黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺技术领域
本发明涉及一种黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，具体属于植物提取技术领域。
背景技术
黄蜀葵花为锦葵科植物黄蜀葵(Abelmoschusmanihot(L.)Medic.)的干燥花冠。始载
于《嘉佑本草》。黄蜀葵花具有清热利湿，消肿解毒的功效，主治湿热壅遏，淋浊水肿，外治
痈疽肿毒，水火烫伤。被收载于《中国药典》(2010版一部)中。黄蜀葵花中富含黄酮类化合
物，如金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、杨梅素、芦丁等。目前，对于黄蜀葵花中黄酮类化合
物的活性研究比较多，有研究表明金丝桃苷具有抗病毒活性、保肝、保护心脑血管、保护神
经系统、治疗原发性肾小球疾病等，张利斌等研究表明低剂量异槲皮苷对抑郁症模型小鼠抗
抑郁有一定活性，另有研究表明槲皮素具有抗氧化活性、抗炎、抗癌，抗纤维化等作用。
现有技术中对于黄酮的提取有直接回流法、温浸法、超声等方法。传统提取方法存在耗
时较长，过程繁琐、提取效率不高以及得率不高等问题，因此，提供一种能够有效解决上述
问题的黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，显得尤为必要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工
艺，能够简便、准确、高效的对黄蜀葵花中金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素进行提取，为其进
一步分离纯化和开发利用奠定了基础。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，所述黄酮类化合物为金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮
素。
前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，具体包括以下步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，
过筛，取黄蜀葵花粉末，加入乙醇后，超声提取，随后进行离心，取上清液过滤即得。
进一步地，前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，包括以下步骤：将黄蜀葵花干燥
后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入40％～90％乙醇，称重后，在200W～400W条
件下超声提取40min～60min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后进行离心，取上清液过0.45
μm微孔滤膜即得。
优选地，前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，包括以下步骤：将黄蜀葵花干燥后
粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入60％乙醇，称重后，在340W条件下超声提取60min，
冷却至室温后加入乙醇补重，随后进行离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜即得。
前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺中，超声提取在30℃～60℃条件下进行；优选
在50℃条件下进行。
前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺中，离心操作是以3500r/min～5000r/min的速
度离心10min～20min；优选以4000r/min的速度离心15min。
前述黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺中，黄蜀葵花粉末与乙醇的料液比为：黄蜀葵
花粉末的质量:乙醇的体积＝0.1:5～25g/mL；优选为：黄蜀葵花粉末的质量:乙醇的体积
＝0.1:15g/mL。
为了确保本发明提取方法科学、合理，发明人进行了相应的实验研究和筛选，才得以确
定本发明的技术方案。具体实验内容如下：
黄蜀葵花中富含黄酮类化合物，如金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等。本发明对黄蜀葵花
中黄酮类化合物的提取主要是针对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的提取。因此，本发明以黄
蜀葵花中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的提取为研究对象。
1、材料与仪器
黄蜀葵花样品贵州省遵义市轩瑞生物科技有限公司提供；金丝桃苷对照品(93.3％)、异
槲皮苷对照品(92.9％)和槲皮素对照品(96.5％)由中国药品生物制品检定所提供；乙腈(色
谱纯)：美国TEDIA公司；无水乙醇(分析纯)：重庆川东化工(集团)有限公司；磷酸(分
析纯)：天津市进丰化工有限公司；水：市售娃哈哈矿泉水。
高效液相色谱仪：AllianceWaterse2695(配有自动进样器和PDA二极管阵列检测器)；工
作站Empower3.0色谱数据工作站；分析天平：StartoriusCP225D型十万分之一天平；TDZ5-WS
型医用离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；FW135型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有
限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
2、实验设计
2.1黄蜀葵花中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的提取
将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，称取黄蜀葵花粉末约0.1g，置于25mL磨口锥
形瓶中，加入50％乙醇15mL，称重，在50℃下300W超声提取50min，冷却至室温后补重，摇
匀取适量离心(4000r/min，15min)，取上清液过0.45μm微孔滤膜即得供试液。
2.2单因素实验设计
以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率为评价指标，选择超声功率、提取时间、乙醇浓度、
提取温度和料液比五个单因素，以2.1项下供试液制备条件，采用单一变量原则，分别取3
个平行样进行试验。具体考察条件如下：
超声功率考察：选择超声功率100、200、300、400、500W；其他条件：提取时间50min、
乙醇浓度50％、料液比0.1g:15mL、提取温度50℃；
提取时间考察：选择提取时间10、20、30、40、50、60min，其他条件：乙醇浓度50％、
料液比0.1g:15mL、提取温度50℃、超声功率300W；
乙醇浓度考察：选择乙醇浓度10％、30％、50％、70％、90％、100％，其他条件：提取时间
50min、料液比0.1g:15mL、提取温度50℃、超声功率300W；
提取温度考察：选择提取温度20、30、40、50、60、70℃，其他条件：提取时间50min、
乙醇浓度50％、料液比0.1g:15mL、超声功率300W；
料液比考察：选择料液比0.1:5、0.1:10、0.1:15、0.1:20、0.1:25g/mL，其他条件：
提取时间50min、乙醇浓度50％、超声功率300W、提取温度50℃。
2.3金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的测定
2.3.1HPLC测定实验设计
本发明采用HPLC法测定金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量。
色谱柱：PhenomenexLuna5μC18(2)100A(250mm×4.60mm)；流动相：乙腈为流动相A，
0.1％磷酸水溶液为流动相B；流速：1.0mL/min；梯度洗脱：0～40min：A:B＝15:85，40～60min：
A:B＝15～30:85～70，60～65min：A:B＝30～15:70～85，65～70min，A:B＝15:85；检测波长：
360nm；柱温：30℃；进样量：10μL。用标准曲线法计算金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的得率。
分别精密称金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品、槲皮素对照品适量，加无水乙醇分别制
成金丝桃苷对照品溶液(0.0497mg/mL)、异槲皮苷对照品溶液(0.4400mg/mL)以及槲皮素对
照品溶液(0.3710mg/mL)。分别精密吸取金丝桃苷对照品溶液0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、
1.80mL，异槲皮苷对照品溶液0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL，槲皮素对照品溶液
0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mL分别置于2mL容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，进
样，分别计算标准曲线。
得率计算公式：得率(％)＝黄酮提取量/样品称样量×100％
采用Empower3.0色谱数据工作站、DesignExpert8.0.6和Origin8.5对采集到的数据进
行线性回归处理。
2.3.2HPLC结果与分析
对HPLC数据进行回归处理建立回归方程:金丝桃苷的回归方程为：Y1＝2.38×104X1－
22100，R2＝0.9980，线性范围：0.0199～0.0447mg/mL；异槲皮苷的回归方程为：Y2＝1.86×
104X2－4120，R2＝0.9969，线性范围：0.0132～0.0352mg/mL；槲皮素的回归方程为：Y3＝3.77
×104X3－6210，R2＝0.9998，线性范围：0.0037～0.0223mg/mL。取2.1项下供试液进样，在
上述色谱条件下，各组分分离良好，如图1所示。
3、单因素实验结果与分析
3.1超声功率对得率的影响
超声功率对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响结果如图2所示。控制其他提取条
件不变，考察的超声功率分别为100W、200W、300W、400W、500W。结果表明，超声功率对金
丝桃苷、异槲皮苷的提取影响较为明显，对槲皮素影响不大，当功率为300W时，金丝桃苷和
异槲皮苷得率最高，随着超声功率升高，得率又呈下降趋势，可能因为大功率会使三种黄酮
结构破坏，促进了黄酮苷的水解作用所致。综合考虑，采用300W作为超声功率较适合。
3.2提取时间对得率的影响
提取时间对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响见图3。控制其他提取条件不变，
考察的提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min。结果表明，提取时间
对三种黄酮得率的影响较显著，在50min时对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率达到一个顶
点，金丝桃苷、异槲皮苷含量达到(5.0±0.2)mg，槲皮素含量达到(1.8±0.2)mg。综合
考虑，提取50min比较合适。
3.3乙醇浓度对得率的影响
乙醇浓度对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响见图4。控制其他提取条件不变，
考察的乙醇浓度分别为10％、30％、50％、70％、90％、100％。结果表明，乙醇浓度对金丝桃苷
和异槲皮苷的提取有较大影响，乙醇浓度达50％时，二者获得最高得率。槲皮素在乙醇浓度
提高过程中，在浓度低于50％时呈现正相关趋势，在浓度为50％～80％时获得较稳定的得率。
综合考虑，选择乙醇浓度为50％。
3.4提取温度对得率的影响
提取温度对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响见图5。在20～70℃的升温考察过
程中，曲线总体比较平稳，说明温度对三种物质得率的影响不显著。槲皮素得率处于(2.0
±0.2)mg/g，金丝桃苷、异槲皮苷得率处于4～5mg/g之间，升高温度虽然增加了溶剂分子
和溶质分子的动能，升温对三种黄酮的浸出率有一定的促进，整体呈现正相关，但三种物质
都已基本浸出，升温意义不大，考虑安全、节能、可操作性，最终选择50℃作为提取温度。
3.5料液比对得率的影响
料液比对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响见图6，控制其他提取条件不变，考
察的料液比分别为0.1:5g/mL、0.1:10g/mL、0.1:15g/mL、0.1:20g/mL、0.1:25g/mL。结果
表明，料液比在0.1:15g/mL时，金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素的得率较高。随着料液比继续
增大，三种黄酮得率反呈下降趋势，可能因为提取体积增大，使后续操作过程增长，加大了
成分损失的风险所致。由于黄蜀葵花含大量粘液质，经预实验结果显示，以乙醇50％为溶剂
时，降低料液比(至低于0.1:5g/mL时)，提取液粘度明显增加，给后续过滤等操作带来难度，
影响了试验结果的重复性和可靠性。综合考虑实验成本、安全、可操作性等因素，最终选择
料液比为0.1:15g/mL。
4、响应面法优化金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的提取条件
4.1响应面实验设计
依据单因素实验结果，固定料液比0.1:15g/mL、提取温度50℃，选取超声功率、提取时
间、乙醇浓度3个因素为自变量，分别表示为X1、X2、X3，以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的
得率Y(mg/g)为评价指标进行分析，根据根据中心组合(Box-Behnken)实验设计原理，采
用三水平三因素的响应面分析方法设计实验，因素与水平编码表见表1。
表1响应面试验因素与水平
选择超声功率(X1)、提取时间(X2)、乙醇浓度(X3)作为自变量，金丝桃苷得率(Y1)、异槲
皮苷得率(Y2)、槲皮素得率(Y3)作为因变量，利用Design-Expert8.0.6设计响应面实验方案，
根据Box-Benhnken中心组合设计原理，选择3水平响应面实验设计，其中包含12个实验点，
5个中心实验点用来估计实验误差，共17个试验点。实验设计和结果见表2。
表2Box-Benhken实验设计与结果
4.2模型建立与显著性检验
通过分析软件Design-Expert8.0.6对表2的实验数据进行二次多项式回归拟合，分别得
到金丝桃苷得率(Y1)、异槲皮苷得率(Y2)、槲皮素得率(Y3)回归方程，对方程的回归分析和方
差分析结果见表3、表4和表5。
金丝桃苷的回归方程：
Y1(mg/g)＝9.06－5.20×10-4X1－0.38X2+0.18X3+3.0×10-5X1X2+2.08×10-4X1X3+2.11×
10-3X2X3－2.14×10-5X12+2.63×10-3X22－3.05×10-3X32
异槲皮苷的回归方程：
Y2(mg/g)＝9.30－6.19×10-3X1－0.31X2+0.13X3+5.83×10-19X1X2+2.71×10-4X1X3+2.24
×10-3X2X3－1.51×10-5X12－1.99×10-3X22－2.80×10-3X32
槲皮素的回归方程：
Y3(mg/g)＝－1.69+3.06×10-3X1－0.10X2+0.20X3+1.50×10-5X1X2+8.25×10-5X1X3+
5.25×10-4X2X3－1.41×10-5X12+7.45×10-4X22－2.11×10-3X32
表3金丝桃苷的方差分析和显著性检验结果
注：**表示表示极显著(p<0.01)；*表示显著(p<0.05)。
表4异槲皮苷的方差分析和显著性检验结果
注：**表示表示极显著(p<0.01)；*表示显著(p<0.05)。
表5槲皮素的方差分析和显著性检验结果
注：**表示表示极显著(p<0.01)；*表示显著(p<0.05)。
由表3、表4和表5可知，三个方程自变量与因变量之间的线性关系明显，实验模型皆
显著(p<0.05)，失拟值(p>0.05)皆不显著，并且三个模型相关系数R2(Y1)＝94.23％、R2(Y2)＝
92.85％、R2(Y3)＝98.23％，校正决定系数Y1:R2Adj＝86.81％、Y2:R2Adj＝83.66％、Y3:R2Adj＝95.95％，
说明三个模型与实际实验拟合良好，可用于实际提取工艺预测。各因素的F值的大小反应出
对实验影响值的重要性，由F值检验可以看出金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素因子贡献率为
X3>X1>X2，即乙醇浓度>超声功率>提取时间，金丝桃苷超声功率和乙醇浓度、提取时间和乙醇
浓度存在交互作用；异槲皮苷超声功率和乙醇浓度存在交互作用；槲皮素超声功率和乙醇浓
度存在交互作用，具体交互作用如图7～图15所示。
4.3提取工艺条件的验证
应用响应面分析法对回归模型进行分析，优化得到金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的最佳
提取工艺均为：超声功率336.44W，提取时间59.74min，乙醇浓度63.98％，通过对二次多元
方程求解得到：金丝桃苷得率平均值为5.10mg/g,异槲皮苷得率平均值为5.06mg/g、槲皮素
的得率平均值为2.17mg/g。
考虑到实际操作的可行性，修正得出金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的最佳提取工艺为：
超声功率340W，提取时间60min，乙醇浓度60％、料液比0.1:15g/mL、提取温度50℃。在此
条件下对提取工艺条件进行3次平行实验，金丝桃苷平均得率为4.97mg/g，RSD＝0.20％，异
槲皮苷平均得率为4.84mg/g，RSD＝2.07％，槲皮素平均得率为2.02mg/g，RSD＝4.46％，模型预
测理论值分别为5.10mg/g、5.06mg/g、2.17mg/g，实际平均得率分别达到理论预测值的97.5％、
95.7％、93.1％，相对误差分别为2.5％、4.5％、6.9％。实验表明实验值和响应面预测值吻合较
好，说明该模型优化黄蜀葵花中三种黄酮的提取工艺是可靠的。
5结论
本发明基于单因素考察，以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素为研究对象，经过响应面分析
法对黄蜀葵花中黄酮类化合物提取工艺进行优化。由Design-Expert8.0.6软件进行
Box-Benhnken中心组合设计分析，得到黄蜀葵花中黄酮类化合物的最佳提取工艺参数为：超
声功率340W、提取时间60min、乙醇浓度60％、料液比0.1:15g/mL、提取温度50℃。三次
工艺验证得到黄蜀葵花中金丝桃苷平均得率为4.97mg/g，RSD＝0.20％；异槲皮苷平均得率为
4.84mg/g，RSD＝2.07％；以及槲皮素平均得率为2.02mg/g，RSD＝4.46％。
本发明的有益之处在于：本发明提供的一种黄蜀葵花中黄酮类化合物的提取工艺，是在
综合考虑了超声功率、乙醇浓度、提取时间、提取温度以及料液比等多个因素对黄蜀葵花中
黄酮类化合物提取的影响，并通过响应面模型对提取条件进行优化，得到的一种新的提取工
艺，能够简便、准确、高效的对黄蜀葵花中黄酮类化合物进行提取，为进一步分离纯化和开
发利用黄蜀葵花奠定了基础。与现有提取工艺相比较，本发明的提取工艺科学合理、操作简
便易实现，提取耗时时间短，提取条件温和、易控制，成本低廉，易于工业化大生产，提取
物黄酮类化合物得率高。本发明的提取工艺所采用溶剂安全无毒，避免对环境造成污染。
附图说明
图1是本发明的样品(A)和对照品(B)的HPLC色谱图；
图2是超声功率对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响图；
图3是提取时间对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响图；
图4是乙醇浓度对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响图；
图5是提取温度对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响图；
图6是料液比对金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素得率的影响图；
图7是提取时间和超声功率对金丝桃苷得率交互影响的响应面3D图；
图8是乙醇浓度和超声功率对金丝桃苷得率交互影响的响应面3D图；
图9是乙醇浓度和提取时间对金丝桃苷得率交互影响的响应面3D图；
图10是乙醇浓度和超声功率对异槲皮苷得率交互影响的响应面3D图；
图11是提取时间和超声功率对异槲皮苷得率交互影响的响应面3D图；
图12是乙醇浓度和提取时间对异槲皮苷得率交互影响的响应面3D图；
图13是提取时间和超声功率对槲皮素得率交互影响的响应面3D图；
图14是乙醇浓度和超声功率对槲皮素得率交互影响的响应面3D图；
图15是乙醇浓度和提取时间对槲皮素得率交互影响的响应面3D图；
图中附图标记的含义：图1:1-金丝桃苷对照品，2-异槲皮苷对照品，3-槲皮素对照品。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入40％乙醇，称重后，
在200W条件下超声提取60min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后进行离心，取上清液过滤
即得。
实施例2
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入70％乙醇，称重后，
在400W和30℃条件下超声提取40min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后进行离心，取上清
液过滤即得。
实施例3
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入50％乙醇，称重后，
在300W条件下超声提取50min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后进行离心，取上清液过0.45
μm微孔滤膜即得。其中，黄蜀葵花粉末与乙醇的料液比为：黄蜀葵花粉末的质量：乙醇的体
积＝0.1:15g/mL。
实施例4
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入90％乙醇，称重后，
在350W和40℃条件下超声提取55min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后以3500r/min的速
度离心20min，取上清液过0.45μm微孔滤膜即得。其中，黄蜀葵花粉末与乙醇的料液比为：
黄蜀葵花粉末的质量：乙醇的体积＝0.1:25g/mL。
实施例5
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入80％乙醇，称重后，
在250W和60℃条件下超声提取45min，冷却至室温后补重，随后以5000r/min的速度离心
10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜即得。其中，黄蜀葵花粉末与乙醇的料液比为：黄蜀葵
花粉末的质量：乙醇的体积＝0.1:5g/mL。
实施例6
黄蜀葵花中黄酮类化合物(金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素)的提取工艺，具体包括以下
步骤：将黄蜀葵花干燥后粉碎，过药典4号筛，取黄蜀葵花粉末，加入60％乙醇，称重后，
在340W和50℃条件下超声提取60min，冷却至室温后加入乙醇补重，随后以4000r/min的速
度离心15min，取上清液过0.45μm微孔滤膜即得。其中，黄蜀葵花粉末与乙醇的料液比为：
黄蜀葵花粉末的质量：乙醇的体积＝0.1:15g/mL。