发明内容
本发明的目的在于，提供了一类由下述通式I所表示的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐，该类化合物通过与Bcl-2家族中抗细胞凋亡成员Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1结合、引起细胞凋亡。
本发明的另一目的是提供上述喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物的制备方法。
本发明的还一目的是提供一种治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关疾病的药物组合物。
本发明的还一目的是公开上述喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关的疾病的药物方面的用途。
本发明的还一目的是公开上述的药物组合物在制备治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关的疾病的药物方面的用途。
作为本发明的一个方面，本发明提供了一类由下述通式I表示的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3和R4各自独立地表示氢、卤素、烷基、烷氧基、C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基、C3-C7环烃基、苄基、芳香环基、脂肪环基或5-7元杂环基；
所述的卤素为氟、氯、溴或碘；
所述的芳香基是苯基、取代苯基、萘基或联苯基；其中所述的取代苯基含1～4个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4酰基；
所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫或氮的杂原子，可被苯基并合，并可含有一个或多个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和芳香基的取代基。
优选地，上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐的结构中，R1、R2各自独立地为氢、烷基或烷氧基。
优选地，上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐的结构中，R3为芳香环基或脂肪环基。
优选地，上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐的结构中，R4为酸。
优选地，上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐中，所述的药学上可接受的盐为与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或与有机碱形成的甲胺盐、乙胺盐、或乙醇胺盐；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后的盐酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、苦味酸盐、甲磺酸盐、或乙磺酸盐。
根据本发明的另一方面，本发明提供了上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物的制备方法，该方法包括：
(1)在有机溶剂中，在碱的作用下，结构式a的化合物和各种结构式b的化合物发生反应，得到结构式c的化合物；
(2)在有机溶剂中，在碱的作用下，结构式c的化合物与硫脲反应，得到结构式d的化合物；
(3)在有机溶剂中，在酸的作用下，结构式d的化合物和氯乙酸反应，得到结构式e的化合物；
(4)在有机溶剂中，在碱的作用下，结构式e的化合物与结构式f的化合物反应，分离后得到本发明的结构式I表示的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物；
其中，步骤(1)、(2)、(3)、(4)中所述的有机溶剂均为四氢呋喃、乙醚、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二氧六环、乙醇、甲醇或乙酸乙酯；
步骤(1)、(2)、(4)中所述的碱均为有机碱或无机碱，其中有机碱为吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶或二异丙基乙胺，无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾；
步骤(3)中所述的酸为有机酸或无机酸，其中有机酸为冰醋酸、磺酸、亚磺酸，无机酸为硝酸、硫酸、盐酸、磷酸。
其中，步骤(1)、(2)、(3)、(4)中，结构式a的化合物的R1和R2的定义与权利要求1中的定义相同，结构式b的化合物的R3的定义与权利要求1中的定义相同，结构式c的化合物、结构式d的化合物和结构式e的化合物中的R1、R2、和R3的定义均与权利要求1中的定义相同，结构式f的化合物的R4的定义与权利要求1中的定义相同。
本发明提供的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。
本发明的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物药学上可接受的盐，可采用药学上常规的成盐方法来制备。
根据本发明的还一方面，本发明提供了一种治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关疾病的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
优选地，上述的治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关疾病的药物组合物中，所述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐占该药物组合物总重量的65％～99.5％。
优选地，上述的治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关疾病的药物组合物中，所述的药学上可接受的载体为气味剂、香味剂、赋形剂和稀释液中的一种或多种。
本发明所提供的化合物和药用组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。该药用组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等。
本发明所提供的药物组合物其理想的比例是，式I化合物作为活性成分占总重量比65％～99.5％，其余部分为占总重量比0.5-35％，或更好为1-20％，或最好为1-10％的药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
根据本发明的还一方面，本发明提供了上述的喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮类衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关的疾病的药物方面的用途。
根据本发明的还一方面，本发明提供了上述的药物组合物在制备治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关的疾病的药物方面的用途。
具体实施方式
实验方法
1、化合物数据库虚拟筛选
首先从Bcl-xL与ABT-737复合物晶体结构(PDB code：2YXJ)中提取蛋白结构参数，氨基酸残基采用CVFF力场参数。不含水分子的Bcl-xL蛋白结构在Discover(version 2.98)(Accelrys Software Inc)中用500步急剧下降法和10,000步共轭梯度法优化，直至最大能量偏差小于在结构优化过程中，主链原子被约束。采用AutoMS和sphgen生成的球状模型来描述位于Bcl-xL残基Glu96、Phe97、Arg100、Tyr101、Ala104、Phe105、Leu108、Val126、Glu129、Leu130、Asn136、Arg139、Val141、Ala142、Phe146、Phe191和Tyr195附近的疏水凹槽。采用Grid程序计算疏水口袋附近节点处的疏水和静电性质。将SPECS(http://www.specs.net)数据库里的化合物依次放到Bcl-xL的疏水口袋里，然后使用并行Dock 4.0程序(http://dock.combio.ucsf.edu)对化合物的构象和方向进行单锚搜索和扭转最小化优化。最后用100步急剧下降法优化化合物构象并用Dock 4.0里的能量打分方程评价。对虚拟筛选得到的最好2,000个化合物在Bcl-xL疏水凹槽中进一步观察其空间碰撞、氢键和疏水作用，最终购买了77个化合物并用表面等离子共振技术测定他们与Bcl-xL的结合能力。
2、通过分子对接和分子动力学模拟方法研究化合物和Bcl-xL的相互作用
用Sybyl 7.3(Tripos)的描述分子模块创建化合物1、12h和13化学结构，原子赋予Gasteiger-Huckel电荷。对结构进行100步鲍威尔最小化和10,000步共轭梯度优化直至能量偏差小于活性化合物的C-7碳原子具有手性，还有一个碳碳双键可能有顺反异构(表1)。每个化合物都生成4个同分异构体并用Sybyl的FlexX SingleReceptor(RDF)模块对接到疏水凹槽里。用ABT-737和Bcl-xL的复合物晶体结构(PDB code：2YXJ)作为分子对接的参考。除了配体最大姿态设为500外，所有的参数都用默认参数。用Insight II 2000对化合物1、12h、13和Bcl-xL的复合物结构进一步优化。在capping模式关闭状态下，对蛋白结构加氢。Bcl-xL残基以及化合物原子采用CVFF力场。用1,000步急剧下降优化和6,000步共轭梯度优化复合物结构，直至能量偏差小于在此过程中，固定Bcl-xL主链原子，并保持化合物一些原子和Bcl-xL某些残基的α碳原子间距离在然后用Discover(version 2.98)对复合物结构进行100次分子动力学模拟退火优化。先是1,000步起始于300K的动力学模拟，然后是2,000步分别起始于600K和300K的模拟。用1,000步急剧下降优化和10,000步共轭梯度进一步优化得到的复合物结构，直至能量偏差小于在这个阶段，释放所有的参数，原子可以自由运动。基于化合物的构效关系(表1)，从100个优化结构中挑出最合适的结合模型。
3、表面等离子共振实验
使用基于表面离子共振技术的Biacore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)测定化合物和Bcl-xL及其突变体的亲和力。将0.2MN-ethyl-N’-dimethylaminopropyl carbodiimide和50mMN-hydroxysuccinimide等体积混合，然后将其流过CM5芯片(BR-1000-14，Biacore AB)。蛋白先用10mM醋酸钠缓冲液(pH 4.7)稀释至1mg/mL，然后偶联到芯片表面。注射1M ethanolamine-HCl将过量的羧基封闭。将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM氯化钠，3mM EDTA，0.005％(v/v)P20，pH 7.4)连续流过芯片一夜以平衡系统。用DMSO溶解化合物配成10mM的储存液。筛选化合物时，用HBS-EP缓冲液将化合物稀释到10μM，并以30μL/min的流速流过芯片。测定亲和力时，将一系列浓度的化合物以30μL/min的流速流过芯片60秒，然后解离120秒。最后采用BIAevaluation软件(version 3.2)中的1∶1Langmuir结合模型拟合动力学参数。
4、荧光极化实验
首先合成Bid BH3多肽(序列：EDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在其N末端标记异硫氰酸荧光素(FITC)。200nM Bcl-xL、Bcl-2或者Mcl-1与各种浓度的化合物在25℃孵育1小时，然后再和等体积的200nM异硫氰酸荧光素标记的BH3多肽混合孵育10分钟。最后用POLARstar OPTIMA酶标仪(BMG LABTECH，德国)测定其荧光极化值。激发波长和发射波长分别是485nm和520nm。
5、细胞毒性实验
采用噻唑蓝比色实验来分析化合物对人源肿瘤细胞的细胞毒性。A2780、OVCAR-3、HepG2、BEL-7404、PC-3和K562细胞来自美国细胞、菌种库(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。所有的细胞培养基都购自Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。噻唑蓝(M5655)和DMSO(D5879)购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。A2780、OVCAR-3、PC-3和K562细胞用RPMI 1640培养基培养，HepG2和BEL-7404细胞用DMEM培养基培养。Thermo细胞培养箱(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的CO2浓度设为5％，温度设为37℃。所有的细胞培养基都含有10％胎牛血清和1％抗生素。向96孔板的每个孔中种入4×103个细胞并用化合物处理48小时。然后向每个孔里加入10μL用PBS配成的5mg/mL的噻唑蓝。在37℃孵育2-4小时后，小心吸去上清并加入100μL DMSO溶解甲臜。最后用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，USA)读取570nm处的吸光度并根据吸光度计算存活细胞的百分比和化合物的EC50。
6、定点突变和蛋白纯化
使用PCR仪扩增人源Bcl-xL的编码区(不包含C末端的22个氨基酸残基)，并将其插入pGEX4T-1载体的EcoR I/Xho I位点。突变体E96A、Y101A和Y195A的正向引物是：5′-gaggcaggcgacgcgtttgaactgcgg-3′，′-gagtttgaactgcgggcccggcgggcattcag-3′和5′-ggatacttttgtggaactcgctgggaacaatgcagcagcc-3′。反向引物和正向引物互补。根据QuikChange定点突变试剂盒(200519，Stratagene Ltd.，美国加利福尼亚州卡)的说明书进行点突变实验。所有的质粒都通过测序鉴定。转化了质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基里37℃培养。当细菌的A600达到0.6-0.8时，加入1mM isopropyl-3-D-thiogalactoside(IPTG)并在37℃继续培养3小时。4,000rpm离心15分钟收集细菌。用PBS重悬菌体，然后在冰上超声30分钟。15,000g离心30分钟除去细胞碎片。谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂用PBS平衡好后，将离心后的上清流过树脂。先用25个柱体积的PBS洗去杂蛋白，再用5个柱体积的洗脱液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris，pH 8.0)洗脱目标蛋白。洗脱的蛋白在PBS里透析三次后冻存于-80℃冰箱。
带GST标签的鼠源Mcl-1(不包含N末端的151个氨基酸残基和C末端的23个氨基酸残基)的表达和纯化方法和Bcl-xL相同。带His标签的人源Bcl-2蛋白(不包含C末端的22个氨基酸残基)的表达和纯化方法和文献报道的一致。
7、线粒体膜电位实验
向1×106个K562细胞中加入一系列浓度的化合物。37℃培养24小时后，收集细胞，并用PBS清洗一次。用500μL JC-1溶液(5μg/mL)重悬细胞并在37℃孵育15分钟。先收集细胞，然后用PBS洗两次，最后用500μL PBS重悬。用Becton Dickinson FACStar Plus流式细胞仪检测细胞的荧光。激发波长和发射波长分别是488nm和530nm。每个样品分析1×104个细胞并重复三次。
8、Caspases剪切实验
向1×106个K562细胞中加入一系列浓度的化合物。37℃培养48小时后，1,000g离心10分钟收集细胞。用PBS洗一次，然后用细胞裂解液重悬。15,000g离心10分钟。用BCA试剂盒(P0012，碧云天，上海)测定每个样品的总蛋白浓度。配制10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶，每个泳道上样量为50μg总蛋白。电泳之后，将蛋白转印到PVDF膜上。用TBST缓冲液(10mM Tris，150mM氯化钠，0.05％吐温20，pH 7.5)配制5％的脱脂奶粉。先用脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1小时，然后再和1000倍稀释的caspase-3单克隆抗体(MAB707，R&D Systems，Inc.)和caspase-9单克隆抗体(MAB8301，R&D Systems，Inc.)4℃孵育过夜。过量的抗体用TBST洗3次。免疫复合体用辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠的抗体和SuperSignal West Pico Kit(34079，Pierce，美国伊利诺斯州)检测。
9、活性氧检测
向1×106K562个细胞中加入一系列浓度的化合物。37℃培养48小时后，1,000g离心10分钟收集细胞。用PBS洗一次，然后用10μMDCFH-DA重悬。37℃孵育30分钟之后，收集细胞，PBS洗3次。用Becton Dickinson FACStar Plus流式细胞仪检测细胞荧光。用488nm波长激发，检测530nm和585nm波长的荧光强度。每个样品分析1×104个细胞并重复三次。
实施例
下面的实施例用于具体地说明本发明化合物的制备，以及其在制备治疗或预防癌症及与细胞凋亡相关的疾病方面的生物活性作为HIV蛋白酶抑制剂的生物学活性，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
2-[3-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1)的制备
常温下，将20ml 4％氢氧化钾乙醇溶液缓慢的加入到1-萘满酮(3.5g，0.02mol)和2-甲氧基苯甲醛(2.0g，0.02mol)的混合物中。在室温下搅拌下，反应4小时，然后终止反应。将反应液抽滤，得到的滤饼用乙醇洗涤、重结晶，得到白色固体2-(2-甲氧基苄烯)-1-萘满酮5.03g(产率：95.2％)。
将2-(2-甲氧基苄烯)-1-萘满酮(2.64g，0.01mol)、硫脲(0.76g，0.01mol)以及1.0g氢氧化钾加入50ml无水乙醇，得到的混合物在强烈的搅拌下回流，反应5小时。将得到的反应液溶剂蒸干一半，并置于冰箱中过夜。将得到的混合物抽滤，得到的滤饼用乙醇洗涤、重结晶，最后得到黄色固体4-(2-甲氧基苯基)-3，4，5，6-四氢并[H]喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮2.79g(产率：86.5％)。
将4-(2-甲氧基苯基)-3，4，5，6-四氢并[H]喹唑啉-2(1H)吡啶硫酮(1.61g，0.005mol)、氯乙酸(0.47g，0.005mol)、无水乙酸钠(0.41g，0.005mol)加入乙酸(10ml)和乙酸酐(2ml)的混合溶液中。回流2小时后，终止反应。反应液冷却后加入到50ml的冰水中，有固体析出。经过抽滤以及洗涤，最后得到红色固体7-(2-甲氧基苯基)-7，10-二氢-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]-9-(6H)喹唑啉酮1.29g(产率：71.2％)。
将上述喹唑啉酮(0.362g，1mmol)、2-(3-醛基苯氧基)乙酸(0.180g，1mmol)以及催化量的哌啶加入无水乙醇中。回流3小时后，终止反应，有大量固体析出，抽滤。将得到的滤饼用乙醇洗涤后，用硅胶柱分离(CH2Cl2∶CH3OH＝20∶1，体积比)。最后得到2-[3-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸为黄色固体0.367g(产率：70.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.78(d，J＝7.8Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.42-7.36(m，1H)，7.29-6.90(m，10H)，6.01(s，1H)，4.51(s，2H)，3.79(s，3H)，2.77-2.69(m，1H)，2.60-2.52(m，1H)，2.32-2.22(m，1H)，1.93-1.83(m，1H)；ESI-MS m/z 523[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C30H24N2O5S(M+)524.1406，found 524.1411.
实施例2
2-[3-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸乙酯(6)的制备
用2-(3-醛基苯氧基)乙酸乙酯代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸乙酯(产率：61.2％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.95(d，1H，J＝7.8Hz)，7.93(s，1H)，7.41-7.08(m，7H)，7.01-6.89(m，4H)，6.10(s，1H)，4.67(s，2H)，4.35-4.28(q，2H)，3.86(s，3H)，2.82-2.77(m，1H)，2.72-2.64(m，1H)，2.32-2.25(m，1H)，2.15-2.06(m，1H)，1.34(t，3H)；ESI-MS m/z 552(M)；HRMS(EI)m/z calcd for C32H28N2O5S(M+)552.1719，found552.1723.
实施例3
2-[2-〔7-(3-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(7)的制备
用2-(2-醛基苯氧基)乙酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[2-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：54.8％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.81(d，1H，J＝7.5Hz)，7.60-7.55(t，3H)，7.31-6.93(m，9H)，6.06(s，1H)，4.80(s，2H)，3.76(s，3H)，2.79-2.72(m，1H)，2.63-2.52(m，1H)，2.36-2.23(m，1H)，2.19-1.85(m，1H)；ESI-MS m/z 523[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C30H24N2O5S(M+)524.1406，found 524.1413.
实施例4
2-[4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸乙酯(8)的制备
用2-(4-醛基苯氧基)乙酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：73.3％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.92(s，1H)，7.78(d，1H，J＝7.5Hz)，7.44-7.41(m，1H)，7.38-6.85(m，10H)，56.06(s，1H)，4.26(s，2H)，3.76(s，3H)，2.78-2.73(m，1H)，2.71-2.54(m，1H)，2.35-2.18(m，1H)，1.96-1.76(m，1H)；ESI-MS m/z 523[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC30H24N2O5S(M+)524.1406，found 524.1411.
实施例5
3-[4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯基)丙烯酸(9)的制备
用3-(4-醛基苯基)丙烯酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯基)丙烯酸(产率：89.8％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.91-7.67(m，3H)，7.62-7.57(m，4H)，7.29-6.90(m，7H)，6.72-6.59(m，1H)，6.04(s，1H)，6.03(s，1H)，3.70(s，3H)，2.78-2.69(m，1H)，2.60-2.47(m，1H)，2.33-2.22(m，1H)，1.97-1.82(m，1H)；ESI-MS m/z 519[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C31H24N2O4S[M+]520.1457，found 520.1449.
实施例6
4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯甲酸(10)的制备
用4-醛基苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物4-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯甲酸(产率：92.5％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.05-8.03(d，2H，J＝8.4Hz)，7.79-7.65(m，4H)，7.30-6.90(m，7H)，6.04(s，1H)，3.72(s，3H)，2.78-2.69(m，1H)，2.61-2.47(m，1H)，2.34-2.23(m，1H)，1.97-1.823(m，1H)；ESI-MS m/z 493[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C29H22N2O4S[M+]494.1300，found 494.1308.
实施例7
3′-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕联苯-3-羧酸(11)的制备
用3′-醛基联苯基-3-羧酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3′-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕联苯-3-羧酸(产率：90.1％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.26(s，1H)，7.97-7.53(m，10H)，7.49-6.93(m，6H)，6.07(s，1H)，3.76(s，3H)，2.89-2.51(m，2H)，2.36-2.25(m，1H)，2.08-1.96(m，1H)；ESI-MS m/z 569[M-H]-；HRMS(EI)m/zcalcd for C29H22N2O4S[M+]570.1613，found 570.1624.
实施例8
3-[5-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12)的制备
用3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：88.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.34(s，1H)，7.93-7.82(m，3H)，7.54-7.48(m，2H)，7.30-7.01(m，7H)，7.04-7.10(m，2H)，6.04(s，1H)，3.72(s，3H)，3.02-2.98(m，1H)，2.80-2.71(m，1H)，2.35-2.24(m，1H)，1.94-1.87(m，1H)；ESI-MS m/z 559[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C33H24N2O5S[M+]560.1406，found 560.1413.
实施例9
3-[4-〔7-(4-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]甲基苯甲酸(13)的制备
用4-甲氧基苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，用3-(3-甲氧基-4-醛基苯氧基)甲基苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(4-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]甲基苯甲酸(产率：87.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.05(s，1H)，7.93(d，1H，J＝7.5Hz)，7.92(d，1H，J＝7.8Hz)，7.59-7.18(m，11H)，7.06-6.93(m，3H)，6.06(s，1H)，5.27(s，2H)，5.11(s，2H)，3.74(s，3H)，2.73-2.67(m，2H)，2.53-2.24(m，1H)，1.96-1.84(m，1H)；ESI-MS m/z 599[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC36H28N2O5S[M+]600.1719，found 600.1724.
实施例10
2-[3-〔7-苯基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1a)的制备
用苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔7-苯基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：80.2％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.66(s，1H)，7.47-7.36(m，4H)，7.23-6.97(m，9H)，5.78(s，1H)，4.75(s，2H)，2.71-2.66(m，1H)，2.54-2.49(m，1H)，2.26-2.20(m，1H)，1.87-1.81(m，1H)；ESI-MS m/z 493[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C29H22N2O4S[M+]494.1300，found 494.1310.
实施例11
2-[3-〔7-(3-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1b)的制备
用3-氟苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔7-(3-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：70.8％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.80(m，1H)，7.61(s，1H)，7.39-6.97(m，11H)，5.85(s，1H)，4.54(s，2H)，2.64-2.48(m，2H)，2.34-2.29(m，1H)，1.96-1.87(m，1H)；ESI-MS m/z 511[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC29H21FN2O4S[M+]512.1206，found 512.1216.
实施例12
2-[3-〔7-(1-萘基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1c)的制备
用1-萘甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔7-(1-萘基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：69.8％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.98-7.84(m，5H)，7.62(s，1H)，7.55-7.41(m，4H)，7.30-7.01(m，6H)，6.02(s，1H)，4.78(s，2H)，2.83-2.72(m，1H)，2.65-2.55(m，1H)，2.47-2.32(m，1H)，1.99-1.87(m，1H)；ESI-MS m/z 543[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C33H24N2O6S[M+]544.1457，found544.1463.
实施例13
2-[3-〔7-(2-呋喃基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1d)的制备
用2-呋喃甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔7-(2-呋喃基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：73.8％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.81(d，1H，J＝7.2Hz)，7.63(s，1H)，7.47-7.36(m，3H)，7.30-6.99(d，7H)，6.07(s，1H)，4.50(s，2H)，2.86-2.75(m，1H)，2.67-2.57(m，1H)，2.37-2.23(m，1H)，1.97-1.88(m，1H)；ESI-MSm/z 483[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C27H20N2O5S[M+]484.1093，found 484.1101.
实施例14
2-[3-〔3-甲氧基-(7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1e)的制备
用6-甲氧基-1-萘满酮代替1-萘满酮，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔3-甲氧基-(7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：75.0％)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.70(d，1H，J＝8.7Hz)，7.59(s，1H)，7.48-7.42(m，1H)，7.30-7.28(m，3H)，7.25-6.91(m，4H)，6.81-6.78(m，1H)，6.71(d，1H，J＝8.7Hz)，6.02(s，1H)，4.86(s，2H)，3.75(s，3H)，3.70(s，3H)，2.73-2.70(m，1H)，2.59-2.54(m，1H)，2.29-2.23(m，1H)，1.93-1.85(m，1H)；ESI-MS m/z 553[M-H]-；HRMS(ESI)m/z calcd for C31H26N2O6S[M+]554.1512，found 554.1518.
实施例15
2-[3-〔4-苄氧基-(7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1f)的制备
用5-苄氧基-1-萘满酮代替1-萘满酮，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔4-苄氧基-(7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：62.3％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.59(s，1H)，7.49-7.35(m，7H)，7.29-7.27(m，2H)，7.24-7.21(m，2H，)，7.19-7.17(m，1H)，7.14-6.93(m，4H)，6.05(s，1H)，5.11(s，2H)，4.66(s，2H)，3.76(s，3H)，2.69-2.51(m，2H)，2.33-2.27(m，1H)，1.92-1.86(m，1H)；ESI-MS m/z 629[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C37H30N2O6S[M+]630.1825，found 630.1831.
实施例16
2-[3-〔4-联苯酰基-7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(1g)的制备
用5-(联苯-2-酰基)-1-萘满酮代替1-萘满酮，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔4-联苯酰基-7-(2-甲氧基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：64.1％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.96(d，1H，J＝6.6Hz)，7.72-7.67(m，2H)，7.60-7.53(m，2H)，7.49-7.04(m，11H)，7.11(s，1H)，6.97-6.94(d，1H，J＝4.5Hz)，6.92-6.82(m，1H)，6.80(d，1H，J＝6.6Hz)，6.01(s，1H)，4.75(s，2H)，3.74(s，3H)，2.50-2.19(m，3H)，1.83-1.77(m，1H)；ESI-MSm/z 719[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C43H32N2O7S[M+]720.1930，found 720.1938.
实施例17
2-[3-〔9-(3-氟苄烯)-5-(3-氟苯基)-3-羰基-3，5，6，7，8，9-六氢-2H-噻唑并[2，3-b]并喹唑啉-2-烯基)甲基〕苯氧基]乙酸(1h)的制备
用环己酮代替1-萘满酮、3-氟苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔9-(3-氟苄烯)-5-(3-氟苯基)-3-羰基-3，5，6，7，8，9-六氢-2H-噻唑并[2，3-b]并喹唑啉-2-烯基)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：66.9％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.81(d，1H，J＝7.8Hz)，7.65(s，1H)，7.48-7.42(m，1H)，7.40-7.29(m，5H)，7.28-7.05(m，4H)，7.04-7.02(m，4H)，5.86(s，1H)，4.75(s，2H)，2.76-2.61(m，2H)，2.39-2.31(m，1H)，1.92-1.90(m，1H)；ESI-MS m/z 569[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC32H24F2N2O4S[M+]570.1425，found 570.1433.
实施例18
2-[3-〔5-(2-甲氧基苯基)-3-羰基-7-苯基-3，5-二氢-2H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-2-烯)甲基〕苯氧基]乙酸(1i)的制备
用苯乙酮代替1-萘满酮，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-[3-〔5-(2-甲氧基苯基)-3-羰基-7-苯基-3，5-二氢-2H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-2-烯)甲基〕苯氧基]乙酸(产率：63.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.77(d，1H，J＝7.5Hz)，7.64(s，1H)，7.43-7.30(m，5H)，7.18-6.96(m，7H)，6.16(d，1H，J＝4.5Hz)，6.04(d，1H，J＝4.2Hz)，4.44(s，2H)，3.83(s，3H)；ESI-MS m/z 497[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C28H22N2O5S[M+]498.1249，found 498.1240.
实施例19
3-[5-〔9-羰基-7-苯基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12a)的制备
用苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔9-羰基-7-苯基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：64.5％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.38(s，1H)，7.93-7.83(m，3H)，7.54-7.49(m，2H)，7.40-7.12(m，10H)，5.84(s，1H)，2.84-2.73(m，1H)，2.67-2.57(m，1H)，2.39-2.28(m，1H)，1.98-1.86(m，1H)；ESI-MS m/z 529[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C32H22N2O4S[M+]530.1300，found530.1308.
实施例20
3-[5-〔7-(2-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12b)的制备
用2-氟苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(2-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：66.7％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.38(s，1H)，7.93-7.84(m，3H)，7.54-7.42(m，4H)，7.28-7.13(m，7H)，5.89(s，1H)，2.79-2.61(m，2H)，2.35-2.30(m，1H)，1.95-1.91(m，1H)；ESI-MS m/z 547[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C32H21FN2O4S[M+]548.1206，found 548.1213.
实施例21
3-[5-〔7-(3-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12c)的制备
用3-氟苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(3-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：70.7％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.38(s，1H)，7.93-7.84(m，3H)，7.64-7.29(m，3H)，7.28-7.13(m，8H)，5.90(s，1H)，2.82-2.73(m，1H)，2.69-2.59(m，1H)，2.40-2.30(m，1H)，1.99-1.88(m，1H)；ESI-MS m/z 547[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C32H21FN2O4S[M+]548.1206，found548.1200.
实施例22
3-[5-〔7-(4-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12d)的制备
用4-氟苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(4-氟苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：66.7％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.45(s，1H)，8.08-7.87(m，6H)，7.69-7.48(m，5H)，7.37-7.12(m，3H)，6.02(s，1H)，2.84-2.73(m，1H)，2.65-2.55(m，1H)，2.44-2.35(m，1H)，1.99-1.90(m，1H)；ESI-MS m/z 547[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C32H21FN2O4S[M+]548.1206，found548.1215.
实施例23
3-[5-〔7-(3-硝基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12e)的制备
用3-硝基苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(3-硝基苯基)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：68.3％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.39(s，1H)，8.28(s，1H)，8.20-8.18(m，1H)，7.93-7.85(m，4H，)，7.71-7.68(m，1H)，7.54-7.48(m，2H)，7.30-7.13(m，5H)，6.10(s，1H)，2.84-2.59(m，2H)，2.49-2.31(m，1H)，1.97-1.85(m，1H)；ESI-MS m/z 574[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC32H21N3O6S[M+]575.1151，found 575.1163.
实施例24
3-[5-〔7-(萘基-1-)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12f)的制备
用1-萘甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(萘基-1-)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：77.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.39(s，1H)，7.97-7.86(m，7H)，7.53-7.46(m，5H)，7.30-7.11(m，5H)，6.02(s，1H)，2.28-2.73(m，1H)，2.65-2.57(m，1H)，2.65-2.57(m，1H)，1.97-1.94(m，1H)；ESI-MS m/z 579[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C36H24N2O4S[M+]580.1457，found580.1449.
实施例25
3-[5-〔7-(呋喃-2-)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(12g)的制备
用2-呋喃甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[5-〔7-(呋喃-2-)-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)甲基〕2-呋喃基]苯甲酸(产率：67.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.40(s，1H)，7.80-7.86(m，3H)，7.55-7.46(d，2H)，7.32-6.94(m，6H)，6.94-6.91(m，2H)，5.76(s，1H)，2.84-2.62(m，2H)，2.37-2.26(m，2H)，；ESI-MS m/z 519[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C30H20N2O5S[M+]520.1093，found 520.1101.
实施例26
3-[4-〔7-(3-甲氧基苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]-4-甲基-苯甲酸(12h)的制备
用3-甲氧基苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]-4-甲基-苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(3-甲氧基苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]-4-甲基-苯甲酸(产率：66.3％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.46(s，1H)，7.90-7.80(m，2H)，7.52(s，1H)，7.44-7.42(m，1H)，7.31-7.03(m，8H)，6.98-6.93(m，1H)，6.07(s，1H)，3.77(s，3H)，2.80-2.74(m，1H)，2.63-2.51(m，4H)，2.37-2.26(m，1H)，1.97-1.86(m，1H)；ESI-MS m/z 573[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd forC34H26N2O5S[M+]574.1562，found 574.1570.
实施例27
3-[4-〔7-(4-甲氧基苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]-4-甲基-苯甲酸(12i)的制备
用4-甲氧基苯甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]-4-甲基-苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(4-甲氧基苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]-4-甲基-苯甲酸(产率：45.7％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.46(s，1H)，7.91-7.83(m，2H)，7.58(s，1H)，7.48-7.45(m，1H)，7.34-7.10(m，7H)，6.94-6.89(m，2H)，5.80(s，1H)，3.74(s，3H)，2.79-2.52(m，5H)，2.35-2.29(m，1H)，2.20-1.92(m，1H)；ESI-MS m/z 573[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C34H26N2O6S[M+]574.1562，found 574.1574.
实施例28
3-[4-〔7-(3-氟苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]苯甲酸(12j)的制备
用6-甲氧基-1-萘满酮代替1-萘满酮、3-氟甲醛代替2-甲氧基苯甲醛、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(3-氟苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]苯甲酸(产率：55.2％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.37(s，1H)，7.92-7.84(m，2H)，7.76(m，1H，J＝7.8Hz)，7.55-7.38(m，3H)，7.26-7.13(m，5H)，6.83-6.74(m，2H)，5.86(s，1H)，3.74(s，3H)，2.77-2..70(m，1H)，2.64-2.58(m，1H)，2.35-2.29(m，1H)，1.91-1.89(m，1H)；ESI-MS m/z 577[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C34H26N2O5S[M+]578.1312，found 578.1321.
实施例29
2-[3-〔9-(3-氟苄烯)-5-(3-氟苯基)-3-羰基-3，5，6，7，8，9-六氢-2H-噻唑并[2，3-b]并喹唑啉-2-烯基)-甲基〕呋喃基]苯甲酸(12k)的制备
用环己酮代替1-萘满酮、3-[2-(5-醛基呋喃基)]苯甲酸代替2-(3-醛基苯氧基)乙酸，按实施例1所述的操作，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物3-[4-〔7-(4-甲氧基苯基)-3-甲氧基-9-羰基-5H-苯并[h]噻唑并[2，3-b]并喹唑-10(6H，7H，9H)-甲基〕呋喃基]-4-甲基-苯甲酸(产率：45.7％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.46(s，1H)，7.91-7.83(m，2H)，7.58(s，1H)，7.48-7.45(m，1H)，7.34-7.10(m，7H)，6.94-6.89(m，2H)，5.80(s，1H)，3.74(s，3H)，2.79-2.52(m，5H)，2.35-2.29(m，1H)，2.20-1.92(m，1H)；ESI-MS m/z 573[M-H]-；HRMS(EI)m/z calcd for C34H26N2O6S[M+]574.1562，found 574.1574.
实验结果
1、先导化合物发现
我们采用数据库虚拟筛选方法，以Bcl-xL表面疏水凹槽为靶点，根据氢键、疏水性和分子形状匹配性，从SPECS化合物数据库中挑选出77个可能与Bcl-xL有结合活性的化合物。采用表面等离子体共振技术我们检测Bcl-xL与这77个化合物的结合活性。Bcl-xL蛋白首先固定在CM5传感芯片，如果化合物与Bcl-xL结合，它们之间的相互作用可通过芯片共振信号变化检测出来。从77个化合物中，我们发现化合物DCBL55能浓度依赖性地引起共振信号变化(图1)。以1∶1结合模式对响应曲线进行数据拟合，发现化合物DCBL55与Bcl-xL结合的平衡解离常数KD为9.50x10-6M。
因DCBL55是针对Bcl-xL表面疏水凹槽而设计的，它应该与BH3多肽竞争性地结合到Bcl-xL蛋白上。为验证这一点，我们以FITC-标记的Bid BH3多肽为底物，将Bid BH3多肽与Bcl-xL(或Bcl-2、Mcl-1)蛋白混合，体系给出一个较高的荧光极化值。加入化合物，如果化合物结合Bcl-xL，BH3多肽被竞争下来，体系的荧光极化值将变低。从图2、表2可以看出，DCBL55及其衍生物与Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1结合。DCBL55对Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1的抑制活性分别为3.4μM、3.1μM、6.4μM。
2、构效关系
根据荧光极化实验结果(表1)，衍生物中有22个化合物(1，1a-1d，1i，7-13，12a-12i)对Bcl-xL的抑制活性在1.9-72.0μM之间。这些化合物除1h、1i、12k具有相同的化学骨架。实验结果表明，化合物1、12c和12e是活性最好的化合物，这表明2-(3-苯氧基)-乙酸和3-(5-呋喃基)-苯甲酸是R4位置的最佳片段。将R4位置上的羧基进行酯化后活性消失(对比化合物1和6)。若将羧基从间位改变成邻位(化合物7)或者对位(化合物8)时，IC50分别下降到12.1 and 36.0μM。当用肉桂酸(化合物9)以及苯甲酸(化合物10)分别代替(3-苯氧基)-乙酸时，活性又分别恢复到12.7 and 12.6μM，这个结果表明减R4链的长度或者增强链的刚性都是对与蛋白结合有益的。当用联苯-3-羧酸(化合物11)或者3-[(2-甲氧基苯氧基)甲基]苯甲酸(化合物13)代替(3-苯氧基)-乙酸时，IC50分别下降到26.7 and 17.4μM。当在R1或者R2位置引入一些取代基，例如：甲氧基(1e，12j)、苄基(1f)或者联苯酰基(1g)，活性都消失。当将A环或者B环用其他的环取代时，活性则大大的下降甚至消失(1h，1i and 12k)。R3位置的取代也影响着活性。实验结果表明，在R3位置上，取代的苯基相对无取代的苯基活性较好(1a and 1b，12a and 12b-e)。R3位置上的取代基，间位明显好于邻位或者对位(12c＞12b，12d)。同时实验结果也表明，用较大的取代基例如萘环(1d，12g)或者较小的取代基例如呋喃(1c，12f)取代苯环时，则活性大大的下降。
3、化合物与Bcl-xL的结合作用
我们采用分子对接和分子动力学方法建立了化合物与Bcl-xL蛋白的复合物模型(图3)。根据模型，Bcl-xL表面凹槽处的P2、P4、P5疏水位点对化合物结合有重要作用。P2位点由Tyr101、Ala104、Leu108、Val126、Asn135、Ala142和Ser145氨基酸残基构成；P4位点由Glu96、Phe97、Gly138、Tyr195构成；P5位点由Leu130、Arg132和Arg139构成。为验证模型是否正确，我们将Glu96、Tyr101和Tyr195分别突变为Ala。SPR实验结果表明，化合物DCBL55与Bcl-xL(E96A)、Bcl-xL(Y195A)突变体的结合能力比Bcl-xL低了4倍和95倍(表3)。化合物12h与Bcl-xL(E96A)、Bcl-xL(Y195A)的结合能力比Bcl-xL分别降低了3倍和10倍。化合物13对Bcl-xL(E96A)、Bcl-xL(Y101A)、Bcl-xL(Y195A)的结合能力比Bcl-xL分别降低了25倍、25倍和17倍。显然，Bcl-xL位点突变和SPR实验结果表明Glu96、Tyr101和Tyr195对化合物的结合非常重要。
进一步，我们将化合物的构效关系和化合物与Bcl-xL的结合模型关联起来进行分析。根据复合物模型，化合物的R4取代基团以氢键作用和疏水作用结合与Bcl-xL的P4位点处。从合成的29个化合物中，化合物1、12c和12e是活性最好的化合物，表明化合物的羧基对Bcl-xL结合非常有利。复合物模型显示，DCBL55的R4取代基团上的羧基与Bcl-xL的Glu96、Tyr195形成氢键，这与表3中的蛋白质位点突变数据相一致。相同原因，当R4基团上的羧基被乙酰化后(化合物6)，化合物不与Bcl-xL结合。将羧基由间位改为邻位(化合物7)或对位(化合物8)，化合物的活性IC50分别降低为12.1μM、36.0μM。
另外，复合物模型还显示化合物的A环以疏水作用结合于P2位点，在A环与Bcl-xL氨基酸残基之间存在很少剩余空间，这是为何在R1、R2位置做修饰都显著减低化合物活性的原因(化合物1e-1g)。化合物1h、1i、12k将A环、B环替换为其他化学基团，同样也显著地降低或消除与Bcl-xL的结合活性。
根据复合物模型，活性化合物的R3取代基团与Bcl-xL蛋白P5位点处的Leu130、Arg139、Arg132侧链有疏水作用。化合物构效关系(表1)表明，R3基团为取代苯环的化合物比没有取代苯环的化合物活性要好(比较化合物12a与12b-12e)。间位取代的化合物比邻位和对位化合物的活性要好(比较化合物12c与12b、12d)。如果将苯环替换为小体积的呋喃环(化合物1d、12g)，化合物活性也分别下降为40.4μM、35.9μM。如果将苯环替换为大体积的萘环(化合物1b、12c)，化合物活性降低为19.7μM、13.4μM(与化合物1b、12c比较)，表明大体积疏水基团与蛋白残基之间的空间位阻影响了化合物与蛋白之间的疏水作用。
4、化合物对癌细胞的杀伤作用
Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1在多种癌细胞中高表达，使癌细胞在化疗中产生抗药性。因化合物1及其类似物结合Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1并能抑制其与促凋亡蛋白的相互作用，所以有必要研究这些化合物对癌细胞的杀伤作用。值得注意的是，化合物1及其类似物对卵巢癌细胞(A2780、OVCAR-3)、肝癌细胞(HepG2、BEL-7404)、前列腺癌细胞(PC-3)和白血病癌细胞(K562)表现出了强效的杀伤作用。
虽然体外实验已证明化合物1及其类似物与抑凋亡Bcl-2家族蛋白质相结合，但是这些化合物的细胞毒性与它们体外亲合力似乎没有关系(表1、4)。例如，化合物6、1e、1f、1g、1h、12j和12k(这些化合物几乎不能与Bcl-xL相结合)，但能导致多种细胞的死亡。一种可能的解释是这些化合物不是Bcl-2家族选择性抑制剂，所以也就不能特异性地通过Bcl-xL通路来发挥功能。正如M.Vogler et al.所报道的一样，仅仅只有ABT-737能通过Bax/Bak来发挥的功能，然而其他的Bcl-2或Bcl-xL抑制剂(如棉子酚、变棉子酚、EM20-25和白屈菜子碱)除了Bcl-2家族以外还有其他靶标。利用电子显微镜学，用化合物ABT-737处理的慢性淋巴白血病细胞会导致线粒体的膨胀和线粒体外膜的间断。然而，棉子酚和变棉子酚处理的线粒体外膜是完整的。在我们的实验中，用化合物1处理的细胞K562显示出了细胞凋亡的形态特征，如染色质的凝聚(图4，黑箭头)。与此同时，线粒体外膜保持完整且线粒体内膜收缩(白箭头)。线粒体外膜的变化意味着化合物1导致细胞死亡不仅仅是通过Bcl-2家族蛋白，也可能通过Bcl-2家族蛋白以外的靶标。
5、化合物对线粒体膜电位影响
线粒体膜电位降低是细胞凋亡的一种早期现象，我们用JC-1荧光染料方法考察了用化合物处理的K562细胞膜电位差异。JC-1荧光染料可以在具有正常膜电位的线粒体中聚集并且发出590nm红色荧光。当膜电位异常时，JC-1以单体形式存在于线粒体膜外，发出527nm绿色荧光。与对照组相比，经化合物1处理的K562细胞显示出浓度依赖性的JC-1聚集态减少，即表示化合物导致K562细胞线粒体膜电位降低(图5-A)。
6、化合物对Caspases活性影响
半胱天冬酶家族属半胱氨酸蛋白酶，它在细胞凋亡、细胞坏死和炎症中起着重要作用。为考察化合物1能否激活半胱天冬酶，我们用免疫印迹法检测到了Caspase-3和Caspase-9的剪切。如图5-B所示，用25μM化合物1处理的细胞中，Caspase-3和Caspase-9的剪切能明显地检测到，这种剪切与先前一些抑凋亡蛋白抑制剂能诱导Caspases活性是一致的。
7、活性氧ROS的产生
我们用DCFH-DA方法考察化合物1对细胞内活性氧的影响。K562细胞用10μM DCFH-DA孵育。DCFH-DA通过细胞膜转运并通过脂酶去乙酰化形成无荧光DCFH。DCFH在细胞中被活性氧氧化成高荧光的DCF。细胞中活性氧水平的提高可通过DCF荧光强度来量化。如图5-C中所示，加入25μM化合物1后，细胞平均荧光强度比没有加化合物时提高了2.7倍，表示化合物1能诱导活性氧的产生。
表1、DCBL55及其衍生物的化学结构以及它们抑制Bcl-xL结合BH3多肽底物的能力
表2、DCBL55及其衍生物抑制Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2结合BH3多肽的活性(IC50，μM).
表3、SPR实验测得的Bcl-xL及其突变体与DCBL55及衍生物的结合活性(KD，μM).
表4、DCBL55及其衍生物对癌细胞的杀伤作用(EC50，μM)