枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途.pdf

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1、10申请公布号CN104099349A43申请公布日20141015CN104099349A21申请号201310118898822申请日20130408C12N15/53200601C12N9/04200601C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人深圳华大基因科技有限公司地址518083广东省深圳市盐田区北山路146号北山工业区综合楼11F372发明人魏晓明朱倩74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育姜建成54发明名称枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途57摘要本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病基因。

2、突变，枫糖尿病相关基因突变，更特别是枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途。51INTCL权利要求书1页说明书10页序列表5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页序列表5页附图2页10申请公布号CN104099349ACN104099349A1/1页21一种枫糖尿病的生物标记物，所述生物标记物包括突变的BCKDHA基因和/或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白，BCKDHA基因的突变是C392AG，支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的突变是PTYR131CYS。2权利要求1的生物标记物，所述生物标记物还包括EX24DUP。3权利要求1或2的生物标记物，。

3、所述突变BCKDHA基因为SEQIDNO1的序列中具有以下突变C392AG。4一种检测受试者的BCKDHA基因和/或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白中是否存在突变位点以及拷贝数变异的方法，所述突变位点以及拷贝数变异选自如下任一种或其组合BCKDHA基因突变C392AG，支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白突变PTYR131CYS；和EX24DUP。5权利要求4的方法，包括如下至少一组引物扩增的步骤SEQIDNO3和SEQIDNO4；SEQIDNO5至SEQIDNO10。6检测突变BCKDHA基因和/或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合BCKDHA基因突。

4、变C392AG，支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白突变PTYR131CYS；和EX24DUP，其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或CDNA序列上前后设计，使得扩增该位臵BCKDHA基因CDNA序列第392位。7与突变BCKDHA基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合BCKDHA基因突变C392AG，所述探针与突变BCKDHA基因的互补区包括选自如下的基因组序列或CDNA序列上的位臵BCKDHA基因CDNA序列第392。8检测突变BCKDHA基因和/或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，并且/或者包含一个或多个核酸探针，其中所述突变是选自如下。

5、任一种或其组合BCKDHA基因突变C392AG，支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白突变PTYR131CYS；和EX24DUP，其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或CDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位臵BCKDHA基因CDNA序列第392位。9权利要求8的试剂盒，所述引物对选自如下的一组或两组SEQIDNO3和SEQIDNO4；SEQIDNO5至SEQIDNO10。权利要求书CN104099349A1/10页3枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途技术领域0001本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病基因突变，枫糖尿病相关基因突变。背景技术000。

6、2枫糖尿病（MAPLESYRUPURINEDISEASE,MSUD）是一种常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，主要是由于以下原因所致支链氨基酸酮酸脱氢酶复合体的基因缺陷，使支链氨基酸（主要包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）转氨基反应后形成的相应支链酮酸不能氧化脱羧，组织中支链氨基酸和支链酮酸异常增高，体液排出酮酸，因而出现类似枫糖的气味，并且由此而得名。同时，由于蓄积体内的支链氨基酸及其酮酸衍生物对脑组织有毒性作用，可以抑制髓鞘生成，干扰脑内蛋白合成，抑制神经递质功能，使发育中的脑组织受到严重损害。特殊气味和严重脑病是本病非常明显的两个特点。目前，本病共分成如下5种类型经典型、中间型、间隙型、维生素B。

7、1治疗有效型和二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶（E3）缺乏型，其中最后一种类型非常罕见。0003枫糖尿病在新生儿中的患病率是1/18万。遗传缺陷是线粒体中存在的BCKD多酶复合体中的E1、E2和E33亚基的基因突变。BCKD多酶复合体是一种存在于线粒体中的多酶复合体，其功能是催化从支链氨基酸降解而产生的3种支链酮酸的氧化性脱羧。酶复合体围绕一立方体核心含有24个相同的双氢脂酰转环酶（DIHYDROLIPOYLTRANSCYLASE，E2）亚基，这些亚基通过离子相互作用连接在一起。此外，还有支链酮酸脱羧酶（E1）、特异性激酶（E3）和特异性磷酸酶。特异性激酶和磷酸酶通过可逆性磷酸化来调节BCKD复合物活性。

8、。E1是杂四聚体，由2个E1和2个E1亚基组成。E3为同二聚体。E1、E1、E2和E3的编码基因都可发生突变而导致BCKD多酶复合体活性降低。E1是焦磷酸硫胺素（TPP）依赖性酶，由2个E1和2个E1形成22四聚体，分子量为170KD。E1和E1基因座分别定位在19Q和6P，均可发生突变。E1基因突变则可阻碍其与正常的E1聚合成四聚体，使E1迅速被降解，从而使支链酮酸脱羧酶活性降低或完全丧失；或者只形成二聚体，也可形成低分子量的四聚体。WYNN等研究了IA型枫糖尿病患者中E1与E1的聚合障碍后指出在被研究的E1突变如果在假定的焦磷酸硫胺素结合袋，则对E1亚基的聚合无影响；如果涉及到C末端芳香性。

9、残基的突变，则阻碍亚基聚合动力学和天然的22结构的形成。E1亚基的突变使支链酮酸脱羧酶活性降低或完全丧失。0004确定新的MSUD基因的致病突变，对开展MUSD的分子诊断具有重要意义。发明内容0005本发明人通过广泛而深入的研究，在一个MUSD患者中发现了编码支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基的基因BCKDHA基因的复合杂合突变错义突变C392AG（即E1亚基蛋白的突变PTYR131CYS）和EX24DUP。该复合杂合突变导致BCKDHA基因失去正常功能，从而导致MUSD发生。发明人在此基础上完成了此发明。说明书CN104099349A2/10页40006本发明涉及MUSD病基因的复合杂合突变，具体。

10、为BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和EX24DUP（指在一条染色体上，BCKDHA基因的24号外显子的拷贝数增加1倍，即出现外显子234234的结构）。其中，BCKDHA基因编码支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基。0007在第一方面，本发明涉及MUSD病的生物标记物，即BCKDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的杂合突变，所述生物标记物是如下的突变BCKDHA基因或E1亚基蛋白BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和EX24DUP。0008在一个实施方。

11、案中，本发明的突变BCKDHA基因为具有以下突变的SEQIDNO1错义突变C392AG和EX24DUP。0009在一个实施方案中，本发明的突变的支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白为具有以下突变的SEQIDNO2错义突变PTYR131CYS和EX24DUP。0010在第二方面，本发明涉及一种检测MUSD病或检查其易感性的方法，所述方法包括检测受试者的BCKDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有MUSD病或易患MUSD病，或者其后代会患有MUSD病或易患MUSD病，所述突变为BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合。

12、体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和/或EX24DUP。0011在一个实施方案中，BCKDHA基因的CDNA序列为SEQIDNO1的序列表示。0012在一个实施方案中，E1亚基蛋白为SEQIDNO2的序列表示。0013在一个实施方案中，本发明的检测MUSD病的方法包括如下两组引物扩增的步骤0014SEQIDNO3和SEQIDNO4；0015SEQIDNO5至SEQIDNO10。0016在一个实施方案中，本发明的检测MUSD病的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱,基于荧光标记技术的DNA测序。0017在本发明第二方面。

13、的方法中，优选检测BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和/或EX24DUP。0018在第三方面，本发明涉及一种检测突变BCKDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的BCKDHA基因（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白）中是否存在BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和/或EX24DUP。0019在一个实施方案中，BCKDHA基因为SEQIDNO1的序列表示。0020在一个实施方案中，E1亚基蛋白为SEQIDNO2的序列表示。

14、。0021在一个实施方案中，本发明的检测突变BCKDHA基因或E1亚基蛋白的方法包括如下两组引物扩增的步骤0022SEQIDNO3和SEQIDNO4；0023SEQIDNO5至SEQIDNO10。0024在一个实施方案中，本发明的检测突变BCKDHA基因或E1亚基蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性说明书CN104099349A3/10页5高效液相色谱,基于荧光标记技术的DNA测序。0025在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变BCKDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白中使用的引物对，所述突变是BCKDHA基因的错义突变C3。

15、92AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和/或EX24DUP。0026其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或CDNA序列上前后设计，使得扩增该位臵BCKDHA基因CDNA序列第392位和/或外显子24。0027在第五方面，本发明涉及与突变BCKDHA基因互补的核酸探针，所述突变是BCKDHA基因的错义突变C392AG和/或EX24DUP。0028所述探针与突变BCKDHA基因的互补区包括选自如下的基因组序列或CDNA序列上的位臵BCKDHA基因CDNA序列第392位和/或外显子24。0029在第六方面，本发明涉及检测突变BCKDHA基因或支链酮酸。

16、脱氢酶复合体E1亚基蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是BCKDHA基因的错义突变C392AG（即支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和/或EX24DUP。0030其中所述引物对分别基于选自如下的位臵在基因组序列或CDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位臵BCKDHA基因CDNA序列第392位和/或外显子24。0031在一个实施方案中，所述检测突变BCKDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的试剂盒包括如下两组引物0032SEQIDNO3和SEQIDNO4；0033SEQIDNO5至SEQIDNO10。0034在第七方面，本发明涉及检测突变BC。

17、KDHA基因或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是BCKDHA基因的错义突变C392AG和/或EX24DUP。0035所述探针与突变BCKDHA基因上包含选自如下位臵的基因组序列或CDNA序列上的区域互补BCKDHA基因CDNA序列第392位和/或外显子24。0036本发明人发现，本发明的BCKDHA基因的C392AG和EX24DUP的复合杂合突变即致病；而本发明的BCKDHA基因的C392AG和EX24DUP任一种的杂合突变并不致病，如杂合错义突变C392AG（PTYR131CYS）存在于患者的母亲中，杂合突变EX24DUP存在于患者的父亲中，他们并未。

18、患病。0037本发明的BCKDHA基因中的复合杂合突变，可以用于枫糖尿病病变的检测和诊断。本发明发现了MUSD病相关基因的复合杂合突变，对这些基因突变的检测可能用于MUSD病患者的辅助诊断，并且可能有利于明确MUSD病患者的分子诊断。因此，本发明的检测复合杂合突变BCKDHA基因（或E1亚基蛋白）和/或EX24DUP的方法可以用于诊断MUSD病或其易感性的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断（PGD）、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。0038另外，本发明的检测突变BCKDHA基因和/或E1亚基蛋白的方法也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究。

19、SNP分布和多态性，用于家族演化研究。本发明可以对MUSD病的发病机理提供重要线索，对MUSD病的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。说明书CN104099349A4/10页60039例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变BCKDHA基因（或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白）或者携带本发明所述的EX24DUP但不患MUSD病，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，。

20、或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。0040因此，本研究丰富了MSUD基因的致病突变谱，对开展MUSD的分子诊断具有重要意义。附图说明0041图1患者（即先证者P610）和其父母（P609是父亲，P611是母亲）的BCKDHA基因的SANGER测序0042图2患者、其父母和正常人对照的BCKDHA基因的QPCR测序结果。其中P610是患者，P611是患者母亲，P609是患者父亲；N108为正常人。0043BCKDHA基因的CDNA序列（SEQIDNO1；下划线部分为EX24；加框的为第392位）0044ATGGCGGTAGCGATCGCTGCAGCGAGGGTCTG。

21、GCGGCTAAACCGTGGTTTGAGCCAGGCTGCCCTCCTGCTGCTGCGGCAGCCTGGGGCTCGGGGACTGGCTAGATCTCACCCCCCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTCATCTCTGGATGACAAGCCCCAGTTCCCAGGGGCCTCGGCGGAGTTTATAGATAAGTTGGAATTCATCCAGCCCAACGTCATCTCTGGAATCCCCATCTACCGCGTCATGGACCGGCAAGGCCAGATCATCAACCCCAGCGAGGACCCCCACCTGCCGAAGGAGAAGGTGCTGAAGCTCTACAAGAGCATGACACT。

22、GCTTAACACCATGGACCGCATCCTCTATGAGTCTCAGCGGCAGGGCCGGATCTCCTTCTCATGACCAACTATGGTGAGGAGGGCACGCACGTGGGGAGTGCCGCCGCCCTGGACAACACGGACCTGGTGTTTGGCCAGTACCGGGAGGCAGGTGTGCTGATGTATCGGGACTACCCCCTGGAACTATTCATGGCCCAGTGCTATGGCAACATCAGTGACTTGGGCAAGGGGCGCCAGATGCCTGTCCACTACGGCTGCAAGGAACGCCACTTCGTCACTATCTCCTCTCCACTGGCCACG。

23、CAGATCCCTCAGGCGGTGGGGGCGGCGTACGCAGCCAAGCGGGCCAATGCCAACAGGGTCGTCATCTGTTACTTCGGCGAGGGGGCAGCCAGTGAGGGGGACGCCCATGCCGGCTTCAACTTCGCTGCCACACTTGAGTGCCCCATCATCTTCTTCTGCCGGAACAATGGCTACGCCATCTCCACGCCCACCTCTGAGCAGTATCGCGGCGATGGCATTGCAGCACGAGGCCCCGGGTATGGCATCATGTCAATCCGCGTGGATGGTAATGATGTGTTTGCCGTATACAACGCCACAAAG。

24、GAGGCCCGACGGCGGGCTGTGGCAGAGAACCAGCCCTTCCTCATCGAGGCCATGACCTACAGGATCGGGCACCACAGCACCAGTGACGACAGTTCAGCGTACCGCTCGGTGGATGAGGTCAATTACTGGGATAAACAGGACCACCCCATCTCCCGGCTGCGGCACTATCTGCTGAGCCAAGGCTGGTGGGATGAGGAGCAGGAGAAGGCCTGGAGGAAGCAGTCCCGCAGGAAGGTGATGGAGGCCTTTGAGCAGGCCGAGCGGAAGCCCAAACCCAACCCCAACCTACTCTTCTCAGAC。

25、GTGTATCAGGAGATGCCCGCCCAGCTCCGCAAGCAGCAGGAGTCTCTGGCCCGCCACCTGCAGACCTACGGGGAGCACTACCCACTGGATCACTTCGATAAGTGA0045E1亚基蛋白的氨基酸序列（SEQIDNO2；下划线为EX24编码的氨基酸；加框的为第131位）0046MAVAIAAARVWRLNRGLSQAALLLLRQPGARGLARSHPPRQQQQFSSLDDKPQFPGASAEFIDKLEFIQPNVISGIPIYRVMDRQGQIINPSEDPHLPKEKVLKLYKSMTLLNTMDRILESQRQGRISFYMTNYGEEGTH。

26、VGSAA说明书CN104099349A5/10页7ALDNTDLVFGQYREAGVLMYRDYPLELFMAQCYGNISDLGKGRQMPVHYGCKERHFVTISSPLATQIPQAVGAAYAAKRANANRVVICYFGEGAASEGDAHAGFNFAATLECPIIFFCRNNGYAISTPTSEQYRGDGIAARGPGYGIMSIRVDGNDVFAVYNATKEARRRAVAENQPFLIEAMTYRIGHHSTSDDSSAYRSVDEVNYWDKQDHPISRLRHYLLSQGWWDEEQEKAWRKQSRRKVMEAFEQAERKPKPNPNLLFSDVYQEMPAQL。

27、RKQQESLARHLQTYGEHYPLDHFDK具体实施方式0047本研究对一个被诊断为MSUD的患者进行BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因的捕获测序。测序后进行变异检测。然后，将检测的变异与DBSNP数据库、千人基因组数据库、HAPMAP数据库、HGMD数据库、LSMD数据库和正常人的数据进行比较，最后找到BCKDHA基因的未报道过的复合杂合突变BCKDHA基因的错义突变C392AG（或支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基蛋白的错义突变PTYR131CYS）和EX24DUP。其中，基因BCKDHA编码支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基。0048样本采集0049我们接受了一个到医院就诊的来自北。

28、京的MUSD患者，3岁，其生产过程正常没有窒息情况，6个月是被诊断为肌迟缓，经一系列检查，其MRI和脑电图均不正常。其血浆的定量氨基酸分析结果显示，亮氨酸异亮氨酸总量为7154808M（参考值120190M），酪氨酸总量为4523789M（参考值200425M）。我们采集了该患者和其父母亲的外周血并提取了基因组DNA。除此之外，本研究还采集了455个正常人的外周血并提取了其基因组DNA。0050与所有受试者或其监护人签订书面的知情许可。0051芯片设计、文库构建和高通量测序0052发明人用定制的捕获芯片（NIMBLGEN，ROCHE）结合SOLEXAHISEQ2000高通量测序技术对该患者的B。

29、CKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因进行了捕获测序，具体如下00531）我们设计了一张捕获芯片（NIMBLGEN，ROCHE）对4个基因的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。00542）将基因组DNA随机打断成150200BP左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备文库（参见HTTP/WWWILLUMINACOM/提供的ILLUMINA/SOLEXA标准建库说明书）。00553）文库经纯化后经过LIGATIONMEDIATEDPCRLMPCR的线性扩增与定制的捕获阵列进行杂交富集，再经过LMPCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为ILLUMINAHISEQ2000，读取。

30、长度为90BP。0056变异检测、注释及与数据库比较00571）测序后获得的原始数据由ILLUMINABASECALLINGSOFTWARE17进行处理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用BWA（VERSION059R16）（可参见LIH,DURBINRFASTANDACCURATELONGREADALIGNMENTWITHBURROWSWHEELERTRANSFORMBIOINFORMATICS2010265589595）将高质量读段比对到参考基因组，获得比对到基因组上的唯一比对读段。然后利用SOAPSNP（可参见LIR,LIY,FANGX,YANGH,ETAL,SNPDETECTI。

31、ONFORMASSIVELYPARALLELWHOLEGENOMERESEQUENCINGGENOMERES2009,19611241132，通过参照将其全文并入本文）和GATK（VERSION说明书CN104099349A6/10页8V104705）（可参见MCKENNA,A,HANNAM,BANKSE,ETALTHEGENOMEANALYSISTOOLKITAMAPREDUCEFRAMEWORKFORANALYZINGNEXTGENERATIONDNASEQUENCINGDATAGENOMERESEARCH201020912971303）分别进行SNP和INDEL的检测。00582）对于检。

32、出的SNP和INDEL变异，我们利用内部的流程进行注释，即确定变异所处基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和DBSNP数据库、千人基因组数据库、HAPMAP数据库、HGMD数据库和LSMD数据库等公共数据库以及正常人的数据进行了比较。我们选出了HGMD数据库和LSMD数据库中包含的变异以及位于编码区和剪接位点区的先前未报道过的变异，然后和我们的内部对照数据库进行比较。对于位于疾病已知基因上的候选致病突变，我们进行了SANGER验证。0059通过上述分析，我们在该患者的BCKDHA基因中发现未。

33、报道过的复合杂合突变错义突变C392AG（PTYR131CYS）和EX24DUP。其中，杂合错义突变C392AG（PTYR131CYS）存在于患者的母亲中，杂合突变EX24DUP存在于患者的父亲中，因此可判断为复合杂合突变。我们的结果表明BCKDHA基因的功能缺失突变是导致枫糖尿病（MUSD）的原因。0060在本文中使用的靶向捕获测序又称为目标区域捕获测序，就是将研究者感兴趣的基因组区域定制探针并与基因组DNA进行芯片杂交（NIMBLEGENSEQUENCECAPTUREARRAY）或溶液杂交（AGILENTSURESELECTSYSTEM），将目标基因区域DNA富集后再利用新一代测序技术进行。

34、测序的研究策略。目标区域可以是连续的DNA序列，也可以是分布在同一染色体不同区域或不同染色体上的片段。目前，由于其高通量、低成本和大大缩短的实验周期，目标区域测序逐渐在临床分子诊断中得到广泛应用。0061在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。C392AG表示CDNA第392位核苷酸由A变成G；PTYR131CYS表示蛋白质水平第131位密码子由TYR变成CYS；EX24DUP表示CDNA和/或蛋白质水平外显子24重复。0062在本发明中，除非另外说明，否则A和/或B，等价于以下三种情况A；B；A和B。0063对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补。

35、双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及BCKDHA基因的CDNA序列，实际上可以包括/或不包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQIDNO1，实际可以包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。0064本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及BCKDHA基因的CDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。0065下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而。

36、不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的分子克隆实验指南，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。0066实施例10067基因组提取说明书CN104099349A7/10页90068采集所有受试者的外周血，利用QIAAMPDNABLOODMINIKIT（QIAGEN,HILDEN,GERMANY）依照制造商提供的方案提取基因组DNA。0069实施例20070芯片设计、文库构建和高通量测序0071本发明人设计了一张捕获芯片（NIMBLG。

37、EN，ROCHE）对BCKDHA、BCKDHB、DBT和DLD这4个基因的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。0072文库构建的方法可参考ILLUMINA公司提供的方案（HTTP/WWWILLUMINACOM/）。现简单描述如下利用超声波仪（COVARISS2,MASSACHUSETTS,USA）将基因组DNA随机打断成200300BP的片段。取1G（用NANODROP定量）纯化DNA片段用T4DNA聚合酶、T4磷酸核苷酸激酶和大肠杆菌（ESCHERICHIACOLI）DNA聚合酶的KLENOW片段进行处理，补平5突出末端和去除3突出末端。在3末端添加A碱基以后再连接上接头序列。添加接。

38、头以后，利用包含8BP标签序列（BARCODESEQUENCE）的PCR引物进行4个循环的PCR得到捕获前的文库。将10个文库混合后与捕获芯片进行72小时杂交。杂交完成以后，利用300ML洗脱缓冲液（SEQCAPEZHYBRIDIZATIONANDWASHKIT；QIAGEN,VALENCIA,CA,USA）对结合到芯片上的DNA片段进行洗脱。在自制的洗脱设备上95洗脱20分钟，然后添加200ML洗脱缓冲液进行一次重复洗脱。参照ILLUMINA标准的成簇和测序的方案，我们利用ILLUMINAHISEQ2000进行了测序，读取长度为90BP。0073实施例30074变异检测、注释及与数据库比较0。

39、0751）测序完成以后，利用ILLUMINA134进行图像分析、错误率估计和碱基读取，获得原始数据。然后过滤低质量读段（READ）和包含接头污染读段。我们将包含超过10的N碱基的读段、50的质量值小于5的碱基占读段使用BWA将高质量读段比对到参考基因组，获得比对到基因组上的唯一比对读段。然后利用SOAPSNP和GATK分别进行SNP和INDEL的检测。00762）对于检出的SNP和INDEL变异，我们利用内部的流程进行注释，即确定变异所处基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和DBSNP数据库。

40、、千人基因组数据库、HAPMAP数据库、HGMD数据库和LSMD数据库等公共数据库进行了比较。我们选出了HGMD数据库和LSMD数据库中包含的变异以及位于编码区和剪接位点区的先前未报道过的变异，然后和我们的内部对照数据库进行比较。0077发现BCKDHA基因的未报道过的复合杂合突变错义突变C392AG（PTYR131CYS）和EX24DUP。0078实施例40079分别对家系内1个患者样本和2个非患者样本进行SANGER测序，确定错义突变C392AG（PTYR131CYS）。具体方法步骤如下00801）DNA提取0081采集患者和其父母的外周静脉血用QIAAMPDNABLOODMINIKITQ。

41、IAGEN,HILDEN,GERMANY方法提取基因组DNA，DNA用于以下步骤2）反应体系中的DNA模板。说明书CN104099349A8/10页1000822）引物设计及PCR扩增反应0083A）引物序列0084用于扩增该突变C392AG位点的引物0085上游引物FAGCAGTCTGGCAGCGTCTTCTTA（SEQIDNO3）0086下游引物RGCTCCTTAGACCTTCCTGGCACTA（SEQIDNO4）0087B）反应体系0088反应采用25L体系，其中酶及缓冲溶液均购自KATARA公司。00890090C）PCR反应程序0091955分钟；009230个循环00939430秒。

42、，0094TM30秒，009572延伸30秒；00967210分钟；009715保持。0098D）在PCR扩增之后进行凝胶电泳检测，确认所扩增出的片段是需要的目的片段。电泳中使用的MARKER为5L的DL2000DNAMARKER和50BPDNAMARKER。电泳采用2的琼脂糖凝胶进行，在135V下电泳35分钟。00993）将步骤2）中获得的PCR扩增产物用QIAQUICKPCR扩增试剂盒（QIAGEN）进行纯化，然后利用ABI的3730XL进行DNA测序（图1）。0100确认患者和患者母亲中带有BCKDHA基因的未报道过的错义突变C392AG（PTYR131CYS），患者父亲则没有该错义突变。

43、。0101实施例50102分别对家系内1个患者样本和2个非患者样本进行QPCR，确定杂合突变EX24DUP。具体方法步骤如下01031）DNA提取0104采集患者和其父母的外周静脉血用QIAAMPDNABLOODMINIKITQIAGEN,HILDEN,GERMANY方法提取基因组DNA。01052）引物设计及PCR扩增反应说明书CN104099349A109/10页110106A）QPCR引物0107BCKDHAQEX2FCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTC（SEQIDNO5）BCKDHAQEX2RGATGGGGATTCCAGAGATGACG（SEQIDNO6）BCKDHAQIN3F。

44、AGGACAGATTCTTTTTTGGGGG（SEQIDNO7）BCKDHAQIN3RCAGGACTGCTCTCACACTTCTC（SEQIDNO8）BCKDHAQIN4FCCTGTGGTCCCCATTGAAGTGT（SEQIDNO9）BCKDHAQIN4RTCCTGGCACTATGCTGCTCCTG（SEQIDNO10）0108其中0109BCKDHAQEX2F和BCKDHAQEX2R用于扩增BCKDHA基因外显子2号。0110BCKDHAQIN3F和BCKDHAQIN3R用于扩增BCKDHA基因外显子3号。0111BCKDHAQIN4F和BCKDHAQIN4R用于扩增BCKDHA基因外显子。

45、4号。0112B）QPCR实验仪器及条件ABI7500荧光定量PCR仪01139530秒；011440个循环01159530秒，01166015秒，01177230S秒（收集荧光）；0118如下是获得溶解曲线的步骤01199515秒0120601分钟01219530秒收集荧光，01226015秒。0123C）实验试剂及其量，其中模板为1L，将实验做三个平行样。0124说明书CN104099349A1110/10页12012501263）最低循环数值（CT）比较法计算BCKDHA基因的2,3号外显子的相对拷贝数应用2CT法，与内对照ALB基因比较可以得出BCKDHA基因的2,3号外显子的相对拷贝。

46、数（图2）。0127确认BCKDHA基因的未报道过的杂合突变EX24DUP，即患者和患者父亲中带有杂合突变EX24DUP，而患者的母亲不携带杂合突变EX24DUP。0128实施例60129对于455个正常样品，按照实施例4和5的步骤进行相同的实验，发现他们都不携带错义突变C392AG（PTYR131CYS），也不携带杂合突变EX24DUP。0130人群中携带杂合错义突变C392AG或杂合突变EX24DUP的人十分少见，同时携带二者的更是罕见。本发明人发现同时携带二者的一名患者患有枫糖尿病，同时进一步证明了此患者携带的这两种突变分别来自其父母。两种突变发生在据认为与枫糖尿病相关的支链酮酸脱氢酶复合体E1亚基上，分别携带这两种突变的父母均不发病，而同时携带二者的患者发病，这证明了同时携带两种突变与枫糖尿病的关系。说明书CN104099349A121/5页1300010002序列表CN104099349A132/5页140003序列表CN104099349A143/5页150004序列表CN104099349A154/5页160005序列表CN104099349A165/5页17序列表CN104099349A171/2页18图1说明书附图CN104099349A182/2页19图2说明书附图CN104099349A19。