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1、(10)申请公布号 CN 102161645 A (43)申请公布日 2011.08.24 CN 102161645 A *CN102161645A* (21)申请号 201110039200.4 (22)申请日 2009.08.20 200910056685.0 2009.08.20 C07D 263/42(2006.01) C07K 14/765(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 曹成喜 周培 谢鹏 席涛 樊柳荫 张薇 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王锡麟 王桂忠 (54) 发。
2、明名称 基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法 (57) 摘要 一种化工技术领域的基于青霉烯酸硫醇汞盐 的全抗原制备方法， 通过将青霉烯酸硫醇汞盐作 为汞离子半抗原， 并进一步以 EDCHCl 作为水溶 性催化剂， 将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗 原经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后， 形成汞离 子全抗原。本发明制备得到的半抗原及全抗原的 合成步骤非常简单， 易于表征 ； 该全抗原可以应 用于汞离子单克隆抗体的制备。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102161646。
3、 A1/1 页 2 1. 一种青霉烯酸硫醇汞盐的应用， 所述青霉烯酸硫醇汞盐的结构如下 ： 其中， R1为 C6H5-CH2-， R2为 Na、 K 或 H， 其特征在于， 将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半 抗原。 2. 一种根据权利要求 1 所述青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法， 其特征在于， 以 EDCHCl 作为水溶性催化剂， 将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原经过与蛋白质牛血清 白蛋白偶联后， 形成汞离子全抗原。 3. 根据权利要求 2 所述的青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法， 其特征是， 所述方法 具体步骤为 ： 1)将纯化后的50mg半抗原转移至烧杯中， 滴加10ml4NaHCO3，。
4、 加入200mg EDC HCl， 搅拌 10min， 使得半抗原上的羧基充分活化， 加入 50mg BSA 或 OVA， 搅拌 12 个小时 ； 2) 反应完毕后， 离心两次， 过滤一次去除未反应的固体杂质， 上清液转移至截留分子量 为 10000 的透析袋中透析 2 天， 更换 4 次透析液， 每次透析时间大于 5 小时， 透析液为 10mM pH7.4PBS ； 3) 透析完毕后将全抗原溶液定容， 取出一定量的溶液进行紫外和 ICP-AES 检测， 其余 的全抗原溶液分装并冻成干粉， -20保存。 权 利 要 求 书 CN 102161645 A CN 102161646 A1/5 页 。
5、3 基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种化工技术领域的汞盐及其全抗原的制备方法， 具体是一种基于青 霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法。 背景技术 0002 重金属离子是有毒的， 持久的环境污染物。在自然环境中， 特别是水体和土壤中， 残留的重金属离子可以直接或者间接的进入人体， 与人体内的蛋白质或功能性酶发生不可 逆转的强烈作用， 对人类的健康构成严重的威胁。 因此， 对环境中的重金属的检测和监控是 非常必要。现在比较常用的重金属检测方法是仪器分析法， 例如原子吸收光谱法 (atomic absorption spectroscopy， AAS)， 电感耦合等。
6、离子体发射光谱法 (ICP-AES)， 电感耦合等离 子体质谱(ICP-MS)， 离子色谱法等。 仪器分析方法比较准确， 但是也存在耗时长， 成本高， 前 处理复杂， 处理通量小等缺点。 0003 重金属离子的免疫学检测方法是一种基于具有亲和性和特异性的 “抗原 - 抗体” 反应的分析方法。 因分子量小且免疫原性弱， 重金属离子不能直接诱导动物产生抗体， 因此 需要将重金属离子以一定方式与蛋白质连接形成重金属离子全抗原， 利用制备出的全抗原 诱导动物产生针对重金属离子特异的抗体。免疫学方法具有快速， 准确， 处理通量大， 前处 理简单， 成本低等特点， 国内外已有用免疫学方法检测重金属离子的报。
7、道。重金属离子的 免疫学方法的核心在于制备出高度特异的单抗隆抗体， 而能否制备出特异的抗体的关键又 在于重金属离子半抗原的制备。目前， 国内外研究机构在制备重金属离子半抗原时使用的 螯合剂主要是乙二胺四乙酸 (EDTA)， 二乙烯三胺五乙酸 (DPTA)， 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (EGTA)， 或类似的衍生物作为偶联剂， 以一定比例与金属离子形成笼形结构的络合物。 0004 现有技术中免疫学方法制备抗体的缺点主要有 ： 1、 免疫系统针对应答的是包含 金属键在内的笼形结构， 因此金属在抗原 - 抗体反应中不再起关键作用， 起决定作用的 是复合物的形状而不是与抗原结合点直接的物理接触。Wyli。
8、e， D.E. 等在 Proc.Natl. Acad.Sci.USA ( 美国科学院院刊 )1992 年第 89 期 4104-4108 页发表了题为 Monoclonal antibodies specific for mercuric ions ( 针对汞离子特异的单克隆抗体 ) 一文， 文中 提及针对金属络合物或者含配位金属的蛋白特异的抗体将会与表位具有与诱导抗体产生 的抗原相同构型的金属络合物结合， 也就是说， 这种抗体与其他金属有交叉反应性， 所以这 种特异性针对特定金属的特异性不强 ； 2、 络合物不稳定， 汞离子在动物体内会被功能性酶 剥夺， 降低了免疫原性， 造成动物中毒甚至死。
9、亡。因此， 国内外还没有通过使用螯合剂制备 出汞离子单克隆抗体的例子。 有研究者使用谷胱甘肽作为偶联剂(D.E.Wylie， L.D.Carson， R.Carlson， F.W.Wagner， S.M.Schuster， Anal.Biochem.194(1991)381)， 连接汞离子和蛋白 质， 这种方法改进了螯合剂作为偶联剂的缺点， 汞离子与谷胱甘肽的硫醇基通过共价键连 接， 在动物体内不会解离， 但是也有缺点 ： 谷胱甘肽作为偶联剂， 免疫原性过低， 产生的抗体 效价很低。 0005 因此， 本发明要解决的技术问题是 ： 克服现有技术中制备的汞离子抗原特异性不 说 明 书 CN 10。
10、2161645 A CN 102161646 A2/5 页 4 强， 抗原安全性差以及免疫原性过低的缺点， 提供一种新的抗原及其制备方法。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗 原制备方法。 本发明的制备方法反应体系简单， 制备过程简单 ； 制备得到青霉烯酸硫醇汞盐 性质稳定， 可作为汞离子的半抗原。 0007 本发明是通过以下技术方案实现的， 0008 本发明涉及一种青霉烯酸硫醇汞盐， 具体结构如下 ： 0009 0010 其中， R1为 C6H5-CH2-， R2为 Na、 K 或 H。 0011 本发明还涉及所述青霉烯酸硫醇汞盐的制。
11、备方法， 包括如下步骤 ： 0012 步骤一， 在咪唑的存在下， 将青霉素 G 钠盐或青霉素 G 钾盐与氯化汞反应 ； 0013 步骤二， 纯化反应产物， 制备得到青霉烯酸硫醇汞盐。 0014 步骤一中， 所述反应的 pH 为 6.0 9.0。 0015 步骤一中， 所述反应在 60下进行。 0016 步骤一中， 所述反应的时间为 2 小时。 0017 步骤二中， 所述纯化为 ： 10000rpm 离心纯化反应产物。 0018 步骤二中， 所述纯化为 ： 10000rpm 离心 5min 纯化反应产物。 0019 本发明涉及一种青霉烯酸硫醇汞盐的应用， 将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗 原。 。
12、0020 本发明涉及基于上述青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法， 以 EDC HCl 作为水溶 性催化剂， 将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后， 形 成一种新的汞离子全抗原， 具体步骤为 ： 通过将纯化后的 50mg 半抗原转移至烧杯中， 滴加 10ml4 NaHCO3， 加入 200mg EDCHCl， 搅拌 10min， 使得半抗原上的羧基充分活化。加入 50mg BSA( 或 OVA)， 搅拌 12 个小时 ； 反应完毕后， 离心两次， 过滤一次去除未反应的固体杂 质， 上清液转移至透析袋 ( 截留分子量为 10000) 中透析 2 天， 更换 4 次透析液，。
13、 每次透析时 间大于 5 小时， 透析液为 10mM pH 7.4PBS。透析完毕后， 将全抗原溶液定容， 取出一定量的 溶液进行紫外和 ICP-AES 检测， 其余的全抗原溶液分装并冻成干粉， -20保存。 0021 与现有技术相比， 本发明具有如下优点 ： 本发明的制备方法反应体系简单， 制备过 程简单 ； 制备得到青霉烯酸硫醇汞盐性质稳定， 可作为汞离子的半抗原 ； 汞离子在半抗原 中通过共价键的形式连接， 在体内不会解离， 不会引起动物的中毒 ； 半抗原分子中有相邻的 汞离子、 恶唑酮环和苯环三个抗原决定簇， 免疫原性强 ； 金属原子完全暴露在外， 在免疫反 应中可以与抗体进行直接的物。
14、理接触。 说 明 书 CN 102161645 A CN 102161646 A3/5 页 5 附图说明 0022 图 1 为青霉烯酸硫醇汞盐与青霉素 G 钠盐或钾盐的紫外可见吸收光谱。 0023 图 2 为青霉烯酸硫醇汞盐的红外图谱。 0024 图 3 为青霉素 G 钠盐或钾盐的红外图谱。 0025 图 4 为抗原青霉烯酸硫醇汞盐 - 牛血清白蛋白和蛋白质 BSA 的紫外可见吸收光 谱。 具体实施方式 0026 以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。 本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施， 给出了详细的实施方式和过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体。
15、条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的 条件。 0027 实施例 0028 步骤一， 青霉烯酸硫醇汞盐的制备 0029 取青霉素G钠盐或钾盐50mg溶解在10ml超纯水中， 加入1g咪唑， 搅拌使其完全溶 解， 逐滴加入 1M HCl 调 pH 至 6.8 ； 加入与青霉素 G 钠盐或钾盐等物质的量的 HgCl2， 即 7ml 的 8mg/ml 的 HgCl2溶液， 60水浴中加热 2 个小时， 取出， 室温中冷却， 反应产生有苦杏仁 气味的黄色粉末状沉淀 ； 0030 步骤二， 青霉烯酸硫醇汞盐的纯化 0031 青霉烯酸硫醇汞盐分子因为含有金属， 所以有无机物的性质， 。
16、其在偏酸性的溶液 中不溶， 因此可以通过酸式沉淀法来分离纯化青霉烯酸硫醇汞盐。在步骤一所得的溶液中 加入过量的 1MHCl， 边滴边轻轻震荡， 溶液中产生大量黄色絮状沉淀， 将溶液分装在 4ml EP 管中， 10000r/m离心5分钟， 弃去上清液 ； 在EP管中加入超纯水洗涤沉淀， EP管置于振荡器 上振荡 2min， 然后置于离心机中 10000r/m 离心 5 分钟， 重复洗涤 2 次。洗涤离心并弃去上 清液后， 得到黄色沉淀 ； 0032 步骤三， 检测产物 0033 青霉烯酸硫醇汞盐是青霉素在咪唑和汞离子作用下定量生成的降解产物， 产物因 含有一个恶唑酮环， 所以在320nm345。
17、nm之间有特征紫外吸收， 该方法为定量检测青霉素 V 钾片中青霉素含量的方法 ( 中国药典， 第二部分， 1995， 334 页 )。因此可以通过紫外扫描 判定青霉烯酸硫醇汞盐是否合成成功。对步骤二得到的产物进行检验， 从图 1 中可以看出， 在 325nm 处有特征吸收， 证明青霉烯酸硫醇汞盐合成成功。由于青霉烯酸硫醇汞盐在水和 有机溶剂中溶解度很低， 因此可用红外光谱法来检测所得产物的结构和纯度。 0034 图 2 是青霉烯酸硫醇汞盐的红外图谱， 由图 2 可知 ： 0035 青霉烯酸硫醇汞盐 ： 3400cm-1OH(-COOH)， 2500cm-1S-H(S-Hg)， 1677cm-1。
18、C O(-C C-C O)， 1400cm -1as-C(CH 3)2 和 1368cm -1s-C(CH 3)2， 1010cm -1 CN ； 0036 图 3 是青霉素 G 钠盐或钾盐的红外图谱， 由图 3 可知 ： 0037 青霉素 G 钠盐或钾盐 ： 3377cm-1OH(-COOH)， 1774cm-1C O， - 内酰胺环的 特 征 峰 ， 1680cm-1C O，酰 胺 ， 1400cm-1as-C(CH3)2 和 1354cm-1s-C(CH3)2， 1018cm-1CN。 1774cm-1(-内酰胺的特征峰)消失了， 表明-内酰胺环在合成反应中被 说 明 书 CN 1021。
19、61645 A CN 102161646 A4/5 页 6 完全降解了。半抗原中的 2500cm-1处的峰表明 MMPA 中存在 -SH( 或 -S-Hg+)。其它非特异 的峰在青霉素和MMPA中都存在， 比如750cm-1， 700cm-1(单取代苯环)， 2927cm-1(-CH2)， 1400， 1368cm-1-C(CH3)2。明显地， 图 2 和图 3 红外光谱的比较可以充分证明合成的半抗原的结 构中存在恶唑酮环， 取代了青霉素中的 - 内酰胺环。 0038 青霉烯酸硫醇汞盐含有一个羧基(-COOH)， 可以和蛋白质的氨基(-NH2)偶联， 生成 全抗原。青霉烯酸硫醇汞盐被创新性的用。
20、作汞离子半抗原， 经过与蛋白质牛血清白蛋白偶 联后， 形成一种新的汞离子全抗原。 为了提高反应的选择性和效率， 在反应溶液中需加入一 定量的水溶性催化剂 EDC HCl， EDC 可以活化羧基， 与羧基形成不稳定的中间物。反应过程 如下 ： 将纯化后的 50mg 半抗原转移至烧杯中， 滴加 10ml4 NaHCO3， 加入 200mg EDCHCl， 搅拌 10min， 使得半抗原上的羧基充分活化。加入 50mg BSA( 或 OVA)， 搅拌 12 个小时 ； 反应 完毕后， 离心两次， 过滤一次去除未反应的固体杂质， 上清液转移至透析袋 ( 截留分子量为 10000)中透析2天， 更换4次。
21、透析液， 每次透析时间大于5小时， 透析液为10mM pH 7.4PBS。 透析完毕后， 将全抗原溶液定容， 取出一定量的溶液进行紫外和 ICP-AES 检测， 其余的全抗 原溶液分装并冻成干粉， -20保存。 0039 青霉烯酸衍生物都含有恶唑酮环， 因此在320345nm处有特征吸收峰， 而其它的 青霉素衍生物或降解产物都没有这种特征吸收。所以， 紫外可见分光光度法可以用来判断 青霉烯酸硫醇汞盐 - 蛋白质的合成效果。从图 4 中可以清楚地看出， 抗原青霉烯酸硫醇汞 盐 - 牛血清白蛋白在 325nm 附近有特殊吸收峰， 而蛋白质 BSA 在 325nm 附近都没有吸收峰， 从而证明半抗原。
22、青霉烯酸硫醇汞盐与 BSA 偶联成功。为了准确的检测半抗原 MMPA 与 BSA 之间的偶联比， 我们使用 ICP-AES 检测抗原溶液中的重金属离子的浓度， 从而确定半抗原 与蛋白质质检的偶联比为 25 1。 0040 该抗原被应用于多克隆抗体的制备， 我们对抗体做了系统地 ELISA 分析， 我们选 取 2 只强壮的雄性新西兰白兔， 每只重量约为 3kg。我们采取的注射方式是皮下 6 8 点 注射， 第一次基础免疫的抗原剂量为 500g/ 只， 每次加强免疫的抗原剂量为 300g/ 只， 具体操作如下 ： 第一次免疫为基础免疫， 全抗原用 PBS(10mM， pH 7.4) 稀释成 1mg。
23、/ml， 与 等量的弗氏完全佐剂充分乳化， 皮下多点注射 ； 14 天后， 进行第一次加强免疫， 等量的全抗 原溶液(1mg/ml)与弗氏不完全佐剂充分乳化， 皮下多点注射 ； 共加强免疫4次， 每次的间隔 时间为 14 天。从第二次加强免疫起， 每次免疫后 7 天从兔子的耳缘静脉取血， 取出的全血 37水浴 2h， 离心取上清， 分装， -20保存。免疫注射前， 每只兔子取血作为阴性对照。 0041 实验结果表明 ： 0042 (1) 合成的全抗原对动物是安全的， 没有发现动物的中毒现象 ； 0043 (2) 免疫全抗原可以刺激动物的免疫系统产生高亲和性的抗体。抗原具有很高的 免疫原性， 经。
24、过 4 次加强免疫后， 动物血清中抗体的效价超过 83000 ； 0044 (3) 虽然动物的免疫系统产生针对 Hg(II) 特异的抗体是非常困难的， 我们仍然 试图找寻能够证明高亲和性抗体存在的证据。实验原理 ： 比较免疫血清与两种包被抗原 OVA-GSH-Hg和OVA-GSH的亲和性的差异。 OVA-GSH-Hg和OVA-GSH分别用50mM的碳酸盐缓冲 液稀释为 20g/ml， 100L/ 孔， 37水浴中温育 3 小时， 而后用 1 OVA 300L/ 孔封闭 ； 每孔滴加100L免疫血清(稀释300倍)， 37水浴中温育1小时， 然后， 用PBST(含0.05 TWEEN 20的10。
25、mMpH 7.4PBS)洗涤3次 ； 洗涤完毕后， 每孔滴入100L羊抗兔IgG-HRP， 37 说 明 书 CN 102161645 A CN 102161646 A5/5 页 7 水浴 1 个小时， PBST 洗涤 5 次 ； 最后 100L/ 孔 TMB 显色液 (10mL 50mM pH 5.6 柠檬酸 缓冲溶液 +400L0.6 TMB+10L30 H2O2， 其中 0.6的 TMB 溶液的溶剂为 DMSO)， 显色 15min 后加入 50L/ 孔 2MH2SO4终止反应。使用酶标仪测量 450nm 下的吸光度值。 0045 实验结果表明抗体与包被抗原 OVA-GSH-HgCl 反应所得吸光度值 (OD 值 ) 大于 OVA-GSH， 表明血清中含有针对汞离子特异的抗体。半抗原及全抗原的合成步骤非常简单， 易于表征。该全抗原可以应用于汞离子单克隆抗体的制备， 有很大的市场潜力。 说 明 书 CN 102161645 A CN 102161646 A1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102161645 A 。