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1、(10)申请公布号 CN 102285948 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102285948 A *CN102285948A* (21)申请号 201010201029.8 (22)申请日 2010.06.17 C07D 311/30(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 19/10(2006.01) A61P 11/06(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 北京盛诺基医药科技有限公司。
2、 地址 100085 北京市海淀区上地开拓路 5 号 中关村医药园 A205 室 (72)发明人 李靖 孟坤 (54) 发明名称 四羟基苯并吡喃酮类化合物及其用途 (57) 摘要 本发明涉及 “四羟基苯并吡喃酮类化合物及 其用途” 属于天然药物化合物领域。 通过实验证明 式 (I) 的化合物及其药学上可接受的盐， 在低浓 度条件下化合物 (I) 不改变 ER-66、 ER-46 和 ER-36 的表达。然而高浓度的化合物 (I) 能同 时抑制三者的表达 ； 同时化合物 (I) 能杀死表达 ER-66、 ER-46和ER-36的乳腺癌细胞MCF-7 细胞。化合物 (I) 可以作为雌激素受体 ER。
3、-36 的调节剂， 用于治疗与雌激素受体 ER-36 异常 表达相关的疾病， 如肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾 病或老年痴呆等病症。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 4 页 CN 102285958 A1/2 页 2 1. 式 (I) 的化合物及其药学上可接受的盐 ： 其中， R1和 R2彼此独立地选自氢、 卤素、 羟基、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基、 异戊烯基， R1和 R2 不同时为氢、 羟基 ； R3和 R4彼此独立地选自氢、 除溴以外的卤素、 C2-C4 烷基、 羧基、 异戊烯。
4、基、 3， 7- 二甲 基 -2， 6- 辛二烯基 ； R4不为氢 ； R3和 R4不同时为异戊烯基 ； 当 R2为羟基时， R4不为异戊烯基。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 所述式 (I) 化合物中的 R1和 R2彼此独立地选自氢、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基、 异戊烯基 ； R3和 R4彼此独立地选自氢、 C2-C4 烷基、 异戊烯基、 3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯基。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 所述式 (I) 化合物中的 R2为 C1-C4 烷氧基、 R3为氢、 R1 和 R4为氢、 异戊烯基或 3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯基。 4。
5、. 根据权利要求 3 所述的应用， 所述式 (I) 化合物中的 R1是氢， R2是甲氧基， R3是氢， R4是 3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯基 ； 即权利要求 1 所述的化合物是具有式 (II) 结构的化合 物 ： 5. 根据权利要求 3 所述的应用， 所述式 (I) 化合物中的 R1是异戊烯基， R2是甲氧基， R3 是氢， R4是异戊烯基 ； 即权利要求 1 所述的化合物是具有式 (III) 结构的化合物 ： 权 利 要 求 书 CN 102285948 A CN 102285958 A2/2 页 3 6.根据权力要求1-5任一所述的式(I)化合物及其药学上可接受的盐在制备与雌。
6、激素 受体 ER- 亚型和 ER- 亚型相关疾病的治疗药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 所述的 ER- 亚型为 ER-36， ER-46， ER-66。 8. 根据权利要求 6 所述的应用， 所述药物包括片剂、 口嚼剂、 胶囊剂、 悬浮液剂、 溶液 剂。 9. 根据权利要求 6 所述的应用， 所述疾病包括肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾病或老年 痴呆。 10. 根据权利要求 9 所述的应用， 所述肿瘤为乳腺癌、 卵巢癌、 子宫内膜癌、 胃癌、 结肠 癌、 前列腺癌、 白血病或肺癌。 权 利 要 求 书 CN 102285948 A CN 102285958 A1/7 页 。
7、4 四羟基苯并吡喃酮类化合物及其用途 技术领域 0001 本发明涉及新四羟基苯并吡喃酮类化合物的用途。本发明化合物适用于治疗肿 瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾病和老年痴呆。 本发明还涉及包含这些化合物的溶剂合物， 并且 涉及使用所述化合物， 单独使用或与其他药剂联合使用， 治疗肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾 病和老年痴呆。 背景技术 0002 雌激素是由体内内分泌系统产生的一种类固醇激素， 在生殖系统、 心血管系统、 中 枢神经系统、 呼吸系统、 免疫系统和骨骼系统中都发挥着重要的作用。近年来的研究表明， 雌激素通过细胞核途径和细胞膜途径两种信号转导通路发挥生物效应 ； 雌激素及其受体信。
8、 号转导系统广泛参与体内多个系统组织中细胞生长、 分化和凋亡过程。 已有大量研究证实， 雌激素受体广泛分布于生殖系统、 骨骼系统、 呼吸系统、 心血管系统和中枢神经系统 ； 这些 系统的疾病， 例如乳腺癌、 卵巢癌和子宫内膜癌， 骨质疏松、 哮喘、 动脉粥样硬化和老年痴呆 等， 其发生和发展甚至治疗预后都与雌激素及其不同受体亚型有着密切的关系 ； 雌激素受 体介导的信号转导途径很可能参与了这些疾病的形成和发展过程。 0003 目前研究证实雌激素受体分为 和 两种亚型 ； 其中 ER- 包括三个同源异构 体 ER-66、 ER-46 和 ER-36。异构体 ER-36 从位于 ER-66 基因的。
9、第一个内含子中 的启动子开始转录， 利用 ER-66 的部分外显子进行编码。因此， ER-36 缺失两个转录功 能区， 保留了 DNA 结合功能区和二聚化功能区 ； 更为重要的是 ER-36 的激素配体结合区 缺失了部分螺旋区， 从而完全改变了其与激素配体结合的专一性和亲和力。ER-36 主要 分布于细胞膜和细胞浆中， 少量存在于细胞核中。ER-36 可以通过雌激素的细胞膜信号 转导途径调节细胞生长和凋亡 (1.ZY， Wang ； XT， Zhang ； P， Shen ； BW， Loggie ； YC， Chang ； TF， Deuel.A variant of estrogen re。
10、ceptor-， hER-36 ： Transduction of estrogen-and antiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling.PNAS.2006， 103(24) ： 9063-9068.2.L， Lee ； J， Cao ； H， Deng ； P， Chen ； Z， Gatalica ； ZY， Wang.ER-36， a novel variant of ER-， is expressed in ER-positive and-negative human breast carcinomas.A。
11、nticancer Res.2008， 28(1B) ： 479-483.) 发明内容 0004 本发明的目的是通过对天然有效成分的研究， 提供新的可以调节 ER- 和 ER- 生物传导系统的化合物， 可以用于肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾病和老年痴呆的药物治疗。 0005 式 (I) 的化合物及其药学上可接受的盐 ： 0006 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A2/7 页 5 0007 其中， 0008 R1和 R2彼此独立地选自氢、 卤素、 羟基、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基、 异戊烯基， R1和 R2不同时为氢、 羟基 ； 0009 R。
12、3和 R4彼此独立地选自氢、 除溴以外的卤素、 C2-C4 烷基、 羧基、 异戊烯基、 3， 7- 二 甲基 -2， 6- 辛二烯基， R4不为氢， R3和 R4不同时为异戊烯基 ； 0010 当 R2为羟基时， R4不为异戊烯基。 0011 优选 ： 所述式 (I) 化合物中的 R1和 R2彼此独立地选自氢、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧 基、 异戊烯基 ； R3和 R4彼此独立地选自氢、 C2-C4 烷基、 异戊烯基、 3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯 基。 0012 更优选 ： 所述式 (I) 化合物中的 R2为 C1-C4 烷氧基、 R3为氢、 R1和 R4为氢、 异戊。
13、烯 基或 3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯基。 0013 特别优选 ： 所述式 (I) 化合物中的 R1是氢， R2是甲氧基， R3是氢， R4是 3， 7- 二甲 基 -2， 6- 辛二烯基 ； 即权利要求 1 所述的化合物是具有式 (II) 结构的化合物 ： 0014 0015 特别优选 ： 所述式 (I) 化合物中的 R1是异戊烯基， R2是甲氧基， R3是氢， R4是异戊 烯基 ； 即权利要求 1 所述的化合物是具有式 (III) 结构的化合物 ： 0016 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A3/7 页 6 0017 上述的式 (I) 化合物。
14、及其药学上可接受的盐在制备与雌激素受体 ER- 亚型和 ER- 亚型相关疾病的治疗药物中的应用。 0018 所述的 ER- 亚型为 ER-36， ER-46， ER-66。 0019 所述药物包括片剂、 口嚼剂、 胶囊剂、 悬浮液剂、 溶液剂。 0020 所述疾病包括肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 心脏疾病或老年痴呆。 0021 所述肿瘤为乳腺癌、 卵巢癌、 子宫内膜癌、 胃癌、 结肠癌、 前列腺癌、 白血病或肺癌。 0022 术语 “式 (I) 化合物” 包括如这里定义的式 (I) 化合物以及这化合物的所有实施 方案， 优选实施方案， 更优选实施方案以及特别优选实施方案， 包括有具体名称的或实施。
15、例 中公开的化合物， 这些化合物的每个都是通式定义的化合物的特别优选实施方案。 关于 “本 发明的化合物” 是指上述定义的式 (I) 中的任何化合物。 0023 本发明还涉及到本发明的化合物的盐、 多晶型物和水合物。 这里使用的术语 “药学 上可接受的盐” ， 除非另有所述， 包括可以在本发明的化合物中存在的盐。 0024 术语 “卤素” 或 “卤” ， 除非另外说明， 表示氟、 氯、 溴和碘基。 0025 用于本发明的动词 “治疗” ， 除非另有所述， 是指逆转、 减轻、 抑制疾病或病症的过 程， 或预防这样的疾病或病症。这里使用的名词 “治疗” 是指治疗的行为， 其中的治疗如上 面所定义。。
16、 0026 本发明还涉及一种药物组合物， 所述的药物组合物包括式 (I) 的化合物和一种药 学上可接受的载体。例如， 药物组合物可以以片剂、 胶囊、 丸剂、 粉末、 缓释剂、 溶液、 悬浮液 的形式口服给药 ； 药物组合物也可以以无菌液、 悬浮液或乳液的形式肠胃外注射给药 ； 药 物组合物也可以以软膏或霜膏的形式局部给药 ； 药物组合物也可以以栓剂的形式直肠给 药。药物组合物可以做成单位剂型， 其适于精确剂量的单一给药。药物组合物包括常规的 药物载体或赋形剂和作为活性成分的本发明的化合物。另外， 药物组合物可以包括其它医 学或药学制剂、 载体、 助剂等等。 0027 式 (II) 和 (III。
17、) 化 合 物 均 是 从 桑 科 构 树 属 植 物 构 树 (Broussonetia papyrifera(L.)Vent) 中提取分离得到。具体提取分离方法如下 ： 0028 构树皮 10kg， 切细， 用 75乙醇 8 倍量回流提取两次， 每次 2 小时。乙醇液合并， 浓缩， 回收至无乙醇味。浓缩液体用等体积乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯层， 浓缩回收 乙酸乙酯。浓缩液用甲醇溶解， 用硅胶拌样， 上正相硅胶柱。硅胶柱用石油醚 - 乙酸乙酯洗 脱 ( 石油醚乙酸乙酯 10 0-6 4)。收集各馏分， 经 TLC 和 HPLC 检测合并馏分。将 含所需分离成分的馏分浓缩， 上反相硅胶柱，。
18、 用甲醇 - 水 (5 5-10 0) 梯度洗脱。收集 各馏分， 用 TLC 和 HPLC 检测， 合并馏分。再将所需分离的成分上 Sephadex-LH-20 柱进一步 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A4/7 页 7 纯化。经以上步骤反复操作， 可分离得到各化合物。 0029 式 (II) 化合物的氢谱和碳谱解析如下 ： 0030 1H-NMR(400Hz， CD 3COCD3) ： 7.81(1H， s， H-2 )， 7.55(1H， d， J 8.4Hz， H-6 )， 6.98(1H， d， J 8.4Hz， H-5 )， 6.37(1H， s，。
19、 H-6)， 5.24(1H， m， H-2” )， 5.00(1H， m， H-7” )， 3.83(3H， s， OCH3)， 3.50(2H， d， J 5.6Hz， H-1” )， 2.04(2H， m， H-6” )， 1.95(2H， m， H-4” )， 1.78(3H， s， 5” -CH3)， 1.52(3H， s， 10” -CH3)， 1.47(3H， s， 9” -CH3). 0031 13C-NMR(CD 3COCD3) ： 179.0(C-4)， 161.8(C-7)， 159.6(C-5)， 156.2(C-2)， 154.4(C-9)， 148.7(C-4 )，。
20、 145.4(C-3 )， 138.3(C-3)， 135.1(C-3” )， 131.0(C-8” )， 124.4(C-7” )， 122.8(C-2” )， 122.3(C-1 )， 121.2(C-6 )， 115.8(C-2 )， 115.5(C-5 )， 106.6(C-8)， 104.9(C-10)， 98.3(C-6)， 59.5(OMe)， 39.6(C-4” )， 26.8(C-6” )， 25.0(C-10” )， 21.5(C-1” )， 17.0(C-9” )， 15.9(C-5” ). 0032 Positive ESI-MS ： 453M+H+， 475M+Na+。
21、 0033 Negative ESI-MS ： 451M-H- 0034 式 (III) 化合物的氢谱和碳谱解析如下 ： 0035 1H-NMR(400Hz， CD 3OD) ： 7.64(1H， d， J 2.0Hz， H-2 )， 7.45(1H， d， J 2.0Hz， H-6 )， 6.23(1H， s， H-6)， 5.35， 5.25(each 1H， m， H-2” ， 2” )， 3.77(OCH3)， 3.49， 3.36(each 2H， br d， H-1” and 1” )， 1.79， 1.73， 1.65(12H， s， 4” ， 5” ， 4” ， 5” -CH3。
22、). 0036 13C-NMR(CD 3OD) ： 179.1(C-4)， 162.1(C-7)， 159.4(C-5)， 157.0(C-2)， 154.3(C-9)， 146.8(C-4 )， 144.7(C-3 )， 138.1(C-3)， 132.6， 131.4(C-3” and 3” )， 128.5(C-1 )， 122.3， 122.2(C-2” and2” )， 121.1(C-6 )， 121.0(C-5 )， 113.0(C-2 )， 106.6(C-8)， 104.9(C-10)， 98.1(C-6)， 59.3(OMe)， 27.8， 21.3(C-1”and 1” 。
23、)， 24.8(C-4” and 4” )， 17.0， 16.7(C-5” and 5” ). 0037 Positive ESI-MS ： 475M+Na+ 0038 Negative ESI-MS ： 451M-H- 0039 构树有补肾清肝、 明目利尿、 健胃、 消炎、 凉血止血之功效。但单一的化合物， 如式 (I) 所示结构的化合物， 对 ER 的生物活性， 尤其对 ER 亚型 ER-36 受体的生物活性以及由 此产生的药效未见报导。 0040 实验表明 ： 正常乳腺上皮细胞表达少量 ER-36， 而在 700 例乳腺癌的检查中发 现大约 39.9乳腺癌样品高表达 ER-36， 且 。
24、40雌激素受体阴性的乳腺癌样品虽不表达 ER-66， 但可表达 ER-36。ER-36 也表达在 100 ER、 PR 和 HER-2 阳性乳腺癌样品中。 上述结果表明 ： ER-36 不仅参与 ER 阳性的乳腺癌的形成和发展， 而且可能参与过去被认 为是ER阴性的乳腺癌的形成和发展。 进一步研究表明， 表达ER-36的乳腺肿瘤预后极差， 并对抗雌激素药物， 如他莫昔芬的治疗反应不强。 0041 雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231不表达ER-66， 但高表达ER-36， 而且雌激素可促进 MDA-MB-231 细胞快速增殖。因此 ER-36 启动的促细胞生长信号转导 可导致细胞增。
25、殖。同时表达 ER-66 和 ER-36 的 ER 阳性 MCF7 细胞， 对雌激素刺激可产 生更强增殖反应， 并对抗雌激素药物如他莫昔酚有抵抗作用。 0042 此外， 研究表明， 心脏疾病、 骨质疏松和老年痴呆等疾病同 ER-36 的生物功能有 着直接的关系。因此以 ER-36 为靶点筛选药物将提供一种新的筛选抗肿瘤、 心脏疾病、 骨 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A5/7 页 8 质疏松和老年痴呆药物的途径。 0043 通过实验证明， 在低浓度条件下化合物 (I) 不改变 ER-66、 ER-46 和 ER-36 的表达。然而高浓度的化合物 (I) 能。
26、同时抑制三者的表达 ； 同时化合物 (I) 能杀死表达 ER-66、 ER-46 和 ER-36 的乳腺癌细胞 MCF-7 细胞。化合物 (I) 可以作为雌激素受体 ER-36 的调节剂， 用于治疗与雌激素受体 ER-36 异常表达相关的疾病， 如肿瘤、 骨质疏 松、 哮喘、 心脏疾病或老年痴呆等病症。 附图说明 0044 图 1ER-66、 ER-46 和 ER-36 在 6 个不同患者的乳腺癌组织中的表达。 0045 泳道 ： 1、 正常乳腺组织 ； 2、 浸润性导管癌组织 ； 3、 浸润性导管癌组织 ； 4、 浸润性导 管癌组织 ； 5、 浸润性小叶癌 ； 6、 浸润性小叶癌 ； 7、 。
27、非浸润性导管癌。 0046 图 1 中的 Actin 为对比例。 0047 图 2 在乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中， 抗 ER-36 特异性抗体显色情况。ER-36， 阳性结果 0048 显示为绿色 ； DAPI， 阳性结果显示为蓝色 ； 联合显色者标注为 “Merge” 。 0049 图 3 化合物 (II) 对 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF-7 的生长抑制作用。 0050 图 4 化合物 (III) 对 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF-7 的生长抑制作用。 0051 图 3、 4 中的 Vehicle 为空白对照。 0052 图 5 化合物 (II) 对 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF。
28、-7 中 ER-66 和 ER-36 受体表达的 下调作用。 0053 图 6 化合物 (III) 对 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF-7 中 ER-66 和 ER-36 受体表达 的下调作用。 0054 图 7 化合物 (III) 对荷瘤裸鼠的相对肿瘤体积变化的影响。 0055 图 8 化合物 (III) 对荷瘤裸鼠的相对肿瘤增值率变化的影响。 0056 具体实施方法 0057 下面的实施例说明制备本发明的化合物的方法。应该理解， 本发明并不受下面提 供的具体内容的限制。 0058 实施例 1 0059 0060 2-(3， 4- 二羟基苯基 )-8-(3， 7- 二甲基 -2， 6- 辛二烯。
29、基 )-5， 7- 二羟基 -3- 甲氧 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A6/7 页 9 基 -4H- 苯并吡喃 -4- 酮 ： 采用前述化合物的具体提取分离方法自构树中提取分离得到。 0061 实施例 2 0062 0063 2-(3， 4-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯基)-3， 5， 7-三羟基-8-(3-甲基-2-丁 烯基)-4H-苯并吡喃-4-酮 ： 采用前述化合物的具体提取分离方法自构树中提取分离得到。 0064 实验例式 (I) 化合物的生物实验 0065 在生物实验中， 化合物 (II) 和化合物 (III) 分别用 GS-14 和。
30、 GS-17 表示。 0066 实验 1 ： 0067 实验方法 ： 含有不同患者乳腺癌组织蛋白的 pre-blot 滤膜片购至 ProSci 公 司 (Poway， CA)。 使 用 ER-36 特 异 性 的 抗 ER-36 抗 体 ER-36 特 异 抗 体 ( 针 对 ER-36C- 端的 20 个氨基酸 ) 是由 Alpha Diagnostic International(San Antonio， TX) 制备， 可参阅 Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 2006， 103(24) ： 9063-9068， HRP 标记的二抗 以及增强化学发光试剂 (ECL， Ame。
31、rSham Pharmacia Biotech) 检测滤膜片并显色。该膜 洗脱后， 使用能同时检测 ER 三种亚型 (ER-66， ER-46 和 ER-36) 的抗 ER- 抗体 H222(Novocastra Laboratories Ltd， UK) 检测膜片。 0068 实验结果 ： 如图 1 所示， ER-66， ER-46 和 ER-36 在浸润性导管癌 ( 泳道 2)、 浸润性小叶癌 ( 泳道 5) 和非浸润性导管癌 ( 泳道 7) 中表达。此外， ER-36 在浸润性导 管癌 ( 泳道 4) 和浸润性小叶癌 ( 泳道 6) 中表达。泳道 2 和泳道 3 是来源于两位不同患者 的。
32、浸润性导管癌。泳道 5 和泳道 6 是来源于两位不同患者的浸润性小叶癌。该结果显示 ER-36可以在ER-66和ER-46表达阴性的乳腺癌中表达， 而在正常乳腺组织中无表达 ( 泳道 1)。 0069 实验 2 ： 0070 实验方法 ： MDA-MB-231 细胞系是公认的缺乏 ER-66 和 ER-46 表达的乳腺癌 细胞系 Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors ： an update.Breast Cancer Research and Treatment 2004， 83 ： 249-289M。
33、DA-MB-231细胞(购 至 ATCC 细胞库 ) 传代置于 8 孔 BIOCOAT 玻片 (BD Science Discovery Labware)， 培养于 含 10胎牛血清的 DMEM 培养基， 并在 37， 5 CO2的条件下培养 12 小时。使用无菌 PBS 冲洗两遍， 4多聚甲醛 (PBS 配制， PH7.4) 在室温固定 30 分钟 ； 然后用 PBS 洗， 和 0.5 (v/v)Triton X-100 破膜 10 分钟 ； PBS 洗， 3血清在室温封闭 1 小时 ； 抗 ER-36 特异性 抗体在室温孵育 1 小时， 含 0.5 Triton X-100 的 PBS(P。
34、BST) 洗三次 ； 异硫氰酸荧光素 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A7/7 页 10 (FITC) 标记的荧光二抗孵育 1 小时 ； PBST 洗三次， PBS 洗一次 ； 防淬灭封片剂 (Molecular Probes， Eugene， OR) 封片。于 Nikon E600 显微镜下观察， 使用 MRC-1024 激光共聚焦显微 镜 (Bio-Rad) 拍摄图像。 0071 实验结果 ： 如图 2 所示， 在 ER-66 和 ER-46 受体表达阴性的的乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中， 抗 ER-36 特异性抗体显色阳性 ( 标注为 ER-3。
35、6， 阳性结果显示为绿 色 )， 并可以被用作免疫的多肽所阻断。细胞核使用 4， 6- 联咪 -2- 苯基 -1H- 吲哚染色 ( 标 注为 DAPI， 阳性结果显示为蓝色 )。联合显色者标注为 “Merge” 。( 图中的 +Peptide 表明 在实验中加免疫源多肽来阻断抗体 ) 0072 实验 3 ： 0073 MCF-7 细胞系是高表达 ER-66、 ER-46 和 ER-36 的乳腺癌细胞系 (Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors ： an update.Marc Lacroix， Guy 。
36、Leclercq， Breast Cancer Research and Treatment 2004， 83 ； 249-289。)MCF-7 细胞 ( 购至 ATCC 细胞库 ) 培养于含 10胎牛血清的 DMEM/F12 培养基 (Invitrogen)， 在 37和 5 CO2 的条件中培养 12 小时。GS-14 和 GS-17 通过 DMSO 溶解稀释。MCF-7 细胞按 1104 的密度接种于 100mm 直径的培养皿中， 由浓度为 0M 至 20M 的化合物 GS-14 和 GS-17 通 过处理两周后， 使用血球计数器在显微镜下对存活的细胞进行计数。按照浓度进行分组， 5 个。
37、培养皿为一组。图示的是 MCF-7 细胞经浓度分别为 0M， 1M， 5M， 10M， 15M 和 20M 的化合物处理两周后， 细胞数目变化的表现。细胞计数的单位为 1104个。 0074 实验结果 ： 如图 3- 图 4 所示， MCF-7 细胞经 GS-14 和 GS-17 处理后活细胞数量均 明显下降。 0075 实验 4 ： 0076 MCF-7细胞经浓度为0M至25M的GS-14和GS-17处理后， 免疫印迹法(Western blot) 检测 ER-66， 和 ER-36 表达的情况。 0077 实验结果 ： 如图 5- 图 6 所示， 随着化合物 GS-14 和 GS-17 浓。
38、度的上升， ER-66 和 ER-36 受体表达量均明显下降。 0078 实验 5 ： 0079 采用 BALB/c-nu 裸鼠右前肢腋下移植人乳腺癌 BCAP-37 瘤块制作荷瘤动物模型。 实验动物分为对照组， 他莫昔芬(16.5mg/kg)组， GS-17(33mg/kg)组 ； 各组连续灌胃给药18 天。给药期间每 3-4 天测量裸鼠腋下移植肿瘤的体积变化， 并计算各组动物肿瘤相对体积 和相对肿瘤增殖率。 0080 实验结果 ： 如图7-图8所示， 给药期间GS-17能明显减少肿瘤体积的增加， 其效应 与对照药物他莫昔芬接近 ； GS-17 还能明显降低肿瘤的相对增值率， 其效应的变化趋。
39、势与 对照药物他莫昔芬一致。动物体内实验观察结果提示化合物 GS-17 对裸鼠负荷的人乳腺癌 瘤块的增长具有抑制作用。 说 明 书 CN 102285948 A CN 102285958 A1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102285948 A CN 102285958 A2/4 页 12 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102285948 A CN 102285958 A3/4 页 13 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102285948 A CN 102285958 A4/4 页 14 图 8 说 明 书 附 图 CN 102285948 A 。