.，
2012：979105-979112；HammakerD.，etal.2012，Rheumatology，51：610-618)。
VEGFR(Vascularendothelialgrowthfactorreceptor)家族中包括VEGFR-1
(Flt1)、VEGFR-2(KDR/Flk1)及VEGFR-3(Flt4)3个成员，由含7个免疫
球蛋白样结构的细胞外区、膜区和酪氨酸激酶区组成，其中的酪氨酸激酶活性通
过受体和配体结合而激活，配体如VEGFsA-F和胎盘生长因子，进一步引起细
胞的多种生物学效应，如在细胞的生长和分化中的重要作用(shibuyaM.，etal.
2010，GenesCancer，1：1119-1123)。此外的研究表明，VEGFR1在RA患者的内
皮细胞、单核细胞及巨噬细胞等中有表达。VEGFA可激活VEGFR1，导致内皮
细胞增殖和血管形成等。VEGFA蛋白在RA病人中的滑液、淋巴液、血清及滑
膜组织中高表达，VEGFA水平与RA疾病呈正相关。VEGFR2在RA患者的滑
膜组织中有表达。VEGFA、C、D可激活VEGFR2信号，增加血管渗透性和血
管形成。VEGFC在RA增厚滑膜内层的多种细胞中被检测到，特别是在血管周
细胞和平滑肌细胞中。VEGFR3可表达于单核细胞、巨噬细胞、一些树突状细胞、
正常乳腺组织中的毛细血管及神经内分泌器官等。研究发现，VEGFR3在RA、
炎症性肠病、溃疡性疾病及克罗恩病等自身免疫性疾病和淋巴管形成相关肿瘤的
发病中都具有一定作用，相关的作用机制尚未完全清楚(D′AuraSwansonC，etal.
2009，Nat.Rev.Rheumatol.，5：317-324；AokiY.，etal.2005，J.Natl.CancerInst.，97：
2-3)。
本文所公开的蛋白激酶抑制剂可用于治疗和/或预防RA、银屑病、克罗恩病、
系统性红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、过敏性疾病、慢性阻塞性肺病、
哮喘、白血病、淋巴瘤等免疫系统相关疾病，但并不限于此。同时，这些化合物
或者包含其作为活性成分的药物组合物等可在安全治疗窗口内能将这些疾病的
临床疗效达到最大化。
发明内容
本发明的一个方面，涉及具有JAK3和/或JAK1抑制活性的芳杂环化合物，
包括其药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、前药等衍生物。
本发明另一方面涉及本文所述化合物的制备方法。
本发明的又一方面涉及包括其本发明化合物作为活性成分的药物组合物，以
及本发明化合物或药物组合物用于治疗/预防与JAKs等激酶活性异常相关的疾
病的临床应用，以及本发明化合物或药物组合物在制备用于治疗和/或预防与
JAKs等激酶活性异常相关的疾病的药物中的应用。
本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可
接受的盐或水合物，
其中，
R1为卤素或C1-C6烷基；
R2为一个或多个取代基，选自氢、羟基、氰基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6
烷氧基、C1-C6的卤代烷基、C1-C6的烷基羰基和C1-C6烷基氨基；
R3为氢或卤素；
R4为氢或C1-C4烷基；
X为NH、O或S；
Y为CO或S(O)2；
Z为共价键、CH2或(CH2)2；
n为1到4的整数；
环A为苯环、吡啶环或哌啶环。
在一个优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、立
体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为卤素或C1-C6烷基；
R2为一个或多个取代基，选自氢、羟基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、
二氟甲基、三氟甲基、乙酰基和二甲氨基；
R3为氢或卤素；
R4为氢或甲基；
X为NH或O；
Y为CO或S(O)2；
Z为共价键、CH2或(CH2)2；
n为1到4的整数；
环A为苯环、吡啶环或哌啶环。
在一个更优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、
立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为卤素或C1-C6烷基；
R2为一个或多个取代基，选自氢、羟基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、
二氟甲基、三氟甲基、乙酰基和二甲氨基；
R3为氢或氟；
R4为甲基；
X为NH；
Y为CO；
Z为共价键；
n为1到4的整数；
环A为苯环、吡啶环。
在一个更优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、
立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为氯、氟或甲基；
R2为一个或多个取代基，选自氢、羟基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、
二氟甲基、三氟甲基、乙酰基和二甲氨基；
R3为氢或氟；
R4为甲基；
X为NH；
Y为CO；
Z为共价键；
n为1到4的整数；
环A为苯环。
在一个还更优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、
立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为氯；
R2为一个或多个取代基，选自氢、羟基、氰基、氟、甲基、乙基、甲氧基、
二氟甲基、三氟甲基、乙酰基和二甲氨基；
R3为氢或氟；
R4为甲基；
X为NH；
Y为CO；
Z为共价键；
n为1到4的整数；
环A为苯环。
在一个特别优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、
立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为氯；
R2为一个或多个取代基，选自氰基、氟和三氟甲基；
R3为氢或氟；
R4为甲基；
X为NH；
Y为CO；
Z为共价键；
n等于1；
环A为苯环。
在一个尤其优选的方面，本发明涉及通式(I)所示的化合物，包括其前药、
立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为氯；
R2为一个或多个取代基，选自氰基；
R3为氢或氟；
R4为甲基；
X为NH；
Y为CO；
Z为共价键；
n等于1；
环A为苯环。
附图说明
图1是表明Z’-LYTE激酶活性检测原理的示意图，其反映了检测过程中所
涉及的激酶与底物反应、发生显色反应以及进行检测等步骤。
具体实施方式
本发明所述的“卤素”为氟、氯、溴、碘，尤其是氟、氯或溴。
本发明所述的“烷基”，包括直链、支链或环状的烷基。优选地，所述烷基
为C1-C8烷基、C1-C6烷基；特别优选的，所述烷基为C1-C4烷基；更特别优
选的，所述烷基为甲基、乙基、丙基或异丙基、正丁基、异丁基或特丁基(叔丁
基)。本发明化合物中的烷基可以是任选取代或未取代的，取代基可以包括烷基、
卤素、烷氧基、烃基、羟基等。本发明烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异
丙基、正丁基、异丁基、特丁基、正戊基、异戊基、正己基、异己基、环丙基、
环丁基、环戊基、环己基等。
本发明所述的“烷氧基”，是指上述烷基与氧原子相连所形成的基团，其中，
氧原子具有自由成键能力，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、异丙
氧基、特丁氧基、环丙氧基、环己基氧基等。
本发明所述的“烷基羰基”，是指上述烷基与羰基相连所形成的基团，如乙
酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、特丁酰基、环丙酰基、环己基酰基等。
本发明所述的“烷基氨基”，是指上述烷基与氨基相连所形成的基团，如甲
胺基、乙胺基、4-二甲氨基等。
本发明所述的“可药用的”或“药学上可接受的”被理解为在合理的医学范
围内适于人和动物使用，可耐受且并无不可接受的副作用包括毒性、过敏反应、
刺激及并发症和其它。
本发明涉及药物组合物，所述药物组合物含有上述通式(I)的化合物，包
括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物作为活性成分，以及可药用
载体、辅料或赋形剂等。所述可药用载体、辅料或赋形剂是指任何可用于药物领
域的稀释剂、辅助剂和载体，如药用辅料手册(HandbookofPharmaceutical
Excipients8thed，2013)中所列的材料，但并不限于此。
本发明所述的化合物任选地可与其他一种或多种活性成分联合使用，其各自
用量和比例可由本领域技术人员根据具体病症和患者具体等情况以及临床需要
而进行调整。
本发明所述的化合物、药物组合物可配制成各种剂型，其中含有药物领域中
常用赋形剂，如口服制剂(片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、滴丸剂等)、
注射制剂、局部制剂等，但并不限于此。本发明的制剂形式中通常含有按重量计
0.5～70％的活性成分，优选地，含有按重量计1～20％的活性成分。
本发明所述通式I的化合物，在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物
(包括人)进行用药，其中尤以口服方式为佳。用药剂量为每日0.0001～200mg/kg
体重，较佳用药剂量为每日0.01～100mg/kg体重，最佳用药剂量为每日0.1～50
mg/kg体重。同时，最佳剂量视个体而定，通常开始时剂量较小，然后逐渐增加
用量。
本发明中所提供的实施例和制备例进一步阐明并举例说明了本发明所述化
合物及其制备方法。应当理解，下述制备例和实施例的范围不以任何方式限制本
发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的通式(I)衍生物的制备方法，如下合成示
意图中所用原料、试剂、催化剂、溶剂等均可通过有机化学领域普通技术人员熟
知的方法制备或者可商购得到。本发明的全部最终衍生物都可都过示意图中所描
述的方法或其类似方法制得，这些方法都是有机化学领域普通技术人员熟知的。
这些示意图中应用的全部可变因素如下文定义或根据权利要求中的定义。
制备方法：
(a)中间体III(a)可由市场直接购得或由如下的示例性合成方法制备：
使单边保护的二胺VI与化合物VII缩合获得化合物VIII。该缩合反应以肽
缩合剂为催化剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)，N，N′-二环己基碳
二亚胺(DCC)，N，N′-羰基二咪唑(CDI)等。反应温度为0～60℃，反应时间为2～72
小时。反应所用溶剂为常用溶剂，如苯、甲苯、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、
氯仿、N，N′-二甲基甲酰胺等。必要时，也可以加入碱，如氢氧化钠、三乙胺或
吡啶等。
所得化合物VIII在酸(优选三氟乙酸)作用下脱Boc得化合物III(a)，反应
温度为0～60℃，反应时间为0.5～2小时。反应所用溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、
N，N′-二甲基甲酰胺等。
(b)中间体III(b)可直接购得或由如下的示例性合成方法制备：
使单边保护的二胺VI与化合物IX缩合获得化合物X，反应温度为0～60℃，
反应时间为0.5～2小时。反应所用溶剂为常用溶剂，如苯、甲苯、四氢呋喃、二
氧六环、二氯甲烷、氯仿、N，N′-二甲基甲酰胺等。缚酸剂常用三乙胺、二异丙
基乙基胺、吡啶等；任选地，可加入无机碱如NaOH、Na2CO3、NaOAc等。
所得化合物X在酸(优选三氟乙酸)作用下脱Boc得化合物III(b)。反应温
度为0～60℃，反应时间为0.5～2小时。反应所用常用溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、
N，N′-二甲基甲酰胺、水等。所用的酸可以为三氟乙酸、盐酸等。
(c)中间体V可由如下的示例性合成方法制备：
使化合物XI(可市场购得或合成得到)与丙烯酰氯在碱(优选二异丙基乙
基胺)存在下缩合得到化合物XII，所得化合物XII经铁粉还原硝基获得目标中
间体V。所用的碱可以为二异丙基乙基胺、三乙胺等。
(d)本发明所述通式(I)可由如下的示例性合成方法制备：
使化合物II与化合物III在三乙胺存在下发生取代反应得到化合物IV，其中
化合物II和III均可由市售购买得到反应温度为回流，反应时间为8-16小时。反
应所用溶剂为乙醇、甲醇、正丁醇等。碱为三乙胺、二异丙基乙基胺等。
使化合物IV与合成的化合物V在酸(优选三氟乙酸)催化下发生取代反应
得到化合物I。反应温度为回流，反应时间为8-16小时。反应所用溶剂为异丙醇、
正丁醇等；反应所用的酸为三氟乙酸、盐酸等。
通式I所述的化合物可以采用常见的分离方法进行纯化，如萃取、重结晶、
柱层析等。
本发明所述的代表性化合物如表1所示。化合物编号与实施例部分中的“实
施例编号”相一致，即表1中化合物1的合成在“实施例1”中得到描述，表1
中化合物30的合成在“实施例30”中得到描述。
表1本发明代表性化合物
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不仅仅局
限于这些实例。本发明所述的百分比除特别注明外，均为重量百分比。说明书中所描述的数值范围，如计量单位、反应条件、化合物物理状态或百分比，均是为
了提供明白无误的书面参考。本领域技术人员在实施本发明时，使用在此范围之
外或有别于单个数值的温度、浓度、数量、碳原子数等，仍然有可能得到预期的
结果。
实施例1
2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺的制备
黄色固体2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺(19.0g，87.0％产率)由如下方法制备。2-
氟-5-硝基苯胺(20.0g，128.2mmol)和多聚甲醛(16.0g，533.3mmol)溶于500mL
甲醇中于室温下搅拌。然后滴加甲醇钠(3.4g，63mmol)的甲醇溶液100mL。该
反应液在室温下搅拌16小时后分两等分加入NaBH4(9.7g，255.2mmol)。搅拌15
分钟。LC-MS跟踪反应。反应结束后倒入1MKOH的水溶液中，搅拌析出固体。
过滤获得目标中间体。LC-MS(m/z)171(M+1)。
实施例2
N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯酰胺的制备
黄色油状物N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯酰胺(12.0g，83.0％产率)由如
下方法制备。2-氟-N-甲基-5-硝基苯胺(11.0g，64.7mmol)和DIPEA(23mL，129.4
mmol)溶于100mLTHF中，将其在室温下搅拌。然后滴加丙烯酰氯(11mL，129.4
mmol)。该反应液在室温下搅拌1小时后蒸掉大部分溶剂，加入100mL乙酸乙
酯稀释，饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，减压浓缩获得目标中间体。LC-MS(m/z)
225(M+1)。
实施例3
N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺的制备
棕色油状物N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(5.6g，54.0％产率)由如下
方法制备。铁粉(20.0g，357mmol)和NH4Cl(20.0g，374mmol)溶于200mL水中
加热至80℃搅拌半小时。然后加入N-(2-氟-5-硝基苯基)-N-甲基丙烯酰胺(12.0g，
53.6mmol)的乙酸乙酯溶液20mL。该反应液在80℃下搅拌1小时后加入
NaHCO3水溶液调碱，过滤铁泥，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相减压浓缩获
得目标中间体。LC-MS(m/z)195(M+1)。
实施例4
3-(4-氰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-氰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(850mg，98.0％产率)由
如下方法制备。将3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)溶于20mL
THF中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.0g，5.24mmol)、
1-羟基苯并三唑(580mg，4.30mmol)、DIPEA(1mL，5.63mmol)和4-氰基苯甲酸
(425mg，2.89mmol)。混合物在室温下搅拌20小时。然后用NaHCO3水溶液调
pH至8-10。乙酸乙酯萃取，合并有机相干燥，过滤，减压浓缩获得目标中间体。
LC-MS(m/z)304(M+1)。
实施例5
N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯甲酰胺(350mg，62.0％产率)由如下方法
制备。3-(4-氰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(850mg，2.8mmol)溶于10mL
二氯甲烷，然后加入三氟乙酸(500μL，6.7mmol)。该反应液在室温下搅拌16小
时后加入NaHCO3水溶液调碱，蒸干后加入二氯甲烷/甲醇(10∶1)的混合溶液超声。
过滤固体后将滤液蒸干获得目标中间体。LC-MS(m/z)204(M+1)。
实施例6
4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯甲酰胺(3.5g，78.0％产率)由如下方法制
备。2，4，5-三氯嘧啶(2.6g，14.2mmol)、N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯甲酰胺(2.6g，12.8
mmol)和三乙胺(2mL，14mmol)溶于50mL乙醇。该反应液加热至70℃搅拌4
小时后反应结束。蒸干溶剂后用乙醚洗涤。过滤获得目标中间体。LC-MS(m/z)
351(M+1)。
实施例7
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-氰基苯甲酰胺(3.1g，60.0％产率)由如下方法制备。N-(3-氨基丙基)-4-氰基
苯甲酰胺(4.0g，11.4mmol)、N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(2.7g，13.9
mmol)和三氟乙酸(1mL，7mmol)溶于60mL异丙醇。该反应液加热至90℃搅拌
24小时后反应结束。反应液倒入NaHCO3水溶液中，析出固体。静置，过滤。
粗产物溶于乙酸乙酯中超声，过滤得目标化合物。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.80-1.83
(m，2H，CH2)，3.10-3.12(m，2H，CH2)，3.32(s，3H，CH3)，3.44-3.46(m，2H，CH2)，
5.59(d，J＝9.4Hz，1H，CH)，6.02-6.08(m，1H，CH)，6.18(d，J＝16.0Hz，1H，CH)，
7.21-7.23(m，1H，Ar-H)，7.26-7.27(m，1H，Ar-H)，7.64(s，1H，嘧啶-NH)，7.91(s，
1H，Ar-H)，7.93(s，1H，嘧啶-H)，7.95-7.96(m，2H，Ar-H)，7.97-7.98(m，2H，Ar-H)，
8.72(s，1H，NH)，9.43(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)508(M+1)。
实施例8
N-(2-氟-5-硝基苯基)丙烯酰胺的制备
黄色固体N-(2-氟-5-硝基苯基)丙烯酰胺(0.3g，71.4％产率)是由2-氟-5-硝基
苯胺(0.3g，2.0mmol)和丙烯酰氯(0.27g，3mmol)按照实施例2中的类似步骤制
备而成。LC-MS(m/z)211(M+1)。
实施例9
N-(5-氨基-2-氟苯基)丙烯酰胺的制备
棕色固体N-(5-氨基-2-氟苯基)丙烯酰胺(0.1g，46.7％产率)是由N-(2-氟-5-硝
基苯基)丙烯酰胺(0.25g，4.7mmol)按照实施例3中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)181(M+1)。
实施例10
3-(4-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(0.22g，90％产率)
是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(0.4g，2.4mmol)和4-三氟甲基苯甲酸(0.38g，2
mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)347(M+1)。
实施例11
N-(3-氨基丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
黄色液体N-(3-氨基丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(1.1g，53％产率)是由3-(4-三
氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(2.8g，8mmol)按照实施例5中的类似步
骤制备而成。LC-MS(m/z)247(M+1)。
实施例12
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(1.9g，
57％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(1.46g，8mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-三氟甲基苯
甲酰胺(1.9g，8mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)393
(M+1)。
实施例13
N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟-苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-三氟甲基
苯甲酰胺的制备
灰色固体N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟-苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(18mg，33％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(39mg，0.1mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)丙烯酰胺(20
mg，0.11mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.85-1.88(m，2H，CH2)，3.32-3.37(m，2H，CH2)，3.55-3.58(m，2H，CH2)，5.76-5.79
(m，1H，CH)，6.27-6.32(m，1H，CH)，6.61-6.68(m，1H，CH)，7.21(t，J＝10.04Hz，1H，
嘧啶-NH)，7.36-7.40(m，1H，Ar-H)，7.82(d，J＝8.16Hz，2H，Ar-H)，8.02(d，J＝8.1Hz，
2H，Ar-H)，8.16(s，1H，嘧啶-H)，8.28(s，1H，Ar-H)，8.37-8.38(m，1H，NH)，
8.73-8.76(m，1H，NH)，9.99(s，1H，苯环-NH)，10.28(s，1H，苯环-NH).LC-MS
(m/z)537(M+1)。
实施例14
3-(4-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，94.1％产率)是由
3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和4-氟苯甲酸(400mg，2.86mmol)
按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)297(M+1)。
实施例15
N-(3-氨基丙基)-4-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氟苯甲酰胺(400mg，75.2％产率)是由3-(4-氟苯
甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，2.70mmol)按照实施例5中的类似步骤制
备而成。LC-MS(m/z)197(M+1)。
实施例16
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氟苯甲酰胺(440mg，63.2％
产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(400mg，2.19mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氟苯甲酰胺
(400mg，2.03mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)343
(M+1)。
实施例17
N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟-苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氟苯甲酰胺的
制备
白色固体N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟-苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-氟苯甲酰胺(8mg，9.41％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
氟苯甲酰胺(60mg，0.17mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)丙烯酰胺(40mg，0.22mmol)
按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.79-1.83(m，2H，
CH2)，3.31-3.33(m，2H，CH2)，3.49-3.51(m，2H，CH2)，5.75(d，J＝11.2Hz，1H，CH)，
6.26(d，J＝16.99Hz，1H，CH)，6.55-6.62(m，1H，CH)，7.11(t，J＝9.92Hz，1H，Ar-H)，
7.22(t，J＝5.66Hz，1H，嘧啶-NH)，7.28(t，J＝8.73Hz，2H，Ar-H)，7.47(t，J＝4.93Hz，
1H，Ar-H)，7.88-7.93(m，3H，Ar-H，嘧啶-H)，8.31(d，J＝5.12Hz，1H，Ar-H)，
8.50-8.52(m，1H，NH)，9.26(s，1H，苯环-NH)，9.85(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)
487(M+1)。
实施例18
N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氟苯甲酰胺(40mg，
52.3％产率)是由2，4-二氯-5-甲基嘧啶(40mg，0.25mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氟
苯甲酰胺(40mg，0.20mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
323(M+1)。
实施例19
4-氟-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)
苯甲酰胺的制备
白色固体4-氟-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶基
-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(5mg，8.68％产率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-氟苯甲酰胺(40mg，0.12mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(40mg，0.21mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.80-1.83(m，2H，CH2)，1.92(s，3H，CH3)，3.19(s，3H，CH3)，3.30-3.32(m，2H，CH2)，
3.42-3.44(m，2H，CH2)，5.58-5.61(m，1H，CH)，6.04-6.11(m，1H，CH)，6.16-6.21(m，
1H，CH)，6.72(t，J＝5.17Hz，1H，Ar-H)，7.21(t，J＝9.44Hz，1H，嘧啶-NH)，7.28(t，
J＝8.8Hz，2H，Ar-H)，7.66-7.68(m，2H，Ar-H，嘧啶-H)，7.88-7.92(m，2H，Ar-H)，
7.98-7.99(m，1H，Ar-H)，8.51(t，J＝5.26Hz，1H，NH)，9.09(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)481(M+1)。
实施例20
N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(0.26
g，72％产率)是由2，4-二氯-5-甲基嘧啶(0.16g，1mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-三氟
甲基苯甲酰胺(0.24g，1mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)373(M+1)。
实施例21
N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶基-4-氨
基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(0.26g，72％产率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-
氨基)丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(75mg，0.2mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基
丙烯酰胺(70mg，0.3mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.81-1.87(m，2H，CH2)，1.93(s，3H，CH3)，3.19(s，3H，CH3)，3.36-3.38
(m，2H，CH2)，3.44-3.46(m，2H，CH2)，5.58-5.61(m，1H，CH)，6.04-6.11(m，1H，CH)，
6.16-6.21(m，1H，CH)，6.73(t，J＝5.64Hz，1H，Ar-H)，7.21(t，J＝9.4Hz，1H，嘧啶
-NH)，7.66-7.68(m，2H，Ar-H，嘧啶-H)，7.84(d，J＝8.3Hz，2H，Ar-H)，7.98-8.00(m，
1H，Ar-H)，8.03(d，J＝8.1Hz，2H，Ar-H)，8.71-9.74(m，1H，NH)，9.10(s，1H，苯环
-NH).LC-MS(m/z)531(M+1)。
实施例22
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
三氟甲基苯甲酰胺的制备
灰色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(0.23g，42％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(0.39g，1mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰
胺(0.28g，1.5mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)
δ1.81-1.84(m，2H，CH2)，3.31-3.33(m，2H，CH2)，3.45-3.47(m，2H，CH2)，5.60(d，
J＝9.6Hz，1H，CH)，6.02-6.08(m，1H，CH)，6.18(d，J＝15.1Hz，1H，CH)，7.25-7.29
(m，1H，Ar-H)，7.61-7.67(m，3H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.82-7.84(m，3H，Ar-H，嘧啶-H)，
8.00-8.03(m，3H，Ar-H，NH)，8.71(s，1H，苯环-NH)，9.71(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)551(M+1)。
实施例23
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-氟苯甲酰胺(117mg，40.3％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-氟苯甲酰胺(200mg，0.58mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(150mg，0.77mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)
δ1.78-1.81(m，2H，CH2)，3.28-3.29(m，2H，CH2)，3.32(s，3H，CH3)，3.43-3.45(m，
2H，CH2)，5.59(d，J＝9.8Hz，1H，CH)，6.05-6.09(m，1H，CH)，6.15-6.20(m，1H，CH)，
7.22-7.30(m，4H，Ar-H)，7.64-7.66(m，1H，嘧啶-NH)，7.87-7.91(m，3H，Ar-H)，7.96
(s，1H，嘧啶-H)，8.50(t，J＝5.2Hz，1H，NH)，9.43(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)
501(M+1)。
实施例24
3-(1-甲基哌啶基-4-甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(1-甲基哌啶基-4-甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(220mg，25.6％
产率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和1-甲基哌啶-4-羧酸
(410mg，2.87mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)300
(M+1)。
实施例25
N-(3-氨基丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲酰胺(130mg，80.1％产率)是由
3-(1-甲基哌啶基-4-甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(220mg，0.74mmol)按照实施
例5中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)200(M+1)。
实施例26
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲酰胺(200mg，
79.6％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(130mg，0.71mmol)和N-(3-氨基丙基)-1-甲基哌
啶基-4-甲酰胺(130mg，0.65mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)346(M+1)。
实施例27
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-1-
甲基哌啶基-4-甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-1-甲基哌啶基-4-甲酰胺(12mg，11.6％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨
基)丙基)-1-甲基哌啶-4-甲酰胺(80mg，0.23mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基
丙烯酰胺(40mg，0.20mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.52-1.58(m，4H，2×CH2)，1.74-1.79(m，2H，CH2)，1.96-1.99(m，1H，
CH)，2.11(s，3H，CH3)，3.05-3.12(m，4H，2×CH2)，3.13-3.16(m，4H，2×CH2)，3.18
(s，3H，CH3)，5.60(d，J＝9.7Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.15-6.21(m，1H，
CH)，7.25-7.30(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.64-7.69(m，1H，Ar-H)，7.76(t，J＝5.45Hz，
1H，NH)，7.84-7.88(m，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，9.43(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)504(M+1)。
实施例28
N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氰基苯甲
酰胺的制备
黑色固体N-(3-(2-(3-丙烯酰胺基-4-氟苯基氨基)-5-氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-氰基苯甲酰胺(20mg，40％产率)是由4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)苯甲酰胺(35mg，0.1mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)丙烯酰胺(22mg，0.12
mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.81-1.87(m，
2H，CH2)，3.30-3.34(m，2H，CH2)，3.52-3.57(m，2H，CH2)，5.75-5.78(m，1H，CH)，
6.25-6.30(m，1H，CH)，6.59-6.66(m，1H，CH)，7.19(t，J＝10.48Hz，1H，嘧啶-NH)，
7.36-7.40(m，1H，Ar-H)，7.92-7.97(m，4H，Ar-H)，8.11(s，1H，嘧啶-H)，8.34(d，
J＝4.6Hz，1H，Ar-H)，8.73(t，J＝5.44Hz，1H，NH)，9.95(s，1H，苯环-NH)，10.05(s，
1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)494(M+1)。
实施例29
3-(4-二甲胺基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-二甲胺基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(840mg，91.1％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和4-二甲胺基苯甲酸(475
mg，2.87mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
实施例30
N-(3-氨基丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺(500mg，86.5％产率)是由
3-(4-二甲胺基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(840mg，2.62mmol)按照实施例5
中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
实施例31
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺(700mg，
84.3％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(550mg，3.00mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-二甲胺
基苯甲酰胺(500mg，2.26mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)368(M+1)。
实施例32
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
二甲胺基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺(49mg，58.3％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-二甲胺基苯甲酰胺(50mg，0.14mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙
烯酰胺(30mg，0.15mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.74-1.78(m，2H，CH2)，2.95(s，6H，2×CH3)，3.25-3.60(m，2H，CH2)，
3.32(s，3H，CH3)，3.41-3.43(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.8Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，
1H，CH)，6.16-6.20(m，1H，CH)，6.68(d，J＝9.8Hz，2H，Ar-H)，7.22-7.27(m，1H，
Ar-H)，7.31-7.34(m，1H，Ar-H)，7.64-7.67(m，1H，嘧啶-NH)，7.70(d，J＝8.7Hz，2H，
Ar-H)，7.89-7.90(m，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.14(t，J＝5.6Hz，1H，NH)，
9.43(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
实施例33
3-(2，4，6-三氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(2，4，6-三氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(200mg，60.1％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(174mg，1.0mmol)和2，4，6-三氟苯甲酸(176
mg，1.0mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)333(M+1)。
实施例34
N-(3-氨基丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺(100mg，43.1％产率)是由
3-(2，4，6-三氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.6mmol)按照实施例5
中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)233(M+1)。
实施例35
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺的制备
黄色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺(120mg，
73.6％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(100mg，0.55mmol)和N-(3-氨基丙基)-2，4，6-三
氟苯甲酰胺(100mg，0.43mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)379(M+1)。
实施例36
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，4，
6-三氟苯甲酰胺的制备
黄色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺(80mg，58.3％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)-2，4，6-三氟苯甲酰胺(120mg，0.32mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙
烯酰胺(110mg，0.56mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.75-1.82(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.25-3.31(m，2H，CH2)，
3.44-3.45(m，2H，CH2)，5.61(d，J＝9.5Hz，1H，CH)，6.04-6.11(m，1H，CH)，
6.16-6.22(m，1H，CH)，7.22-7.28(m，4H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.67-7.69(m，1H，Ar-H)，
7.87(d，J＝5.2Hz，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.71(t，J＝5.4Hz，1H，NH)，9.40
(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)537(M+1)。
实施例37
3-(4-甲氧基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-甲氧基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，90.4％产率)
是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和4-甲氧基苯甲酸(437mg，
2.87mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)309(M+1)。
实施例38
N-(3-氨基丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(500mg，92.6％产率)是由3-(4-
甲氧基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，2.60mmol)按照实施例5中的类
似步骤制备而成。LC-MS(m/z)209(M+1)。
实施例39
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(600mg，
70.3％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(690mg，3.74mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-甲氧基
苯甲酰胺(500mg，2.40mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
355(M+1)。
实施例40
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
甲氧基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(10mg，13.9％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(50mg，0.14mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯
酰胺(30mg，0.15mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)
δ1.77-1.80(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.28-3.31(m，2H，CH2)，3.43-3.45(m，
2H，CH2)，3.80(s，3H，CH3)，5.59(d，J＝9.5Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，
6.16-6.21(m，1H，CH)，6.97(d，J＝8.7Hz，2H，Ar-H)，7.21-7.27(m，2H，Ar-H，嘧啶
-NH)，7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，7.81(d，J＝8.7Hz，2H，Ar-H)，7.89(d，J＝6.4Hz，1H，
Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.31(t，J＝5.2Hz，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)513(M+1)。
实施例41
3-(2-氰基烟酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(2-氰基烟酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(400mg，91.3％产率)是由
3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(250mg，1.44mmol)和6-氰基烟酸(212mg，1.44mmol)
按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)305(M+1)。
实施例42
N-(3-氨基丙基)-6-氰基烟酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-6-氰基烟酰胺(240mg，89.6％产率)是由3-(2-氰基
烟酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(400mg，1.32mmol)按照实施例5中的类似步骤制
备而成。LC-MS(m/z)205(M+1)。
实施例43
6-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)烟酰胺的制备
白色固体6-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)烟酰胺(80mg，19.3％
产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(280mg，1.53mmol)和N-(3-氨基丙基)-6-氰基烟酰胺
(240mg，1.18mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)351
(M+1)。
实施例44
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-6-
氰基烟酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-6-氰基烟酰胺(15mg，17.4％产率)是由6-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)烟酰胺(60mg，0.17mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(46mg，
0.24mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.81-1.88(m，2H，CH2)，3.21(s，3H，CH3)，3.32-3.36(m，2H，CH2)，3.46-3.51(m，2H，
CH2)，5.61(d，J＝9.8Hz，1H，CH)，6.04-6.1(m，1H，CH)，6.17-6.22(m，1H，CH)，
7.29(t，J＝9.3Hz，1H，嘧啶-NH)，7.61-7.62(m，1H，Ar-H)，7.78(s，1H，Ar-H)，7.83(d，
J＝5.3Hz，1H，Ar-H)，8.06(s，1H，嘧啶-H)，8.17(d，J＝7.4Hz，1H，Ar-H)，8.36-8.41
(m，1H，Ar-H)，8.89(t，J＝5.4Hz，1H，NH)，9.09(s，1H，Ar-H)，9.85(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)509(M+1)。
实施例45
3-(4-羟基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-羟基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(600mg，71.1％产率)是
由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和4-羟基苯甲酸(440mg，2.87
mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)295(M+1)。
实施例46
N-(3-氨基丙基)-4-羟基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-羟基苯甲酰胺(300mg，75.8％产率)是由3-(4-羟
基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(600mg，2.04mmol)按照实施例5中的类似步
骤制备而成。LC-MS(m/z)195(M+1)。
实施例47
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-羟基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-羟基苯甲酰胺(200mg，
84.3％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(300mg，1.64mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-羟基苯
甲酰胺(300mg，1.54mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
341(M+1)。
实施例48
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
羟基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-羟基苯甲酰胺(3mg，1.3％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-羟基苯甲酰胺(200mg，0.47mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(100mg，0.52mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.75-1.81(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.27-3.29(m，2H，CH2)，3.42-3.44(m，2H，
CH2)，5.59(d，J＝9.4Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.16-6.20(m，1H，CH)，
6.78(d，J＝7.9Hz，2H，Ar-H)，7.24-7.27(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.67-7.69(m，1H，
Ar-H)，7.70(d，J＝8.1Hz，2H，Ar-H)，7.88-7.90(m，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，
8.20(s，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH)，9.89(s，1H，OH).LC-MS(m/z)499
(M+1)。
实施例49
3-(4-氰基-2-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-氰基-2-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(450mg，70.1％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(348mg，2.0mmol)和4-氰基-2-氟苯甲酸(330
mg，2.0mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
实施例50
N-(3-氨基丙基)-4-氰基-2-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氰基-2-氟苯甲酰胺(278mg，90.0％产率)是由
3-(4-氰基-2-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(450mg，1.4mmol)按照实施例5
中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
实施例51
4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2-氟苯甲酰胺的制备
白色固体4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2-氟苯甲酰胺(312mg，
67.4％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(238mg，1.3mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氰基-2-
氟苯甲酰胺(278mg，1.26mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)368(M+1)。
实施例52
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
氰基-2-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-氰基-2-氟苯甲酰胺(106mg，49.3％产率)是由4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶
基-4-氨基)丙基)-2-氟苯甲酰胺(150mg，0.41mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲
基丙烯酰胺(87mg，0.45mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.80-1.83(m，2H，CH2)，3.20(s，3H，CH3)，3.30-3.31(m，2H，CH2)，
3.45-3.47(m，2H，CH2)，5.61(d，J＝9.7Hz，1H，CH)，6.04-6.10(m，1H，CH)，
6.15-6.21(m，1H，CH)，7.20-7.25(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.62-7.65(m，1H，Ar-H)，
7.75-7.76(m，2H，Ar-H)，7.88-7.94(m，2H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.57(s，1H，
NH)，9.41(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
实施例53
3-(4-氰基-3-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-氰基-3-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(462mg，71.9％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(348mg，2.0mmol)和4-氰基-3-氟苯甲酸(330
mg，2.0mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)322(M+1)。
实施例54
N-(3-氨基丙基)-4-氰基-3-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氰基-3-氟苯甲酰胺(275mg，86.5％产率)是由
3-(4-氰基-3-氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(462mg，1.44mmol)按照实施例
5中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)222(M+1)。
实施例55
4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氟苯甲酰胺的制备
白色固体4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氟苯甲酰胺(340mg，
74.6％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(229mg，1.25mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氰基-3-
氟苯甲酰胺(275mg，1.24mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)368(M+1)。
实施例56
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
氰基-3-氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-氰基-3-氟苯甲酰胺(98mg，45.6％产率)是由4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基
-4-氨基)丙基)-3-氟苯甲酰胺(150mg，0.41mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基
丙烯酰胺(87mg，0.45mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.81-1.84(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.33-3.35(m，2H，CH2)，
3.45-3.46(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.7Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，1H，CH)，
6.21-6.20(m，1H，CH)，7.21-7.25(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.63-7.65(m，1H，Ar-H)，
7.81-7.89(m，2H，Ar-H)，7.95(s，1H，嘧啶-H)，8.04-8.12(m，2H，Ar-H)，8.76(t，
J＝5.6Hz，1H，NH)，9.45(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)526(M+1)。
实施例57
N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氰基苯甲酰胺的制备
黄色固体N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-氰基苯甲酰胺(100mg，
60.6％产率)是由2，4-二氯-5-甲基嘧啶(82mg，0.5mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氰基
苯甲酰胺(100mg，0.5mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
330(M+1)。
实施例58
4-氰基-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶基-4-氨基)
丙基)-苯甲酰胺的制备
黑色固体4-氰基-N-(3-(2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)-5-甲基嘧啶
基-4-氨基)丙基)-苯甲酰胺(10mg，3.3％产率)是由N-(3-(2-氯-5-甲基嘧啶基-4-氨
基)丙基)-4-氰基苯甲酰胺(100mg，0.61mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯
酰胺(128mg，0.66mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.82-1.85(m，2H，CH2)，1.92(s，3H，CH3)，3.19(s，3H，CH3)，3.35-3.37
(m，2H，CH2)，3.43-3.46(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.8Hz，1H，CH)，6.04-6.1(m，1H，
CH)，6.15-6.20(m，1H，CH)，6.68(t，J＝5.5Hz，1H，Ar-H)，7.19(t，J＝9.5Hz，1H，嘧
啶-NH)，7.65-7.67(m，2H，Ar-H)，7.93-7.99(m，5H，Ar-H，嘧啶-H)，8.69(t，J＝5.5
Hz，1H，NH)，9.04(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)488(M+1)。
实施例59
N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-氨基)丙基)4-氰基苯甲酰胺的制备
黄色固体N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-氨基)丙基)4-氰基苯甲酰胺(100mg，
60.0％产率)是由2，4-二氯-5-氟嘧啶(83mg，0.5mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯
甲酰胺(100mg，0.5mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)334
(M+1)。
实施例60
4-氰基-N-(3-(5-氟-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙
基)苯甲酰胺的制备
灰色固体4-氰基-N-(3-(5-氟-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基
-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(49mg，58.3％产率)是由N-(3-(2-氯-5-氟嘧啶基-4-氨基)丙
基)4-氰基苯甲酰胺(100mg，0.30mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(110mg，0.56mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.84-1.85(m，2H，CH2)，3.18(s，3H，CH3)，3.33-3.35(m，2H，CH2)，3.42-3.43(m，2H，
CH2)，5.59(d，J＝8.6Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，1H，CH)，6.15-6.20(m，1H，CH)，
7.20(t，J＝9.1Hz，1H，嘧啶-NH)，7.47-7.49(m，1H，Ar-H)，7.63-7.64(m，1H，Ar-H)，
7.88-7.89(m，2H，Ar-H)，7.92-7.96(m，4H，嘧啶-H，Ar-H)，8.68(s，1H，NH)，9.23(s，
1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)492(M+1)。
实施例61
3-(2-(4-氰基苯基)乙酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(2-(4-氰基苯基)乙酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(511mg，80.6％
产率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(348mg，2.0mmol)和2-(4-氰基苯基)乙酸
(322mg，2.0mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)318
(M+1)。
实施例62
N-(3-氨基丙基)-2-(4-氰基苯基)乙酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-2-(4-氰基苯基)乙酰胺(312mg，89.4％产率)是由
3-(2-(4-氰基苯基)乙酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(511mg，1.61mmol)按照实施例
5中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)218(M+1)。
实施例63
2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)乙酰胺的制备
白色固体2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)乙酰胺(360
mg，68.9％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(265mg，1.45mmol)和N-(3-氨基丙基)-2-(4-
氰基苯基)乙酰胺(312mg，1.44mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。
LC-MS(m/z)364(M+1)。
实施例64
N-(5-(5-氯-4-(3-(2-(4-氰基苯基)乙酰胺基)丙基氨基)嘧啶基-2-氨基)-2-氟苯
基)-N-甲基丙烯酰胺的制备
白色固体N-(5-(5-氯-4-(3-(2-(4-氰基苯基)乙酰胺基)丙基氨基)嘧啶基-2-氨
基)-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(113mg，53.1％产率)是由2-(4-氰基苯基)-N-(3-(2，
5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)乙酰胺(150mg，0.41mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-
甲基丙烯酰胺(87mg，0.45mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.67-1.72(m，2H，CH2)，3.08-3.11(m，2H，CH2)，3.18(s，3H，CH3)，
3.37-3.38(m，2H，CH2)，3.52(s，2H，CH2)，5.60(d，J＝10.2Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，
1H，CH)，6.16-6.21(m，1H，CH)，7.19-7.22(m，1H，Ar-H)，7.26(t，J＝9.3Hz，1H，嘧
啶-NH)，7.44(d，J＝8.1Hz，2H，Ar-H)，7.64-7.66(m，1H，Ar-H)，7.74(d，J＝8.2Hz，2H，
Ar-H)，7.88-7.89(m，1H，Ar-H)，7.95(s，1H，嘧啶-H)，8.13(t，J＝5.6Hz，1H，NH)，
9.39(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)522(M+1)。
实施例65
3-(4-氰基苯磺酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-氰基苯基磺酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(0.25g，73.7％产率)
由如下方法制备。4-氰基苯磺酰氯(0.2g，1.0mmol)和N-Boc-1，3-丙二胺(0.18g，
1.03mmol)溶于5mLTHF中于室温下搅拌。然后加入DIPEA(0.26g，2.0mmol)
室温反应4小时。LC-MS跟踪反应。反应结束后倒入饱和的NaHCO3的水溶液
中，搅拌析出固体。过滤获得目标中间体。LC-MS(m/z)340(M+1)。
实施例66
N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯磺酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯磺酰胺(150mg，85.2％产率)是由3-(4-氰
基苯磺酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(250mg，0.74mmol)按照实施例5中的类似步
骤制备而成。LC-MS(m/z)240(M+1)。
实施例67
4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯磺酰胺的制备
白色固体4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯磺酰胺(150mg，
61.9％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(128mg，0.7mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-氰基苯
磺酰胺(150mg，0.63mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
386(M+1)。
实施例68
N-(5-(5-氯-4-(3-(4-氰基苯磺酰胺基)丙基氨基)嘧啶基-2-氨基)-2-氟苯基)-N-
甲基丙烯酰胺的制备
白色固体N-(5-(5-氯-4-(3-(4-氰基苯磺酰胺基)丙基氨基)嘧啶基-2-氨基)-2-
氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺的制备(35mg，30.7％产率)是由4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧
啶基-4-氨基)丙基)苯磺酰胺(80mg，0.21mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙
烯酰胺(43mg，0.22mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.63-1.70(m，2H，CH2)，2.80-2.85(m，2H，CH2)，3.17(s，3H，CH3)，
3.34-3.35(m，2H，CH2)，5.60(d，J＝10.3Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，1H，CH)，
6.15-6.20(m，1H，CH)，7.13-7.16(m，1H，Ar-H)，7.25(t，J＝9.4Hz，1H，嘧啶-NH)，
7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，7.81-7.82(m，1H，Ar-H)，7.88(t，J＝5.9Hz，1H，NH)，7.91(d，
J＝8.4Hz，2H，Ar-H)，7.94(s，1H，嘧啶-H)，8.03(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)，9.38(s，1H，
苯环-NH).LC-MS(m/z)544(M+1)。
实施例69
4-氰基-N-(3-羟基丙基)苯甲酰胺的制备
黄色液体4-氰基-N-(3-羟基丙基)苯甲酰胺(400mg，99％产率)是由3-氨基-1-
丙醇(150mg，2mmol)和4-氰基苯甲酸(294mg，2mmol)按照实施例4中的类似
步骤制备而成。LC-MS(m/z)205(M+1)。
实施例70
4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氧基)丙基)苯甲酰胺的制备
黄色固体4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氧基)丙基)苯甲酰胺(120mg，17％
产率)由如下方法制备。4-氰基-N-(3-羟基丙基)苯甲酰胺(408mg，2mmol)溶于3
mLDMF中置于冰浴下搅拌，10分钟后加入NaH(48mg，2mmol)，继续搅拌，
10分钟后加入2，4，5-三氯嘧啶(366mg，2mmol)撤掉冰浴，室温反应。LC-MS跟
踪反应。反应结束后倒入200mL盐水，析出黄色粘稠物，倒掉水层，加入200mL
PE超声，过滤获得目标中间体。LC-MS(m/z)351(M+1)。
实施例71
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氧基)丙基)-4-
氰基苯甲酰胺的制备
褐色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氧基)
丙基)-4-氰基苯甲酰胺(20mg，20.0％产率)是由4-氰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氧
基)丙基)苯甲酰胺(70mg，0.2mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(50
mg，0.24mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.98-2.06(m，2H，CH2)，3.18(s，3H，CH3)，3.40-3.47(m，2H，CH2)，4.45-4.51(m，2H，
CH2)，5.60(d，J＝9.5Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.16-6.21(m，1H，CH)，
7.28(t，J＝9.4Hz，1H，嘧啶-NH)，7.64-7.67(m，1H，Ar-H)，7.78-7.80(m，1H，Ar-H)，
7.93(d，J＝8.3Hz，2H，Ar-H)，7.98(d，J＝8.3Hz，2H，Ar-H)，8.32(s，1H，嘧啶-H)，
8.77(t，J＝5.3Hz，1H，NH)，9.85(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)509(M+1)。
实施例72
3-(异烟酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(异烟酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(1.0g，78.0％产率)是由3-氨
基丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，4.60mmol)和异烟酰氯(900mg，6.38mmol)按照
实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)280(M+1)。
实施例73
N-(3-氨基丙基)-异烟酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-异烟酰胺(180mg，28.1％产率)是由3-(异烟酰胺基)
丙基氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.58mmol)按照实施例5中的类似步骤制备而成。
LC-MS(m/z)180(M+1)。
实施例74
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)异烟酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)异烟酰胺(120mg，32.8％产率)
是由2，4，5-三氯嘧啶(276mg，1.51mmol)和N-(3-氨基丙基)-异烟酰胺(180mg，
1.00mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)326(M+1)。
实施例75
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)异
烟酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)异烟酰胺(4.2mg，2.3％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)异烟
酰胺(120mg，0.36mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(70mg，0.36
mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.80-1.84(m，
2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.26-3.33(m，2H，CH2)，3.45-3.47(m，2H，CH2)，5.59(d，
J＝10.1Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.15-6.20(m，1H，CH)，7.23-7.27(m，
2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.64-7.66(m，1H，Ar-H)，7.72(d，J＝5.6Hz，2H，Ar-H)，7.89(d，
J＝5.2Hz，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，7.70(d，J＝5.5Hz，2H，Ar-H)，8.73(s，1H，
NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)484(M+1)。
实施例76
3-(4-乙基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-乙基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，91.1％产率)是
由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.87mmol)和4-乙基苯甲酰氯(530mg，
3.15mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)307(M+1)。
实施例77
N-(3-氨基丙基)-4-乙基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-乙基苯甲酰胺(300mg，55.7％产率)是由3-(4-乙
基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(800mg，2.61mmol)按照实施例5中的类似步
骤制备而成。LC-MS(m/z)207(M+1)。
实施例78
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-乙基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-乙基苯甲酰胺(500mg，
97.5％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(300mg，1.64mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-乙基苯
甲酰胺(300mg，1.46mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
353(M+1)。
实施例79
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
乙基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-乙基苯甲酰胺(86mg，59.4％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-羟基苯甲酰胺(100mg，0.28mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(71mg，0.37mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.19(t，J＝7.6Hz，3H，CH3)，1.78-1.81(m，2H，CH2)，2.62-2.67(m，2H，CH2)，3.19(s，
3H，CH3)，3.30-3.33(m，2H，CH2)，3.44-3.45(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝10.1Hz，1H，
CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.16-6.21(m，1H，CH)，7.22-7.29(m，4H，Ar-H，嘧啶
-NH)，7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，7.76(m，J＝8.0Hz，2H，Ar-H)，7.89(d，J＝5.2Hz，1H，
Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.37(t，J＝5.5Hz，1H，NH)，9.39(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)511(M+1)。
实施例80
3-(4-甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(0.45g，79％产率)是由
3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(0.3g，1.95mmol)和4-甲基苯甲酰氯(0.34g，1.95
mmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)293(M+1)。
实施例81
N-(3-氨基丙基)-4-甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-甲基苯甲酰胺(290mg，99％产率)是由3-(4-甲基
苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(450mg，1.54mmol)按照实施例5中的类似步骤
制备而成。LC-MS(m/z)193(M+1)。
实施例82
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-甲基苯甲酰胺(400mg，
78.1％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(300mg，1.64mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-甲基苯
甲酰胺(290mg，1.51mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
339(M+1)。
实施例83
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-甲基苯甲酰胺(200mg，34.2％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-4-甲基苯甲酰胺(400mg，1.18mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(400mg，2.06mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.76-1.83(m，2H，CH2)，2.34(s，3H，CH3)，3.19(s，3H，CH3)，3.29-3.33(m，2H，CH2)，
3.44-3.45(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.7Hz，1H，CH)，6.03-6.10(m，1H，CH)，
6.16-6.21(m，1H，CH)，7.22-7.26(m，4H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，
7.74(d，J＝8.0Hz，2H，Ar-H)，7.89(d，J＝5.2Hz，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，
8.38(t，J＝5.4Hz，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)497(M+1)。
实施例84
3-苯甲酰胺基丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-苯甲酰胺基丙基氨基甲酸叔丁酯(700mg，88.3％产率)是由3-氨
基丙基氨基甲酸叔丁酯(400mg，2.85mmol)和苯甲酰氯(500mg，3.57mmol)按照
实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)279(M+1)。
实施例85
N-(3-氨基丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)苯甲酰胺(375mg，80.4％产率)是由3-苯甲酰胺基
丙基氨基甲酸叔丁酯(700mg，2.62mmol)按照实施例5中的类似步骤制备而成。
LC-MS(m/z)179(M+1)。
实施例86
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(556mg，81.7％产率)
是由2，4，5-三氯嘧啶(550mg，3.00mmol)和N-(3-氨基丙基)苯甲酰胺(375mg，
2.1mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)325(M+1)。
实施例87
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)苯
甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)苯甲酰胺(245mg，42.8％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲
酰胺(400mg，1.23mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺(280mg，1.44
mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.79-1.83(m，
2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.31-3.34(m，2H，CH2)，3.44-3.46(m，2H，CH2)，5.59(d，
J＝9.8Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.16-6.21(m，1H，CH)，7.22-7.27(m，2H，
Ar-H，嘧啶-NH)，7.45(d，J＝7.5Hz，2H，Ar-H)，7.52(t，J＝7.1Hz，1H，Ar-H)，
7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，7.83(d，J＝5.2Hz，2H，Ar-H)，7.89(d，J＝7.4Hz，1H，Ar-H)，
7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.46(t，J＝5.2Hz，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).LC-MS
(m/z)483(M+1)。
实施例88
3-(3-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(3-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(640mg，79.7％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(400mg，2.32mmol)和3-三氟甲基苯甲酰氯
(596mg，2.87mmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)347
(M+1)。
实施例89
N-(3-氨基丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(300mg，66.0％产率)是由
3-(3-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(640mg，1.84mmol)按照实施例5
中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)247(M+1)。
实施例90
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(480mg，
93.2％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(360mg，2.21mmol)和N-(3-氨基丙基)-3-三氟甲
基苯甲酰胺(300mg，1.47mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)393(M+1)。
实施例91
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-
三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(240mg，35.7％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨
基)丙基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(480mg，1.22mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基
丙烯酰胺(260mg，1.34mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.80-1.87(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.32-3.37(m，2H，CH2)，
3.44-3.48(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.6Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，
6.16-6.21(m，1H，CH)，7.21-7.25(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，
7.71(t，J＝7.8Hz，1H，Ar-H)，7.88-7.90(m，2H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.14(d，
J＝7.9Hz，1H，Ar-H)，8.16(s，1H，Ar-H)，8.72(t，J＝5.4Hz，1H，NH)，9.40(s，1H，苯
环-NH).LC-MS(m/z)551(M+1)。
实施例92
3-(3-氰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(3-氰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(740mg，80.6％产率)是
由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(600mg，3.44mmol)和3-氰基苯甲酰氯(500mg，
3.02mmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)304(M+1)。
实施例93
N-(3-氨基丙基)-3-氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-3-氰基苯甲酰胺(300mg，86.5％产率)是由3-(3-氰
基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(740mg，2.62mmol)按照实施例5中的类似步
骤制备而成。LC-MS(m/z)204(M+1)。
实施例94
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氰基苯甲酰胺(460mg，
89.4％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(360mg，2.21mmol)和N-(3-氨基丙基)-3-氰基苯
甲酰胺(300mg，1.47mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
350(M+1)。
实施例95
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-
氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-3-氰基苯甲酰胺(210mg，31.8％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙
基)-3-氰基苯甲酰胺(460mg，1.31mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(280mg，1.44mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.80-1.86(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.31-3.35(m，2H，CH2)，3.44-3.48(m，2H，
CH2)，5.59(d，J＝10.2Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，6.16-6.21(m，1H，CH)，
7.21-7.26(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.64-7.66(m，1H，Ar-H)，7.68-7.70(m，1H，
Ar-H)，7.89-7.90(m，1H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，7.98(d，J＝7.7Hz，1H，Ar-H)，
8.13(d，J＝7.9Hz，1H，Ar-H)，8.24(s，1H，Ar-H)，8.66(t，J＝5.7Hz，1H，NH)，9.40(s，
1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)508(M+1)。
实施例100
3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
黄色固体3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(728mg，
100％产率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(348mg，2mmol)和3-氟-4-三氟甲基
苯甲酸(416mg，2mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)365
(M+1)。
实施例101
N-(3-氨基丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺(264mg，50％产率)是由
3-(3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(728mg，2mmol)按照实施
例5中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)265(M+1)。
实施例102
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
黄色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺
(200mg，49％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(183mg，1.00mmol)和N-(3-氨基丙基)-3-
氟-4-三氟甲基苯甲酰胺(264mg，1.00mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而
成。LC-MS(m/z)411(M+1)。
实施例103
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-3-
氟-4-三氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺(50mg，20％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-
氨基)丙基)-3-氟-4-三氟甲基苯甲酰胺(205mg，0.5mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯
基)-N-甲基丙烯酰胺(110mg，0.6mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H
-NMR(DMSO-d6)δ1.81-1.86(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.32-3.36(m，2H，
CH2)，3.45-3.47(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.4Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，1H，CH)，
6.15-6.20(m，1H，CH)，7.20-7.24(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.64-7.66(m，1H，Ar-H)，
7.83-7.92(m，4H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.75(t，J＝5.2Hz，1H，NH)，9.40(s，
1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)569(M+1)。
实施例104
3-(2，3，4，5-四氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(2，3，4，5-四氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(400mg，57.1％
产率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(348mg，2.00mmol)和2，3，4，5-四氟苯甲
酰氯(848mg，4.00mmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)351
(M+1)。
实施例105
N-(3-氨基丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺(250mg，100％产率)是由
3-(2，3，4，5-四氟苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(350mg，1.00mmol)按照实施
例5中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)251(M+1)。
实施例106
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺(200
mg，50％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(183mg，1.00mmol)和N-(3-氨基丙基)-2，3，4，
5-四氟苯甲酰胺(250mg，1.00mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。
LC-MS(m/z)397(M+1)。
实施例107
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-2，3，
4，5-四氟苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺(50mg，18％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨
基)丙基)-2，3，4，5-四氟苯甲酰胺(200mg，0.5mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲
基丙烯酰胺(110mg，0.6mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.79-1.82(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.28-3.30(m，2H，CH2)，
3.44-3.46(m，2H，CH2)，5.60(d，J＝9.8Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，
6.16-6.21(m，1H，CH)，7.23-7.27(m，2H，Ar-H，嘧啶-NH)，7.56-7.61(m，1H，Ar-H)，
7.65-7.67(m，1H，Ar-H)，7.88(d，J＝5.4Hz，1H，Ar-H)，7.95(s，1H，嘧啶-H)，8.52(s，
1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).LC-MS(m/z)555(M+1)。
实施例108
3-(4-乙酰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-乙酰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(385mg，60.2％产率)
是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(350mg，2.01mmol)和4-乙酰基苯甲酸(328mg，
2.00mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)321(M+1)。
实施例109
4-乙酰基-N-(3-氨基丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体4-乙酰基-N-(3-氨基丙基)苯甲酰胺(200mg，75.8％产率)是由3-(4-
乙酰基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(385mg，1.20mmol)按照实施例5中的类
似步骤制备而成。LC-MS(m/z)221(M+1)。
实施例110
4-乙酰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体4-乙酰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(120mg，
36.1％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(180mg，0.98mmol)和4-乙酰基-N-(3-氨基丙基)
苯甲酰胺(200mg，0.91mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
367(M+1)。
实施例111
4-乙酰基-N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)苯甲酰胺的制备
白色固体4-乙酰基-N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶
基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(83mg，47.9％产率)是由4-乙酰基-N-(3-(2，5-二氯嘧啶
基-4-氨基)丙基)苯甲酰胺(120mg，0.33mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯
酰胺(70mg，0.36mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)
δ1.79-1.85(m，2H，CH2)，2.61(s，3H，CH3)，3.19(s，3H，CH3)，3.32-3.36(m，2H，
CH2)，3.45-3.48(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.9Hz，1H，CH)，6.02-6.09(m，1H，CH)，
6.15-6.20(m，1H，CH)，7.21-7.28(m，2H，嘧啶-NH，Ar-H)，7.64-7.69(m，1H，Ar-H)，
7.88-7.89(m，1H，Ar-H)，7.94(d，J＝8.3Hz，2H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.01(d，
J＝8.4Hz，2H，Ar-H)，8.65(t，J＝5.3Hz，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).LC-MS
(m/z)525(M+1)。
实施例112
3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(780mg，84.3％产
率)是由3-氨基丙基氨基甲酸叔丁酯(490mg，2.82mmol)和4-二氟甲基苯甲酸(485
mg，2.82mmol)按照实施例4中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)329(M+1)。
实施例113
N-(3-氨基丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-氨基丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺(180mg，33.2％产率)是由
3-(4-二氟甲基苯甲酰胺基)丙基氨基甲酸叔丁酯(780mg，2.38mmol)按照实施例5
中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)229(M+1)。
实施例114
N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺(250mg，
84.5％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(180mg，0.98mmol)和N-(3-氨基丙基)-4-二氟甲
基苯甲酰胺(180mg，0.79mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS
(m/z)375(M+1)。
实施例115
N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)丙基)-4-
二氟甲基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(3-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺(26mg，23.2％产率)是由N-(3-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)
丙基)-4-二氟甲基苯甲酰胺(80mg，0.21mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙
烯酰胺(50mg，0.26mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR
(DMSO-d6)δ1.81-1.84(m，2H，CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.32-3.40(m，2H，CH2)，
3.45-3.47(m，2H，CH2)，5.59(d，J＝9.4Hz，1H，CH)，6.03-6.09(m，1H，CH)，
6.16-6.20(m，1H，CH)，6.94(s，0.4H，CHF2)，7.08(s，0.6H，CHF2)，7.22-7.26(m，2H，
Ar-H，嘧啶-NH)，7.64-7.66(m，3H，Ar-H)，7.89-7.90(m，1H，Ar-H)，7.95(d，J＝7.3
Hz，2H，Ar-H)，7.96(s，1H，嘧啶-H)，8.59(s，1H，NH)，9.40(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)533(M+1)。
实施例120
6-(4-氰基苯甲酰胺基)己基氨基甲酸叔丁酯的制备
白色固体6-(4-氰基苯甲酰胺基)己基氨基甲酸叔丁酯(1300mg，73.4％产率)
是由6-己基氨基甲酸叔丁酯(1100mg，5.09mmol)和4-氰基苯甲酰氯(900mg，5.45
mmol)按照实施例76中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)346(M+1)。
实施例121
N-(6-氨基己基)-4-氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(6-氨基己基)-4-氰基苯甲酰胺(700mg，75.6％产率)是由6-(4-氰
基苯甲酰胺基)己基氨基甲酸叔丁酯(1300mg，3.76mmol)按照实施例5中的类似
步骤制备而成。LC-MS(m/z)246(M+1)。
实施例122
4-氰基-N-(6-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)己基)苯甲酰胺的制备
白色固体4-氰基-N-(6-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨基)己基)苯甲酰胺(80mg，
49.7％产率)是由2，4，5-三氯嘧啶(120mg，0.66mmol)和N-(6-氨基己基)-4-氰基苯
甲酰胺(100mg，0.41mmol)按照实施例6中的类似步骤制备而成。LC-MS(m/z)
392(M+1)。
实施例123
N-(6-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)己基)-4-
氰基苯甲酰胺的制备
白色固体N-(6-(5-氯-2-(4-氟-3-(N-甲基丙烯酰胺基)苯基氨基)嘧啶基-4-氨基)
己基)-4-氰基苯甲酰胺(47mg，50.3％产率)是由4-氰基-N-(6-(2，5-二氯嘧啶基-4-氨
基)己基)苯甲酰胺(68mg，0.17mmol)和N-(5-氨基-2-氟苯基)-N-甲基丙烯酰胺
(46mg，0.24mmol)按照实施例7中的类似步骤制备而成。1H-NMR(DMSO-d6)δ
1.30-1.32(m，4H，2×CH2)，1.52-1.56(m，4H，2×CH2)，3.19(s，3H，CH3)，3.26-3.29
(m，2H，CH2)，3.36-3.37(m，2H，CH2)，5.60(d，J＝9.9Hz，1H，CH)，6.03-6.10(m，1H，
CH)，6.17-6.21(m，1H，CH)，7.22-7.27(m，2H，嘧啶-NH，Ar-H)，7.59-7.61(m，1H，
Ar-H)，7.93-7.98(m，6H，嘧啶-NH，Ar-H)，8.64(s，1H，NH)，9.38(s，1H，苯环-NH).
LC-MS(m/z)550(M+1)。
体外生物学评价
本检测方法用于本发明所述化合物的体外活性评价，包括体外酶学活性评
价方法、细胞生长活性评价方法以及细胞内活性评价方法。
本检测的目的在于综合评价不同化合物对JAK、ITK、BLK、TBK1及VEGFR
等激酶的体外酶学抑制活性特点、亚型选择性特征以及对细胞模型的生物学活性
影响，包括细胞生长活性以及信号通路调节活性。
实施例A酶学活性检测
实验主要原理
体外酶学活性检测的基本原理是利用荧光标记的特异性底物，在激酶作用下
进行磷酸化，磷酸化底物和非磷酸化底物在不同波长会产生强弱不同的荧光信号
(445nm与520nm)。当加入不同测试化合物时，其对激酶活性的抑制体现为底
物磷酸化的程度，从而表现出不同的荧光信号，并以此计算化合物对激酶的抑制
活性。基本的检测原理如附图1所示。
酶学抑制活性检测利用GST标记的人重组JAKs激酶JAK1/PV4774、JAK2/
PV4210、JAK3/PV3855、TYK2/PV4790及其相应的特异性底物Tyr6(Z′-
KinaseAssayKit-Tyrosine6Peptide，JAK1/PV4122)、Tyr4(Z′-KinaseAssay
Kit-Tyrosine4Peptide，JAK2/PV3193)、Tyr4(Z′-KinaseAssayKit-Tyrosine
4Peptide，JAK3/PV3193)、Tyr3(Z′-KinaseAssayKit-Tyrosine4Peptide，
TYK2/PV3192)。检测试剂均为显色剂A(DevelopmentreagentA，PV3297)。上
述所有材料均从Invitrogen公司购买。
实验主要过程
实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行(Invitrogen)。流程如下：
(1)实验准备：按照要求配制激酶反应缓冲液(工作液)，用激酶反应缓冲
液将测试化合物稀释成不同浓度梯度(对JAK1、JAK2、TYK2检测，化合物最
高浓度均为10μM；对JAK3检测，化合物最高浓度为1μM)。
(2)酶学反应体系10μL，包含2.5μL测试化合物、5μL激酶反应缓冲液
和2.5μLATP溶液(试剂盒提供)，混匀后，室温反应1小时。
(3)检测反应同时设置有对照反应，包括未添加测试化合物的溶剂对照、
未添加ATP的阴性对照以及添加磷酸化底物的阳性对照。所有检测重复3次。
(4)酶学反应结束后，加入5μL预先配制的显色反应缓冲液，室温反应1
小时。随后加入5μL终止缓冲液终止反应。
(5)使用荧光检测仪(AscentFluoroskanFLreader，ThermoLabsystems)
检测每孔的荧光信号，激发波长为400nm，检测的发射波长分别为445nm和520
nm。底物磷酸化的比例参照荧光信号强度C445/F520。
(6)测试化合物的酶学抑制率计算公式：抑制率(％)＝1-检测孔底物磷酸
化/溶剂对照孔磷酸化率。对不同浓度梯度的测试化合物分别计算出磷酸化抑制
率后利用IC50计算器计算酶学半抑制浓度(IC50)。
根据上述实验方法，以Xeljanz(枸橼酸托法替尼)为阳性对照化合物，将本
发明所述化合物进行体外JAKs酶学评价(对JAK3和JAK2检测，测试化合物
浓度为30nM；对JAK1检测，测试化合物浓度为300nM)。数据小结见下表(表
2)。
表2本发明代表性化合物抑制JAKs的酶学数据
aRV＝测试化合物/Xeljanz的抑制率比值；ND(没有数据)
上表数据表明：与阳性对照药相比，本发明化合物具有选择性JAK3和/或
JAK1激酶抑制活性。
选择本发明所述部分化合物委托Eurofins公司(http：//www.eurofins.com)进行
激酶谱筛选(KinaseProfilerTM)和酶学抑制活性(IC50ProfilerTM)测定。完成活性筛选
的激酶中除了JAK家族激酶外，还包括多数Group3F和Group4激酶(ITK、
BLK、TBK1、VEGFRs、ERBBs等)以及血液系统相关激酶(ZhangJ.，etal.2009，
Nat.Rev.Cancer.，9：28-39)。测试化合物进行激酶谱筛选的浓度为1μM，IC50测
定采用9个半对数浓度梯度。实验检测按照Eurofins公司的标准实验流程开展。
实验方法如下：根据不同激酶的反应要求，0.2μL测试化合物(50μM溶于二甲
基亚砜DMSO)加入含有特定激酶的反应缓冲液(根据激酶类型不同，缓冲体
系分别包含：20mMMOPS，1mMEDTA，0.01％Brij-35，5％Glycerol，0.1％
β-mercaptoethanol，1mg/mLBSA或50mMTRIS，0.1mMEGTA，0.1mM
Na3VO4，0.1％β-巯基乙醇，1mg/mLBSA)，随后依次加入终浓度为50μM的激
酶特异性底物(不同激酶采用不同底物)、10mMMgAcetate和同位素标记的γ-33P
ATP(放射活性约500cpm/pmol)，反应体系总体积为10μL。室温孵育40分钟，
以3％磷酸终止反应，随后转入滤网式低温喷雾干燥设备(P30filtermat)，以75
mM磷酸清洗三次和甲醇清洗一次，干燥后进行放射活性检测。具体操作流程参
见Eurofins公司提供的标准操作流程：
http：//www.eurofins.com/media/9724077/kinaseprofiler_assav_protocol_guide_eurofi
ns_v64.pdf)。数据小结见下表(表3)。
表3本发明代表性化合物抑制JAKs、ITK、BLK、TBK1及VEGFR的IC50(nM)
ND(没有数据)
上表数据表明：(1)本发明部分化合物具有选择性JAK3和/或JAK1激酶抑
制活性。(2)本发明部分化合物对ITK、BLK、TBK1及VEGFR家族中的部分
激酶具有抑制活性。
实施例B细胞生长活性检测
如前所述，JAKs激酶表达分布具有分布特异性，除了免疫系统细胞外，在
其它细胞类型也有表达。JAK3主要表达于T淋巴细胞，其它亚型的分布较为广
泛。JAK激酶通过介导不同细胞因子信号，对靶细胞的生长活性具有潜在的影响。
JAKs激酶抑制剂通过抑制不同亚型的JAKs，从而对模型细胞的生长可能产生不
同的作用效果。
MTS检测为常规细胞毒检测方法，其基本原理是活细胞线粒体中的脱氢酶
能够代谢还原黄色的新型甲臢化合物MTS为甲臜，在490nm吸收值(OD)测
量的甲臢产物的量直接与培养物中活细胞的数量成正比，因此可根据OD值推测
出活细胞的数目，了解测试化合物抑制细胞生长或杀伤细胞的能力。
本实验依据MTS检测方法利用不同类型的细胞模型评价本发明所述化合物
对细胞生长活性的影响，进而了解其细胞内的活性特点。
(1)CTLL-2细胞模型
实验主要原理
JAKs活性对免疫细胞的生长有明显影响。对于活化增殖的T淋巴细胞，其
生长依赖于细胞生长因子受体IL-2以及其下游的JAK1、3激酶活性。
本实验采用小鼠T淋巴细胞系CTLL-2，该细胞系的增殖生长严重依赖于
IL-2，通常用于评价外源IL-2的活性效价。通过抑制JAK1/3激酶活性，在体外
培养条件下能够抑制CTLL-2细胞增殖。T淋巴细胞活化增殖也是各种免疫性疾
病的重要病理特征。因此，本模型同时具有病理相关性。
采用MTS检测方法，通过比较经测试化合物处理后细胞产生吸光度值的变
化，来了解测试化合物对模型细胞的生长抑制活性，进而评价化合物对JAK1/3
通路的潜在抑制活性。
实验主要过程
MTS按常规实验操作流程，实验在96孔板中进行。
模型细胞按照适当的浓度(约20，000个/每孔)接种到96孔培养板中，24
小时后加入不同浓度梯度的测试化合物(最高终浓度10μM)，同时设置溶剂对
照(DMSO)和阴性对照孔，按照3次重复孔设置。细胞继续培养24小时后进
行检测。
CTLL-2为悬浮细胞，培养结束后，直接向培养孔中加入20μL预先配制的
MTS和PMS混合液(按照20∶1的比例混和)，37℃温箱培养2小时后用酶标仪
进行检测(490nm)。
扣除阴性对照的背景值后，测试化合物对细胞生长的影响，其通过比较测试
孔和溶剂对照孔的OD值差异进行计算。对不同浓度梯度的测试化合物分别计算
对模型细胞的生长率，并计算其生长半抑制浓度(GI50)。
(2)HeLa和HUVEC细胞模型
实验主要原理
HeLa细胞为人宫颈癌细胞系，属于上皮类型肿瘤细胞系；HUVEC为人脐
静脉血管内皮细胞，属于内皮型原代细胞；这两种细胞均表达除JAK3以外的其
他亚型。
JAK激酶活性变化对除免疫细胞外的其他细胞类型的生长没有明显影响，利
用上述两种细胞模型主要评价测试化合物是否存在JAK激酶以外影响细胞生长
的其他激酶靶点或者非选择性的细胞毒作用。
实验采用培养的细胞模型，与不同浓度的测试化合物共孵育指定时间后，利
用MTS方法检测测试化合物处理对细胞生长的影响。
实验主要过程
MTS按常规实验操作流程，实验在96孔板中进行。
模型细胞按照适当的浓度(约5000个/每孔)接种到96孔培养板中，24小
时后加入不同浓度梯度的测试化合物(最高终浓度40μM)，同时设置溶剂对照
(DMSO)和阴性对照孔，按照3次重复孔设置。细胞继续培养72小时后进行
检测。
吸出培养孔中的所有培养液，每孔加入100μL新鲜培养基和20μL预先配
制的MTS和PMS混合液(按照20∶1的比例混和)，37℃温箱培养2小时后用酶
标仪进行检测(490nm)。
测试化合物的细胞生长率和GI50的计算方法同上。
根据上述实验方法，将本发明所述化合物进行细胞学评价(对CTLL-2细胞
检测，测试化合物浓度为300nM；对HeLa和HUVEC细胞检测，测试化合物浓
度为10μM)。数据小结见下表(表4)。
表4本发明代表性化合物在不同细胞株中的生长率
ND(没有数据)
上表数据表明：本发明部分化合物具有特异性的CTLL-2细胞抑制活性。
根据细胞学实验方法，以Xeljanz为阳性对照化合物，选择本发明化合物进
行体外JAKs酶学的IC50和对不同细胞株的GI50测定。结果见下表(表5)。
表5本发明代表性化合物在不同细胞株中的GI50(μM)
ND(没有数据)
上表数据表明：与阳性对照药相比，本发明化合物具有高选择性的JAK3激
酶抑制活性，同时这些化合物还具有很好的特异性CTLL-2的细胞抑制活性。
实施例C细胞内活性评价
细胞因子、JAK激酶和STAT蛋白信号通路是一个复杂的网络系统，不同的
细胞因子通过激活特定的JAK亚型同源二聚体或不同亚型组成的异源二聚体，
进而促进不同STAT蛋白成员的磷酸化。在不同的细胞模型上，利用特定的细胞
因子刺激，可以检测到与相关JAK亚型特定相关的下游STAT磷酸化信号，而
JAK抑制剂通过抑制相关激酶的活性而抑制这一通路活性，由此可以评价测试化
合物对不同JAK亚型的细胞内抑制活性。
本实验采用蛋白免疫印迹(WB)方法和流式细胞术，利用U937、THP-1、
CTLL-2、UT-7/EPO及活化的人外周血细胞(hPBC)共5种细胞模型，通过比
较STATs磷酸化和非磷酸化检测信号的相对水平评价待测化合物的细胞内活性。
本实验中WB杂交使用的一抗和二抗均从CellSignaling公司
(http：//www.cellsignal.com)购买，流式细胞术使用的荧光标记抗体均从
eBiosciences公司(http：//www.ebioscience.com)购买。
实验主要原理
U937为单核细胞系，细胞因子IFNγ通过激活JAK1/2异源二聚体而引起下
游STAT5a磷酸化，通过抑制JAK1/2活性进而抑制STAT5a磷酸化。基于此，通
过检测STAT5磷酸化水平变化可以评价测试化合物对JAK1/2的细胞内抑制活
性。
THP-1为单核细胞系，细胞因子IL-4通过激活JAK1/3异源二聚体，引起下
游STAT6磷酸化，JAK抑制剂化合物通过抑制JAK1/3活性进而抑制STAT6磷
酸化。通过检测STAT6磷酸化水平变化可以评价化合物对JAK1/3的细胞内抑制
活性。
CTLL-2为T淋巴细胞系，其增殖生长依赖于细胞因子IL-2，细胞因子IL-2
通过激活JAK1/3异源二聚体，引起下游STAT5磷酸化，JAK抑制剂化合物通过
抑制JAK1/3活性进而抑制STAT5磷酸化。通过检测STAT5磷酸化水平变化可
以评价化合物对JAK1/3的细胞内抑制活性。
UT-7/EPO为来自巨细胞白血病患者骨髓经EPO诱导培养后形成的细胞系，
其对细胞因子EPO具有明显反应，EPO信号经由JAK2同源二聚体传递，引起
下游STAT5磷酸化，JAK抑制剂化合物通过抑制JAK2活性进而抑制STAT5磷
酸化。通过检测STAT5磷酸化水平变化可以评价化合物对JAK2的细胞内抑制
活性。
人外周血细胞(hPBC)经过CD3抗体共刺激活化后形成细胞因子IL-2依赖
的增殖，该生长信号通路由JAK1/3异源二聚体介导，并引起下游STAT5磷酸化。
通过检测STAT5磷酸化水平变化可以评价化合物对JAK1/3的细胞内抑制活性。
实验主要过程
蛋白免疫印迹(WB)
(1)化合物处理：实验采用6孔板，U937、THP-1细胞分别培养至适当密
度，加入不同浓度的测试化合物，过夜培养(16小时)，加入相应的IFNγ、IL-4
(10ng/mL)，30分钟后离心收集相应细胞。
(2)蛋白提取和WB检测：蛋白提取后定量，蛋白经PAGE电泳后转膜，
WB检测按照标准实验流程进行。杂交使用的二抗分别包括STAT5(#9363)、
STAT6(#9362)和相应的磷酸化STAT5(#9351)、STAT6(#9361)，按照抗体
说明书推荐的方法进行检测。
(3)信号检测：杂交信号检测采用X光片成像，扫描后的灰度信号转化为
数字信号，分别计算磷酸化STATs和STATs的相对信号强度，进而评价化合物
对STATs的磷酸化抑制活性。
流式细胞术(FCS)
(1)化合物处理：实验采用6孔板，THP-1、CTLL-2、UT7/EPO、以及体
外活化的志愿者外周血细胞(hPBC)分别培养至适当密度，加入不同浓度的测
试化合物，过夜培养(16小时)，加入相应的IFNγ、IL-4、IL-2、EPO(10ng/mL)，
30分钟后离心收集相应细胞。
(2)细胞固定和荧光标记：细胞采用多聚甲醛固定(30分钟)，随后以冷
冻甲醇进行透膜处理(15分钟)。细胞以PBS缓冲液清洗后制成悬液，按照100∶1
的比例加入抗磷酸化STAT5、STAT6抗体(Mouseanti-Humanp-STAT5
(pY694)-；Mouseanti-Rabbitp-STAT6(pY641)-)，避光孵育
30分钟，以PBS清洗后制成上样悬液。
(3)流式细胞检测：检测采用easyCyte流式细胞仪，按照仪器说
明书进行检测操作，选定合适的细胞群测量样品的中位荧光信号(MFI)，以此
为依据，参照实验中的阴性(未加因子刺激)和阳性对照(加因子刺激和溶剂对
照)样品的信号，分别计算不同化合物处理浓度下磷酸化STATs的相对信号强度，
进而计算出评价化合物对STATs磷酸化抑制活性的IC50值。
根据上述实验方法，选择本发明化合物进行WB和流式细胞检测，其中部分
化合物对特定细胞模型中的STATs磷酸化抑制IC50值。数据小结见下表(表6)。
表6本发明化合物的磷酸化抑制数据
ND(没有数据)
上表数据表明：本发明部分化合物具有细胞内选择性的JAK3和/或JAK1抑
制活性，其与体外酶学评价结果一致。
实施例D试验化合物在大鼠胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)模型中的影响
目的：本试验用鸡型胶原诱发Wistar大鼠关节炎，体内给予实施例7和实施例
22的化合物，通过观察大鼠关节炎发病指数的变化来评价试验化合物对大鼠关
节炎的治疗作用。
实验动物：36只雌性Wistar大鼠，开始研究时，重180-200g，购于广州中山大
学动物实验中心。四组(每组8只)用于关节炎模型，另有一组(4只)用作正
常对照。
实验材料：鸡II型胶原蛋白，弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant)，均购
于北京博蕾德科技发展有限公司。阳性对照物：甲氨蝶呤(methotrexat，MTX)。
受试药物：测试化合物实施例7和实施例22。
配制方法：临用时先配制0.2％CMC-Na+0.1％Tween-80无菌水作为溶剂，加入
受试化合物配成所需浓度，超声混匀即可。
试验方法：
CIA模型：将鸡胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，在0天于大鼠尾根部皮
下注射进行致敏(250μL/只)，第7天再于尾根部注射(100μL/只)进行加强免
疫。在关节炎发病(约第13天)后，将大鼠随机分成4组，每组8只。于首次
免疫后第14天开始给药，连续给药14天。肉眼观察大鼠四肢，对关节炎的严重
程度进行0-4级评分：0＝正常；1＝轻微症状，但踝关节或腕出现红肿等现象；2＝
踝关节或腕中度红肿现象；3＝整个爪包括趾(指)在内都严重红肿；4＝关节严重
肿胀并伴有功能障碍；每只鼠最高评分为16分。同时测量动物后肢足趾部厚度
及足容积。
药物治疗：灌服化合物实施例7，40mg/kg，2次/天；灌服化合物实施例22，40
mg/kg，2次/天。阳性对照，使用MTX5mg/kg腹腔注射，每周2次。用灌服溶
剂作为阴性对照。给药后14天与给药前数据相比，实验结果见下表(表7)：
表7化合物在大鼠胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)模型中的药效数据
实验结果显示：
1、与溶剂组比较，灌服化合物实施例7(40mg/kg)时能显著地抑制大鼠关节炎
肿胀程度，各项指标的抑制率均优于阳性对照药物甲氨蝶呤；灌服化合物实施例
22(40mg/kg)对大鼠关节炎发病也有一定抑制作用；
2、甲氨蝶呤给药组与溶剂组比较，动物体重有所减轻，反映了甲氨蝶呤对试验
大鼠有一定的毒性。而测试化合物实施例7和22组大鼠体重增加均优于溶剂组，
提示化合物实施例7和22不具有明显毒性，化合物实施例7的综合药效/安全性
指标优于阳性对照药物MTX。