一种香豆素类化合物及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及有机化学领域，具体涉及一种杂环化合物。
背景技术
香豆素，又称双呋喃环和氧杂萘邻酮，英文名称为coumarin，是一种重要的香料，天然存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰和兰花中。香豆素的衍生物有些存在于自然界，有些则可通过合成方法制得；有的游离存在，有的与葡萄糖结合在一起，其中不少具有重要经济价值。
香豆素类化合物是指邻羟基桂皮酸的内酯，具有芳香气味。该类化合物按其母核结构可分为简单香豆素类、呋喃香豆素类、吡喃香豆素类三种类型，主要分布在伞形科、豆科、菊科、芸香科、茄科、瑞香科、兰科等植物中。香豆素类化合物是生药中的一类重要的活性成分，如补骨脂内酯(psolalen)具有光敏活性作用，用于治疗白斑病；奥斯脑(osthole)是来源于蛇床子和毛当归的一种香豆素类活性成分，具有抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的药理活性；海棠果内酯(calophylloide)具有很强的抗凝血作用；滨蒿内酯(scoparon)是生药茵陈蒿平肝利胆、松弛平滑肌的主要活性成分。目前尚未发现具有治疗视网膜病变和抗氧化作用的香豆素类化合物。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种具有治疗视网膜病变和抗氧化作用的香豆素类化合物。
本发明实现上述目的的技术方案是：
一种香豆素类化合物，其分子结构如式I所示。
本发明所述的香豆素类化合物首次分离于细梗胡枝子[Lespedeza virgata(Thurb)DC]，分子式为C21H19O8，分子量为399，常温常压下为黄色无规则粉末。
本发明所述的香豆素类化合物可从细梗胡枝子全草中分离得到，具体的方法为：
(1)将干燥的细梗胡枝子全草粉碎后，用95％乙醇渗漉提取，回收提取液中的乙醇得到浸膏，所得浸膏先用石油醚萃取，取水相，再用氯仿萃取，取水相，然后用乙酸乙酯萃取，取水相，最后用正丁醇萃取，取正丁醇部分；
(2)将正丁醇部分经正向硅胶柱，依次用体积比分别为98∶2、95∶5、9∶1的氯仿和甲醇混合物梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为95∶5的洗脱液，再经ODS反向柱层析，依次用浓度为30％、50％和60％的甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇的洗脱液，最后经Sephadex LH-20柱层析，用纯甲醇洗脱，洗脱液经层析条件为氯仿∶甲醇＝95∶5、碘显色的薄层层析检测，取薄层层析后碘显色为蓝黑色的洗脱液，除去甲醇得到黄色结晶即可。
本发明所述的香豆素类化合物具有治疗视网膜病变和抗氧化作用，可用于制备治疗视网膜病变的药物，该药物由质量百分比为0.1～10％的权利要求1所述的化合物和90～99.9％的药用辅料组成，可以是注射剂、口服片剂、胶囊等。
为了更好地理解本发明，下面将通过动物实验来证明本发明具有的技术效果。
(一)本发明化合物治疗大鼠糖尿性视网膜病变
1.糖尿性视网膜病变大鼠模型的制备
1)实验动物：健康、雌雄各半、清洁级SD大鼠，体重(200±20)g，由南方医科大学动物中心提供。
2)糖尿性视网膜病变模型的诱发：大鼠按体重150mg/kg一次性腹腔注射四氧嘧啶，3日后尾静脉取血，血糖≥16.7mmol/L为造模成功。
2.治疗试验采用下述实施例2的片剂
1)给药方法：造模一周后开始给药，本发明治疗组以实施例2所述的注射剂以2mg/kg剂量每日一次腹腔注射，模型组与对照组以等容的生理盐水每日一次腹腔注射。
3.观察项目及方法
1)标本取材及切片制作：各组动物10周后股动脉取血处死，取眼球于10％中性甲醛固定后常规脱水、浸蜡、包埋，将眼球沿纵向取视网膜切片，切片厚7μm。
2)DUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡：凋亡指数以凋亡细胞占同一视野细胞总数的百分比表示，计数方法以每张玻片高倍镜下随机选五个视野计数。凋亡指数＝细胞凋亡数/细胞总数×％。
4.结果
正常大鼠视网膜未凋亡细胞，治疗组可见视网膜神经节细胞凋亡，内核层偶见凋亡，模型组神经节细胞层及内核层均见大量凋亡细胞阳性表达，外核层也可见凋亡细胞。治疗组与模型组与正常组比较，凋亡细胞数均明显增加，具有显著差异(P＜0.01)，治疗组与模型组相比，凋亡细胞明显减少，差异显著(P＜0.0)见表1。
表1各组大鼠视网膜神经细胞凋亡指数(x±s)
组别 n AI(％) 正常组 10 0.00±0 模型组 9 28.76±1.37 本发明治疗组 9 5.32±1.42
二、体外人视网膜色素上皮细胞实验：
(一)材料和方法
人视网膜色素上皮细胞(HRPE)购自武汉中国典型培养物保藏中心、DMEM培养基为sigma公司产品，胎牛血清(FBS)为杭州四季清公司产品，、AnnexinV/PI调亡试剂盒南京凯基公司产品。
2、本发明物干预及实验分组
将5mg本发明物溶于10ml全培养基，即得终浓度为500μg/ml的储备液。
(1)正常组：空白对照组：10％FBS MEM培养液
(2)模型组：阳性对照组：10％FBS MEM培养液+H2O2(500mmol/L)
(3)I组：本发明化合物(200μg/ml)+H2O2(500mmol/L)
(4)II组：本发明化合物(40μg/ml)+H2O2(500mmol/L)
(5)III组：本发明化合物(8μg/ml)+H2O2(500mmol/L)
3、本发明化合物对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响
采用TURNAL染色法，阴性组没有检测到视网膜色素上皮细胞凋亡，而阳性对照组HRPE细胞明显凋亡。采用流式细胞仪对照组HRPE细胞凋亡率为(23.33±1.275)％，III组、IV组HRPE细胞凋亡率分别为(5.49±0.634)％，(9.83±2.31)％和(16.57±1.253)，与对照组比较有显著差异。见表2。
表5本发明化合物对人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响
上述实验证明，本发明化合物能有效降低糖尿病发病过程中视网膜色素上皮细胞凋亡及由此引起的病理损害。
【具体实施方式】
例1：从胡枝子中提取分离本发明化合物。
将干燥的细梗胡枝子全草40kg粉碎后，用95％乙醇渗漉提取，回收提取液中的乙醇得到浸膏，所得浸膏先用石油醚萃取，取水相，再用氯仿萃取，取水相，然后用乙酸乙酯萃取，取水相，最后用正丁醇萃取，将正丁醇部分经正向硅胶柱，依次用体积比分别为98∶2、95∶5、9∶1的氯仿和甲醇混合物梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为95∶5的洗脱液，经ODS反向柱层析，依次用浓度为30％、50％、60％的甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇的洗脱液，经Sephadex LH-20柱层析，用纯甲醇洗脱，洗脱液经层析条件为氯仿∶甲醇＝95∶5、碘显色的薄层层析，回收薄层层析后碘显色为蓝黑色的洗脱液，除去甲醇得到1.14g黄色结晶，得率为0.03g/kg)。
鉴定：分子式C17H16O6，黄绿色无规则粉末，HR-ESI-MS：399.0473(M)+.1H-NMR、13C-NMR、HMBC数据如下所示：
UV(MeOH)λmax(logε)：214(4.82)，253(2.02)，347(2.35)nm；ESIMS m/z：435[M+Cl]-，399[M-H]-，369[M-OCH3]-；HRESIMS m/z：399.1074，[M-H]-(calcd for C21H19O8，399.1080)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.25(1H，s，H-10)，7.16(1H，s，H-7)，6.73(1H，s，H-4)，3.90(3H，s，1-OMe)，2.65(2H，m，H2-1′)，1.57(2H，m，H2-2′)，1.17(6H，s，H-4′，H-5′)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ：159.3(C-3)，157.8(C-6)，157.7(C-11a)，153.7(C-1)，152.5(C-4a)，149.0(C-10a)，145.6(C-9)，144.4(C-8)，121.0(C-2)，104.5(C-7)，100.0(C-11b)，99.1(C-4)，98.9(C-10)，69.0(C-2′)，62.4(C-3′)，43.3(C-2′)，29.1(C-4′，C-5′)，18.3(C-1′).
例2：
取例1得到的化合物1000mg溶于1000ml的生理盐水中，加热溶解，混合均匀后灌入瓶中，密封，消毒配成2mg/2ml一支的注射液。本品用于静脉注射(iv.)，成人6mg/天，相当于3支；小儿常用量：按体重0.05mg/kg/天。
例3：
取例1得到的化合物2000mg，溶于1000ml的生理盐水中，加热溶解，混合均匀后灌入瓶中，密封，消毒制成4mg/2ml一支的注射液。本品用于静脉注射(iv.)，成人6mg/天，相当于1.5支；小儿常用量：按体重0.05mg/kg/天。
例4：
取例1得到的化合物1600mg，加淀粉13440mg，加乳糖8960mg混合均匀，制成片重为150mg的片剂，每片含本品10mg。用法：口服。成人常用量：一次20mg(2粒)，每六小时一次；小儿常用量：按体重一次0.5mg/kg，每六小时一次。
例5：
取例1所得化合物3200mg，加淀粉17280mg，加乳糖11520mg混合均匀，制成片重为200mg地片剂，每片含本品20mg。用法：口服。成人常用量：一次20mg(1粒)，每六小时一次；小儿常用量：按体重一次0.5mg/kg，每六小时一次。
例6：
取例1所得化合物3200mg，加淀粉11520mg，加乳糖17280mg混合均匀制成颗粒，灌装成每粒内容物为200mg的胶囊，每粒胶囊含本品20mg。用法：口服。成人常用量：一次20mg(1粒)，每六小时一次；小儿常用量：按体重一次0.5mg/kg，每六小时一次。