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1、(10)申请公布号 CN 103316360 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103316360 A *CN103316360A* (21)申请号 201310248169.4 (22)申请日 2013.06.20 A61K 49/00(2006.01) A61K 33/14(2006.01) A61D 1/00(2006.01) (71)申请人 广东药学院 地址 510006 广东省广州市大学城外环东路 280 号 (72)发明人 王丽京 郑凌云 何晓东 李卫东 邢丽英 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 谭英强 (54) 发明名称。
2、 P110 突变失活小鼠模型的应用 (57) 摘要 本发明公开了 P110 突变失活小鼠模型的 应用。包括 110 突变失活小鼠在研究动脉瘤发 生机理和 / 或筛选治疗动脉瘤病药物中的应用。 本发明通过系统的运用组织形态学以及分子生物 学方法明确 p110 突变失活小鼠本身的血管壁 存在一定程度的病理性损伤， 主要以内皮细胞凋 亡， 平滑肌细胞减少以及胶原、 弹力纤维成分降低 为特征， 这些细胞因子的升高和血管壁损伤特点 与动脉瘤的典型特征十分接近。 因此p110突变 失活小鼠可作为研究动脉瘤始动阶段药物靶点和 机制的理想模型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图。
3、 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103316360 A CN 103316360 A *CN103316360A* 1/1 页 2 1.P110 突变失活小鼠模型在研究血管疾病发生机理中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述血管疾病为动脉瘤。 3.P110 突变失活小鼠模型在筛选治疗血管疾病药物中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述血管疾病为动脉瘤。 5. 一种动脉瘤动物模型的构建方法， 包括采用氯化钙在 p110 突变失活小鼠上诱导 。
4、腹主动脉瘤。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 选取 6 8 周龄的 P110 突变小鼠， 60mg/kg 戊巴比妥钠腹腔麻醉后， 无菌条件下 打开腹腔 ； （2） 将浸含 0.5 mol/L 的 CaCl 2生理盐水棉花团包裹于游离的腹主动脉上方， 注意用 棉团隔离保护周围脏器不受 CaCl2溶液影响， 20 30min 后去除棉团并用灭菌生理盐水轻 柔冲洗腹腔后， 关腹缝合即可。 7. 一种动脉瘤动物模型的构建方法， 包括对 p110 突变失活小鼠进行颈总动脉再狭 窄诱导。 8.权利要求57任一项的方法构建得到的动脉瘤动物模型在研究早期动脉瘤疾病。
5、发 病机理中的应用。 9.权利要求57任一项的方法构建得到的动脉瘤动物模型在筛选治疗中/晚期动脉 瘤疾病药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103316360 A 2 1/5 页 3 P110 突变失活小鼠模型的应用 技术领域 0001 本发明涉及 P110 突变失活小鼠模型的应用。 背景技术 0002 动脉瘤 （aneurysm） ， 是一种具有高致死性的临床常见的血管性疾病。好发于主动 脉各部， 尤其以腹主动脉瘤更为常见。 其起病隐匿， 早期不易诊断， 呈进行性发展， 大部分病 人入院前动脉瘤已破裂导致死亡， 而能入院确诊的病人往往病灶处已呈破裂倾向， 临床常 只能以外科手术方式降低。
6、动脉瘤破裂风险， 目前尚无有效的药物可用于治疗。 0003 动脉瘤的发病机理较为复杂， 目前主要认为是一种慢性炎症性血管病变。其在病 理形态上主要表现为血管壁内弹力膜的显著丢失或破裂， 中层平滑肌细胞大量减少， 官腔 明显增大伴有局部膨出， 外膜下有明显的炎症细胞浸润。 0004 现阶段绝大部分动脉瘤的研究主要集中在动脉瘤进行性发展到后期呈现出上述 典型病理改变后的相关信号途径上， 特别是单核细胞、 淋巴细胞浸润及其分泌的众多炎症 因子和基质金属蛋白酶被认为是造成动脉瘤的主要原因。但由于其病变发展呈现多样性， 且不同部位形成的动脉瘤具有较大的差异， 因此近来有研究提出针对性的研究动脉瘤始动 阶。
7、段的发病机制则对预测和研发有效的药物治疗具有更大的临床价值， 特别是动脉瘤发病 部位的血管壁本身病变被认为可能是诱发其形成的关键因素。 0005 而目前用于研究动脉瘤的动物模型较为局限， 主要是针对研究动脉瘤进展到后期 的病理机制较为理想， 可形成典型的动脉瘤病灶。 但所采用的动物其血管壁本身结构完整， 并不易诱发动脉瘤形成， 因此成模率较低。如利用普通的大鼠、 小鼠或家兔为研究对象， 通 过氯化钙、 弹力酶以及血管紧张素 II 药物并结合高脂饮食或机械刺激进行大约 6-12 周诱 导使其形成典型的动脉瘤病灶 ； 但制备过程需要多种因素结合且成模周期长， 成模率较低。 0006 基因工程小鼠作。
8、为疾病动物模型具有比普通小鼠更多优势， 其可在整体水平更自 然的模拟临床上疾病的发生发展过程， 提供在 RNA、 蛋白质、 形态学或生理学等不同水平直 接观察与疾病发生密切相关的基因在活体内的变化情况， 以及其表达产物所引起的表型效 应的可能， 从而可有效地将复杂的生物学问题分解为多个因素分别进行考察， 也能将涉及 多系统或多学科的问题集中到同一个体内进行综合考察， 这就使得复杂生命现象的研究变 得相对简单和可行。 而且在活体动物中进行研究， 能兼顾类似于人体内的各种背景因素， 研 究结论通常具有很高的可靠性。 0007 比如目前广泛为国内外公认且采用的 apoE-/-小鼠。其与野生型小鼠相比。
9、， 易在高 脂饮食下诱发动脉粥样硬化的典型病理表现， 从而缩短成模周期， 而且与人类动脉粥样硬 化发生具有相似的机制， 为研究动脉粥样硬化提供了可靠的动物模型。 0008 但是目前除了 apoE 小鼠外， 针对心血管系统其它疾病尚未找到类似的理想动物 模型。 因此如能找到一种本身具有动脉瘤发病倾向适合用于动脉瘤始动阶段发病机制研究 的基因工程小鼠， 将为深入阐明动脉瘤这种高致死性疾病的发病机制、 寻找早期有效治疗 药物的关键靶点并进一步为大规模临床前动物实验提供更好的研究平台。 说 明 书 CN 103316360 A 3 2/5 页 4 发明内容 0009 本发明的一个目的在于公开 P110。
10、 突变失活小鼠模型在研究动脉瘤发生机理中 的应用以及其在筛选治疗动脉瘤药物中的应用。 0010 本发明还提供了利用颈总动脉结扎以及氯化钙孵育两种方法构建动脉瘤动物模 型的方案。 0011 本发明首次发现并在其基础上建立了一种能早期模拟动脉瘤形成的基因工程动 物p110 突变失活小鼠 （p110-mutant mice）（p110 为 I 类 PI3K （磷脂酰肌醇 3 激 酶） 催化亚基的一个类别， 可称为 I 类 PI3K 激酶催化亚基 ； 英文正式写法为 p110D910A） 。 该基因工程小鼠首次构建于 2002 年， 其主要用于研究与 B/T 淋巴细胞的免疫缺陷相关 的分子机制研究 （。
11、详细见参考文献 ： Okkenhaug K, Bilancio A, Farjot G, Priddle H, Sancho S, Peskett E, Pearce W, Meek SE, Salpekar A, Waterfield MD, Smith AJ, Vanhaesebroeck B. Impaired b and t cell antigen receptor signaling in p110delta pi 3-kinase mutant mice. Science. 2002;297:1031-1034） 。该小鼠大体生长、 发育 情况与正常小鼠无显著差异， 存在自发的结。
12、肠炎症性病变， 其炎症相关的细胞因子 IL-2， TNF-alpha 等表达较正常升高。 0012 本发明通过系统的运用组织形态学以及分子生物学方法明确 p110 突变失活小 鼠本身的血管壁存在一定程度的病理性损伤， 主要以内皮细胞凋亡， 平滑肌细胞减少以及 胶原、 弹力纤维成分降低为特征， 这些细胞因子的升高和血管壁损伤特点与动脉瘤的典型 特征十分接近。因此 p110 突变失活小鼠可作为研究动脉瘤始动阶段药物靶点和机制的 理想模型。 0013 本发明还发现， 通过颈总动脉结扎以及氯化钙孵育两种方法都可诱导 p110 突 变失活小鼠动脉瘤形成， 且形成动脉瘤的时间与既往的动脉瘤模型相比进展更快。
13、， 造模较 为简单， 尤其是其因存在血管壁结构的缺陷， 这也为深入研究血管壁本身环境在动脉瘤形 成的始动阶段的作用机制提供了良好的研究对象。 附图说明 0014 图 1 为 p110 突变失活小鼠重要脏器的形态学分析 ； 图 2 为 p110 突变失活引起血管内皮细胞和平滑肌层细胞凋亡情况 ； 图 3 为透射电镜显示 p110 突变失活小鼠血管弹力纤维异常与平滑肌细胞部分空泡 变性情况 ； 图 4 为小鼠颈总动脉壁胶原纤维 IV 含量明显减少 ； 图 5 为中层血管平滑肌 （-SMA） 减少情况 ； 图 6 为小鼠进行再狭窄诱导后， 狭窄部下方血管壁结构 （A ： 在 C57 正常小鼠上进行再。
14、 狭窄诱导后， 狭窄部下方血管壁结构 ； B ： 在 p110 突变失活小鼠上再狭窄诱导后， 狭窄部 下方出现自发动脉瘤特征） ； 图 7 为在 P110 突变失活小鼠上进行诱导颈总动脉再狭窄时出现自发的真性动脉瘤 病理特征 （A ： 两种小鼠的动脉瘤发生率 ； B ： 两种小鼠结扎后的血管管径大小） ； 图 8 为小鼠诱导再狭窄时血管壁弹力纤维的结构情况 说 明 书 CN 103316360 A 4 3/5 页 5 图 9 为采用氯化钙在 C57 和 p110 突变失活小鼠诱导腹主动脉瘤的病理表现。 具体实施方式 0015 下面结合实施例对本发明作进一步的说明， 但并不局限于此。 0016 。
15、1. p110 突变失活小鼠的整体观察 为进一步研究 p110 突变失活小鼠 （p110-mutant mice） 成为特异的诱发动脉瘤模 型的可行性， 我们对该小鼠进行了系统的分析， 发现该小鼠从整体外观上与普通的 C57/B6J 小鼠无显著差异， 其发育过程无明显缺陷， 其纯合子繁殖力略低于普通小鼠 ； 动脉血压测定 结果与普通 C57 小鼠无显著差异 ； P110 蛋白表达与野生鼠相同 ； 脂质激酶失活， 胸腺细 胞， 成熟 B 细胞、 T 细胞的 IA PI3K 活性比正常情况降低 30%50%。p110 突变失活小鼠的 重要组织器官 HE 染色和形态学分析如图 1 所示 ： 心脏 ：。
16、 组织正常， 心肌细胞明显， 心肌纤维成短圆柱状， 有分支， 互相连接成网， 在显微 镜下没有看到明显的异常情况 ； 肝 ： 肝组织有明显的中央静脉， 肝小叶清晰可见， 肝细胞完整， 肝血窦无充血， 比较正 常 ； 脾 ： 脾脏组织正常， 白髓与红髓分布清楚， 能看见明显的红细胞分布， 也能看见明显的 小梁 ； 肺 ： 绝大部分肺组织正常， 肺静脉、 细支气管清晰可见 ； 肾 ： 正常， 能看见明显的肾小球分布。 0017 上述结果提示该小鼠无明显其他组织器官的缺陷， 主要伴有 B/T 淋巴细胞相对减 少， 而其血管特异的形态和结构异常则是我们首次发现， 我们随后结合 HE 普通形态学染 色、。
17、 EVG 染色， Gomori s 染色、 投射电镜检查、 免疫组织化学和 Western blot 等方法明确并 证实了 p110 突变失活小鼠中存在血管壁的特异性损伤， 而这些损伤表现与动脉瘤的发 生和形成密切相关。 0018 2. P110 突变失活小鼠的血管壁损伤的病理表现 2.1p110 突变失活引起颈总动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞凋亡 取 p110 突变失活小鼠麻醉后， 生理盐水灌注， 取出颈总动脉血管组织， 4% 的多聚甲 醛固定过夜， 蔗糖梯度脱水后， OTC 包埋剂包埋， 切片， 80保存切片。从 80取出冰 冻切片， 室温放置 30min， 用 TBS 洗涤。装有 0.01。
18、Mol/L 柠檬酸盐缓冲液修复 10 到 15min。 冷却至室温， 用 TBS 洗涤。10 BSA 封闭， 盒在 37放置 1h。倾去 10 BSA， 加一抗， 置于 4， 过夜。TBS 洗涤。擦干玻片， 避光在组织切片上加荧光二抗， 37避光中放置 1h。避 光洗去多余二抗， 荧光显微镜下观察， 拍片。如图 2 所示， p110 突变失活后血管内皮细胞 减少， 中层平滑肌部分减少并发生凋亡。 0019 2.2 透射电镜显示弹力纤维异常与平滑肌细胞部分空泡变性 选取p110突变失活小鼠及C57小鼠各2只， 8周， 雄性， 快速取颈总动脉血管， 组织块 大小为 1 立方毫米， 用 2.5% 戊。
19、二醛， 磷酸缓冲液固定液 4 度固定过夜后， 送中山大学电镜室 制备样品并进行后期观察， 放大倍数 5800。如图 3 所示， p110 突变失活小鼠颈总动脉 血管壁弹力纤维异常与平滑肌细胞部分空泡变性。 0020 2.3 颈总动脉壁胶原纤维 IV 含量明显减少 说 明 书 CN 103316360 A 5 4/5 页 6 从 80取出步骤 2.1 中制备好的颈总动脉血管冰冻切片， 室温放置 30min， 用 TBS 洗 涤。装有 0.01Mol/L 柠檬酸盐缓冲液修复 10 到 15min。冷却至室温， 用 TBS 洗涤。10 BSA 封闭， 盒在 37放置 1h。倾去 10 BSA， 加胶。
20、原 IV 一抗 （抗小鼠， 1:1000） ， 置于 4， 过夜。 TBS 洗涤。擦干玻片， 在组织上加二抗， 37中放置 1h。组织切片晾干， 滴加中性树胶， 封 片。阴性对照组 （Negative control） 则用正常小鼠 IgG 代替一抗 （1:1000） 孵育， 其余步 骤全部相同， 如图 4 所示， p110 突变后小鼠颈总动脉壁胶原含量减少， 统计结果有显著差 异。 0021 2.4 中层血管平滑肌 （-SMA） 明显减少 从 80取出步骤 2.1 中制备好的颈总动脉血管冰冻切片， 室温放置 30min， 用 TBS 洗涤。装有 0.01Mol/L 柠檬酸盐缓冲液修复 10 。
21、到 15min。冷却至室温， 用 TBS 洗涤。10 BSA 封闭， 盒在 37放置 1h。倾去 10 BSA， 于组织切片上滴加 anti-SMA 一抗 （抗小鼠 1:1000） ， 置于 4过夜。TBS 洗涤。擦干玻片， 在组织上加二抗， 37中放置 1h。组织切 片晾干， 滴加中性树胶， 封片。染色结果显示， p110-mutant 后小鼠颈总动脉中层 -SMA （血管平滑肌细胞分子标志） 表达减少。 0022 免疫印迹 （western blot） ： 将样品与5 X Loading Buffer混匀后100度煮10min， 待用。配置分离胶和浓缩胶， 常温凝胶 1 h。SDS-PAG。
22、E 电泳 ： 每孔加样 20-30 ul， 浓缩胶电 压 70V， 30 min, 当染料前沿进入分离胶后， 将电压提高到 120-150V, 继续电泳至溴酚兰到 达分离胶底部。转膜 ： 三明治顺序 ： 转膜夹黑面朝下， 自下而上依次叠放海绵、 滤纸、 胶、 膜、 滤纸、 海绵。100V， 4 C 90 min。封闭 ： 将 PVDF 膜置于含 5脱脂奶粉的 TBST 中， 室温封 闭 1h。TBST 洗三次， 每次 5 min。加一抗 ： 将一抗用封闭液稀释至适当浓度 ； 均匀覆盖于 PVDF 膜表面， 4孵育过夜。TBST 室温下脱色摇床上洗三次， 每次 10min。 加二抗 ： 同上方 。
23、法准备二抗稀释液 （Anti-Rabbit 1 ： 10000， Anti-Biotin 1 ： 1000， Anti-Mouse 1 ： 10000, Promega） 并与膜接触， 室温下孵育 1h 后， 用 TBST 在室温下脱色摇床上洗三次， 每次 10min。 显影 ： 配置发光液。等体积均匀混合溶液 A 和溶液 B 于洗膜盒， 约 2-3 ml。将膜倒扣于发光 液上， 反应 5min 后， 将膜包于保鲜膜中， 注意避免产生皱折和气泡， 放入 X- 光片夹中。在暗 室中， 将 X- 光片放在膜上， 压片时间一般视不同抗体而定， 显影， 定影。 凝胶图象分析 ： 将 胶片进行扫描或拍照。
24、， Quantity-one凝胶蛋白分析软件对条带进行分析。 进一步用western blot（免疫印迹） 检测证实小鼠 p110 突变后可导致血管平滑肌细胞减少， 统计结果有显 著差异 （见图 5） 。 0023 3. P110 突变失活小鼠上进行诱导颈总动脉再狭窄时出现自发的真性动脉瘤病 理特征 本发明进一步在 P110 突变失活小鼠上进行颈总动脉再狭窄模型时意外发现， 该小 鼠中有近30%在再狭窄术后4周就会同时伴发典型动脉瘤表现 ： 外膜下大量炎症细胞聚集、 弹力纤维断裂、 平滑肌细胞减少， 动脉瘤形成后血管官腔明显较正常鼠扩大 （见图 6 和图 7） 。再狭窄局部的弹力纤维染色显示其。
25、结构在 p110 突变失活小鼠上与 C57 正常小鼠有 显著差异， 如图 8 所示， 在光镜下观察到 C57 小鼠从 HE 染色， EVG 染色和 Gomoris 醛品红 染色中看出血管结扎后， 细胞外基质染色较均匀， p110 突变后， 血管壁的弹性纤维紊乱， 疏散， 弹性降低， 细胞外基质疏松。 0024 颈总动脉再狭窄实验步骤如下 ： 说 明 书 CN 103316360 A 6 5/5 页 7 8 周龄的雄性 p110 突变失活小鼠 (20 只 ) 为实验组， 同时取同周龄的 C57 小鼠 （20 只） 为对照组。血管重构模型的建立参见文献 （ Wang YJ, Wang JT, Fa。
26、n QX, Geng JG. Andrographolide inhibits nf-kappabeta activation and attenuates neointimal hyperplasia in arterial restenosis. Cell Res. 2007;17:933-941） ： 全 部小鼠以 60mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后 , 仰卧固定在动物专用固定架上， 作颈正中 切口, 上至下颌, 下至胸骨, 长约2.5cm。 在手术显微镜下， 分离暴露出左颈总动脉, 用 9/0 丝线在左颈总动脉分支处结扎， 阻断血流， 切口用甲硝唑注射液反复冲洗， 避免感染。 逐。
27、层缝合皮下组织与皮肤， 继续普通饲料喂养及自由饮水， 动物在 4 周的过程中无死亡， 手术成功率较高。术后 28 天后， 动物经再麻醉 , 依上述方法 , 在结扎处上下各取长度约 2.5mm 的左颈总动脉， 在生理盐水和 4% 福尔马林内固定后， 做石蜡或者冰冻切片。 0025 附弹力纤维染色方法 ： 胶原纤维染色 - Van Gieson（V.G） 染色法 ： 切片脱蜡至水， 流水冲洗 10min， 染 Van Gieson 氏液 1min， 用 95% 酒精快速分化， 无水酒精脱水， 二甲苯透明， 封固。 0026 弹性纤维染色 - Gomoris 醛品红法 ： 切片脱蜡至水， 0.5% 。
28、高锰酸钾水溶液氧化 5min， 水洗， 2% 草酸漂白 1-2min， 水洗， 入 70% 酒精稍浸泡 1min， 入染液中浸染 10-15min， 70% 酒精分化， 至无余色脱下为止， 0.5% 橙黄 G 做对比染色， 20-30s， 脱水， 透明， 封固。 0027 结果 ： 弹性纤维深蓝色， 背景不同程度的红色。 0028 4. 采用氯化钙在 p110 突变失活小鼠上诱导腹主动脉瘤的病理表现 进一步我们仅利用单纯的氯化钙诱导腹主动脉瘤的方法， 发现在 p110 突变失活小 鼠上 6 周后形成的动脉瘤管壁更薄， 管壁细胞外基质降解更明显， 部分管壁呈现破损表现 （见图 9） 。 0029。
29、 具体实验方法如下 ： （1） 选取 8-10 周龄 P110 突变失活小鼠和 C57BL/6J 小鼠， 雄性， 随机分成实验组和 对照组， 每组各 20 只 ； （2） 戊巴比妥钠 （60mg/kg ） 腹腔麻醉后， 无菌条件下打开腹腔 ； （3） 将浸泡有 0.5mol/L 的 CaCl2 的棉花块放置于游离的腹主动脉上方， 注意保护周围 组织避免接触， 20min 后移除棉花块。用消毒纱布小心吸干腹腔内残留的 CaCl2溶液， 并用 无菌生理盐水冲洗周围组织， 减少对周围组织的损伤， 关腹缝合。 0030 （4） 对照组采用同样手术操作， 只是用浸泡了 0.9%NaCl 的生理盐水取代 。
30、CaCl 2 。 0031 6周后即可形成动脉瘤晚期病理特征。 如图9所示。 经氯化钙诱导处理后的p110 突变失活小鼠呈现更明显的管壁变薄， 局部胶原和细胞外基质断裂， 管腔增大等典型病理 特征。 0032 从以上研究可知， p110 突变失活小鼠本身血管壁存在缺陷， 其病理损伤特点与 动脉瘤十分接近， 可作为研究动脉瘤始动阶段药物靶点和机制的理想模型。 0033 通过颈总动脉结扎以及氯化钙孵育两种方法都可在 p110 突变失活小鼠上诱导 形成典型的动脉瘤晚期的病理损伤特征， 且形成动脉瘤的时间与既往的动脉瘤模型相比进 展更快， 造模较为简单， 尤其是其因存在血管壁结构的缺陷， 这也为深入研究血管壁本身环 境在动脉瘤形成的始动阶段的作用机制提供了良好的研究对象。 说 明 书 CN 103316360 A 7 1/5 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103316360 A 8 2/5 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103316360 A 9 3/5 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103316360 A 10 4/5 页 11 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103316360 A 11 5/5 页 12 图 9 说 明 书 附 图 CN 103316360 A 12 。